基于pH梯度SPR的结合测定

摘要

本文报道了一种用于确定抗体与其抗原在解离pH值的解离速率常数kd的方法，其中所述方法包括以下步骤：在第一pH值将所述抗体固定在已经缀合有所述抗体的所述抗原的固相上；施加从所述第一pH值到所述解离pH值的pH梯度，然后将pH值维持在所述解离pH值；以及在维持所述pH值期间记录结合信号，并由此计算所述抗体与其抗原在所述解离pH值的解离速率常数kd。

说明书

技术领域

本发明属于功能测定领域。本文报道了一种新颖的基于SPR的结合测定，用于测量抗体的pH依赖性相互作用。

背景技术

SPR(表面等离子体共振)是一种基于生物传感器的技术，以测量实时蛋白质-蛋白质相互作用。SPR技术已成为生物制药研究和开发中的标准工具[1-5]，并且通常用于确定大分子相互作用的结合常数。确定分子相互作用的缔合和解离动力学的能力提供了对复合物形成机理的详细见解[6]。该信息正成为单克隆抗体和其他生物制药产品选择和优化过程的重要组成部分[7-10]。此外，SPR技术允许确定例如抗体结合靶标的结合活性(结合能力)。

单一抗体分子的抗原中和能力取决于其亲和力。通过提高亲和力，可以用较少量的抗体中和抗原。可以使用多种方法来提高抗体亲和力。此外，如果通过将抗体与抗原共价结合可以使亲和力无限大，则单一抗体分子可以中和一个抗原分子(二价抗体可以中和两个抗原分子)。然而，由于一个抗体对一个抗原(一个二价抗体对两个抗原)的化学计量中和，不可能用比抗原量少的抗体量来完全中和抗原。为了将中和抗体的中和作用延长一定时间段，抗体的施用剂量必须高于同一时间段期间体内产生的抗原量。仅凭借抗体药代动力学或亲和力成熟技术的改进，所需抗体剂量的减少是有限的。

因此，为了以比抗原量少的抗体量在目标时间段内维持抗体的抗原中和作用，单一抗体必须中和多个抗原。

Shank-Retzlaff,M.L.和Sligar,S.G.公开了分析物梯度-表面等离子体共振作为确定动力学速率和大分子结合亲和力的一步法(Anal.Chem.72(2000)4212-4220)。

US 2005/0019933公开了表征液体环境中两种物质之间的相互作用的方法，其中包含所述至少一种物质的液体作为流而经过测量系统，并且其中相互作用发生在所述测量系统内。该方法包括产生至少一种所述物质或至少一种对相互作用或相互作用的组分具有影响的其他物质的浓度梯度。

Schasfoort,R.B.M.等人在表面等离子体共振手册(2008年12月31日(2008-12-31)，第354-394页，剑桥)中公开了SPR技术的未来趋势。

US 2010/256338公开了包含全长抗体和单链Fab片段的多特异性抗体、尤其是双特异性抗体，它们的制备方法，含有这些抗体的药物组合物及其用途。

WO 2012/023053公开了对免疫球蛋白分子的每个结合位点具有不同特异性的新型双特异性单克隆抗体和制备对免疫球蛋白分子的每个结合位点具有不同特异性的新型双特异性单克隆抗体的方法。

Schlothauer,T.等人公开了用于单克隆抗体功能表征的分析FcRn亲和色谱法(mAbs 5(2013)576-586)。

WO 2015/140126公开了用于使用FcRn亲和色谱柱在不同盐浓度的存在下以正线性pH梯度洗脱来确定抗体-Fc-FcRn复合物中影响体内半衰期的抗体-Fab-FcRn相互作用的存在的方法。

WO 2015/172800公开了新型多特异性分子和基于此类多特异性分子的新型治疗方法。

Meschendoerfer,W.等人公开了能够进行双特异性分子的全功能分析的基于SPR的测定(J.Pharm.Biomed.Anal.132(2016)141-147)。

EP 2 275 443公开了用于改善抗原结合分子的药代动力学的方法和用于增加抗原结合分子的抗原结合次数的方法，以及具有改善的药代动力学的抗原结合分子、具有增加的抗原结合次数的抗原结合分子和用于制备此类分子的方法。

发明内容

本文报道了一种新颖的基于SPR的测定，用于测量抗体的pH依赖性结合活性。

如本文所报道的一个方面是一种用于确定(单克隆)抗体与其抗原的结合是否为pH依赖性(即抗体具有pH依赖性抗原结合)的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，

b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗体与固相的解离，

其中如果在步骤b)中可以检测到抗体与固相的解离，则抗体与其抗原的结合是pH依赖性的。

示出pH依赖性解离的示例性SPR传感图在图2中示出。

如本文所报道的一个方面是一种用于选择与其抗原pH依赖性结合的(单克隆)抗体(即抗体具有pH依赖性抗原结合)的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，

b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗体与固相的解离，

其中如果在步骤b)中可以检测到抗体与固相的解离，则选择该抗体。

如本文所报道的一个方面是一种用于确定与其抗原pH依赖性结合的抗体与其抗原解离(pH依赖性解离)的pH值的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，

b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗体与固相的解离，

其中抗体与其抗原解离的pH值是可以在步骤b)中检测到抗体与固相解离的pH梯度的pH值。

本文所报道的一个方面是一种用于确定抗体与其抗原的解离速率常数k

a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，

b)对固相施加从第一pH值到解离pH值的pH梯度，然后将pH值维持在解离pH值，

c)记录(结合)信号并由此计算解离速率常数k

示出在解离pH值解离的示例性SPR传感图在图3中示出。

如本文所报道的一个方面是一种用于确定抗体寡聚化对(单克隆)抗体与其抗原的pH依赖性结合的影响的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值将单体抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，

b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，监测抗体与固相的解离，并因此计算解离速率，

c)用二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗体重复步骤a)至b)，

其中如果步骤b)中计算的解离速率对于单体抗体和二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗体相差超过10％，则抗体与其抗原的pH依赖性结合受寡聚化影响。

如本文所报道的一个方面是一种用于确定抗原寡聚化对(单克隆)抗体与其抗原的pH依赖性结合的影响的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的单体抗原的固相上，即通过抗体与其抗原的相互作用进行捕获/固定，

b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，监测抗体与固相的解离，并因此计算解离速率，

c)用固定在固相上的二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗原重复步骤a)至b)，

其中如果步骤b)中计算的解离速率对于单体抗原和二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗原相差超过10％，则抗体与其抗原的pH依赖性结合受寡聚化影响。

如本文所报道的一个方面是一种用于从结合相同抗原的抗体混合物中分离或离析低pH结合(单克隆)抗体的方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值将抗体混合物施加到已缀合有抗体混合物的抗原的固相上，即通过与其抗原相互作用来捕获/固定抗体，

b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并任选地监测抗体与固相的解离，

c)收集在低pH值解离的抗体，

从而从结合相同抗原的抗体混合物中分离或离析低pH结合(单克隆)抗体。

在一个实施例中，低pH值为pH 6.5或更低。在一个实施例中，低pH值为pH 6.0或更低。在一个实施例中，低pH值为pH 5.5或更低。

下面介绍前面概述的方面的实施例。应当理解，还公开了实施例彼此的所有可能的组合。

在一个实施例中，步骤b)中的条件除pH值之外都保持恒定。

在一个实施例中，该方法是表面等离子体共振方法。

在一个实施例中，解离由表面等离子体共振确定。

在一个实施例中，固相是表面等离子体共振芯片。

在一个实施例中，抗原以高密度固定。

在一个实施例中，固相是表面等离子体共振芯片，解离由表面等离子体共振确定，并且抗原至少以/用500RU固定到表面等离子体共振芯片。在一个优选的实施例中，抗原以/用500-4000RU固定。

在一个实施例中，抗体与固相的结合是强烈的结合。

在一个实施例中，第一pH值为pH 7.4或更高，第二pH值为pH 5.5或更低，或反之亦然。

在一个实施例中，如果抗原不是单体的，则抗体是单体的，反之亦然。

在一个实施例中，抗体对于其抗原是二价的。

在一个实施例中，解离发生在结合信号变化5％或更多时。在一个实施例中，解离发生在结合信号变化10％或更多时。

在一个实施例中，抗原是可溶性抗原。

在一个实施例中，抗体是单特异性抗体。

在一个实施例中，抗体是双特异性抗体。

在一个实施例中，抗体是双特异性抗体，该双特异性抗体具有与抗原上的第一表位特异性结合的第一结合位点和与抗原上的第二表位特异性结合的第二结合位点。

在一个实施例中，通过以2.5至30μL/min的流速、在一个优选的实施例中以2.5至10μL/min的流速并且以0.6μg/mL至30μg/mL的浓度注射抗体45至720秒来进行捕获。在一个优选的实施例中，通过以约5μL/min的流速并且以0.6μg/mL至10μg/mL的浓度注射抗体约60秒来进行捕获。

在一个实施例中，pH梯度持续100至10,000秒。在一个实施例中，pH梯度持续1000至5000秒。在一个实施例中，pH梯度持续2000-2300秒。

在一个实施例中，解离pH值在第一步中使用根据本发明的方法确定。

在一个实施例中，解离pH值维持100至10,000秒。在一个实施例中，解离pH值维持150至1,000秒。

如本文所报道的一个方面是一种用于确定(单克隆)抗体与其抗原的结合是否为pH依赖性(pH依赖性抗原结合)的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值，使用与抗体的恒定结构域特异性结合的捕获试剂将抗体捕获/固定在固相上，

b)将捕获的抗体与其抗原一起孵育/将其抗原施加到捕获的抗体上以形成捕获的抗体-抗原复合物，直到获得稳定/恒定的结合信号，

c)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗原与抗体的解离，

其中如果在步骤c)中可以检测到抗原与抗体的解离，则抗体与其抗原的结合是pH依赖性的。

如本文所报道的一个方面是一种用于选择与其抗原pH依赖性结合的(单克隆)抗体(具有pH依赖性抗原结合)的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值，使用与抗体的恒定结构域特异性结合的捕获试剂将抗体捕获/固定在固相上，

b)将捕获的抗体与其抗原一起孵育/将其抗原施加到捕获的抗体上以形成捕获的抗体-抗原复合物，直到获得稳定/恒定的结合信号，

c)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗原与抗体的解离，

其中如果在步骤c)中可以检测到抗原与抗体的解离，则选择该抗体。

如本文所报道的一个方面是一种用于确定与其抗原pH依赖性结合的抗体与其抗原解离(pH依赖性解离)的pH值的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值，使用与抗体的恒定结构域特异性结合的捕获试剂将抗体捕获/固定在固相上，

b)将捕获的抗体与其抗原一起孵育/将其抗原施加到捕获的抗体上以形成捕获的抗体-抗原复合物，直到获得稳定/恒定的结合信号，

c)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗原与抗体的解离，

其中抗原与抗体解离的pH值是可以在步骤c)中检测到抗原与抗体解离的pH梯度的pH值。

本文所报道的一个方面是一种用于确定抗体与其抗原的解离速率常数k

a)在第一pH值，使用与抗体的恒定结构域特异性结合的捕获试剂将抗体捕获/固定在固相上，

b)将捕获的抗体与其抗原一起孵育/将其抗原施加到捕获的抗体上以形成捕获的抗体-抗原复合物，直到获得稳定/恒定的结合信号，

c)对固相施加从第一pH值到解离pH值的pH梯度，然后将pH值维持在解离pH值，

d)记录结合信号并由此计算解离速率常数k

如本文所报道的一个方面是一种用于确定抗体寡聚化对(单克隆)抗体与其抗原的pH依赖性结合的影响的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值，使用与抗体的恒定结构域特异性结合的捕获试剂将单体抗体捕获/固定在固相上，

b)将捕获的抗体与其抗原一起孵育/将其抗原施加到捕获的抗体上以形成捕获的抗体-抗原复合物，直到获得稳定/恒定的结合信号，

c)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，监测抗原与抗体的解离，并因此计算解离速率，

d)用二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗体重复步骤a)至c)，

其中如果步骤c)中计算的解离速率对于单体抗体和二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗体相差超过10％，则抗体与其抗原的pH依赖性结合受寡聚化影响。

如本文所报道的一个方面是一种用于确定抗原寡聚化对(单克隆)抗体与其抗原的pH依赖性结合的影响的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值，使用与抗体的恒定结构域特异性结合的捕获试剂将抗体捕获/固定在固相上，

b)将捕获的抗体与其单体抗原一起孵育/将其单体抗原施加到捕获的抗体上以形成捕获的抗体-抗原复合物，直到获得稳定/恒定的结合信号，

c)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，监测抗原与抗体的解离，并因此计算解离速率，

d)用二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗原重复步骤a)至c)，

其中如果步骤c)中计算的解离速率对于单体抗原和二聚体、三聚体、四聚体和/或寡聚体抗原相差超过10％，则抗体与其抗原的pH依赖性结合受寡聚化影响。

下面介绍前面概述的方面的实施例。应当理解，还公开了实施例彼此的所有可能的组合。

在一个实施例中，除pH值之外的所有条件在步骤c)中保持恒定。

在一个实施例中，解离由表面等离子体共振确定。

在一个实施例中，固相是表面等离子体共振芯片。

在一个实施例中，抗体以高密度固定。

在一个实施例中，固相是表面等离子体共振芯片，解离由表面等离子体共振确定，并且抗体至少以50RU固定到表面等离子体共振芯片。在一个优选的实施例中，抗体以/用50-400RU固定。

在一个实施例中，第一pH值为pH 7.4或更高，第二pH值为pH 5.5或更低，或反之亦然。

在一个实施例中，如果抗原不是单体的，则抗体是单体的，反之亦然。

在一个实施例中，抗体对于其抗原是二价的。

在一个实施例中，解离发生在结合信号变化5％或更多时。在一个实施例中，解离发生在结合信号变化10％或更多时。

在一个实施例中，抗原是可溶性抗原。

在一个实施例中，抗体是单特异性抗体。

在一个实施例中，抗体是双特异性抗体。

在一个实施例中，抗体是双特异性抗体，该双特异性抗体具有与抗原上的第一表位特异性结合的第一结合位点和与抗原上的第二表位特异性结合的第二结合位点。

在一个实施例中，通过以2.5至30μL/min的流速、在一个优选的实施例中以2.5至10μL/min的流速并且以0.6μg/mL至30μg/mL的浓度注射抗体45至720秒来进行捕获。在一个优选的实施例中，通过以约5μL/min的流速并且以0.6μg/mL至10μg/mL的浓度注射抗体约60秒来进行捕获。

在一个实施例中，pH梯度持续100至10,000秒。在一个实施例中，pH梯度持续1000至5000秒。在一个实施例中，pH梯度持续2000-2300秒。

在一个实施例中，解离pH值在第一步中使用根据本发明的方法确定。

在一个实施例中，解离pH值维持100至10,000秒。在一个实施例中，解离pH值维持150至1,000秒。

附图说明

图1经典SPR-BIAcore动力学实验方案，其中对一次测量仅应用一种恒定缓冲液条件。

图2根据本发明的方法，用pH 7.4至pH 4.9的pH梯度，从固体表面解离pH依赖性抗体的示例性传感图。

图3用于确定在解离pH值的解离速率常数的示例性传感图。

具体实施方式

术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10％范围。在一个实施例中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5％范围。

本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体、三特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。

抗体通常包含两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。重链多肽和轻链多肽中的每一者都含有可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基末端部分)，该可变结构域包含能够与抗原相互作用的结合区。重链多肽和轻链多肽中的每一者都包含恒定区(通常是羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体i)与携带Fcγ受体(FcγR)的细胞(诸如吞噬细胞)或ii)与携带新生儿Fc受体(FcRn)(也称为Brambell受体)的细胞的结合。它还介导与一些因子的结合，这些因子包括经典补体系统的因子，诸如组分(C1q)。抗体重链的恒定结构域包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，而轻链仅包含一个恒定结构域CL，它可以是κ同种型或λ同种型。

免疫球蛋白轻链或重链的可变结构域又包含不同的区段，即四个框架区(FR)和三个高变区(HVR)。

抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG

术语“与...结合”表示结合位点与其靶标的结合，例如包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域(VH/VL对)的抗体结合位点与相应抗原的结合。这种结合可以使用例如

例如，在

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式呈递)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。

如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：抗体可变结构域的在序列中高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：

(a)存在于氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)存在于氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处的CDR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；

(c)存在于氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及

(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。

除非另有说明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如FR残基)在本文中根据Kabat等人编号。

如在本申请中所用的术语“价”表示(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。因此，术语“二价”“四价”和“六价”分别表示(抗体)分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。如本文所报道的双特异性抗体是“二价”的一个优选实施例。

在某些实施例中，抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施例中，结合特异性中的一个针对第一抗原，而另一个针对不同的第二抗原。在某些实施例中，多特异性抗体可以与同一抗原的两个不同的表位结合。多特异性抗体也可用于将细胞毒性剂定位于表达该抗原的细胞。多特异性抗体可以制备为全长抗体或抗体片段。

用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein,C.和Cuello,A.C.,Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829，以及Traunecker,A.等人,EMBO J.10(1991)3655-3659)和“杵臼结构”工程化(参见例如US 5,731,168)。多特异性抗体也可以通过如下方法来制备：工程化静电操纵效应以制备抗体Fc-异二聚体分子(WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如US 4,676,980，以及Brennan,M.等人,Science 229(1985)81-83)；使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体(参见例如Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553)；使用“双抗体”技术制备双特异性抗体片段(参见例如Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(1993)6444-6448)；使用单链Fv(scFv)二聚体(Gruber,M.等人,J.Immunol.152(1994)5368-5374)；以及如Tutt,A.等人,J.Immunol.147(1991)60-69中所述制备三特异性抗体。

抗体或片段也可以是多特异性抗体，如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO2010/145792或WO 2010/145793中所述。

其抗体或片段也可以是如WO 2012/163520中公开的多特异性抗体。

新型生物治疗药物诸如抗体的日益增加的复杂性对功能表征提出了新的挑战。如果必须表征显示与其相应抗原的pH依赖性结合的抗体，则尤其如此。

例如在EP 2 275 443中报道了具有pH依赖性抗原结合的示例性抗体及其产生。原则上，pH依赖性抗原结合可以引入任何抗体中。通过将pH依赖性抗原结合引入抗体中，可以将单一抗原结合抗体转化为能够与多个抗原分子结合的重复抗原结合抗体。当抗体与多个抗原分子结合时，这种抗体比普通的抗原结合分子发挥更优越的体内效果。

与在pH 7.4的抗原结合活性相比削弱抗体在pH 5.8的抗原结合活性的方法(赋予pH依赖性结合能力的方法)没有特别限制并且可以是任何方法。此类方法包括例如通过用组氨酸取代抗体中的其他氨基酸或将组氨酸插入抗体中，与在pH 7.4的抗原结合活性相比削弱在pH 5.8的抗原结合活性的方法。已经知道，通过用组氨酸取代抗体中的氨基酸可以赋予抗体以pH依赖性抗原结合活性(FEBS Letter,309(1),8588(1992))。这种组氨酸突变(取代)或插入位点没有特别限制，并且任何位点都是可接受的，只要与突变或插入前相比，在pH 5.8的抗原结合活性低于在pH 7.4的抗原结合活性(K

组氨酸可以在单个位点或两个或更多个位点处进行取代或插入。同时引入非组氨酸突变(除组氨酸之外的氨基酸突变)也是可行的。此外，组氨酸突变可以与组氨酸插入同时引入。可以使用组氨酸扫描等方法随机取代或插入组氨酸，该方法在本领域技术人员已知的丙氨酸扫描中使用组氨酸代替丙氨酸。替代性地，可以从具有随机组氨酸突变或插入的抗原结合分子文库中选择与突变前相比K

当组氨酸取代抗体的氨基酸或插入到抗体的氨基酸之间时，优选但不要求组氨酸取代或插入后抗体在pH 7.4的抗原结合活性与组氨酸取代或插入前抗体在pH 7.4的抗原结合活性相当。“组氨酸取代或插入后抗体在pH 7.4的抗原结合活性与组氨酸取代或插入前抗体在pH 7.4的抗原结合活性相当”是指即使在组氨酸取代或插入后，抗体仍保留组氨酸取代或插入前的抗原结合活性的10％或更多、优选50％或更多、更优选80％或更多、并且还更优选90％或更多。当抗体的抗原结合活性因组氨酸取代或插入而削弱时，可通过在抗体中引入取代、缺失、添加和/或插入一个或多个氨基酸来调整抗原结合活性，以便抗原结合活性变得与组氨酸取代或插入前的抗原结合活性相当。

与在pH 7.4的抗原结合活性相比削弱抗体在pH 5.8的抗原结合活性的替代方法，包括用非天然氨基酸取代抗体中的氨基酸或将非天然氨基酸插入到抗体氨基酸中的方法。已经知道，可以使用非天然氨基酸人为控制pKa(Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,34；Chem.Soc.Rev.2004 Sep 10；33(7):422-30；Amino Acids.1999；16(3-4):345-79)。因此，可以使用非天然氨基酸来代替上文描述的组氨酸。这种非天然氨基酸取代和/或插入可以与上文描述的组氨酸取代和/或插入同时引入。任何非天然氨基酸均可用于本发明。可以使用本领域技术人员已知的非天然氨基酸。

因此，本发明的一个目的是提供用于确定抗体的多次结合其抗原的pH依赖性抗原结合的方法。

本领域中已经描述了基于标准SPR的测定设置。这些设置允许在一组条件下评估抗体与其抗原的结合活性。

在本发明中，酸性与中性pH之间的抗原结合活性的绝对差异不重要，只要在酸性pH的抗原结合活性与在中性pH的抗原结合活性不同即可。

然而，在一个实施例中，K

然而，在一个实施例中，K

当抗原是可溶性抗原时，抗原结合活性可以用解离常数(K

在一个实施例中，当解离速率常数(k

在一个实施例中，当解离速率常数(kd)代替解离常数(KD)用作结合活性差异的指标时，kd(pH7.4)/kd(pH5.8)值(即在pH 7.4与在pH 5.8对抗原的解离速率常数(kd)之比)优选为2或更大，更优选为5或更大，甚至更优选为10或更大，并且还更优选为30或更大。kd(pH7.4)/kd(pH5.8)值的上限没有特别限制，并且可以是任何值，例如50、100或200，只要分子可以通过本领域技术人员公知的技术生产即可。

当抗原是可溶性抗原时，抗原结合活性可以用解离速率常数(k

在本文中，与在中性pH的抗原结合活性相比削弱在酸性pH的抗原结合活性是指与在pH 6.7至pH 10.0的抗原结合能力相比削弱抗体在pH 4.0至pH 6.5的抗原结合能力，优选地与在pH 7.0至pH 8.0的抗原结合活性相比削弱抗体在pH 5.5至pH 6.5的抗原结合活性，更优选地与在pH 7.4的抗原结合活性相比削弱抗体在pH 5.8的抗原结合活性。因此，在本发明中，酸性pH通常为pH 4.0至pH 6.5，优选为pH 5.5至pH 6.5，并且更优选为pH 5.8。另选地，在本发明中，中性pH通常为pH 6.7至pH 10.0，优选为pH 7.0至pH 8.0，并且更优选为pH 7.4。

因此，在一个实施例中，第一pH值介于pH 6.7至pH 10.0之间并包括端值，并且第二pH值介于pH 4.0至pH 6.5之间并包括端值。在一个实施例中，第一pH值介于pH 7.0至pH8.0之间并包括端值，并且第二pH值介于pH 5.5至pH 6.5之间并包括端值。在一个实施例中，第一pH值介于pH 7.2至pH 7.6之间并包括端值，并且第二pH值介于pH 5.5至pH 5.8之间并包括端值。在一个优选的实施例中，第一pH值为约pH 7.4，并且第二pH值介于pH 5.5至pH 5.8之间并包括端值。

本发明至少部分地基于这样的发现，即可以利用pH梯度进行表面等离子体共振实验。因此，一方面通过确定抗体与其抗原发生这种解离的精确pH值，即解离pH值，另一方面通过确定在所述解离pH值的解离速率常数，可以表征抗体的pH依赖性抗原结合。

根据本发明的方法包括在施加pH梯度的同时记录或监测抗体与抗原的结合信号作为必要步骤。在结合信号开始降低的pH梯度点，抗体与其抗原之间的相互作用由于结合位点中氨基酸残基的质子化或去质子化而减弱。所述pH梯度点限定了抗体与其抗原之间的pH依赖性相互作用的解离pH值。

例如，为了评估具有pH依赖性抗原结合的抗体作为能够结合多个抗原分子的重复抗原结合抗体的适用性，可以用根据本发明的方法确定pH依赖性抗原结合。如果在溶酶体pH(即低于pH 6.0)、优选在约pH 5.0与抗原的结合降低(或甚至消除)，而在生理pH(即高于pH 7.0)、优选在约pH 7.4的结合保持(或甚至最大)，则所述抗体适用于预期目的。

因此，根据本发明的方法包括以下核心步骤

-将抗体-抗原-复合物暴露于从生理pH到溶酶体pH的pH梯度并确定

i)如果有的话，

或者

ii)抗体-抗原-复合物解离精确的pH值。

尽管上文已针对从中性到酸性pH值的pH梯度进行了概述，但根据本发明的方法可以任何pH梯度使用，即从中性到酸性或从中性到碱性或从碱性到酸性或从酸性到碱性。

因此，如本文所报道的一个方面是一种用于确定(单克隆)抗体与其抗原的结合是否为pH依赖性(pH依赖性抗原结合)的测定或方法，其中该方法包括以下步骤：

a)在第一pH值将抗体捕获/固定在已缀合有该抗体的抗原的固相上，

b)对固相施加从第一pH值到第二pH值的pH梯度，并监测抗体与固相的解离，

其中如果在步骤b)中可以检测到抗体与固相的解离，则抗体与其抗原的结合是pH依赖性的。

本文所报道的一个方面是一种用于确定抗体与其抗原的解离速率常数k

a)在第一pH值，使用与抗体的恒定结构域特异性结合的捕获试剂将抗体捕获/固定在固相上，

b)将捕获的抗体与其抗原一起孵育以形成捕获的抗体-抗原复合物，直到获得稳定/恒定的结合信号，

c)对固相施加从第一pH值到解离pH值的pH梯度，然后将pH值维持在解离pH值，

d)记录结合信号并由此计算解离速率常数k

这种方法是有利的，因为通过将pH值从高于解离pH值降低到解离pH值，可以模拟胞吞作用和溶酶体酸化期间的过程。另外，可以精确地设定确定解离速率常数的起始点，从而允许更准确地确定在解离pH值的所述解离速率常数。

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提供以下实例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求中阐明。应当理解的是，在不脱离本发明精神的前提下，可以对阐明的程序进行修改。

所有SPR实验均在带有传感器芯片Xantec SCR CMD500L的Xantec SR7500DC上进行

为了固定抗原，准备了两种流动池(Fc)，Fc1作为空白对照，Fc2作为特异性靶结合相互作用表面。为了将抗原固定在流动池二上，其表面已被EDC/NHS活化以制备二聚体抗原构建体的胺偶联。抗原二聚体已在pH 4.5的10mM醋酸盐缓冲液中制备，浓度为30μg/ml。将该溶液以20μl/min的流速注射到Fc2上10分钟

为了建立梯度，制备了两种PBS-P+缓冲液。缓冲液A的pH设置为7.4。缓冲液B设置为pH 4.9。

以100μl/min的流速将浓度为100nM的抗体样品注射到缓冲液A中，持续90秒。平衡210秒后，梯度在2400秒内从100％缓冲液A起始至100％缓冲液B。在运行结束时，用pH为1.5的10mM甘氨酸缓冲液再生表面。

通过25:75的缓冲液A和缓冲液B之比确定pH依赖性结合剂开始解离时的pH值。测量该混合物，得到pH值为5.85至5.9。

为了固定抗人Fc捕获抗体(GE BR-1008-39)，准备了两种流动池，Fc1作为空白对照，Fc2作为特异性靶结合相互作用表面。为了将捕获抗体固定在流动池二上，其表面已被EDC/NHS活化以制备胺偶联。已在pH 4.5的10mM醋酸盐缓冲液中制备，浓度为30μg/ml。将该溶液以20μl/min的流速注射到Fc2上10分钟。

为了建立梯度，制备了两种PBS-P+缓冲液。缓冲液A的pH设置为7.4。缓冲液B设置为pH 4.9。以100μl/min的流速将所讨论的浓度为100nM的抗体注射到缓冲液A中，持续90秒。在第二步中，将浓度为100nM的不同抗原制剂(二聚体、野生型和单体)注射到缓冲液A中，持续90秒。平衡210秒后，梯度在2400秒内从100％缓冲液A起始至100％缓冲液B。在运行结束时，用3M MgCl