一种基于纳米复合材料检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法

摘要

一种基于纳米复合材料检测1,5‑AG的方法，以吡喃糖氧化酶(PROD)为识别分子，PROD与1,5‑AG的特异性结合，形成一种RGO‑CMCS‑Hemin/Pt NPs纳米复合材料。再基于该材料良好电子传递效应和优异的催化性能，构建一种能对1,5‑AG特异性识别和定量分析的电化学生物传感器。该方法具有较低的检测限，能达到0.0384mg/mL。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料检测1,5-脱水葡萄糖醇的方法。

背景技术

目前检测1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）的方法有全酶法，反相色谱法，液质联用分析法（LC/MS)，酶联免疫法（ELISA)等。公开号为CN 108918447A的发明专利，涉及了一种基于QCM的检测1,5-AG的传感器及检测方法，但该方法对石英晶振片的处理过程复杂。公开号为CN 110702676A的发明专利，涉及了一种1,5-AG的检测试剂盒及方法，通过选择适宜的方法和稳定剂使试剂R1和试剂R2在高葡萄糖浓度的干扰下保持稳定，通过吡喃糖氧化酶法测定人体血清样本中的1,5-AG含量；但该方法操作复杂，成本较高。因此，需要开发一种简便、快速检测1,5-AG的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于还原性氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-血红素/纳米铂（RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs）的纳米复合材料构建电化学传感器，实现1,5-AG检测的方法。

为了解决该技术问题，利用一步还原法制备RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料，采用层层自组装方式将RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料和1,5-AG在吡喃糖氧化酶（PROD）固定在修饰纳米金的丝网印刷电极表面，构建了基于RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs的电化学生物传感器。1,5-AG在PROD的催化作用下，生成1,5-脱水果糖和过氧化氢(H

本发明按以下步骤进行：

步骤1：RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料的制备

（1）还原性氧化石墨烯（RGO）的制备

称取单层氧化石墨烯（GO）置于蒸馏水中混匀，加入抗坏血酸（AA）进行还原，得还原性氧化石墨烯（RGO）。

（2）RGO-CMCS的制备

在RGO溶液中加入羧甲基壳聚糖溶液，超声混匀，得RGO-CMCS分散液。

（3）RGO-CMCS-Hemin的制备

在RGO-CMCS分散液加入氯化血红素，搅拌混匀，得到还原性氧化石墨烯-羧甲基壳聚糖-血红素（RGO-CMCS-Hemin）溶液。

（4）RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料制备

在RGO-CMCS-Hemin分散液中加入氯铂酸钠和抗坏血酸，搅拌并离心洗涤，即得到RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料。

步骤2：电化学传感界面的构建

(1)将丝网印刷电极（SPCE）置于稀硫酸溶液中活化。

(2)将活化后的SPCE置入氯金酸溶液中，进行恒电位沉积，得到Au NPs/SPCE。

(3)在Au NPs/SPCE电极上滴加RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料悬浊液孵育，洗涤晾干，得到RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs/Au NPs/SPCE。

(4)取PROD滴加在RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs/Au NPs/SPCE上，孵育洗涤，得到PROD/RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs/Au NPs/SPCE传感界面，晾干备用。

步骤3：1,5-AG工作曲线的绘制

(1)将标准1,5-AG溶液滴加到步骤2得到的PROD/RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs/AuNPs/SPCE传感界面，孵育洗涤，得到工作电极，晾干备用。

(2)将工作电极放入PBS溶液中，采用差分脉冲伏安法（DPV）进行扫描，记录传感器的响应电流值。

(3)分别对不同浓度的1,5-AG进行检测，记录峰电流，根据峰电流和1,5-AG浓度的关系绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限。

步骤4：实际血清样本中1,5-AG的检测

(1)将正常人血清样本以1:1的比例与1,5-AG标准溶液充分混合，制成混合液，在步骤2制备的传感界面滴加待测混合液，孵育洗涤，得到工作电极，晾干备用。

(2)将工作电极放入PBS溶液中，采用差分脉冲伏安法（DPV）进行扫描，记录传感器的响应电流值。

(3)根据步骤3所得到的工作曲线，计算待测实际血清样本中1,5-AG的浓度。

其中，步骤1为步骤2提供一种高导电率的纳米复合材料。步骤2中生物传感界面的构建是步骤3和步骤4中1,5-AG电化学检测中必不可少的关键步骤。步骤3的1,5-AG的工作曲线为步骤4的实际血清样本中1,5-AG浓度的测定提供计算依据。可见步骤1-4相互支撑，共同作用，才能利用以RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料实现1,5-AG的检测。

本发明与现有技术相比具有如下优点：

1. 本发明所制备的RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs纳米复合材料具有独特的膜状结构，较大的比表面积、较强的催化活性以及较高的导电性，其中, RGO-CMCS-Hemin纳米复合材料的大比表面积为Pt NPs以及PROD提供了有效的结合位点，加大PROD酶在电极的固定，增强对1,5-AG的催化效率，提高了检测灵敏度。此外，利用CMCS的良好生物相容性和成膜能力、RGO的高比表面积和高电子转移效率、Hemin的过氧化物酶性能以及纳米铂（Pt NPs）的优异催化，通过协同作用形成具有高效类过氧化物酶性能的RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料，可高效催化分解H

2. 本发明采用PROD对1,5-AG的特异性识别和催化分解，构建基于RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料的纳米电化学传感器；该传感器能达到0.0384mg/mL的检测限。

附图说明

图1基于RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs纳米复合材料检测1,5-AG的原理图；

图2 RGO-CMCS-Hemin（A）和RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs（B）的透射电镜（TEM）图；

图3电极表面修饰过程的扫描电镜（SEM）表征图；

图4不同1,5-AG浓度的DPV曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一种基于RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs纳米复合材料检测1,5-AG的检测原理见图1。首先，利用CMCS的良好生物相容性和成膜能力、RGO的高比表面积和高电子转移效率、Hemin的过氧化物酶性能以及纳米铂（Pt NPs）的优异催化，通过协同作用形成具有高效类过氧化物酶性能的RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料；采用层层自组装方式将RGO-CMCS-Hemin/PtNPs复合材料和1,5-AG在吡喃糖氧化酶（PROD）固定在纳米金修饰的丝网印刷电极表面，构建了基于RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs的电化学生物传感器。PROD 与1,5-AG特异性结合催化生成双氧水(H

具体实施步骤如下：

1. RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料的制备

首先，称取6mg氧化石墨烯（GO），置于蒸馏水中定容至60 mL，使用超声细胞破碎仪超声1 h使其充分溶解均匀，制成 0.1 mg/mL的GO水溶液。随后加入10 mg 抗坏血酸（AA）搅拌还原20 h，即得RGO溶液。

其次，加入20mg CMCS到RGO溶液中，超声破碎30min，获得混合均匀的RGO-CMCS分散液。

第三，在RGO- CMCS溶液加入10mL 1mg/mL的Hemin溶液，超声破碎 1h使其充分混匀，得到RGO-CMCS-Hemin分散液。

第四，在RGO-CMCS-Hemin分散液中加入4ml 0.01mg/mL的氯铂酸钠，边搅拌边加入抗坏血酸10mg，搅拌20h，得到RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs悬浊液。

最后，离心洗涤，并于70

采用美国FEI公司生产的Tecnai G2 F30 S-TWIN透射电子显微镜（TEM）对RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料进行表征分析，见如图2所示。图2A为RGO-CMCS-Hemin的TEM图，可以看出RGO-CMCS-Hemin是较为平整的膜状褶皱结构。图2B为RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs的TEM图，膜状褶皱结构中出现深颜色的小颗粒且更加清晰平整，这说明RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs复合材料制备成功。

电化学生物传感界面的构建

丝网印刷电极（SPCE）在使用前首先浸泡在0.5 mol/L H

采用日本日立公司生产的SU8020扫描电镜对电极表面的修饰过程进行表征。典型的扫描电镜图（SEM）如图3所示，图3A是SPCE，表面较为平整。图3B是Au NPs/SPCE，可观察到表面有许多闪亮的小颗粒物质，说明纳米金沉积到丝网印刷电极上。图3C是RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs/Au NPs/SPCE，相对图3B，闪亮的小颗粒物质减少，出现包裹状，这是由于RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs附着造成的；图3D明显看到白色片状结构，说明PROD已经成功的附着在RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs/Au NPs/SPCE上，上述现象均表明已经成功的制备了1,5-AG传感器。

工作曲线的绘制

在PROD/RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs/Au NPs/SPCE传感界面滴加3µL 1,5-AG溶液，37℃温度下孵育30min，用pH7.4的PBS溶液和蒸馏水交替洗涤并吹干，得到1,5-AG/PROD/RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs/Au NPs/SPCE。SEM图见图3E。对比图3D，有明显可见的小点点，这表示1,5-AG已通过和PROD特异性结合，成功固定到了电极表面。

将1,5-AG/PROD/RGO-CMCS-Hemin/Pt NPs/Au NPs/SPCE置于PBS缓冲液（0.2 mol/L， pH 7.4）中，采用电化学工作站的DPV扫描，记录其峰值电流。不同1,5-AG浓度的DPV曲线图见图4。1,5-AG的浓度从0.1 mg/mL到2 mg/mL内，传感器的电流响应值与1,5-AG的浓度呈线性关系，线性方程Y=4.01372+2.18401X（其中y为电流峰电位响应强度，x为1,5-AG浓度），R² = 0.98229。通过公式C

实际血清样本中1,5-AG的检测

将正常人血清样本以1:1的比例分别与0.5 mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg/mL的1,5-AG标准溶液充分混合，制成混合液。分别滴加3 μL上述混合液到PROD/RGO-CMCS-Hemin/PtNPs/Au NPs/SPCE表面形成工作电极。按照步骤3所述，将工作电极置于PBS缓冲液中，采用DPV进行扫描，记录其电流值。根据步骤3的标准曲线Y=4.01372+2.18401X，计算可得到对应的实际血清样本中1,5-AG的浓度，检测结果见表1。其回收率在99.25-107.60%范围内，RSD值为1.80-6.14%。这些结果表明，所开发的1,5-AG电化学传感器具有良好的应用前景。

表1实际血清样本中1,5-AG的检测结果

（注：血清样本由中国人民解放军联勤保障部队第九二四医院提供）。