相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年10月29日提交的美国临时专利申请No.62/752,269和2018年10月29日提交的美国临时专利申请No.62/752,276的权益，其全部内容通过引用的方式纳入本文。
在联邦资助的研究和开发下所作发明的权利的声明
不适用。
技术领域
本文所述的方法和组合物通常涉及核酸扩增领域。特别地，本文所述为用于提高扩增效率的方法和组合物。
背景技术
多种核酸扩增方法是可获得的，并且许多方法已用于实现基于核酸检测的灵敏诊断测定。聚合酶链式反应(PCR)仍然是最广泛使用的DNA扩增和定量方法。巢式PCR(一种两步PCR)用于提高PCR的特异性和灵敏度(美国专利No.4,683,195)。用于PCR扩增的巢式引物为具有与靶序列上反向引物和正向引物靶向位点之间的区域互补的序列的寡核苷酸。然而，PCR通常具有若干限制。PCR扩增在每个循环中仅能够实现靶序列量的不足两倍的增加。其仍然是相对较慢的。此外，该方法的灵敏度通常受到限制，使得难以在单个反应中检测仅以少数分子存在的靶标。
发明内容
本文描述了基于新引物(例如，新的内引物)的使用的方法和组合物，设计所述新引物以使得在扩增时产生的扩增子中维持外引物结合位点。
本文考虑到的各种实施方案可以包括但不必限于以下一个或多个：
实施方案1：用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包括这样的寡核苷酸，其为至少两种第一引物形式或能够形成至少两种第一引物，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少两种第一引物包含第一外引物和第一内引物，所述第一外引物包括与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a，引物序列a包括一个或多个第一经修饰的碱基；并且所述第一内引物包括与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于a’并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包括：引物序列a，其邻近于单链引物序列b并且是单链引物序列b的5’；和夹持序列c(clamp sequence c)，其邻近于引物序列a并且是引物序列a的5’，其中夹持序列c不与第一链模板序列d’互补，所述序列d’邻近于第一链模板序列a’并且是第一链模板序列a’的3’；其中双链引物序列的第二链包括邻近于引物序列a’并且是引物序列a’的3’的引物序列c’，其中联合序列c’-a’与联合序列c-a互补，引物序列a’包括一个或多个第二经修饰的碱基；并且其中第一和第二经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第二经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第二经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
实施方案2：实施方案1所述的引物组，其中所述引物组还包括至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物。
实施方案3：用于扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述方法包括：(a)使所述样品与以下接触：(i)至少两种能够与所述第一模板链杂交的第一引物，其中所述至少两种第一引物包含第一外引物和第一内引物，所述第一外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的引物序列a，引物序列a包括一个或多个第一经修饰的碱基；并且所述第一内引物包括与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于a’并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包括：引物序列a，其邻近于单链引物序列b并且是单链引物序列b的5’；和夹持序列c，其邻近于引物序列a并且是引物序列a的5’，其中夹持序列c不与第一链模板序列d’互补，所述序列d’邻近于第一链模板序列a’并且是第一链模板序列a’的3’；其中双链引物序列的第二链包括引物序列c’，其邻近于引物序列a’并且是引物序列a’的3’，其中联合序列c’-a’与联合序列c-a互补，引物序列a’包括一个或多个第二经修饰的碱基；其中第一和第二经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第二经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第二经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；和(ii)至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物，其中所述接触是在其中引物退火至它们的模板链的条件下进行(如果存在)；以及(b)在其中发生链置换的条件下，(如果存在)使用缺少5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶扩增靶核酸以产生扩增子，所述扩增子包含从模板序列a’延伸至所述第二引物结合位点的序列。
实施方案4：实施方案3所述的方法，其中所述DNA聚合酶在85摄氏度以上是稳定的。
实施方案5：前述实施方案中任一个所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序列c-a的T
实施方案6：前述实施方案中任一个所述的引物组或方法，其中联合序列c-a比联合序列a-b更富含GC和/或包含更多稳定的碱基。
实施方案7：前述实施方案中任一个所述的引物组或方法，其中所述引物组能够在扩增的指数期中以至少3
实施方案8：前述实施方案中任一个所述的引物组或方法，其中所述引物组或方法允许在这样的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约12％-42％。
实施方案9：实施方案2-8中任一项所述的引物组或方法，其中所述第二引物包括这样的寡核苷酸，其为至少两种第二引物形式或能够形成至少两种第二引物，所述第二引物能够与所述第二模板链杂交，其中所述至少两种第二引物包含第二外引物和第二内引物，所述第二外引物包括与第二模板链序列e’特异性杂交的引物序列e，引物序列e包括一个或多个第三经修饰的碱基；并且所述第二内引物包括与第二模板链序列f’特异性杂交的单链引物序列f，其中f’邻近于e’并且是e’的5’，并且其中单链引物序列f在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包括：引物序列e，其邻近于单链引物序列f并且是单链引物序列f的5’；和夹持序列g，其邻近于引物序列e并且是引物序列e的5’，其中夹持序列g不与第二链模板序列h’互补，所述序列h’邻近于第二模板链序列e’并且是第二模板链序列e’的3’；其中双链引物序列的第二链包括引物序列g’，其邻近于引物序列e’并且是引物序列e’的3’，其中联合序列g’-e’与联合序列g-e互补，引物序列e’包括一个或多个第四经修饰的碱基；并且其中第三和第四经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第三和第四经修饰的碱基之间的配对相比，第三和第四经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
实施方案10：实施方案9所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序列g-e的T
实施方案11：实施方案9-10中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列g-e比联合序列e-f更富含GC和/或含有更多稳定的碱基。
实施方案12：实施方案9-11中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组能够在扩增的指数期中以至少6
实施方案13：实施方案9-12中任一项所述的引物组或方法，其中引物组或方法允许在这样的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约36％-66％。
实施方案14：前述实施方案中任一个所述的引物组或方法，其中夹持序列c和g(如果存在)不能在扩增过程中被复制。
实施方案15：实施方案14所述的引物组或方法，其中夹持序列c和/或g(如果存在)包含2’-O-甲基RNA。
实施方案16：前述实施方案中任一个所述的引物组或方法，其中所述第一内引物和/或所述第二内引物(如果存在)的双链引物序列不包含发夹序列。
实施方案17：实施方案1-15中任一项所述的引物组或方法，其中所述第一内引物的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列c连接至互补序列c’，和/或所述第二内引物其双链引物序列(如果存在)包含发夹序列，在该发夹序列中夹持序列g连接至互补序列g’。
实施方案18：用于扩增样品中靶核酸的核酸引物组，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链与所述第一模板链互补，所述引物组包括这样的寡核苷酸，其为至少三种第一引物形式或能够形成至少三种第一引物，所述第一引物能够与所述第一模板链杂交，其中所述至少三种第一引物包含第一外引物、第一中间引物和第一内引物，所述第一外引物包括与第一模板链序列d’特异性杂交的引物序列d，引物序列d包括一个或多个第一经修饰的碱基；所述第一中间引物包括与第一模板链序列a’特异性杂交的单链引物序列a，其中a’邻近于d’并且是d’的5’，引物序列a包括一个或多个第二经修饰的碱基，其中单链引物序列a在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包括：引物序列d，其邻近于单链引物序列a并且是单链引物序列a的5’；和夹持序列c1，其邻近于引物序列d并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c1不与第一模板链序列i’互补，该模板序列i’邻近于第一模板链序列d’并且是第一模板链序列d’的3’；其中双链引物序列的第二链包括引物序列c1’，其邻近于引物序列d’并且是引物序列d’的3’，其中联合序列c1’-d’与联合序列c1-d，引物序列d’包括一种或多种第三经修饰的碱基；并且所述第一内引物包括与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于a’并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包括：引物序列a，其邻近于单链引物序列b并且是单链引物序列b的5’；引物序列d，其邻近于引物序列a并且是引物序列a的5’；和夹持序列c2，其邻近于引物序列d并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c2不与第一链模板序列i’互补；其中内引物的双链引物序列的第二链包括引物序列c2’，其邻近于引物序列d’并且是引物序列d’的3’，所述引物序列d’邻近于引物序列a’并且是引物序列a’的3’，引物序列a’包括一个或多个第四经修饰的碱基，其中联合序列c2’-d’-a’与联合序列c2-d-a互补；其中第一和第三经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第三经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第三经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；并且其中第二和第四经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第二和第四经修饰的碱基之间的配对相比，第二和第四经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
实施方案19：实施方案18所述的引物组，其中所述引物组还包括至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物。
实施方案20：用于扩增样品中靶核酸的方法，其中所述靶核酸包括第一模板链和任选的第二模板链，其中所述第二模板链(如果存在)与所述第一模板链互补，所述方法包括：(a)使所述样品与以下接触：(i)至少三种能够与所述第一模板链杂交的第一引物，其中所述至少三种第一引物包含第一外引物、第一中间引物和第一内引物，所述第一外引物包括与第一模板链序列d’特异性杂交的引物序列d，所述引物序列d包括一种或多种第一经修饰的碱基；所述第一中间引物包括与第一模板链序列a’特异性杂交的单链引物序列a，其中a’邻近于d’并且是d’的5’，引物序列a包括一个或多个第二经修饰的碱基，其中单链引物序列a在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包括：引物序列d，其邻近于单链引物序列a并且是单链引物序列a的5’；和夹持序列c1，其邻近于引物序列d并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c1不与第一模板链序列i’互补，该序列i’邻近于第一模板链序列d’并且是第一模板链序列d’的3’；其中双链引物序列的第二链包括引物序列c1’，其邻近于引物序列d’并且是引物序列d’的3’，其中联合序列c1’-d’与联合序列c1-d互补，引物序列d’包括一个或多个第三经修饰的碱基；并且所述第一内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于a’并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包括：引物序列a，其邻近于单链引物序列b并且是单链引物序列b的5’；引物序列d，其邻近于引物序列a并且是引物序列a的5’；和夹持序列c2，其邻近于引物序列d并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c2不与第一链模板序列i’互补；其中双链引物序列的第二链包括引物序列c2’，其邻近于引物序列d’并且是引物序列d’的3’，所述序列d’邻近于引物序列a’并且是引物序列a’的3’，引物序列a’包括一个或多个第四经修饰的碱基，其中联合序列c2’-d’-a’与联合序列c2-d-a互补；其中第一和第三经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第一和第三经修饰的碱基之间的配对相比，第一和第三经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；并且其中第二和第四经修饰的碱基的未修饰形式是互补的，并且与第二和第四经修饰的碱基之间的配对相比，第二和第四经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；以及(ii)至少一种能够与所述第二模板链特异性杂交的第二引物，其中所述接触在其中引物退火至它们的模板链的条件下进行(如果存在)；和(b)在其中发生链置换的条件下，(如果存在)使用缺少5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶扩增所述靶核酸以产生扩增子，所述扩增子包含从模板序列a’延伸到所述第二引物结合位点的序列。
实施方案21：实施方案20所述的方法，其中所述DNA聚合酶在85度以上是稳定的。
实施方案22：实施方案20或实施方案21所述的方法，其中与不包括经修饰的碱基的相同引物组的每个循环的时间相比，完成每个扩增循环所需的时间至少减少了10-95％。
实施方案23：实施方案22所述的方法，其中与不包括经修饰的碱基的相同引物组的每个循环的时间相比，完成每个扩增循环所需的时间减少了50-85％。
实施方案24：实施方案18-23中任一项所述的引物组或方法，其中c1具有与c2不同的序列。
实施方案25：实施方案18-24中任一项所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序列c1-d的T
实施方案26：实施方案18-25中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列c1-d比联合序列d-a更富含GC和/或含有更多稳定的碱基，并且联合序列c2-d-a比联合序列d-a-b更富含GC和/或比联合序列d-a-b含有更多稳定的碱基。
实施方案27：实施方案18-26中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组能够在扩增的指数期中以至少4
实施方案28：实施方案18-27中任一项所述的引物组或方法，其中所述引物组或方法允许在这样的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约25％-55％。
实施方案29：实施方案18-28中任一项所述的引物组或方法，其中所述第二引物包括这样的寡核苷酸，其为至少三种所述第二引物形式或能够形成至少三种所述第二引物，所述第二引物能够与所述第二模板链杂交，其中所述至少三种第二引物包含第二外引物、第二中间引物和第二内引物，所述第二外引物包括与第二模板链序列h’特异性杂交的引物序列h，引物序列h包括一个或多个第五经修饰的碱基；所述第二中间引物包括与第二模板链序列e’特异性杂交的单链引物序列e，其中e’邻近于h’并且是h’的5’，引物序列e包括一个或多个第六经修饰的碱基，其中单链引物序列e在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包括：引物序列h，其邻近于单链引物序列e并且是单链引物序列e的5’；和夹持序列g1，其邻近于引物序列h并且是引物序列h的5’，其中夹持序列g1不与第二模板链序列j’互补，所述序列j’邻近于第二模板链序列h’并且是第二模板链序列h’的3’；其中双链引物序列的第二链包括邻近于引物序列h’并且是引物序列h’的3’的引物序列g1’，其中联合序列g1’-h’与联合序列g1-h互补，引物序列h’包括一个或多个第七经修饰的碱基；并且所述第二内引物包括与第一模板链序列f’特异性杂交的单链引物序列f，其中序列f’邻近于e’并且是e’的5’，并且其中单链引物序列f在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包括：引物序列e，其邻近于单链引物序列f并且是单链引物序列f的5’；引物序列h，其邻近于引物序列e并且是引物序列e的5’；和夹持序列g2，其邻近于引物序列h并且是引物序列h的5’，其中夹持序列c2不与第一链模板序列j’互补；其中内引物的双链引物序列的第二链包括邻近于引物序列h’并且是引物序列h’的3’的引物序列g2’，所述序列h’邻近于引物序列e’并且是引物序列e’的3’，引物序列e’包括一个或多个第八经修饰的碱基，其中联合序列g2’-h’-e’与联合序列g2-h-e；并且其中第五和第七经修饰的碱基的未修饰形式互补，与第五和第七经修饰的碱基之间的配对相比，第五和第六经修饰的碱基优先与未修饰形式配对；并且其中第六和第八经修饰的碱基的未修饰形式互补，并且与第六和第八经修饰的碱基之间的配对相比，第六和第八经修饰的碱基优先与未修饰形式配对。
实施方案30：实施方案29所述的引物组或方法，其中双链形式的联合序列g1-h的T
实施方案31：实施方案29或30中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列g1-h比联合序列h-e更富含GC和/或含有更多稳定的碱基，联合序列g2-h-e比联合序列h-e-f更富含GC和/或比联合序列h-e-f含有更多稳定的碱基。
实施方案32：实施方案29-31中任一项所述的方法，其中所述引物组能够所述方法在扩增的指数期中以至少8
实施方案33：实施方案29-32中任一项所述的方法，其中所述扩增允许在这样的扩增循环内检测生物样品中的单拷贝核酸：所述扩增循环比仅使用单个正向引物和单个反向引物的所述检测所需的扩增循环少约42％-72％。
实施方案34：实施方案18-33中任一项所述的引物组或方法，其中夹持序列c1和c2以及g1和g2(如果存在)不能在扩增期间被复制。
实施方案35：实施方案34所述的引物组或方法，其中夹持序列c1和c2以及g1和g2(如果存在)包含2’-O-甲基RNA。
实施方案36：实施方案20-35中任一项所述的引物组或方法，其中所述第一内引物和所述第一中间引物；和/或所述第二内引物和所述第二中间引物(如果存在)的双链引物序列不包含发夹序列。
实施方案37：实施方案20-35中任一项所述的引物组或方法，其中：所述第一内引物的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列c2连接至互补序列c2’；和/或所述第一中间引物的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列c1连接至互补序列c1’；和/或所述第二内引物(如果存在)的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列g2连接至互补序列g2’；和/或所述第二中间引物(如果存在)的双链引物序列包括发夹序列，在该发夹序列中夹持序列g1连接至互补序列g1’。
实施方案38：实施方案3-17或20-37中任一项所述的方法，其中所述扩增包括PCR。
实施方案39：实施方案3-17或20-38中任一项所述的方法，其中所述方法包括检测和任选地定量所述靶核酸。
实施方案40：实施方案3-17或20-39中任一项所述的方法，其中所述样品由来自单个细胞的核酸组成。
实施方案41：实施方案1-8中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列a-b比联合序列c-a含有更多不稳定的碱基。
实施方案42：实施方案9-17中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列e-f比联合序列g-e含有更多不稳定的碱基。
实施方案43：实施方案18-28中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列d-a比联合序列c1-d含有更多不稳定的碱基，和/或联合序列d-a-b比联合序列c2-d-a含有更多不稳定的碱基。
实施方案44：实施方案29-43中任一项所述的引物组或方法，其中联合序列h-e比联合序列g1-h含有更多不稳定的碱基，和/或联合序列h-e-f比联合序列g2-h-e含有更多不稳定的碱基。
实施方案45：前述实施方案中任一个所述的引物组或方法，其中与未修饰的互补碱基相比，修饰的互补碱基彼此形成更少的氢键。
实施方案46：实施方案45所述的引物组或方法，其中在经修饰的互补碱基之间形成的碱基对的T
实施方案47：实施方案9-46中任一项所述的引物组或方法，其中至少一种经修饰的碱基与至少一种其他经修饰的碱基相同。
实施方案48：前述实施方案中任一个所述的引物组或方法，其中至少一对修饰的碱基包括经修饰形式的腺嘌呤和胸腺嘧啶。
实施方案49：实施方案48所述的引物组或方法，其中腺嘌呤和胸腺嘧啶的修饰形式分别是2-氨基腺嘌呤和2-硫代胸腺嘧啶。
实施方案50：前述实施方案中任一个的引物组或方法，其中至少一对经修饰的碱基包括经修饰形式的鸟嘌呤和胞嘧啶。
实施方案51：实施方案50所述的引物组或方法，其中经修饰形式的鸟嘌呤包括脱氧肌苷、7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤、2’-次黄嘌呤或7-硝基-7-脱氮次黄嘌呤(deazahypoxanthine)，经修饰形式的胞嘧啶包括3-(2’-脱氧-β-D-呋喃核糖基)吡咯并-[2,3-d]-嘧啶-2-(3H)-酮、N4-烷基胞嘧啶(例如，N4-乙基胞嘧啶)或2-硫代胞嘧啶。
实施方案52：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中包含经修饰的碱基的引物序列中的一个或多个包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个经修饰的碱基。
实施方案53：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中引物组包含探针或所述方法使用探针。
实施方案54：前述实施方案中任一项所述的引物组或方法，其中引物组包含探针或所述方法使用探针，所述探针包含一个或多个经修饰的碱基，其中所述经修饰的碱基优先与未修饰的碱基配对。
附图说明
图1：示意图示出了在双链DNA模板上进行的完全巢式PCR。侧翼引物如图2和图3所记载的。
图2：示意图示出了与靶核苷酸序列的一端杂交的示例性的双引物组。该组可以是，例如正向引物组。示出引物序列的不同片段(a,b,c)；互补序列表示为(a’,b’,c’)。模板序列3’-5’表示为d’、a’和b’。外引物(a)是单链的。内引物具有单链部分(b)和双链部分(a-c)。
图3：示意图示出了与图2中所示的靶核苷酸序列的相反端杂交的示例性的双引物组。该组可以是，例如反向引物组。引物序列的不同片段示为(e,f,g)；互补序列表示为(e’,f’,g’)。模板序列3’-5’表示为h’、e’和f’。外引物(e)是单链的。内引物具有单链部分(f)和双链部分(a-g)。
图4：示意图示出了与靶核苷酸序列的一端杂交的示例性的三引物组。该组可以是，例如正向引物组。引物序列的不同片段示为(a,b,c1,c2,d)；互补序列表示为(a’,b’,c1’,c2’,d’)。模板序列3’-5’表示为i’、d’、a’和b’。外引物(d)是单链的。中间引物具有单链部分(a)和双链部分(d-c1)。内引物具有单链部分(b)和双链部分(a-d-c2)。
图5：示意图示出了与图4中所示的靶核苷酸序列的相反端杂交的示例性的三引物组。该组可以是，例如反向引物组。引物序列的不同片段示为(e,f,g1,g2,h)；互补序列表示为(e’,f’,g1’,g2’,h’)。模板序列3’-5’表示为j’、h’、e’和f’。外引物(d)是单链的。中间引物具有单链部分(e)和双链部分(h-g1)。内引物具有单链部分(f)和双链部分(e-h-g2)。
图6A-B：示意图示出了当允许具有夹持序列的示例性引物与模板杂交时，该引物的两种替代的结构。荧光猝灭剂(Q)存在于引物中的一个位置，在该位置它使模板链中对应的荧光标记(F)猝灭。在实施例1中，进行实验，其中在存在或不存在夹子的情况下测量引物和互补靶序列的T
图7A-B：(A)示意图示出了示例性的双引物组，其中荧光猝灭剂(Q)存在于内引物中的一个位置，在该位置它使模板链中对应的荧光标记(F)猝灭。(B)在实施例2的引物延伸反应中，荧光强度作为时间的函数。三条上升迹线是具有稍微不同的夹子的单独的反应；水平迹线没有外(侧翼)置换引物存在。
图8A：胸腺嘧啶和腺嘌呤(式1a)、胸腺嘧啶和2-氨基腺嘌呤(式1b)、2-硫代胸腺嘧啶和腺嘌呤(式2b)以及2-硫代胸腺嘧啶和2-氨基腺嘌呤(式2b)之间的Watson-Crick双峰的碱基配对方案。2-硫代胸腺嘧啶和2-氨基腺嘌呤碱基对不稳定，而胸腺嘧啶和2-氨基腺嘌呤以及2-硫代胸腺嘧啶和腺嘌呤碱基对稳定。
图8B：胞嘧啶和鸟嘌呤(式3a)、胞嘧啶和肌苷(式3b)、dP和鸟嘌呤(式4a)以及dP和肌苷(式4b)之间的Watson-Crick双峰的碱基配对方案。dP和肌苷碱基对不稳定，而胞嘧啶和肌苷以及dP和鸟嘌呤碱基对稳定。
图9：使用修饰的碱基可使基数-3扩增中用于引物退火(顶部)的期望的构型更稳定。底部示出了用于引物退火的不期望的构型。指向上方的较大箭头指示不期望的构型比期望的构型更不稳定。换言之，以双链形式的联合序列c-a(即，c-a/c’-a’)(在此上下文中使用连字符表示由序列c和a组成的联合核酸序列)的稳定性高于双链形式的联合序列a-b(即，a-b/a’-b’)的稳定性。
图10A-10B：A和B组比较了修饰的测试引物组(“8系列；”A图)和未修饰的测试引物组(“6系列；”B图)的实时PCR生长曲线。使用对数y轴刻度对荧光(y轴)相对于PCR循环数作图。参见实施例3。
图11A：从减少的模板DNA分子的数量开始，通过基数-6(每个循环约6个重复)PCR扩增生成的实时PCR荧光生长曲线。参见实施例4。
图11B：图11B示出了达到荧光的阈值水平所需的扩增循环数(Ct)相对于实施例4中所述的研究的起始DNA模板分子数目的log 10作图。
具体实施方式
除非另有说明，权利要求书和说明书中所用术语如下文所述来定义。
术语“核酸”是指核苷酸聚合物，除非另外限定，其包括天然核苷酸的类似物，所述类似物能够以与天然存在的核苷酸类似的方式发挥作用(例如杂交)。
术语核酸包括任何形式的DNA或RNA，包括例如基因组DNA；互补DNA(cDNA)，其为mRNA的DNA表现形式，通常通过信使RNA(mRNA)的逆转录或通过扩增而获得；通过合成或通过扩增产生的DNA分子；mRNA；和非编码RNA。
术语核酸涵盖双链或三链核酸复合物，以及单链分子。在双链或三链核酸复合物中，核酸链不需要是共同延伸的(即双链核酸不需要在两条链的整个长度上都是双链的)。
术语核酸也涵盖其任意修饰，例如通过甲基化和/或通过加帽。核酸修饰可包括添加向单独的核酸碱基或向作为整体的核酸引入额外的电荷、极化性、氢键、静电相互作用和官能性的化学基团。这样的修饰可包括碱基修饰，例如2’位的糖修饰、5位的嘧啶修饰、8位的嘌呤修饰、在胞嘧啶环外胺处的修饰、5-溴-尿嘧啶的置换、糖磷酸骨架修饰、稀有碱基配对组合例如异碱基异胞苷和异胍等。
更具体地，在一些实施方案中，核酸可包括聚脱氧核糖核苷酸(包含2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(包括D-核糖)，和任何其他类型的嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的核酸，以及包含非核苷酸骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(例如肽核酸(PNA))和聚吗啉代聚合物(参见，例如Summerton and Weller(1997)“Morpholino Antisense Oligomers:Design,Preparation,and Properties,”Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.7:1817-195；Okamoto et al.(20020)“Development of electrochemically gene-analyzing methodusing DNA-modified electrodes,”Nucleic Acids Res.Supplement No.2:171-172)，以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是所述聚合物包含允许碱基配对和碱基堆积的构型的核苷碱基，例如于DNA和RNA中发现的。术语核酸还涵盖锁核酸(LNA)，其记载于美国专利No.6,794,499、6,670,461、6,262,490和6,770,748中，所述专利的LNA公开内容以引用的方式全文纳入本文。
核酸可获自完全化学合成方法，例如固相介导的化学合成；可获自生物来源，例如通过从产生核酸的任何物种中分离；或可获自涉及通过分子生物学工具来操作核酸的方法，例如DNA复制、PCR扩增、逆转录；或可获自这些方法的组合。
本文使用的术语“互补”是指两个核苷酸之间精确配对的能力；即，如果核酸给定位置处的核苷酸能够与另一核酸的核苷酸进行氢键键合以形成标准碱基对，则这两种核酸被认为是在该位置彼此互补。两个单链核酸分子之间的互补可以是“部分的”，其中仅有一些核苷酸结合，或者当两个单链分子之间存在完全互补性时可以是完全的。核酸链之间的互补性程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。
“特异性杂交”是指在确定的严格条件下，在不存在与杂交混合物中存在的其他核苷酸序列实质性结合的情况下，核酸与靶核苷酸序列的结合。本领域技术人员了解，放宽杂交条件的严格度允许容忍序列错配。
在一些实施方案中，在严格杂交条件下进行杂交。词语“严格杂交条件”通常是指在确定的离子强度和pH下，低于特定序列的解链温度(T
术语“寡核苷酸”用于指相对短的核酸，其通常短于200个核苷酸，更特别地，短于100个核苷酸，最特别地，短于50个核苷酸。通常，寡核苷酸为单链DNA分子。
术语“引物”是指这样的寡核苷酸，其能够与核酸杂交(也称为“退火”)，并且能够用作在适合的条件(即在存在四种不同的三磷酸核苷和聚合试剂(例如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶)的情况下)下在适合的缓冲液中和适合的温度下的核苷酸(RNA或DNA)聚合反应的起始位点。引物的适合长度取决于引物的预期用途，但是引物的长度通常为至少7个核苷酸，在一些实施方案中，引物长度为10至30个核苷酸，或在一些实施方案中，引物长度为10至60个核苷酸。在一些实施方案中，引物长度可以为例如15至50个核苷酸。短引物分子通常需要更低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的准确序列，但是必须充分互补以与模板杂交。
如果引物或其部分与核酸内的核苷酸序列杂交，则称引物退火至另一核酸。引物与特定核苷酸序列杂交的陈述并不意欲暗示引物完全地或排他地与该核苷酸序列杂交。例如，在一些实施方案中，本文使用的扩增引物被称为“退火至”或“特异性针对”核苷酸序列。该描述涵盖全部退火至核苷酸序列的引物，以及部分退火至核苷酸序列的引物。
术语“引物对”是指一组引物，其包括与待扩增的DNA序列的5’端的互补序列杂交的5’“上游引物”或“正向引物”，以及与待扩增的序列的3’端杂交的3’“下游引物”或“反向引物”。本领域技术人员将了解，术语“上游”和“下游”或“正向”和“反向”不意欲为限制性的，而是在一些实施方案中提供示例性的方向。
“探针”是这样的核酸，其能够通过一种或多种类型的化学键，一般通过互补碱基配对，通常通过氢键形成而结合至具有互补序列的靶核酸，从而形成双链结构。探针可用可检测标记物进行标记以使探针易于检测，特别是探针一旦与其互补靶标杂交时。或者，然而，探针可以是未标记的，但是可通过与被标记的配体直接或间接地特异性结合来检测。探针的大小可显著不同。通常，探针长度为至少7至15个核苷酸。其他探针长度为至少20、30或40个核苷酸。还有其他探针更长，长度为至少50、60、70、80或90个核苷酸。还有其他探针仍然更长，长度为至少100、150、200或更多个核苷酸。探针也可以是任意上述数值所界定的任意范围内的任何长度(例如长度为15-20个核苷酸)。
引物或探针可与靶核苷酸序列完全互补或尚未完全互补。在一些实施方案中，引物在至少7个核苷酸的序列上、更典型地在10-30个核苷酸的序列上以及在一些实施方案中在至少14-25个核苷酸的序列上与靶核苷酸序列的互补序列具有至少65％的同一性，在一些实施方案中具有至少75％的同一性、至少85％的同一性、至少90％的同一性、或至少95％、96％、97％、98％或99％的同一性。应理解，通常希望某些碱基(例如引物的3’碱基)与靶核苷酸序列的相应碱基完全互补。在严格杂交条件下，引物和探针通常退火至靶序列。
如本文所使用的，提及引物的一部分或引物内的核苷酸序列时，术语“特异性针对”核酸是指在适当的退火条件下能够特异性地退火至靶核酸的引物或核苷酸序列。
根据本发明教导的扩增涵盖通常以模板依赖性方式使至少一种靶核酸的至少一部分复制的任何方法，包括但不限于用于线性地或指数地扩增核酸序列的大范围的技术。用于进行扩增步骤的示例性的方法包括PCR、基于核酸链的扩增(NASBA)、两步多重扩增、滚环扩增(RCA)等，包括其多个版本和其组合，例如但不限于OLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(也称为结合链反应——CCR)、解旋酶依赖性的扩增(HDA)等。这类技术的描述可参见Ausbel et al.；PCR Primer:A Laboratory Manual,Diffenbach,Ed.,Cold Spring Harbor Press(1995)；The Electronic Protocol Book,Chang Bioscience(2002)；Msuih et al.,J.Clin.Micro.34:501-07(1996)；The NucleicAcid Protocols Handbook,R.Rapley,ed.,Humana Press,Totowa,N.J.(2002)；Abramsonet al.,Curr Opin Biotechnol.1993Feb.；4(1):41-7,美国专利No.6,027,998；美国专利No.6,605,451,Barany et al.,PCT公开No.WO 97/31256；Wenz et al.,PCT公开No.WO 01/112579；Day et al.,Genomics,29(1):152-162(1995),Ehrlich et al.,Science 252:1643-50(1991)；Innis et al.,PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications,Academic Press(1990)；Favis et al.,Nature Biotechnology 18:561-64(2000)；andRabenau et al.,Infection 28:97-102(2000)；Belgrader,Barany,and Lubin,Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay,SixthInternational Symposium on Human Identification,1995(可在万维网:promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html上获得)；LCR Kit Instruction Manual,Cat.#200520,Rev.#050002,Stratagene,2002；Barany,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:188-93(1991)；Bi and Sambrook,Nucl.Acids Res.25:2924-2951(1997)；Zirvi et al.,Nucl.Acid Res.27:e40i-viii(1999)；Dean et al.,Proc Natl Acad Sci USA 99:5261-66(2002)；Barany and Gelfand,Gene 109:1-11(1991)；Walker et al.,Nucl.AcidRes.20:1691-96(1992)；Polstra et al.,BMC Inf.Dis.2:18-(2002)；Lage et al.,Genome Res.2003Feb.；13(2):294-307,and Landegren et al.,Science 241:1077-80(1988),Demidov,V.,Expert Rev Mol Diagn.2002Nov.；2(6):542-8.,Cook et al.,JMicrobiol Methods.2003May；53(2):165-74,Schweitzer et al.,Curr OpinBiotechnol.2001Feb.；12(1):21-7；美国专利No.5,830,711；美国专利No.6,027,889；美国专利No.5,686,243；PCT公开No.WO0056927A3和PCT公开No.WO9803673A1等来源。
在一些实施方案中，扩增包括至少一个循环的以下连续步骤：使至少一种引物与至少一种靶核酸中的互补序列或基本上互补的序列退火；使用聚合酶，以模板依赖性方式合成至少一条核苷酸链；使新形成的核酸双链变性以使链分开。可重复或可不重复所述循环。扩增可包含热循环或可在等温下进行。
“巢式扩增”是指使用多于两种引物来扩增靶核酸。
“半巢式扩增”是指使用多于一种(例如两种或三种)在靶核苷酸序列的一端退火的引物。
“完全巢式扩增”是指使用多于一种在靶核苷酸序列的每一端退火的引物。
关于巢式扩增，通过使用术语“内”、“外”和“中间”来区分在扩增子的一端退火的多种引物。
“外引物”是指这样的引物，其与在靶核苷酸序列的相同末端退火的另一种引物相比，退火到更靠近所述靶核苷酸序列的末端的序列。在一些实施方案中，外引物序列定义了从靶核酸产生的扩增子的末端。在本文中，“外引物”也被称为“侧翼引物”。
“内引物”是指这样的引物，其与在靶核苷酸序列的相同末端退火的另一种引物相比，退火到更靠近所述靶核苷酸序列的中间的序列。
术语“中间引物”在本文中用于巢式扩增，在所述巢式扩增中，使用至少三种退火到靶核苷酸序列一端的引物。中间引物是退火到内引物和外引物之间的序列的引物。
如本文使用的术语“邻近于”用于指足够靠近以使所述方法起作用的序列。在一些实施方案中，彼此邻近的序列是直接邻近的，没有插入的核苷酸。
“多重扩增反应”是其中同时扩增两种或多种可通过序列区分的核酸的反应。
本文使用术语“qPCR”以指定量实时聚合酶链式反应(PCR)，其还已知为“实时PCR”或“动态聚合酶链式反应”；所有术语是指具有实时信号检测的PCR。
“试剂”广义上指除分析物(例如被分析的核酸)以外用于反应中的任何试剂。用于核酸扩增反应的示例性试剂包括但不限于缓冲液、金属离子、聚合酶、逆转录酶、引物、模板核酸、核苷酸、标记物、染料、核酸酶、dNTP等。用于酶反应的试剂包括例如底物、辅因子、缓冲液、金属离子、抑制剂和激活剂。
本文使用的术语“标记物”是指可用于提供可检测和/或可定量信号的任何原子或分子。具体地，标记物可直接或间接连接至核酸或蛋白。可连接至探针的适合的标记物包括但不限于放射性同位素、荧光团、生色团、质量标记物、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记物、发出化学发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。
本文使用的术语“染料”通常指吸收电磁辐射的任何有机或无机分子。
构成DNA和RNA的天然碱基腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶在本文中被描述为“未修饰的碱基”或“未修饰的形式”。
本文使用的术语“修饰的碱基”是指不是标准的天然存在的碱基(例如，腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶)。修饰的碱基的实例是2-硫代胸腺嘧啶和2-氨基腺嘌呤。
包含经修饰的碱基的核苷酸在本文中称为“修饰的核苷酸”。
如果DNA聚合酶在核酸扩增反应中提供令人满意的延伸速率，则称其在该特定温度下“稳定”。
美国专利No.8,252,558和Harris et al.,BioTechniques 54:93-97(2013年2月)教导了巢式PCR形式，称为“聚合酶链置换反应”(PCDR)(这两篇文件的描述均以引用的方式纳入本文)。在PCDR中，当延伸从外引物发生时，外引物置换从内引物产生的延伸链，因为反应使用了具有链置换活性的聚合酶。理论上，这使得每个扩增循环的扩增产物的增加大于2倍，因此灵敏度和速度相对常规PCR提高。实际上，从巢式引物产生的每个扩增子都不再包含外引物的引物退火位点。因此，PCDR无法在非常多的循环中维持每个扩增循环的扩增产物的的增加大于2倍。为此，PCDR仅提供检测靶核酸所需要的扩增循环数的适度减少(例如从约23至约20)。相比之下，下表1表明每个循环的持续四倍化(4
表1——具有不同“碱基”的扩增程度
维持每个扩增循环大于2倍的扩增产物增加的关键是设计内(巢式)引物，以使内(巢式)引物的延伸产物包含外(侧翼)引物序列。图1示出了使用正向内和外引物以及反向内和外引物进行的完全巢式PCR的方案。在内引物退火到模板时形成的“瓣状(flap)”包含外引物序列，以使得从两条模板链产生的四条新链的每一条从正向外引物序列(或其互补序列)延伸(并包含)，通过(并包含)反向外引物序列。然而，需要的不只是简单地将外引物序列添加到内引物的5’端，因为当内引物退火时，所添加的序列也将立即退火并阻止外引物退火。这个问题的解决方案是使用额外的内引物的5’添加物(即除外引物序列以外的序列)，以及与这两个序列互补的寡核苷酸，其在本文中称为“夹子”。为了便于讨论，添加的序列被称为“夹持序列”。该构型如图2所示。
夹持序列c与模板(d’区域)不同源。本文中c-a/c’-a’比a-b/a’-b’更稳定。在一些实施方案中，这可通过使用序列c来实现，该序列c相对于a更长、富含GC(即比a更富含GC)、或包含一个或多个稳定的碱基(当a不包含这类碱基时)或比a中更多的稳定的碱基。在一些实施方案中，这可通过使用序列c来实现，该序列c相对于b更长、富含GC(即比b更富含GC)、或包含一个或多个稳定的碱基(当b不包含这类碱基时)或比b中更多的稳定的碱基。在一些实施方案中，稳定的碱基可被包含在c-a-b的a区，以及在c’-a’的a’区以增加c-a/c’-a’相对于a-b/a’-b’的稳定性。可选地或另外地，b可包含一个或多个不稳定的碱基，例如肌苷。外引物保留序列a。在这种情况下，外引物仍然可接触模板中的序列a’。在更高温度下，内引物的c’-a’夹子和5’端将比任何其他序列更快地退火，因此c’-a’夹子不必连接至内引物以形成发夹结构。然而，在一些实施方案中，使用具有这种类型的发夹结构的内引物可增加反应速度。
在一些实施方案中，内引物中的c序列(以红色突出显示)优选地不在PCR过程中复制。如果它在PCR过程中复制，则这些新模板将具有c’-a’尾，其将与内引物一起产生c-a-b/c’-a’-b’双链体，所述双链体会在链置换竞争中“胜过”其他可能的结构并且再次阻止侧翼引物序列a退火。为了阻止这种复制，可从DNA聚合酶不能很好复制的RNA(或2’-O-甲基RNA，其相对易于通过合成方法来制备)制备红色序列。该红色序列可从能够进行碱基配对、但不能够被复制的任何碱基来制备。
在一些实施方案中，夹持寡核苷酸(a’-c’)在3’端被阻断延伸，例如由于缺少3’羟基或使用化学阻断基团，这可提高扩增的特异性。
可使用本领域已知的常规方法从生物来源获得并制备包含核酸的样品。特别地，可用于本文所述方法的核酸可从任何来源获得，包括单细胞生物和高等生物如植物或非人动物，例如犬、猫、马、灵长类动物和其他非人哺乳动物，以及人。在一些实施方案中，可从疑似或已知感染了病原体的个体、疑似患有或已知患有疾病(例如癌症)的个体或妊娠个体获得样品。
通过任意多种标准技术，可从细胞、体液(例如血液、血液级分、尿等)或组织样品获得核酸。在一些实施方案中，所述方法利用血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、胸膜液、口腔液和皮肤的外切片的样品；来自呼吸道、肠道、生殖道或尿道的样品；眼泪、唾液、血细胞、干细胞或肿瘤的样品。样品可获自活生物体或死生物体，或来自体外培养物。示例性的样品可包括单细胞、石蜡包埋的组织样品和针吸活组织检查样品。在一些实施方案中，被分析的核酸获自单细胞。
使用本领域中公知的方法可分离目的核酸。样品核酸不需要为纯的形式，但是通常足够纯以允许进行本文所述方法的步骤。
使用本文所述的方法可检测可通过核酸扩增检测的任何靶核酸。在典型的实施方案中，靶核酸的至少一些核苷酸序列信息将是已知的。例如，如果使用的扩增反应是PCR，通常可获得给定靶核酸的各端的充分序列信息，以允许设计适合的扩增引物。
靶标可包括例如与病原体(例如病毒、细菌、原生动物或真菌)相关的核酸；RNA，例如其过表达或低表达指示疾病的那些RNA，以组织特异性方式或发育特异性方式表达的那些RNA；或由特定刺激物诱导的那些；基因组DNA，可分析其特异的多态性(例如SNP)、等位基因或单倍型，例如在基因分型中。特别感兴趣的是在遗传病或其他病理中改变(例如扩增、缺失和/或突变)的基因组DNA；与期望或不期望的性状相关的序列；和/或独特地鉴定个体的序列(例如在法医学中或亲子测定中)。
适于核酸扩增的引物足够长以在适合的核酸聚合酶存在下启动延伸产物的合成。引物的准确长度和组成将取决于许多因素，包括例如退火反应的温度、引物的来源和组成，以及在使用探针的情况下，探针退火位点与引物退火位点的邻近度，以及引物:探针浓度比。例如，根据靶核酸序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含约10至约60个核苷酸，尽管它可包含更多或更少的核苷酸。引物应当充分互补以选择性地退火到它们各自的链并形成稳定的双链体。
通常，本领域技术人员知晓如何设计能够扩增目的靶核酸的合适的引物。例如，可通过使用任何市售可得的软件或开源软件如Primer3(参见例如Rozen and Skaletsky(2000)Meth.Mol.Biol.,132:365-386；www.broad.mit.edu/node/1060等)，或通过访问Roche UPL网站来设计PCR引物。将扩增子序列输入到Primer3程序中，其中UPL探针序列在括号中以保证Primer3程序会在括号中的探针序列的任一侧上设计引物。
将通过任何适合的方法来制备引物，所述方法包括例如，通过例如采用以下方法的直接化学合成：Narang et al.(1979)Meth.Enzymol.68:90-99的磷酸三酯法；Brown etal.(1979)Meth.Enzymol.68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage et al.(1981)Tetra.Lett.,22:1859-1862的二乙基亚磷酰胺法；美国专利No.4,458,066的固体载体法等，或者可由商业来源提供引物。通过使用Sephadex柱(Amersham Biosciences,Inc.,Piscataway,NJ)或本领域技术人员已知的其他方法来纯化引物。引物纯化可提高本文所述的方法的灵敏度。
图2示出了双引物组如何退火到靶核苷酸序列一端的第一模板链。为了便于讨论，该引物组可被认为是“正向”引物组。外引物包含与第一模板链序列a’特异性杂交的序列a。图3示出了双引物组如何退火到靶核苷酸序列相反端的第二模板链。为了便于讨论，该引物组可被认为是“反向”引物组。在此处，外引物包含与第一模板链序列e’特异性杂交的序列e。图4和5示出了示例性的“正向”和“反向”三引物组。在图4中，正向外引物包含与第一模板链序列d’特异性杂交的序列d。在图5中，正向外引物包含与第一模板链序列d’特异性杂交的序列d。通常，设计适合的外引物的考虑因素与设计用于常规巢式PCR的外引物的那些并无差异。值得注意的是，在一些实施方案中，相对于另一引物序列(例如内引物序列或中间引物序列)在“外”的任何引物序列的T
“稳定的碱基”包括，例如，可被掺入到DNA寡核苷酸中以增加双链体稳定性的肽核酸(PNA)区段(stretch)。锁核酸(LNA)和非锁核酸(UNA)是在固相寡核苷酸合成中可容易地被掺入到DNA寡核苷酸中的RNA类似物，并且分别提高和降低双链体稳定性。适合的稳定的碱基也包括提高碱基对(和因此整个双链体)的稳定性的经修饰的DNA碱基。这些经修饰的碱基可在固相合成过程中被掺入到寡核苷酸中，并且提供更可预测的增加DNA双链体稳定性的方法。实例包括AP-dC(G-夹)和2-氨基腺嘌呤以及5-甲基胞嘧啶和C(5)-丙炔基胞嘧啶(替代胞嘧啶)和C(5)-丙炔基尿嘧啶(替代胸腺嘧啶)。
“不稳定的碱基”为由于形成比典型的A-T和/或G-C碱基对更不稳定的碱基对而使双链DNA不稳定的那些碱基。肌苷(I)是不稳定的碱基，因为它与胞嘧啶(C)配对，但是I-C碱基对比G-C碱基对更不稳定。这种更低的稳定性是由于以下事实导致的：与G-C碱基对的三个氢键相比，肌苷是仅能够形成两个氢键的嘌呤。其他不稳定的碱基是本领域技术人员已知或易于鉴定的。
参考图2，正向双引物组中的内引物包含单链引物序列b，其与第一模板链序列b’特异性杂交，其中b’邻近于a’并且是a’的5’，并且其中单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链。该第一链包含：引物序列a，其邻近于单链引物序列b并且是单链引物序列b的5’；和夹持序列c，其邻近于引物序列a并且是引物序列a的5’，其中夹持序列c不与第一链模板序列d’互补，该序列d’邻近于第一链模板序列a’并且是第一链模板序列a’的3’。在一些实施方案中，双链形式的联合序列c-a(本文中用连字符来表示由序列c和a组成的联合核酸序列)(即c-a/c’-a’)的T
正向双引物组可与用于半巢式扩增的简单的常规反向引物或与反向双引物组一起使用。
参考图3，反向双引物组中的内引物包含单链引物序列f，其与第一模板链序列f’特异性杂交，其中f’邻近于e’并且是e’的5’，并且其中单链引物序列f在其5’端连接至双链引物序列的第一链。该第一链包含：引物序列e，其邻近于单链引物序列f并且是单链引物序列f的5’；和夹持序列g，其邻近于引物序列e并且是引物序列e的5’，其中夹持序列g不与第一链模板序列h’互补，该序列h’邻近于第一链模板序列e’并且是第一链模板序列e’的3’。在一些实施方案中，双链形式的联合序列g-e(即g-e/g’-e’)的T
在一些实施方案中，夹持序列c和g(如果存在)不能在扩增期间被复制。RNA或RNA类似物(例如抗水解的RNA类似物)可用于提供所需的碱基对以形成双链夹持序列，而不在扩增期间被DNA依赖性聚合酶复制。最常见的RNA类似物是2’-O-甲基取代的RNA。可特异性地进行碱基配对但是无法被复制的其他核酸类似物包括锁核酸(LNA)或BNA(桥接核酸)、吗啉代和肽核酸(PNA)。尽管这些寡核苷酸具有不同的骨架糖，或在PNA的情况中，具有替代磷酸核糖的氨基酸残基，但它们仍然按照Watson和Crick配对结合至RNA或DNA，但是不受核酸酶活性的影响。它们无法通过酶法来合成，只能使用亚磷酰胺策略通过合成获得，或对于PNA，通过肽合成法获得。
如果需要，夹持序列c可共价连接至互补序列c’，以使从发夹结构形成a-c/a-c’；然而，这对于高效形成引物的双链夹持部分而言并不是必需的。类似地，夹持序列g能够但不需要共价连接至互补序列g’以使从发夹结构形成e-g/e’-g’。
在一些实施方案中，可在靶核酸序列的一端或两端使用第三引物以进一步增加在扩增的每个循环中产生的拷贝数。图4和图5示出了示例性的“正向”和“反向”三引物组。三引物组包括如上文所讨论的外引物和在结构上与上文讨论的内引物基本上相同的中间引物。另外的引物是内引物，其被设计以与中间引物的模板链5’杂交。
正向三引物组中的内引物包含与第一模板链序列b’特异性杂交的单链引物序列b，其中b’邻近于a’并且是a’的5’。单链引物序列b在其5’端连接至双链引物序列的第一链，该第一链包含：引物序列a，其邻近于单链引物序列b并且是单链引物序列b的5’；引物序列d，其邻近于引物序列a并且是引物序列a的5’；和夹持序列c2，其邻近于引物序列d并且是引物序列d的5’，其中夹持序列c2不与第一链模板序列i’互补。夹持序列c2可以与用于内引物的夹持序列(c1)相同或不同。在优选的实施方案中，c1和c2是不同的序列。如上文针对双引物组中的内引物所讨论的，类似的考虑因素适用于三引物组中的内引物的设计，并且反向三引物组(图5中所示)的内引物具有与正向三引物组中的内引物相同的结构。可在一种或多种(或全部)夹持寡核苷酸(图4中的d’-c1’和a’-d’-c2’，以及图5中的h’-g1’和e’-h’-g2’)的3’端阻断延伸。正向三引物组可与用于半巢式扩增的简单的常规反向引物一起使用，与反向双引物组一起使用，或与反向三引物组一起使用。
在一些实施方案中，根据引物序列的T
可根据上文讨论的原则来设计其他巢式引物。
图9在该图的上图示出了用于基数-3扩增的期望的引物退火构型，而在下图示出了不会产生基数-3扩增的替代引物退火构型。为了有效地进行基数-3扩增，上图构型应比下图构型更稳定。实现此目的的一种方法是设计引物，以使得双链形式的联合序列c-a(即c-a/c’-a’)的T
在本文所述的引物组中使用经修饰的碱基的优点是，与不包括经修饰的碱基的相同引物组的每个循环的时间相比，其减少了完成每个扩增循环所需的时间量。在各种实施方案中，如本文所述在引物中使用经修饰的碱基可以将每个循环的时间减少例如10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％或以上。循环时间百分比减少可以落入由任意这些值界定的范围内，例如10-95％、20-95％、30-95％、40-95％、50-95％、60-95％、70-95％、80-95％、85-95％、10-90％、20-90％、30-90％、40-90％、50-90％、60-90％、70-90％、80-90％、85-90％、10-85％、20-85％、30-85％、40-85％、50-85％、60-85％、70-85％、80-85％等。
下一部分详细描述适用于引物的经修饰的碱基。本部分的其余部分在上文讨论的各种实施方案中描述了本文所述引物中修饰的碱基的定位。
图9(上图构型)示出了具有经修饰的碱基的双引物组如何退火至靶核苷酸序列的一端的第一模板链。该引物组的设计与图2所示的相同。为便于讨论，可以将该引物组视为“正向”引物组。外引物包括与第一模板链序列a’特异性杂交的序列a。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列a可以包括一个或多个第一经修饰的碱基。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列a可以包括一个或多个第一经修饰的碱基。如果引物序列a包括一个以上的第一经修饰的碱基，则第一经修饰的碱基可以相同或不同(在本文中使用术语“第一”、“第二”、“第三”等是为了便于讨论，但并不意味着所有第一、第二或第三经修饰的碱基都相同)。
如在图2中，图9的引物组包括具有双链部分的内引物，该双链部分的一条链包含邻近于引物序列a’并且是引物序列a’的3’的引物序列c’，其中联合序列c’-a’与联合序列c-a互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列a’可包括一个或多个第二经修饰的碱基。外引物序列a中的修饰的碱基是互补序列，并且位于会允许它们与内引物(引物序列a’)第二条链中的经修饰的碱基进行碱基配对的位置。然而，因为是互补的，修饰的碱基不以稳定的方式进行碱基配对(相对于它们的未修饰形式)，所以不利的是不期望的引物退火构型(图9中下图构型)的形成。
图3示出了双引物组如何退火至靶核苷酸序列相对端的第二模板链。为了便于讨论，可以将该引物组视为“反向”引物组。此处，外引物包括与第一模板链序列e’特异性杂交的序列e。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列e可以包括一个或多个第三经修饰的碱基。
图3的引物组还包括具有双链部分的内引物，该双链引物序列的第二链包括邻近于引物序列e’并且是引物序列e’的3’的引物序列g’，其中联合序列g’-e’与联合序列g-e互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列e’可以包括一个或多个第四经修饰的碱基。外引物序列e中的经修饰的碱基是互补序列，并且位于会允许它们与内引物第二链中的修饰的碱基(引物序列e’)进行碱基配对的位置。然而，因为是互补的，修饰的碱基不以稳定的方式进行碱基配对(相对于它们的未修饰形式)，所以不利的是不期望的引物退火构型(图9中下图构型)的形成。
图4和5示出了示例性的“正向”和“反向”三引物组，其也可以设计为具有修饰的碱基。参照图4中的正向引物组，在经修饰的碱基的实施方案中，外引物的引物序列d可以包括一个或多个第一经修饰的碱基。
中间引物具有单链部分和双链部分。单链部分包括引物序列a，其可以包含一个或多个第二经修饰的碱基。双链部分包括这样一条链，该链包括邻近于引物序列d’并且是引物序列d’的3’的引物序列c1’，其中联合序列c1’-d’与联合序列c1-d互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列d’可以包括一个或多个第三经修饰的碱基。
内引物也具有单链部分和双链部分。双链部分包括这样一条链，该链包括邻近于引物序列d’并且是引物序列d’的3’的引物序列c2’，所述引物序列d’邻近于引物序列a’并且是引物序列a’的3’，其中联合序列c2’-d’-a’与联合序列c2-d-a互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列a’可以包括一个或多个第四经修饰的碱基。
第一和第三经修饰的碱基是互补序列，并且处于会允许它们碱基配对的位置，但是所述修饰不鼓励这种配对，而有利于与它们的天然的、未修饰的互补序列进行碱基配对。类似地，第二和第四经修饰的碱基是互补序列，并且处于会允许它们碱基配对的位置，但是所述修饰不鼓励这种配对，而有利于与它们的天然的、未修饰的互补序列进行碱基配对。
参考图5中的反向引物组，在经修饰的碱基的实施方案中，外引物的引物序列h可以包括一个或多个第五经修饰的碱基。
中间引物具有单链部分和双链部分。单链部分包括引物序列e，其可以包含一个或多个第六经修饰的碱基。双链部分包括这样一条链，该链包括邻近于引物序列h’并且是引物序列h’的3’的引物序列g1’，其中联合序列g1’-h’与联合序列g1-h互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列h’可以包括一个或多个第七经修饰的碱基。
内引物也具有单链部分和双链部分。双链部分包括这样一条链，该链包括邻近于引物序列h’并且是引物序列h’的3’的引物序列g2’，所述序列h’邻近于引物序列e’并且是引物序列e’的3’，其中联合序列g2’-h’-e’与联合序列g2-h-e互补。在经修饰的碱基的实施方案中，引物序列a’可以包括一个或多个第八经修饰的碱基。
第五和第七经修饰的碱基是互补序列，并且处于会允许它们碱基配对的位置，但是所述修饰不鼓励这种配对，而有利于与它们的天然的、未修饰的互补序列进行碱基配对。类似地，第六和第八经修饰的碱基是互补序列，并且处于会允许它们碱基配对的位置，但是所述修饰不鼓励这种配对，而有利于与它们的天然的、未修饰的互补序列进行碱基配对。
可用于本文所述的引物中的修饰的碱基包括其中修饰的碱基与天然互补碱基形成稳定的氢键键合的碱基对，但不与其修饰的互补碱基形成稳定的氢键键合的碱基对的那些(为便于讨论，互补碱基在本文中也称为“配对体”)。在一些实施方案中，在修饰的碱基可以与其天然配对体形成两个或更多个氢键，但是与其修饰的配对体仅形成一个氢键或不形成氢键时，实现这一点。这使得产生不会彼此形成基本稳定的氢键键合杂交体的引物对，如在低于约40℃的解链温度(在生理或基本生理条件下)中所显示的。然而，引物对的引物与单链或双链靶核酸的模板链(例如，第一模板链)中的互补核苷酸序列以及与模板链互补的链(例如，第二个模板链)形成基本稳定的杂交体。在一些实施方案中，由于此类杂交体中氢键数目的增加(在一些实施方案中为两倍)，与使用具有未经修饰的碱基的引物形成的杂交体相比，用本发明的引物形成的杂交体更稳定。
根据公认的惯例，天然存在的核酸的核苷酸的名称为A、U、G和C(RNA)以及dA、dT、dG和dC(DNA)。下文描述适用于核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，因此，除非上下文另有要求，否则在本说明书中无需在A和dA、U和dT等之间进行区分。
将在碱基部分中修饰以与T(或在RNA的情况下为U)而不与修饰的T形成稳定的氢键键合对的A的类似物，称为A*。将在碱基部分中修饰以与A而不与A*形成稳定的氢键键合对的T的类似物称为T*。将在碱基部分中修饰以与C而不与修饰的C形成稳定的氢键键合对的G的类似物称为G*。将在碱基部分中修饰以与G而不与G*形成稳定的氢键键合对的C的类似物称为C*。在一些实施方案中，当A*、T*、G*和C*核苷酸(统称，修饰的核苷酸)中的每一个与它们的天然配对体形成两个或多个氢键，但与它们的修饰的配对体仅形成一个氢键或不形成氢键时，满足前述条件。这由下文的式1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a和4b(以及在图8A-8B中)举例说明，其中举例说明了天然A-T(在RNA的情况中，则为A-U)和G-C对之间的氢键键合，以及示例性的A*-T、T*-A、G*-C、C*-G、A*-T*和G*-C*对之间的氢键键合。
通常，与引物-至-引物退火相比，将足够数量的修饰的核苷酸掺入本文所述的引物中以优先增加引物向靶核酸的模板链的退火。为实现这一点，不必用修饰的核苷酸替换引物的每个天然核苷酸。在一些实施方案中，除了一个或多个修饰的核苷酸外，引物还包括一个或多个天然存在的核苷酸和/或天然存在的核苷酸的变体，条件是所述变化不显著干扰引物的互补结合能力，如上文所讨论。例如，包括修饰的核苷酸的引物可以包括除核糖或2-脱氧核糖之外的戊呋喃糖部分，以及核糖和2-脱氧核糖的衍生物，例如3-氨基-2-脱氧核糖、2-氟-2-脱氧核糖，以及2-O-C
下文的式5、6和7提供了合适种类的修饰的A类似物A*的一般结构，显示为掺入引物中的3'-磷酸酯(或硫代磷酸酯)，其中：
X是N或CH；
Y是O或S；
Z是OH或CH
R是H、F或OR
R
式8提供了合适种类的修饰的T类似物T*的一般结构，显示为掺入引物中的3'-磷酸酯(或硫代磷酸酯)，其中：
Y、Z和R如上定义；且
R
如果适用，后一个核苷酸可以缩写为2-sT或d2-sT。
式9、10和11提供了合适种类的修饰的G类似物G*的一般结构，显示为掺入引物中的3'-磷酸酯(或硫代磷酸酯)，其中：
R
X、Y、Z和R如上定义。G*的示例性实施方案具有6-氧代-嘌呤(次黄嘌呤)作为碱基，如式3b所示。如果适用，后一个核苷酸可以缩写为I或dI。
式12和13提供了合适种类的修饰的C类似物C*的一般结构，显示为掺入引物中的3'-磷酸酯(或硫代磷酸酯)，其中：
Y、Z、R和R
Z
R
上述修饰的碱基和核苷酸也记载于美国专利No.5,912,340(1999年6月15日授权给Kutyavin等人)中，其描述通过引用的方式纳入本文。d2-amA和d2-sT的杂交特性记载于Kutyavin et al.(1996)Biochemistry 35:11170-76中，其描述通过引用的方式纳入本文。dI和dP的合成和杂交特性记载于Woo et al.(1996)Nucleic Acids Research 25(13):2470-75中，其描述通过引用的方式纳入本文。
G*和C*的其他实例分别包括7-烷基-7-脱氮鸟嘌呤和N
G*和C*的其他实例分别包括7-硝基-7-脱氮次黄嘌呤(NitrocH)和2-硫代胞嘧啶(sC)，其记载于Lahoud et al.(2008)Nucleic Acids Research 36(22):6999-7008(其描述通过引用的方式纳入本文)。Hoshinka et al.(2010)Angew Chem Int Ed Engl.49(32):5554-5557记载了使用这样的碱基(“Self-Avoiding Molecular Recognition Systems”)，其包括2’-次黄嘌呤作为G*(该参考文献的描述通过引用的方式纳入本文；尤其参见图1)；另请参见Yang et al.(2015)Chembiochem.16(9):1365-1367(该参考文献的描述通过引用的方式纳入本文；尤其参见方案1)。这项研究中测试的类似物示于式13中。
公开的方法使用聚合酶进行扩增。在一些实施方案中，聚合酶是缺少5’至3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶。在这样的条件下使用所述聚合酶以使得从第一引物延伸的链可通过从第二引物延伸的正在形成的链的聚合而被置换，所述第二引物相对于第一引物是在“外”。方便地，聚合酶能够置换与模板链互补的链，该特性被称为“链置换”。链置换导致每个模板分子合成多拷贝的靶序列。在一些实施方案中，用于公开的方法中的DNA聚合酶是高度推进性的(processive)。示例性的DNA聚合酶包括缺少5’至3’外切核酸酶活性的Taq DNA聚合酶的变体，例如Taq DNA聚合酶的Stoffel片段(ABI)、SD聚合酶(Bioron)、USPN5474920中所述的缺少5’至3’外切核酸酶活性的突变Taq、Bca聚合酶(Takara)、Pfx50聚合酶(Invitrogen)、Tfu DNA聚合酶(Qbiogene)。如果将进行热循环(如在PCR中)，则DNA聚合酶优选地为热稳定的DNA聚合酶。下表2列出了可获自新英格兰生物实验室(New EnglandBiolabs)的聚合酶，其不具有5’至3’外切核酸酶活性，但是具有伴随热稳定性的链置换活性。
在一些实施方案中，使用两种或多种聚合酶的共混物(blend)可能是有利的。例如，示例性的聚合酶共混物包括特别擅长从部分双链DNA引物开始延伸的聚合酶和特别擅长链置换合成的聚合酶，因为在一些实施方案中将这些特性结合可以提供净优势。替代地或另外地，在需要使用Taqman型探针进行本发明人的实时PCR的情况下，聚合酶混合物可以包括具有5’至3’核酸外切酶活性的聚合酶，只要设计引物结构使得其不易受“瓣状(flap)”核酸内切酶活性的影响；实际上，由于所述“瓣状”的双链性质，本文所述的结构可能固有地不易受到该活性的影响。Taq DNA聚合酶可以例如用于这样的聚合酶共混物，尽管Taq DNA聚合酶被描述为包括5’至3’核酸外切酶活性，但Taq DNA聚合酶起作用的方式更像瓣状核酸内切酶。
表2—缺少5’至3’外切核酸酶活性的热稳定的链置换聚合酶
在一些实施方案中，DNA聚合酶包含Taq聚合酶和拓扑异构酶的一部分之间的融合物，例如TOPOTAQ
例如，对于SD聚合酶，示例性聚合酶浓度范围为每个反应约20至200单位。在各种实施方案中，聚合酶浓度可以至少为：每个反应10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200或更多单位。在一些实施方案中，聚合酶浓度落入任意这些值所限定的范围内，例如，每个反应10-200、10-150、10-100、10-50、20-150、20-100、20-50、50-200、50-150、50-100、100-200、100-150等单位。当使用聚合酶共混物时，总的聚合酶的总浓度可以是任意这些值或落入任意这些范围中。
也可通过使用链置换因子(例如解旋酶)来促进链置换。在存在链置换因子的情况下能够进行链置换的任何DNA聚合酶适用于所公开的方法，即使DNA聚合酶在不存在这样的因子的情况下不进行链置换。适用于本文所述方法的链置换因子包括BMRF1聚合酶辅助亚基(Tsurumi et al.,J.Virology 67(12):7648-7653(1993))、腺病毒DNA结合蛋白(Zijderveld and van der Vliet,J.Virology 68(2):1158-1164(1994))、单纯疱疹病毒蛋白ICP8(Boehmer and Lehman,J.Virology 67(2):711-715(1993)；Skaliter andLehman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(22):10665-10669(1994))、单链DNA结合蛋白(SSB；Rigler and Romano,J.Biol.Chem.270:8910-8919(1995))和小牛胸腺解旋酶(Siegel etal.,J.Biol.Chem.267:13629-13635(1992))。解旋酶和SSB的热稳定形式是可获得的，因此适用于PCR。
使上述引物组与样品核酸在这样的条件下接触：其中引物退火到它们的模板链(如果存在)。使用能够在所采用的反应条件下进行链置换的缺少5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶来进行所需的核酸扩增方法。该扩增产生扩增子，所述扩增子包含扩增反应中所用的全部引物的序列。可将引物组以单独的寡核苷酸的形式方便地添加到扩增混合物中。例如，双引物组可由三种寡核苷酸组成(假定内引物不包含发夹结构)，三引物组可由五种寡核苷酸组成(假定内引物和中间引物都不包含发夹结构)。
对于如上所述使用双引物组的半巢式扩增，在PCR的指数期中可实现至少3
下表3示出了使用本文所述的不同实施方案来扩增单拷贝核酸至10
对于如上所述使用三引物组的半巢式扩增，在PCR的指数期中可实现至少4
对于如上所述使用三引物组的完全巢式扩增，在PCR的指数期中可实现至少8
在一些实施方案中，使用PCR来进行扩增步骤。对于运行实时PCR反应，反应混合物通常包含适合的缓冲液、范围约1至约10mM(例如范围约2至约8mM)的镁离子(Mg
在本文所述方法中可使用任何适合的标记策略。当分析反应中单一扩增产物的存在情况时，可在扩增混合物中使用通用检测探针。在特定的实施方案中，可使用通用qPCR探针来进行实时PCR检测。适合的通用qPCR探针包括双链DNA结合染料，例如SYBR绿、Pico绿(Molecular Probes,Inc.,Eugene,OR)、Eva绿(Biotinum)、溴化乙锭等(参见Zhu et al.,1994,Anal.Chem.66:1941-48)。
在一些实施方案中，在扩增混合物中使用一个或多个靶特异性qPCR探针(即对待检测的靶核苷酸序列具有特异性)以检测扩增产物。通过谨慎地选择标记物，可进行分析，其中在单一反应中不同的标记物在不同波长下被激发和/或被检测(“多重检测”)。参见例如Fluorescence Spectroscopy(Pesce et al.,Eds.)Marcel Dekker,New York,(1971)；White et al.,Fluorescence Analysis:A Practical Approach,Marcel Dekker,NewYork,(1970)；Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2nd ed.,Academic Press,New York,(1971)；Griffiths,Colour and Constitution ofOrganic Molecules,Academic Press,New York,(1976)；Indicators(Bishop,Ed.).Pergamon Press,Oxford,19723；和Haugland,Handbook of Fluorescent Probes andResearch Chemicals,Molecular Probes,Eugene(1992)；以及Linck et al.(2017)“Amultiplex TaqMan qPCR assay for sensitive and rapid detection of phytoplasmasinfecting Rubus species,”PLOS One 12(5)。
在一些实施方案中，在扩增混合物中使用的一种或多种引物上包含标记物可能是方便的。
在一些实施方案中，使用自动样品处理和/或分析平台来检测靶核酸。在一些实施方案中，利用市售可得的自动分析平台。例如，在一些实施方案中，利用
举例说明本文所述的方法用于GeneXpert系统。示例性的样品制备和分析方法如下文所述。然而，本发明不限于特定的检测方法或分析平台。本领域技术人员了解，可利用任何数量的平台和方法。
所述筒的部件包括但不限于包含试剂的处理室、过滤器和可用于提取、纯化和扩增靶核酸的捕获技术。阀门使得流体从一个室转移到另一个室，并包含核酸裂解和过滤部件。光学窗口使得能够进行实时光学检测。反应管使得能够进行非常快的热循环。
在一些实施方案中，
在将样品添加到筒之后，样品与裂解缓冲液接触，释放的核酸结合至核酸-结合基质(substrate)(例如二氧化硅或玻璃基质)。然后除去样品上清液并在洗脱缓冲液(例如Tris/EDTA缓冲液)中洗脱核酸。然后可在筒中处理洗脱物以检测本文所述的靶基因。在一些实施方案中，洗脱物用于使至少一些试剂复原，所述试剂作为冻干颗粒存在于筒中。
在一些实施方案中，PCR用于扩增并检测一种或多种靶核酸的存在。在一些实施方案中，PCR使用具有热启动功能的Taq聚合酶，例如AptaTaq(Roche)。
在一些实施方案中，脱机(off-line)离心用于改善使用具有低细胞含量的样品的测定结果。将添加或不添加缓冲液的样品离心并除去上清液。然后将沉淀物重新悬浮于更小体积的上清液、缓冲液或其他液体中。然后将重新悬浮的沉淀物添加到之前所述的
还考虑到用于进行本文所述的方法的试剂盒。这样的试剂盒包括一种或多种可用于实施任意这些方法的试剂。试剂盒通常包括具有一种或多种盛放试剂的容器的包装，所述试剂为一种或多种分开的组合物，或任选地在试剂相容性允许的情况下为混合物。所述试剂盒也可包括从使用者角度而言需要的其他材料，例如缓冲液、稀释剂、标准品和/或可用于样品处理、清洗或进行测定的任何其他步骤的任何其他材料。
试剂盒优选地包括实施一种或多种本文所述的筛选方法的说明书。试剂盒中包含的说明书可附于包装材料上或可作为包装插入物包括在内。尽管说明书通常为书面或印刷材料，但不限于此。任何能够存储这样的说明书并将其传播到终端使用者的介质都能够被采用。这样的介质包括但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、卡带、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。本文使用的术语“说明书”可包括提供说明书的互联网地址。
进行实验，其中测量在存在和不存在“夹持”寡核苷酸的情况下的引物寡核苷酸(尽管被称为“引物”，它在本实验中并非如此使用)以及互补靶序列的Tm。合成的靶寡核苷酸具有5’荧光标签(荧光素)，并且引物中掺入荧光猝灭部分(参见图6)。红色表明存在2’O-甲基骨架。所测试的寡核苷酸序列列于下表4。图6的结构中所示的最右侧双螺旋区的Tm是通过追踪荧光的增加来测量，所述荧光的增加是随着温度升高以及通过该双螺旋区解链分开荧光团(fluorophor)和猝灭剂而导致。
如果，如图6A所示，引物的靶标结合区域被所述夹子(clamp)限于b/b’结合，则预测该区域的T
表4——使用的寡核苷酸
A*＝2,6-二氨基嘌呤，U01＝dabcyl淬灭剂标记的尿嘧啶，小写字母为2’-O-甲基核苷酸。寡核苷酸16142被阻断以防止延伸。
表5——T
所有杂交体解链分析的条件为：0.01M tris-HCl、0.05M KCl和0.006M MgCl
使用软件(www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer)预测b/b’和ab/a’b’的T
如图7A所图解的，也以1μM存在的侧翼引物(16147至16149)在测量的T
在表6中所示的条件下，在PCR反应中测试图7A中示意性地示出的外(侧翼)引物的可延伸性。
表6
所有的反应包含10mM Tris-HCl；dATP、dTTP、dCTP和dGTP各0.125mM；0.15μM来自上表5的引物寡核苷酸16140；0.125μM来自表1的靶寡核苷酸16145；0.125μM来自表1的夹持寡核苷酸16142；45mM KCl；3.5mM MgCl
按照上表6添加0.125mM或不添加侧翼引物；使用SmartCycler随时间监测反应，将温度升至95℃以分开寡核苷酸，同时激活聚合酶，然后降低温度至60℃以允许寡核苷酸退火并允许任何引物延伸发生。结果示于图7B。三条上升迹线是具有略微不同的夹子的单独的反应；水平迹线没有外(侧翼)置换引物存在。这些结果表明，当存在外(侧翼)引物时，发生置换猝灭剂的链置换反应。
实施例3：使用修饰的引物产生具有令人满意的延伸时间的基数-3扩增
如本实施例举例说明的，通过包括修饰的碱基，可以进一步缩短每个扩增循环中的引物延伸时间。
图10A和10B比较了修饰的测试引物组(“8系列”)与未修饰的测试引物组(“6系列”)的实时PCR生长曲线。使用对数y轴刻度将荧光(y轴)相对于PCR循环数作图。所有寡核苷酸序列均可在下表7中找到，其也示出了修饰的核苷酸2,6-二氨基嘌呤和2-硫代胸腺嘧啶的位置。
表7
A*＝2,6-二氨基嘌呤，C01＝5-甲基胞嘧啶，小写字母为2’-O-甲基核苷酸。夹子b’c’6为3’-阻断的以防止延伸。夹子b’c’8也可以为3’-阻断的以防止延伸。
所有PCR使用相同的正向f1引物(SEQ ID NO:1)，其被包括在主混合物中。EvaGreen染料(Biotium)是一种绿色荧光核酸嵌入染料，用于实时PCR。使用每种引物的终浓度为0.4μM，并添加了模板的1.25E+.07拷贝(SEQ ID NO:9)、69个核苷酸的合成的寡核苷酸或水对照(NTC或“无模板对照”条件)。使用链置换(SD)聚合酶(Bioron)，其是一种提供强置换活性的热稳定的聚合酶。在所有PCR中通用的试剂的PCR主混合溶液包括20单位SD聚合酶、1x SD聚合酶缓冲液、1x Evagreen染料、5mM MgCl
在图10A中，“cba8”和“b8”反应用作“双引物”，对照条件由正向引物f1加上反向引物cba8(SEQ ID NO:3)组成，与b’c’8(SEQ ID NO:4)“夹持”寡核苷酸或反向引物b8(SEQ IDNO:8)一起使用。“8测试”结合了所有三种引物，“8测试NTC”用作测试条件的无模板对照。在荧光阈值为50时，三引物测试条件导致最早的Ct为7.7，比二引物的对照条件提前了约5个循环。在荧光阈值或接近荧光阈值时，对于“8测试”PCR可以看到荧光水平超过两倍，而就两个引物对照PCR而言则不超过两倍。
在图10B中，反应“cba6”，其包括引物cba6(SEQ ID NO:3)和寡核苷酸b’c’6(SEQID NO:5)，“b6”，其包括引物b6(SEQ ID NO:7)，“6测试”和“6测试NTC”(包括cba6、b’c’6和b6)分别类似于图9A的“cba8”、“b8”、“8测试”和“8测试NTC”，不同之处在于任何寡核苷酸中都不存在修饰的核苷酸2,6-二氨基嘌呤和2-硫代胸腺嘧啶。
在这些引物中使用修饰的碱基在每个循环中产生三倍生长，每个循环的延伸时间少于60秒。
图11A示出了实时PCR荧光生长曲线，所述曲线通过由减少的模板DNA分子的数量开始的基数-6(每个循环约6个重复)的PCR扩增产生。化脓链球菌(S.pyogenes)基因组DNA的Log 10稀释用作DNA模板输入。图11B示出了达到荧光阈值水平所需的扩增循环数(Ct)相对于起始DNA模板分子数目的log 10绘制的图。所有寡核苷酸序列可在表8中找到。
表8
该实验中用于所有反应的试剂的PCR主混合物溶液包括80单位链置换(SD)聚合酶、1x SD聚合酶缓冲液、1x Evagreen荧光染料、5mM MgCl
化脓链球菌基因组DNA(ATCC 12433D-5)用水稀释至1.27E7拷贝/μL、1.27E6拷贝/μL、1.27E5拷贝/μL、1.27E4拷贝/μL和1.27E3拷贝/μL。将1μL的每种稀释的模板溶液加入到PCR主混合物溶液中，并加水至25μL的总体积。这导致5个模板反应下降了10倍，从1.27E7拷贝到1270拷贝，并且没有模板对照反应。所有反应均在冰上准备，然后置于CepheidSmartCycler实时PCR仪中进行2-温度热循环仪实验方案：92℃下1秒，62℃下30秒，25个循环。
图11A示出为了减少的模板量，通过荧光阈值(虚线)所需的循环数增加。在存在荧光、dsDNA结合染料、Evagreen的情况下，双链DNA扩增子的量增加会导致该增加的荧光。图1B绘制了循环数(Ct)相对于模板的起始拷贝数的log 10的图。这条线的负斜率的倒数约为每log 10稀释约1.3个循环，这与每个周期约6倍复制一致。在标准的基数-2 PCR中，每log10稀释约有3.3个循环。
机译： 嵌套式重叠重叠因子，使指数基数3的核酸扩增时间减少
机译： 使用嵌套重叠引物降低扩增时间的指数碱基-3核酸扩增
机译： 制备引物的方法和使用所述引物的核酸指数扩增方法
