非编码RNA、包含非编码RNA的RNA序列及其应用

摘要

本发明属于肿瘤干细胞研究技术领域，具体涉及一种非编码RNA和编码RNA、包含非编码RNA的RNA序列及其应用。该非编码RNA的序列如Sequence NO.1所示，该非编码RNA与与所述PLA2G16基因的mRNA的3'‑UTR‑1区结合增强PLA2G16基因的表达，从而促进细胞的干性特征，在肿瘤干细胞中，可以通过敲除所述非编码RNA抑制PLA2G16基因的表达，从而抑制肿瘤干细胞的发生/发展。本发明通过有效敲除所述非编码RNA抑制PLA2G16基因的表达可以有效的抑制乳腺癌干细胞/肿瘤的发生/发展。

说明书

技术领域

本发明属于肿瘤干细胞研究技术领域，具体涉及一种非编码RNA和编码RNA、包含非编码RNA的RNA序列及其应用。

背景技术

肿瘤干细胞被认为是肿瘤发生、复发、转移、耐药，引起患者不良预后的主要原因，然而，参与维持肿瘤干细胞特性与生物行为的调节机制仍然未知。而且现有的预防或治疗乳腺癌的药物存在药物耐药性，为消除或抑制乳腺癌细胞/肿瘤带来阻碍作用。长链非编码RNA是一类长度超过200个核苷酸且不编码蛋白质的转录本。越来越多的研究表明，长链非编码RNA是各种生物学过程中的关键调控因子，包括DNA损伤修复、炎症、代谢、细胞信号传导、细胞分化、增殖、凋亡、迁移、侵袭等。尽管一些研究表明长链非编码RNA在肿瘤干细胞中异常表达，但是只有一小部分被鉴定出具有重要功能。

发明内容

有鉴于此，本发明在于提供一种非编码RNA，所述非编码RNA是通过lncRNA芯片分析，鉴定到的在乳腺癌干细胞中高表达的长链非编码RNA，本发明把它命名为lncROPM。同时，lncROPM在临床乳腺肿瘤以及其他实体瘤中高表达，并且与疾病的恶性程度、组织学分级以及病人的不良预后成正相关。体内和体外功能得失实验表明lncROPM是维持乳腺癌干细胞干性特征所必须的。机制上，lncROPM通过与PLA2G16mRNA的3‘UTR区域直接结合维持其mRNA的稳定性来调节靶基因PLA2G16的表达。增加的PLA2G16促进磷脂代谢以及游离脂肪酸的产生，尤其是促进花生四烯酸的产生。随后，增多的花生四烯酸活化PI3K/AKT，Wnt/β-catenin and Hippo/YAP信号通路，从而参与维持乳腺癌干细胞的干性特征。重要的是，lncROPM和PLA2G16还显著促进乳腺癌干细胞耐药。将临床治疗药物(如多柔比星，顺铂，或他莫昔芬)与吉利帕地(胞浆磷脂酶A2抑制剂)联用可有效消除乳腺癌干细胞和肿瘤发生。综上所述，本发明的lncROPM及其靶基因PLA2G16在促进乳腺癌干细胞干性特征方面起着至关重要的作用，并且可以作为乳腺癌干细胞或者其他肿瘤干细胞的标志物。

所述非编码RNA的核酸序列如Sequence NO.1所示。

进一步，所述非编码RNA位于人类11q12.3-q13.1染色体，邻近于PLA2G16基因。

进一步，所述非编码RNA由两个外显子连接组成，长度为573bp。

进一步，所述非编码RNA位于干细胞胞浆中。

在某些具体实施例中，所述干细胞包括乳腺癌干细胞、肾透明细胞癌干细胞、头颈部鳞状细胞癌干细胞、卵巢浆液性囊腺癌干细胞。

本发明目的在于还提供一种RNA序列，所述RNA序列包括：PLA2G16基因的mRNA和前述的非编码RNA。

进一步，所述RNA序列为所述非编码RNA与所述PLA2G16基因的mRNA的3'-UTR-1区结合。

进一步，所述RNA序列如Sequence NO.2所示。

本发明目的在于还提供一种增强PLA2G16基因表达的方法，所述方法包括：将前述的非编码RNA与所述PLA2G16基因的mRNA的3'-UTR-1区结合。

在某些实施例中，通过将前述的非编码RNA与所述PLA2G16基因的mRNA的成熟mRNA的3'-UTR-1区结合从而延长PLA2G16基因的mRNA半衰期、提高mRNA含量和PLA2G16含量来显示增强PLA2G16基因表达。

本发明目的在于还提供一种延长PLA2G16基因的mRNA半衰期的方法，所述方法为将前述的非编码RNA与所述PLA2G16基因的mRNA的成熟mRNA的3'-UTR-1区结合。

本发明目的在于还提供一种调节细胞中PLA2G16基因转录和/或翻译的方法。

所述方法包括：a)敲低细胞中前述的非编码RNA，则抑制所述PLA2G16基因的转录和/或翻译；或b)过表达细胞中前述的非编码RNA，则增强PLA2G16基因转录和/或翻译。

在本发明某些具体实施例中，通过PLA2G16的mRNA和蛋白水平展示PLA2G16基因转录和/或翻译的结果。

本发明在于还提供一种体外调节干细胞/非干细胞中干细胞生长的方法。

所述方法包括：a)敲除干细胞/非干细胞中权利要求1-4任一所述的非编码RNA，抑制干细胞生长；或b)过表达干细胞/非干细胞中权利要求1所述的非编码RNA，促进干细胞生长；或c)抑制PLA2G16基因表达，抑制干细胞生长；或d)过表达PLA2G16基因，促进干细胞生长。

进一步，所述细胞/非干细胞为癌细胞或正常细胞。

进一步，肾透明癌干细胞、头颈部鳞状癌干细胞、卵巢浆液性囊腺癌干细胞、乳腺癌干细胞。

进一步，所述乳腺癌干细胞包括：BT549乳腺癌干细胞、Hs578T乳腺癌干细胞、MDA231乳腺癌干细胞、MDA468乳腺癌干细胞、MDA436乳腺癌干细胞、MCF7乳腺癌干细胞、T47D乳腺癌干细胞。

本发明某些具体实施例中，是通过调节干细胞/非干细胞的干性特征来调节干细胞/非干细胞中干细胞生长的。

本发明还提供一种调节干细胞/非干细胞的干性特征的方法。

所述方法包括：a)敲除所述干细胞/非干细胞中前述的非编码RNA或抑制PLA2G16基因的表达或使用吉利帕地，减弱干性特征；或b)过表达干细胞/非干细胞中前述的非编码RNA或过表达PLA2G16基因，促进干特征；所述干性特征包括干性相关基因的表达和/或干细胞成球率和/或干细胞大小和/或CD44

进一步，所述干性基因包括：SOX2、Nanog、OCT4、KLF4、β-Actin。

进一步，所述干细胞/非干细胞包括：肾透明癌干细胞/非干细胞、头颈部鳞状癌干细胞/非干细胞、卵巢浆液性囊腺癌干细胞/非干细胞、乳腺癌干细胞/非干细胞。

在本发明某些具体实施中，所述方法包括：a)在乳腺癌干细胞中敲除所述非编码RNA，减弱干性特征；或b)在乳腺癌非干细胞中过表达非编码RNA促进干性特征。

本发明在于提供一种鉴别干细胞和/或非干细胞的方法。

所述方法包括：检测细胞中PLA2G16基因表达水平，a)若表达水平高的则为干细胞，或b)若表达水平低的则为非干细胞。

进一步，所述方法包括：检测细胞中前述的非编码RNA是否与所述PLA2G16基因的mRNA的3'-UTR-1区结合，如结合，则为干细胞；若没有结合，则为非干细胞。

在本发明某些具体实施例中，所述方法包括：a)所述干细胞和非干细胞为乳腺癌干细胞/非干细胞，PLA2G16表达水平高的为乳腺癌干细胞；或b)所述干细胞为胚胎干细胞和胚胎干细胞衍生的干细胞，PLA2G16表达水平高的为胚胎干细胞；或c)所述干细胞和非干细胞为肝脏干细胞和已分化细胞的肝脏细胞，PLA2G16表达水平高的为肝脏干细胞。

本发明在于还提供一种激活/抑制PI3K/AKT，Wnt/β-catenin和Hippo/YAP信号通路的方法。

所述方法包括：a)过表达权利前述的非编码RNA或过表达PLA2G16基因，则激活PI3K/AKT，Wnt/β-catenin和Hippo/YAP信号通路；或b)敲除前述的非编码RNA或抑制PLA2G16基因表达，则抑制PI3K/AKT，Wnt/β-catenin和Hippo/YAP信号通路。

本发明目的在于还提供一种抑制/促进细胞花生四烯酸含量的方法，所述包括：a)通过敲除权利要求1所述的非编码RNA或抑制PLA2G16基因的表达来抑制所述细胞花生四烯酸含量；或过表达权利要求1所述的非编码RNA或过表达PLA2G16基因来促进所述细胞花生四烯酸含量。

在某些具体实施例中，敲低lncROPM后代表性产物Cer(神经酰胺)和FFA(游离脂肪酸)含量显著降低，过表达lncROPM后Cer和FFA含量显著增加，表明Cer和FFA可能是lncROPM-PLA2G16驱动乳腺癌干细胞干性特征的关键代谢产物。PLA2G16表达越活跃，AA(花生四烯酸)的含量越高；同时，与非干细胞相比，AA在乳腺癌干细胞中明显富集；此外，本发明实施例还发现AA在晚期肿瘤组织、复发性肿瘤组织及耐药组织中明显富集。AA(花生四烯酸)是FFA(游离脂肪酸)主要的一部分。

本发明在于还提供一种抑制肿瘤发生/发展的方法，所述方法包括：敲低所述肿瘤的细胞中前述的非编码RNA。

进一步，所述肿瘤为肾透明肿瘤、头颈部鳞状肿瘤、卵巢浆液性囊腺肿瘤、乳腺肿瘤。

在某些具体实施例中，在肿瘤干细胞中，敲低lncROPM降低肿瘤的起始频率；或b)在肿瘤非干细胞中，过表达lncROPM增加肿瘤的起始频率。

本发明在于还提供一种调节癌干细胞/非干细胞对药物敏感性的方法。

所述方法包括：a)敲低前述的非编码RNA和/或抑制PLA2G16基因表达会增加癌干细胞/非干细胞对药物敏感性；或b)过表达前述的非编码RNA和/或过表达PLA2G16基因会降低干细胞/非干细胞对药物敏感性。

进一步，所述癌干细胞/非干细胞为乳腺癌干细胞/非干细胞。

在某些具体实施例中，所述方法包括：a)敲低所述非编码RNA和/或抑制所述PLA2G16基因表达和/或添加花生四烯酸降低BT549乳腺癌干细胞/非干细胞对多柔比星的药物敏感性；或b)过表达所述非编码RNA和/或所述过表达PLA2G16基因减弱BT549乳腺癌干细胞/非干细胞对多柔比星的药物敏感性；或c)敲低所述非编码RNA或抑制所述PLA2G16基因/或添加花生四烯表达增加BT549乳腺癌干细胞/非干细胞对顺铂的药物敏感性；或d)过表达所述非编码RNA或所述过表达PLA2G16基因减弱BT549乳腺癌干细胞/非干细胞对顺铂的药物敏感性；或e)敲低所述非编码RNA或抑制所述PLA2G16基因/或添加花生四烯增加BT549乳腺癌干细胞/非干细胞对他莫昔芬的药物敏感；或f)过表达所述非编码RNA或过表达PLA2G16基因减弱BT549乳腺癌干细胞/非干细胞对他莫昔芬的药物敏感。

在某些具体实施例中，所述方法包括：a)敲低权利要求1中所述非编码RNA或抑制PLA2G16基因表达或使用吉立帕地处理的BT549乳腺癌干细胞中添加花生四烯酸后可以恢复乳腺癌干细胞对多柔比星的药物耐药性；或b)敲低权利要求1中所述非编码RNA或抑制PLA2G16基因表达或使用吉立帕地处理的MCF7乳腺癌干细胞中添加花生四烯酸后可以恢复干细胞对他莫昔芬的药物耐药性。

本发明还提供一种体外抑制乳腺癌干细胞/肿瘤的发生/发展方法。

所述方法包括：使用吉利帕地分别与多柔比星、顺铂、他莫昔芬联用抑制前述的非编码RNA与PLA2G16基因的表达从而抑制乳腺癌干细胞/肿瘤的发生/发展。

在某些具体实施例中，所述方法包括：a)吉利帕地与多柔比星联合使用抑制BT549/Hs578T乳腺癌干细胞/肿瘤的发生/发展；或b)吉利帕地与顺铂联合使用抑制BT549/Hs578T乳腺癌干细胞/肿瘤的发生/发展；或c)吉利帕地与他莫昔芬联合使用抑制MCF7乳腺癌干细胞/肿瘤的发生/发展。

本发明有益效果在于：

本发明提供的lncROPM通过与PLA2G16 mRNA的3‘UTR区域直接结合维持其mRNA的稳定性来调节靶基因PLA2G16的表达；增加的PLA2G16促进磷脂代谢以及游离脂肪酸的产生，尤其是促进花生四烯酸的产生。随后，增多的花生四烯酸活化PI3K/AKT，Wnt/β-cateninand Hippo/YAP信号通路，从而参与维持乳腺癌干细胞的干性特征。

本发明提供的lncROPM和PLA2G16还显著促进乳腺癌干细胞耐药，将药物(如多柔比星，顺铂，或他莫昔芬)与吉利帕地(胞浆磷脂酶A2抑制剂)联用可有效消除乳腺癌干细胞和肿瘤发生。

附图说明

图1为MCF7乳腺癌干细胞(CD44

图2为与在乳腺癌干细胞中与代谢通路相关的lncRNAs。

图3为长链非编码RNA lncROPM的序列情况。

图4为lncROPM在各种不同乳腺癌细胞系的癌干细胞中的表达。

图5为RNA Fish实验定位lncROPM。

图6为亚细胞分离实验定位lncROPM。

图7为TANRIC数据库检索lncROPM在病人中的表达情况。

图8为高表达的lncROPM与乳腺癌病人的不良预后显著相关。

图9为qRT-PCR实验检测乳腺癌组织和配对邻近正常乳腺组织中lncROPM的表达。

图10为lncROPM的表达与肿瘤大小、TNM分期、组织分级、淋巴结转移、肿瘤复发关系代表性图像。

图11为lncROPM在乳腺癌组织中与干性标志物SOX2表达关系。

图12为lncROPM在乳腺癌组织中与干性标志物OCT4表达关系。

图13为lncROPM在乳腺癌干细胞中和非干细胞中表达情况。

图14为lncROPM在对化疗药物耐受/不耐受的乳腺癌组织中表达情况。

图15为头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中lncROPM表达于组织分级增加的关系。

图16为卵巢浆液性囊腺癌(OV)中lncROPM表达于组织分级增加的关系。

图17为肾透明细胞癌(KIRC)的干细胞与非干细胞中lncROPM的表达情况。

图18为头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的干细胞与非干细胞中lncROPM的表达情况。

图19为卵巢浆液性囊腺癌(OV)的干细胞与非干细胞中lncROPM的表达情况。

图20为在不同乳腺癌干细胞中短发夹RNA(shRNAs)沉默了lncROPM后的情况。

图21为在不同乳腺癌干细胞中慢病毒载体过表达lncROPM的情况。

图22为在不同乳腺癌干细胞中有效敲除lncROPM后干性相关基因(SOX2，Nanog，OCT4，KLF4)的表达情况。

图23为在不同乳腺癌干细胞中有效敲除lncROPM后干细胞成球及大小实物情况。

图24为在不同乳腺癌干细胞中有效敲除lncROPM后干细胞成球率/干细胞大小情况。

图25为非干细胞中过表达lncROPM与干性相关基因(SOX2，Nanog，OCT4，KLF4)的表达情况。

图26为非干细胞中过表达lncROPM后干细胞成球及大小实物情况。

图27为非干细胞中过表达lncROPM后干细胞成球率/干细胞大小情况。

图28为体内实验乳腺癌干细胞中lncROPM缺失与乳腺肿瘤的起始频率关系。

图29为体外实验乳腺癌干细胞中lncROPM缺失与乳腺肿瘤的起始频率关系。

图30为体内实验乳腺癌非干细胞中lncROPM过表达失与乳腺肿瘤的起始频率关系。

图31为体外实验乳腺癌非干细胞中lncROPM过表达失与乳腺肿瘤的起始频率关系。

图32为乳腺癌干细胞中敲低lncROPM后靶基因PLA2G16表达情况。

图33为乳腺癌干细胞中敲低lncROPM后靶基因PLA2G16蛋白表达情况。

图34为乳腺癌非干细胞中过表达lncROPM后靶基因PLA2G16表达情况。

图35为乳腺癌非干细胞中过表达lncROPM后靶基因PLA2G16蛋白表达情况。

图36为乳腺癌组织样本中lncROPM的表达与PLA2G16的表达关系。

图37为高表达的PLA2G16与晚期TNM分期、高组织分级、淋巴结转移、肿瘤复发的代表性图像。

图38为PLA2G16在药物耐受/敏感的乳腺癌组织中表达情况。

图39为PLA2G16与乳腺癌患者的不良预后及耐药相关情况。

图40为MCF7乳腺癌干细胞中敲低lncROPM后PLA2G16前体mRNA和成熟mRNA的表达水平情况。

图41为BT549乳腺癌干细胞中敲低lncROPM后PLA2G16前体mRNA和成熟mRNA的表达水平情况。

图42为敲低lncROPM后PLA2G16前体mRNA和成熟mRNA的表达情况。

图43为lncROPM与PLA2G16 mRNA的3'-UTR区域相互作用情况。

图44为lncROPM与PLA2G16 mRNA的3'-UTR区域结合情况。

图45为过表达lncROPM与含有PLA2G16 3'-UTR区构建体的萤光素酶活性情况。

图46为缺失lncROPM的乳腺癌干细胞中/过表达lncROPM的乳腺癌非干细胞中PLA2G16 mRNA的半衰期情况。

图47为PLA2G16在乳腺癌干细胞/非干细胞中表达情况。

图48为乳腺癌组织样本中PLA2G16的表达与干性相关基因SOX2表达关系。

图49为乳腺癌组织样本中PLA2G16的表达与干性相关基因OCT4表达关系。

图50敲低PLA2G16的乳腺癌干细胞中PLA2G16基因表达情况。

图51敲低PLA2G16的乳腺癌干细胞中PLA2G16蛋白表达情况。

图52为过表达PLA2G16的乳腺癌非干细胞中PLA2G16基因表达情况。

图53为过表达PLA2G16的乳腺癌非干细胞中PLA2G16蛋白表达情况。

图54为吉利帕地抑制PLA2G16的酶活性情况。

图55为在不同乳腺癌干细胞中敲低内源性PLA2G16或使用吉利帕地后干性相关基因(SOX2，OCT4，KLF4)的表达情况。

图56为在不同乳腺癌干细胞中敲低内源性PLA2G16或使用吉利帕地后干细胞成球情况。

图57为在不同乳腺癌干细胞中敲低内源性PLA2G16或使用吉利帕地后干细胞成球率情况。

图58为在不同乳腺癌干细胞中敲低内源性PLA2G16或使用吉利帕地后干细胞大小情况。

图59为在不同乳腺癌非干细胞中过表达PLA2G16后干细胞成球情况。

图60为在不同乳腺癌非干细胞中过表达PLA2G16后干细胞成球率情况。

图61为在不同乳腺癌非干细胞中过表达PLA2G16后干性相关基因(SOX2，OCT4，KLF4，β-Actin)的表达情况。

图62为在不同乳腺癌非干细胞中过表达PLA2G16后干细胞成球大小情况。

图63为高/低表达PLA2G16与CD44

图64为高/低表达PLA2G16与干性相关基因表达关系。

图65为胚胎干细胞与胚状体中PLA2G16表达情况。

图66为胚胎干细胞与其衍生的干细胞中PLA2G16表达情况。

图67为肝脏中已分化细胞的细胞与干细胞中PLA2G16表达情况。

图68为肥大细胞中经干细胞中PLA2G16表达情况。

图69为MCF7乳腺癌干细胞中敲低PLA2G16或抑制PLA2G16酶活性后花生四烯酸的含量情况。

图70为MCF7乳腺癌非干细胞中过表达PLA2G16后花生四烯酸的含量情况。

图71为乳腺癌干细胞/非干细胞中花生四烯酸富集情况。

图72为晚期肿瘤组织、复发性肿瘤组织及耐药组织中花生四烯酸富集情况。

图73为干性细胞中敲低lncROPM或PLA2G16后引起的受抑制添加花生四烯酸后的干性相关基因(SOX2，OCT4和KLF4)的表达情况。

图74为干性细胞中敲低lncROPM后添加花生四烯酸后的干细胞成球情况。

图75为干性细胞中敲低PLA2G16后添加花生四烯酸后的干细胞成球情况。

图76为敲低lncROPM后加入花生四烯酸与PI3K/AKT，Wnt/β-catenin以及Hippo/YAP信号通路的关系。

图77为敲低PLA2G16后加入花生四烯酸与PI3K/AKT，Wnt/β-catenin以及Hippo/YAP信号通路的关系。

图78为敲低lncROPM或PLA2G16后BT549乳腺癌干细胞对多柔比星(Doxorubicin)的药物敏感情况。

图79为敲低lncROPM或PLA2G16后BT549乳腺癌干细胞对顺铂(Cisplatin)的药物敏感情况。

图80为敲低lncROPM或PLA2G16后BT549乳腺癌干细胞对他莫昔芬(Tamoxifen)的药物敏感情况。

图81为缺失lncROPM或PLA2G16以及吉立帕地处理的BT549乳腺癌干细胞中添加花生四烯酸后干细胞对多柔比星(Doxorubicin)的药物敏感情况。

图82为缺失lncROPM或PLA2G16以及吉立帕地处理的BT549乳腺癌干细胞中添加花生四烯酸后干细胞对顺铂(Cisplatin)的药物敏感情况。

图83为缺失lncROPM或PLA2G16以及吉立帕地处理的MCF7乳腺癌干细胞中添加花生四烯酸后干细胞对他莫昔芬(Tamoxifen)的药物敏感情况。

图84为在BT549乳腺癌非干细胞中过表达lncROPM或PLA2G16后对多柔比星(Doxorubicin)的药物敏感情况。

图85为在BT549乳腺癌非干细胞中过表达lncROPM或PLA2G16后对顺铂(Cisplatin)的药物敏感情况。

图86为在MCF7乳腺癌非干细胞中过表达lncROPM或PLA2G16后对他莫昔芬(Tamoxifen)的药物敏感情况。

图87为不同乳腺癌细胞的干细胞与其亲代细胞的干细胞中lncROPM和PLA2G16的表达情况。

图88为不同乳腺癌细胞的干细胞与其亲代细胞的干细胞中感性特征基因(OCT4、SOX2)的表达情况。

图89为吉利帕地(Giripladib)与多柔比星(Doxorubicin)联合或单独使用以对BT549/Hs578T乳腺癌干细胞成球影响的实物图。

图90为吉利帕地(Giripladib)与多柔比星(Doxorubicin)联合或单独使用以对BT549/Hs578T乳腺癌干细胞成球率的影响。

图91为吉利帕地(Giripladib)与顺铂(Cisplatin)联合或单独使用以对BT549/Hs578T乳腺癌干细胞成球影响的实物图。

图92为吉利帕地(Giripladib)与顺铂(Cisplatin)联合或单独使用以对BT549/Hs578T乳腺癌干细胞成球率的影响。

图93为吉利帕地(Giripladib)与他莫昔芬(Tamoxifen)联合或单独使用以对MCF7乳腺癌干细胞成球影响的实物图。

图94为吉利帕地(Giripladib)与他莫昔芬(Tamoxifen)联合或单独使用以对MCF7乳腺癌干细胞成球率的影响。

图95为吉利帕地联合多柔比星与肿瘤体积情况。

图96为吉利帕地联合多柔比星与肿瘤发生和生长情况。

图97为联合治疗后肿瘤中干细胞相关转录因子KLF4的表达情况。

其中，图中，CSCs为干细胞，non-CSCs为非干细胞。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明实施例中，人乳腺癌细胞系(BT549、Hs578T、MDA231、MDA468、MDA436、MCF7和T47D)来自美国模式培养物集存库(ATCC，USA)；所有的细胞均在温度为37℃、含5％CO

本发明实施例中，为了建立抗顺铂(Cisplatin或DDP)的MDA231细胞系(MDA231/DDP)、抗多柔比星(Doxorubicin或DOX)的BT549细胞系(BT549/DOX)以及抗他莫昔芬(Tamoxifen或TAM)的MCF7细胞系(MCF7/TAM)，MDA231、BT549和MCF7细胞在6个月的时间内反复地暴露于递增浓度的药物中。

本发明实施例中，为了维持抗性表型，MDA231/DDP、BT549/DOX、MCF7/TAM细胞分别培养在含有2μM顺铂(Med-ChemExpress，NJ，USA)、2μM多柔比星(Med-ChemExpress，NJ，USA)、1μM他莫昔芬(Med-ChemExpress，NJ，USA)的培养基中培养。

本发明实施例中，花生四烯酸购买自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)；吉利帕地(Giripladib)，一种胞质磷脂酶A2抑制剂，购买自USBiological Life Sciences(Swampscott，MA，USA)。

本发明实施例中，人乳腺肿瘤组织及其相应的正常组织(距肿瘤组织至少5cm)收自于重庆医科大学附属第一医院从接受初次手术且未接受任何术前放疗或化疗的乳腺癌患者，随后从新鲜的肿瘤组织中分离出人乳腺癌原代细胞。同时，还从新辅助化疗后切除乳腺的患者中获得了对化疗药物敏感和对化疗药物耐受的乳腺肿瘤组织。本方明是依据实体瘤反应评估标准(RECIST)指南来评估肿瘤组织对新辅助化学疗法的反应。并且根据机构批准的协议从医疗记录中获得乳腺癌患者的临床和病理特征信息。切除的标本固定在10％福尔马林中，随后进行石蜡包埋并切成4μm切片以供后续分析。

本发明实施例中，磁性细胞分离技术分选乳腺癌干细胞的方法为：用偶联CD44/CD24抗体的磁珠(Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)从乳腺癌细胞中分选乳腺癌干细胞与非干细胞，分选过程遵循制造商的说明。

本发明实施例中，RNA制备和定量逆转录PCR(qRT-PCR)的方法为：按照制造商的说明，通过TRIzol试剂(Takara，Japan)从组织标本和细胞中分离出总RNA，使用PrimeScriptRT试剂盒(Takara，Japan)进行逆转录。随后使用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(Takara，Japan)通过qRT-PCR实验检测基因表达。用比较CT值法计算相对mRNA水平，并以β-actin的表达为标准进行归一化处理，所有实验至少进行了3次。

本发明实施例中，乳腺微球体形成和自我更新能力测定的方法为：按照文献报导的方法培养乳腺微球体，在随后的传代中，细胞分别以1×10

本发明实施例中，RNA荧光原位杂交(FISH)实验的方法为：为了在乳腺癌细胞或肿瘤组织中原位检测lncROPM，使用RiboBio(China)公司设计并合成了Cy3标记的lncROPM探针，U6探针和18S探针。根据制造商的说明，使用荧光原位杂交试剂盒(RiboBio，China)进行细胞或组织FISH分析。并使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica，Germany)观察图像。

本发明实施例中，亚细胞分离实验的方法为：为了确定lncROPM的细胞定位，使用PAKIS试剂盒(Thermo Fisher Scientific，USA)根据制造商的说明分离细胞质和细胞核RNA。随后立即将提取的RNA进行逆转录，并通过qRT-PCR分析基因的表达情况。以U6 RNA作为核对照，GAPDH mRNA作为细胞质对照。

本发明实施例中，建立稳定表达基因的细胞系的方法为：为了敲低lncROPM和PLA2G16基因，将GenePharma公司(Shanghai，China)合成的特异shRNA以及对照shRNA分别插入GenePharma公司(Shanghai，China)的慢病毒表达载体pGLV3/H1/GFP/Puro中。详细的shRNA序列在补充表1中列出。为了过表达lncROPM和PLA2G16基因，将GenePharma(Shanghai，China)合成的lncROPM和PLA2G16序列克隆到Genepharma(Shanghai，China)的慢病毒表达载体LV5/EF-1aF/GFP/Puro中。按照制造商的说明，将包装好的慢病毒用于感染乳腺癌细胞。为了建立稳定表达的细胞系，将感染的细胞用1μg/ml嘌呤霉素(Gibco，USA)处理两周。

本发明实施例中，蛋白质印迹分析(Western blotting)的方法为：收集、洗涤并在含有蛋白酶抑制剂(Beyotime，China)混合物的RIPA缓冲液(Beyotime，China)中裂解乳腺癌细胞。提取总蛋白并用BCA蛋白测定试剂盒(Beyotime，China)进行定量。用8％-12％SDS-PAGE凝胶分离等量的蛋白质，然后转移到PVDF膜上(Bio-Rad，USA)。将膜在5％脱脂牛奶(BOSTER，China)中封闭2h，并与一抗在4℃下孵育过夜。用TBST洗涤后，将膜与合适的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠或兔IgG二抗(ZSGB-BIO，中国)在室温下孵育1小时。通过化学发光增强系统(Bio-Rad，Hercules，EDA USA)对蛋白质条带进行可视化检测。使用Scion图像软件捕获图像，β-actin蛋白被用作内部对照。本发明中使用了以下抗体：KLF4(1:500，1880-1-AP，Proteintech)，SOX2(1:500，ab97959，Abcam)，OCT4(1:2000，60242-1-Ig，Proteintech)，PLA2G16(1:500，A16018，ABclonal)，Akt(1:500，10176-2-AP，Proteintech)，p-Akt(Ser473)(1:500，66444-1-Ig，Proteintech)，PI3K(1:500，CY5355，Abways)，p-PI3K(Tyr607)(1:500，CY6427，Abways)，YAP1(1:500，CY5381，Abways)，p-YAP1(S127)(1:500，CY5743，Abways)，β-catenin(1:500，A5038，Bimake)，Notch1(1:500，A5176，Bimake)，Shh(1:500，A5115，Bimake)，PARP(1:500，A5037，Bimake)，GAPDH(1:500，40493-1，SAB)，β-actin(1:1000，BA2305，BOSTER)。

本发明实施例中，流式细胞仪分析的方法为：为了检测乳腺癌干细胞亚群，本发明使用了以下抗体：APC-anti-CD44(eBioscience，17-0441，1:167dilution)，FITC-anti-CD24(eBioscience，11-0247，1:20dilution)，APC-rat isotype control(eBioscience，174031，1:167dilution)，FITC-mouse isotype control(eBioscience，11-4714，1:20dilution)。将1×10

本发明实施例中，体外极限稀释实验方法为：将细胞以每孔1000、100和10个细胞的剂量接种到96孔超低附着培养皿中，重复24次，在干细胞培养基中培养7天。计数含有微球体的孔；使用极限稀释分析(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)计算和比较数据。

本发明实施例中，细胞活力测定的测定方法为：使用CCK-8试剂盒(CCK8，Dojindo，Japan)按照制造商给出的实验步骤检测细胞活力，即以每孔2000个细胞的密度接种到96孔板中在37℃下过夜。随后，将细胞用不同浓度的顺铂、多柔比星或他莫昔芬处理48小时后，将10μL的CCK-8试剂添加到培养了细胞的每个孔中。温育3小时后，用酶标仪(BioTek，Winooski，Vermont，USA))检测，在450nm处读板。所有实验均重复三次。

本发明实施例中，RNA稳定性分析的方法为：将细胞暴露于2μg/ml的转录抑制剂放线菌素D(Cayman Chemical，USA)中分别处理0、2、4、6或8小时以阻断转录，并以DMSO(Sigma-Aldrich，USA)作为对照试剂。在指定的时间点收集细胞样品后进行RNA提取，随后进行qRT-PCR实验分析PLA2G16 mRNA的表达水平。以0小时时间点PLA2G16 RNA含量为标准来量化每个时间点中剩余PLA2G16 RNA的量。

本发明实施例中，RNA pull-down的方法为：根据生产商的说明，使用Pierce

本发明实施例中，萤光素酶报告基因实验的方法为：将PLA2G16 3'-UTR序列插入PMIR-Reporter载体，称为PMIR-PLA2G16-3'-UTR。随后使用lipofectamine 2000(Invitrogen，USA)将PMIR-PLA2G16-3'-UTR和对照载体pRL-TK分别转染入lncROPM沉默的乳腺癌干细胞和lncROPM过表达的乳腺癌非干细胞。共培养36小时后，用双重萤光素酶报告系统(Promega，USA)检测萤光素酶活性。

本发明实施例中，脂质提取的方法为：按照Rahul Vijay Kapoore等人的方法，从细胞中提取脂质。即将细胞(每个实验组收集)用磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)洗涤两次，随后加入五倍体积预冷的60％甲醇水溶液和0.85％(w/v)碳酸氢铵来快速淬灭细胞；将淬灭的生物质在-9℃下以2500μg离心5分钟；随后除去上清液，收集细胞沉淀，在液氮中快速速冻后保存在-80℃以进行下一步分析。

本发明实施例中，通过UHPLC-QTOFMS进行脂质分析的方法为：通过超高效液相串联色谱四极杆飞行时间质谱系统(UHPLC-QTOFMS，Agilent 1290UHPLC+AB Triple TOF6600+)和购自Kinetex的C18色谱柱(Phenomenex，USA；2.1×100mm，1.7μm)，对提取的脂质进行了检测。流动相条件为：A:10mM HCOONH4 in ACN/H2O(v/v，6:4)，B:10mM HCOONH4 inACN/IPA(v/v，1:9)；程序设置为：0-12.0min，300μL/min，40％-100％B；12.0-13.5min，300μL/min，100％B；13.5-13.7min，300μL/min，100％-40％B；13.7-18.0min，300μL/min，40％B；MS参数为：Gas1:60psi；Gas2:60psi；Curtain Gas:30psi；温度：600℃；离子喷雾电压：TOF质量(Da)：5000V；TOF Masses(Da):Min＝200.0000，Max＝1200.0000。依据内部数据库中的数据，通过代谢物精确的质量和MS/MS光谱来鉴定脂质。

本发明实施例中，免疫组织化学染色的方法为：将石蜡包埋的切片进行脱蜡、再水化和封闭内源性过氧化物酶和非特异性结合位点。然后，将切片分别与多克隆抗体PLA2G16(1：100，Sangon Biotech)、KLF4(1：200，Proteintech)孵育，在4℃下过夜。随后，将切片与过氧化物酶抗兔IgG(ZSGB-BIO,China)在37℃下孵育30分钟后用二氨基联苯胺染色。最后用苏木素复染并密封后，使用Nikon Eclipse 80i显微镜(Tokyo，Japan)捕获图像。

本发明实施例中，建立乳腺微球体异种移植模型的方法为：动物实验已获得重庆医科大学动物护理与伦理委员会批准。将来1×10

本发明实施例中，统计分析使用GraphPad Prism 7.0软件(San Diego，CA，USA)进行统计分析，所有实验重复至少三遍，数据以平均值±标准差表示；采用双尾学生t检验评估两组间的统计学意义以及单因素方差分析(ANOVA)对不同组间的差异进行分析；使用Pearson相关分析分析变量间的相关性，P<0.05被认为具有统计学意义。

本发明实施例中，所用到的引物如下表1所示：

表1实施例所利用到的引物序列汇总表

实施例1 lncROPM筛选、定位及编码评估

本发明实施例研究了哪些lncRNAs在调节乳腺癌干细胞干性中扮演了重要的角色，利用lncRNA芯片检测了来自MCF7乳腺癌干细胞(CD44

代谢重塑已经被报导在调节干细胞命运和生物行为中扮演了重要的角色，本发明实施例利用生物信息学分析，分析结果如图2所示，筛选到了23个与在乳腺癌干细胞中与代谢通路相关的lncRNAs。其中，一个在乳腺癌干细胞中高表达的，定位于人类11q12.3-q13.1染色体，邻近于PLA2G16基因的，命名为lncROPM的长链非编码RNA，如图3所示，LncROPM由两个外显子连接组成，长度为573bp。

本发明实施例还使用CPAT和CPC系统对lncROPM进行编码潜力评估，结果显示lncROPM不具备编码能力，结果如表2和表3所示。

表2 CPAT编码潜力评估结果

表3 CPCT编码潜力评估结果

本发明实施例还利用qRT-PCR(定量荧光PCR)检测了来自各种不同乳腺癌细胞系(BT549、Hs578T、MDA231、MDA468、MDA436、MCF7、T47D)的癌干细胞和非干细胞中lncROPM的表达情况，结果如图4所示，干细胞与非干细胞相比，lncROPM在各种不同乳腺癌细胞系的癌干细胞中均高表达。

除此之外，本发明实施例还利用RNA Fish实验和亚细胞分离实验定位lncROPM，结果显示lncROPM主要定位于乳腺癌干细胞胞浆(如图5和图6所示)。

实施例2lncROPM促进乳腺癌或者其他肿瘤发展验证

本发明实施例利用TANRIC数据库(TCGA-BRCA，RNAseq data)中检索lncROPM在病人中的表达，结果如图7和图8所示，与存活的乳腺癌患者相比，lncROPM的平均表达水平在死于乳腺癌的患者中高表达(p<0.05)(如图7所示)；三年总体生存分析结果表明高表达的lncROPM与乳腺癌病人的不良预后显著相关(n＝607，p＝0.012)(如图8所示)。并且，在经过治疗的ER-PR-Her2-以及ER+PR+Her2-的乳腺癌病人中lncROPM的表达与总体生存率呈负相关，即lncROPM可能与药物耐受相关。

本发明实施例还利用qRT-PCR实验检测了50组乳腺癌组织和配对邻近正常乳腺组织中lncROPM的表达，结果如图9所示，与邻近正常乳腺组织相比，lncROPM在乳腺癌组织中显著高表达。

本发明实施例还收集了130例临床乳腺癌患者的标本，分析lncROPM的表达与临床病理因素之间的相关性，标本临床病理特征情况下表4所示。使用OLYMPUS IX70显微镜获取其代表性图像，如图10所示，lncROPM的表达与肿瘤大小(p＝0.016)、TNM分期(p＝0.002)、组织分级(p＝0.019)、淋巴结转移(p＝0.042)、肿瘤复发(p＝0.001)密切相关。

表4标本临床病理特征情况

表4中：实验组间的差异采用Mann-Whitney检验，表中的数据为平均值±标准差，其中，*p<0.05；**p<0.01。

本发明实施例还利用Pearson相关系数分析了在这些组织中lncROPM的表达与干性标志物的表达的相关性，结果如图11和图12所示，lncROPM在乳腺癌组织中与干性标志物SOX2和OCT4的表达成正相关。即肿瘤的组织分级反映了肿瘤的去分化程度，即干性情况。

本发明实施例还利用qRT-PCR实验检测了从原发性乳腺癌样本中分离到的乳腺癌干细胞与非干细胞中lncROPM的表达情况，结果如图13所示，与非干细胞相比，lncROPM在乳腺癌干细胞中高表达。

本发明实施例还收集了对化疗药物耐受与不耐受的乳腺癌组织进行qRT-PCR实验，结果如图14所示，表明与不耐受的乳腺癌组织相比，lncROPM在对化疗药物耐受的乳腺癌组织中显著高表达。

本发明实施例还通过TANRIC数据库分析，还发现lncROPM在其他类型的肿瘤中也具有重要的功能，结果显示，在肾透明细胞癌中，高表达的lncROPM与病人的不良预后密切相关(n＝515，p＝0.0030)；在头颈部鳞状细胞癌与卵巢浆液性囊腺癌中，lncROPM随着组织分级的增加表达也明显增加(如图15和图16所示)。

本发明实施例还利用qRT-PCR检测来自肾透明细胞癌、头颈部鳞状细胞癌、卵巢浆液性囊腺癌干细胞与非干细胞中lncROPM的表达，结果如图17、图18、图19所示，表明与非干细胞相比，lncROPM在肾透明细胞癌(如图17所示)、头颈部鳞状细胞癌(如图18所示)、卵巢浆液性囊腺癌(如图19所示)干细胞中高表达。

综上，本发明实施例表明lncROPM是一个促进乳腺癌或者其他肿瘤发生发展的重要的致癌基因。

实施例3 lncROPM促进乳腺癌干细胞的干性特征验证

本发明实施例探究了lncROPM在乳腺癌干细胞中的功能，在乳腺癌干细胞中用两条慢病毒介导的短发夹RNA(shRNAs)沉默了lncROPM(如图20所示)；同时在乳腺癌非干细胞中用慢病毒载体过表达lncROPM(如图21所示)。在乳腺癌干细胞中有效敲除lncROPM可以显著降低干性相关基因(SOX2，Nanog，OCT4，KLF4)的表达(如图22所示)、干细胞成球率(如图23所示)和干细胞大小(如图24所示)；而在非干细胞中过表达lncROPM显著促进干性相关基因(SOX2，Nanog，OCT4，KLF4)的表达(如图25所示)、干细胞成球率(如图26所示)和干细胞大小(如图27所示)。

本发明实施例还通过极限稀释实验在体内和体外检测了lncROPM对肿瘤起始频率的作用，结果如图28、图29、图30、31所示。干细胞中，体内实验结果表明lncROPM缺失显著降低乳腺肿瘤的起始频率(如图28所示)；体外实验结果表明lncROPM缺失显著降低乳腺肿瘤的起始频率(如图29所示)。而在非干细胞中，体内实验结果表明过表达lncROPM显著增加乳腺肿瘤的起始频率(如图30)；体外实验结果表明过表达lncROPM显著增加乳腺肿瘤的起始频率(如图31所示)。

综上，本发明实施例表明lncROPM促进乳腺癌干细胞的干性特征。

实施例4 PLA2G16是lncROPM的靶基因并且促进乳腺癌的发展与耐药

本发明实施例研究了lncROPM调节乳腺癌干细胞干性的潜在机制，利用生物信息学方法预测了lncROPM潜在的靶基因并发现其邻近基因PLA2G16可能是它的潜在靶基因。为了检测lncROPM能否影响PLA2G16的表达，利用qRT-PCR实验与western blotting实验检测了敲低与过表达lncROPM后靶基因PLA2G16的变化。实验结果表明，在乳腺癌干细胞中敲低lncROPM后靶基因PLA2G16在mRNA水平与蛋白水平均下调(如图32、图33所示)。而在非干细胞中过表达lncROPM后靶基因PLA2G16在mRNA水平与蛋白水平均增加(如图34、图35所示)。

本发明实施例还利用Pearson相关系数分析收集到的乳腺癌组织样本，结果如图36所示，表明在收集到的乳腺癌组织样本中lncROPM的表达与PLA2G16的表达成正相关。高表达的PLA2G16与晚期TNM分期(p＝0.004)、高组织分级(p＝0.026)、淋巴结转移(p＝0.039)、肿瘤复发(p＝0.005)密切相关，使用OLYMPUS IX70显微镜获取其代表性图像，如图37所示。同样地，与对化疗药物敏感的乳腺癌组织相比，PLA2G16在耐受病人的乳腺癌组织中高表达(如图38所示)。

本发明实施例还利用GEO数据库进一步检索，结果如图39所示，与对新辅助疗法有病理性完全应答(pCR)的患者相比，PLA2G16在对新辅助紫杉醇/放射治疗只有部分应答(pPR)的乳腺癌患者的肿瘤组织中PLA2G16高表达，表明PLA2G16与乳腺癌患者的不良预后及耐药密切相关。

综上，本发明实施例表明PLA2G16是lncROPM的重要靶基因，并且促进乳腺癌的发展和耐药。

实施例5 LncROPM通过增加PLA2G16 mRNA的稳定性来调节其表达验证

LncRNA的调节机制取决于它在细胞中的定位，本发明实施例1已经验证lncROPM主要定位于细胞胞浆，所以本发明实施例先假设lncROPM可能是在转录后水平调节PLA2G16的表达，然后对该假说进行验证。

(1)首先通过qRT-PCR实验检测了在MCF7/BT549乳腺癌干细胞中敲低lncROPM后PLA2G16前体mRNA和成熟mRNA的表达水平。结果如图40、图41、图42所示，lncROPM敲低后PLA2G16的成熟mRNA(包含3'-UTR区、CDS区和5'-UTR区)表达水平均显著降低，而PLA2G16的前体mRNA(包含内含子1、内含子2、内含子3)水平保持不变。

随后，通过序列比对分析，分析结果如下表5和图43所示，发现lncROPM可能与PLA2G16 mRNA的3'-UTR区域直接结合相互作用(energy＝-17.86kcal/mol)。

表5 lncROPM与PLA2G16 mRNA的3'-UTR区域结合情况

(2)进一步，进行了RNA-pull-down实验来检测lncROPM和PLA2G16之间的结合能力，结果发现与对照组探针相比，使用lncROPM探针可明显增加PLA2G16 3'-UTR区的富集，而不是5'-UTR区或CDS区。反过来，将PLA2G16 3'-UTR区分为两部分，利用针对这两部分的探针进行RNA-pull-down实验，结果如表6和图44所示，表明是PLA2G16的3'-UTR-1区而非3'-UTR-2可以与lncROPM特异性结合。

表6 PLA2G16 3'-UTR RNA-pull-down实验情况

本发明实施例还进行荧光素酶报告基因实验，结果如图45所示，证明了敲低lncROPM后会显着降低含有PLA2G16 3'-UTR区构建体的萤光素酶活性，而过表达lncROPM后会显著提高含有PLA2G16 3'-UTR区构建体的萤光素酶活性。

已经有文献报导3'UTR区对于mRNA的稳定性很重要，因此，本发明实施例还用转录抑制剂放线菌素D检测了lncROPM对PLA2G16 mRNA稳定性的影响，结果如图46所示，在缺失lncROPM的乳腺癌干细胞中，PLA2G16 mRNA的半衰期迅速降低，而在过表达lncROPM的乳腺癌非干细胞中PLA2G16 mRNA的半衰期明显增加。

综上，本发明实施例表明lncROPM可以与PLA2G16 mRNA的3'UTR区结合增强其稳定性，从而提高PLA2G16的表达水平。

实施例6 PLA2G16对lncROPM介导的促进乳腺癌干细胞干性调节验证

本发明实施例为了了解PLA2G16是否调节乳腺癌干细胞干性，利用qRT-PCR和Western blotting实验检测乳腺癌不同细胞系和临床肿瘤来源的癌干细胞与非干细胞中PLA2G16的表达，结果如图47所示，表明与非干细胞相比，PLA2G16明显在乳腺癌干细胞中高表达。

本发明实施例还利用Pearson相关系数分析，分析结果如48、图49所示，表明在本发明收集到的乳腺癌组织样本中PLA2G16的表达与干性相关基因(如SOX2和OCT4)的表达成正相关。

本发明实施例还使用两条慢病毒介导的短发夹RNA(shRNAs)构建了在乳腺癌干细胞中稳定敲低PLA2G16的细胞系(如图50、图51所示)以及用携带PLA2G16基因的慢病毒过表达载体构建了在乳腺癌非干细胞中稳定过表达PLA2G16(如图52、图53所示)的细胞系。还使用了吉利帕地，一种胞浆型磷脂酶A2的抑制剂，也可以抑制定位于细胞胞浆的PLA2G16的酶活性(如图54所示)。然后分析其与干性因素的关系，结果表明，在乳腺癌干细胞中有效地敲低内源性PLA2G16或使用吉利帕地显著降低了干性相关基因(SOX2，OCT4，KLF4)的表达(如图55所示)、干细胞成球率(如图56、图57所示)、干细胞大小(如图58所示)；而在非干细胞中过表达PLA2G16促进了干细胞成球(如图59、图60、图62所示)、干性相关基因(SOX2，OCT4，KLF4，β-Actin)的表达(如图61所示)。这些数据表明PLA2G16促进乳腺癌干细胞的干性特征。

本发明实施例为了进一步证实PLA2G16在干细胞中的作用，通过流式细胞术从乳腺癌细胞中分离出了高表达PLA2G16(PLA2G16

本发明实施例还利用GEO数据库进一步分析，结果显示在胚胎干细胞与其衍生的干细胞和胚状体中，PLA2G16在胚胎干细胞中表达最高(图65、图66所示)；同样地，在肝脏中，与已分化细胞的细胞相比，PLA2G16在肝脏干细胞中表达最高(如图67所示)；此外，PLA2G16在骨髓来源的肥大细胞中经干细胞因子刺激后表达明显上调(如图68所示)。

本发明实施例为了探究lncROPM是否是以依赖于PLA2G16的方式调节乳腺癌干细胞的干性特征，进行了回复实验。实验结果表明，在乳腺癌干细胞中过表达PLA2G16可以部分挽回由于缺失lncROPM所导致的干性相关基因表达的下调和干细胞成球率的降低；而在非干细胞中敲低PLA2G16可以下调由于过表达lncROPM所导致的干性相关基因表达的升高和干细胞成球率的增加。

综上，本发明实施例验证表明，PLA2G16参与调节干细胞干性，并可能成为乳腺癌干细胞甚至其他类型干细胞的标志物，即PLA2G16可能促进干细胞的自我更新和增殖。

实施例7 LncROPM通过调节PLA2G16所介导的磷脂代谢促进乳腺癌干细胞干性验证

据报道，PLA2G16参与磷脂代谢过程。本发明实施例探究了lncROPM是否是通过影响PLA2G16介导的磷脂代谢的改变而调节乳腺癌干细胞干性，以及哪些代谢产物对调节乳腺癌干细胞干性起到了关键作用，使用UHPLC-QTOFMS系统检测在乳腺癌干细胞中敲低lncROPM后以及在非干细胞中过表达lncROPM后脂质代谢组学的变化。结果显示，在乳腺癌干细胞中敲低lncROPM后PLA2G16的底物PC(磷脂酰胆碱)和PG(甘油磷酸甘油)含量明显增加，过表达lncROPM后PC和PG含量明显降低；而敲低lncROPM后代表性产物Cer(神经酰胺)和FFA(游离脂肪酸)含量显著降低，过表达lncROPM后Cer和FFA含量显著增加，表明Cer和FFA可能是lncROPM-PLA2G16驱动乳腺癌干细胞干性特征的关键代谢产物。由于在本发明中FFA的变化倍数最大，为了深入探究代谢产物对乳腺癌干细胞特征的影响，本发明实施例将对FFA进一步研究。在FFA中，代谢产物花生四烯酸(花生四烯酸)是变化最大的代谢产物(如表7和表8所示)。

表7 shROPM vs shCtrl代谢产物情况

表8 LV-ROPM vs LEV代谢产物情况

本发明实施例为了确认花生四烯酸与PLA2G16的关系，还测量了在乳腺癌干细胞中敲低PLA2G16后或用吉利帕地抑制PLA2G16酶活性后以及在非干细胞中过表达PLA2G16后花生四烯酸的含量，结果如图69、图70所示，结果显示花生四烯酸的含量变化受PLA2G16的调节，PLA2G16表达越活跃，花生四烯酸的含量越高；同时，与非干细胞相比，花生四烯酸在乳腺癌干细胞中明显富集(如图71所示)；此外，本发明实施例还发现花生四烯酸在晚期肿瘤组织、复发性肿瘤组织及耐药组织中明显富集(如图72所示)。验证了花生四烯酸对于维持乳腺癌干细胞干性至关重要，并可能在临床上作为乳腺癌恶性进展的生物标志物。

本发明实实施例为了进一步验证花生四烯酸对乳腺癌干细胞的作用，将外源性添加花生四烯酸以研究它的作用。外源性添加花生四烯酸后可以恢复由于敲低lncROPM或PLA2G16后引起的受抑制的干性相关基因(SOX2，OCT4和KLF4)的表达(如图73所示)和干细胞成球率(如图74、图75所示)。

本发明实施例还检查了干细胞经典相关信号通路(Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog、Hippo/YAP、PI3K/AKT)的变化，结果显示花生四烯酸可以激活PI3K/AKT，Wnt/β-catenin以及Hippo/YAP信号通路(如图76、图77所示)。

综上，本发明实施例验证了lncROPM-PLA2G16信号轴调节磷脂代谢，促进代谢产物花生四烯酸的产生，从而激活PI3K/AKT，Wnt/β-catenin和Hippo/YAP信号通路，从而促进乳腺癌干细胞的干性。

实施例8利帕地与化疗药物联用可有效消除乳腺癌干细胞验证

在本发明实施例中2的图14和图38显示，lncROPM和PLA2G16在乳腺癌耐药组织中高表达。

本发明实施例为了进一步验证lncROPM和PLA2G16对乳腺癌细胞药物耐受的作用，检测了化疗药物处理时乳腺癌细胞的存活情况。结果表明，敲低lncROPM或PLA2G16后会增加乳腺癌干细胞对化疗药物(多柔比星，顺铂，他莫昔芬)的敏感性，例如，敲低lncROPM或PLA2G16后会增加BT549乳腺癌干细胞对多柔比星(Doxorubicin)的药物敏感性(如图78所示)；敲低lncROPM或PLA2G16后会增加BT549乳腺癌干细胞对顺铂(Cisplatin)的药物敏感性(如图79所示)；敲低lncROPM或PLA2G16后会增加BT549乳腺癌干细胞对他莫昔芬(Tamoxifen)的药物敏感性(如图80所示)。同样，用吉利帕地处理乳腺癌干细胞有相似的结果。

本发明实施例进一步向缺失lncROPM或PLA2G16以及吉立帕地处理的乳腺癌干细胞中外源性添加花生四烯酸可以恢复干细胞对药物的耐药性，例如缺失lncROPM或PLA2G16以及吉立帕地处理的BT549乳腺癌干细胞中添加花生四烯酸后可以恢复干细胞对多柔比星(Doxorubicin)的药物耐药性(如图81所示)；缺失lncROPM或PLA2G16以及吉立帕地处理的BT549乳腺癌干细胞中添加花生四烯酸后可以恢复干细胞对顺铂(Cisplatin)的药物耐药性(如图82所示)；缺失lncROPM或PLA2G16以及吉立帕地处理的MCF7乳腺癌干细胞中添加花生四烯酸后可以恢复干细胞对他莫昔芬(Tamoxifen)的药物耐药性(如图83所示)。

本发明实施例，在非干细胞中过表达lncROPM或PLA2G16降低了细胞对化疗药物的敏感性，例如在BT549乳腺癌非干细胞中过表达lncROPM或PLA2G16后降低了细胞对多柔比星(Doxorubicin)的敏感性(如图84所示)；在BT549乳腺癌非干细胞中过表达lncROPM或PLA2G16后降低了细胞对顺铂(Cisplatin)的药物敏感性(如图85所示)；在MCF7乳腺癌非干细胞中过表达lncROPM或PLA2G16后降低了细胞对他莫昔芬(Tamoxifen)的药物敏感性。

本发明实施例还在来源于对他莫昔芬耐药的MCF7细胞、对顺铂耐药的MDA-MB-231细胞以及对多柔比星耐药的BT549细胞及其亲代细胞的干细胞中检测了lncROPM和PLA2G16的表达情况。结果如图87、图88所示，与亲代细胞相比，在这些具有强干性特征的耐药细胞来源的干细胞中lncROPM和PLA2G16显著高表达。

以上实施例表明，lncROPM、PLA2G16以及花生四烯酸促进乳腺癌干细胞对化疗药物耐受，并且吉利帕地可以通过抑制PLA2G16的酶活性来抑制乳腺癌干细胞的耐药性。

因此，本发明实施例还将吉利帕地与临床药物(多柔比星、顺铂或他莫昔芬)联合使用以消除乳腺癌干细胞。通过微球体形成实验显示吉利帕地与临床药物联用比通过单独地单一药物治疗更有效地减少了乳腺癌干细胞的数量，例如吉利帕地(Giripladib)与多柔比星(Doxorubicin)联合使用对BT549/Hs578T乳腺癌干细胞成球抑制优于单独使用(如图89、图90所示)；吉利帕地(Giripladib)与顺铂(Cisplatin)联合使用对BT549/Hs578T乳腺癌干细胞成球抑制优于单独使用(如图91、图92所示)；吉利帕地(Giripladib)与他莫昔芬(Tamoxifen)联合使用以对MCF7乳腺癌干细胞成球抑制优于单独使用(如图93、图94所示)。

本发明实施例进行了体内实验，在裸鼠中构建异种移植模型来进行验证。一致地，与单一治疗组相比，吉利帕地联合化疗药物(多柔比星)显著降低了肿瘤发生并抑制了肿瘤的生长(如图95、图96所示)。并且通过免疫组织化学(IHC)分析发现，在接受联合治疗的肿瘤中干细胞相关转录因子KLF4的表达显著降低(如图97所示)。

综上所述，本发明实施例显示，lncROPM、PLA2G16以及花生四烯酸促进乳腺癌干细胞的耐药性，吉利帕地与化疗药物的协同作用可通过抑制PLA2G16的活性来有效消除乳腺癌干细胞。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 重庆医科大学

<120> 非编码RNA、包含非编码RNA的RNA序列及其应用

<130> 2021-4-16

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atttttttag attccatata taagtgagat cacaaagtat gtgtctttct gtgcctggct 60

tatttcactg aacgtaatgt tctccaggaa aataactgtt atctgggaaa ctgcatttaa 120

agggaagctg tttgcaatgc ttctttgcac acaaggaaca gaatccacaa agttcacaac 180

aaggaacaga aaccacaaat ttcacaacat gacaacattc aaaatgggag tatgtctcaa 240

gtgctccacc agccagctga atgcagggtt ttcacaggtg taaaacatgt gactatgcca 300

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gtataacttc cttctgaatc ccctttgaaa cccaagtcct actgaagagg aaagagaaca 420

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cagcactttg ggaggctgag gcgggcggat cac 573

<210> 2

<211> 849

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ctgaaaaaga ctgtcctgtc agcgatgact ttatacatca agggggtctt gttttgctag 60

agagtttggg gtttggtttg tggatttcat tgtgatttat aataaggctt attttcacag 120

aataaaataa agcaaaacga gggaggattt tattggggga agtgcagcaa gaactgcctg 180

gtgtgaagtc tgttcaggga acagccgggc tgtcttcctg gtcagggatt gtctttcact 240

ttctttttgc gtgctgtgtt ctttgcattg caggaggcag agtccagctc cagttatctc 300

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ttggctacct ttgggtcagg tgatctccac tagacctatc gcctatgcct gatggtgggt 840

cacatggtg 849