与草莓花瓣脱落快慢性状相关的KASP分子标记及其应用

摘要

本发明公开了一种与草莓花瓣脱落快慢性状相关的KASP分子标记及其应用，所述的分子标记位于草莓2‑2号染色体，在第776356bp处碱基A突变成G，基因型为GG的草莓表现为花瓣脱落快，在F1群体及资源群体中进行基因型和表型间相关性的验证，结果表明，该分子标记可用于草莓花瓣脱落的早期分子辅助选择，对于加快草莓通过选育花瓣脱落快的品种实现绿色生产具有重要的理论和实践指导意义。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种与草莓花瓣脱落快慢性状相关的分子标记及应用。

背景技术

草莓是一种重要园艺类经济作物，在全世界范围内广泛种植、营养价值高且生产周期短。中国是世界第一大草莓生产国和消费国，2018年中国草莓种植面积11万公顷，产量达296万吨(FAO,2018)。灰霉病是导致草莓产量损失最为严重的病害之一，在草莓生长期和贮藏期均可发生，造成草莓年产量损失至少10％～30％，严重时高达50％以上。灰霉病菌可侵染草莓的茎叶、花以及果实等几乎所有地上部分，其中衰老的花瓣是灰霉菌侵染的重要途径。我们前期研究发现摘除草莓果实上衰老花瓣可降低果实灰霉病的发病率。田间试验表明草莓现蕾后第7天花瓣脱落率与果实灰霉病发病率呈显著负相关，不同草莓品种花瓣脱落快慢不同，因此通过选育花瓣脱落快的草莓品种可以有效降低草莓灰霉病的发病率，从而降低农药使用量和生产成本，有效实现草莓的绿色安全生产和增加经济创收。

分子标记辅助选择是一种可以实现快速选育出具有特定性状品种的方法，它依赖于与目标基因紧密连锁的分子标记。目前，涉及草莓花瓣脱落快慢的研究极少，因此，要想实现花瓣脱落的分子辅助育种，挖掘调控草莓花瓣脱落快慢的遗传位点、关键基因以及相关的分子标记迫在眉睫。本发明通过对草莓花瓣脱落分离群体进行Bulked Segregant RNAsequencing(BSR)定位，并从中筛选出了关键基因，根据关键基因序列设计开发了KASP引物，经验证该引物可对草莓花瓣脱落快慢进行辅助选择。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的是定位草莓花瓣脱落快慢的遗传位点，鉴定出遗传位点内候选基因，基于候选基因SNP信息开发KASP分子标记，并在群体中进行基因型和表型间相关性的验证，辅助于筛选草莓花瓣脱落快和慢的品种，加快育种进程。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

与草莓花瓣脱落快慢性状相关的KASP分子标记，所述分子标记位于草莓八倍体基因组上的2-2号染色体，在第776356bp处碱基A突变成G，基因型为 GG的草莓表现为花瓣脱落快。

用于扩增上述KASP分子标记的特异性引物的序列如SEQ ID NO.2-4所示。

上述KASP分子标记在草莓花瓣脱落快慢性状鉴定或分子育种中的应用，包括以下步骤：

(1)提取待测草莓的基因组DNA；

(2)以待测的草莓基因组DNA为模版，利用上述引物进行PCR扩增反应；

(3)PCR反应结束后，收集每个反应孔产生的荧光信号，根据荧光信号的类型判断分子标记的基因型，若KASP分子标记的基因型为GG，则该草莓表现为为花瓣脱落快，若检测的基因型为GA，则表现为花瓣脱落慢。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了一种根据定位草莓花瓣脱落的遗传位点、筛选遗传位点中的关键基因以及利用关键基因的SNP信息开发KASP标记的方法，该方法可将遗传位点以及关键基因转换为可供分子育种用的分子标记序列，为实现分子辅助育种选择花瓣脱落快慢的品种奠定了重要基础和必要的前提。

(2)利用本发明开发的KASP标记引物，对花瓣脱落分离群体进行检测， 13个样本中，花瓣脱落快的共有6个样本，基因型全部为GG，花瓣脱落慢的共有7个样本，其中6个为GA，1个为GG，标记与表型的符合率为92.3％。

(3)利用本发明开发的KASP标记引物，对资源材料进行了检测，花瓣脱落快慢与基因型相符的有14个，占比82.4％。

附图说明

图1为本发明实施例1中BSR定位结果。上下两幅图分别是欧氏距离和 SNP-Index计算方法计算的定位结果，图中虚线表示的阈值线，红色箭头标示的是在两种方法中均定位出的位于2-2号染色体上的控制草莓花瓣脱落快慢的遗传位点，关键候选基因maker-Fvb2-2-augustus-gene-7.55位于该位点。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

该实施例提供草莓花瓣脱落基因相关KASP分子标记获得的方法，具体包括如下步骤：

(1)花瓣脱落分离群体的构建以红颜为母本，其花瓣在14天脱落率达80％以上，父本为甜查理，28天的花瓣脱落率低于80％，群体各单株种植后于开花期鉴定花瓣脱落的快慢；

(2)根据上述鉴定结果，分别挑选出花瓣脱落快和慢的单株，利用BulkedSegregant RNA sequencing(BSR)方法进行定位，获得调控草莓花瓣脱落快慢的位点；

(3)从(2)中定位到的位点中挑选出候选基因，并根据候选基因序列及SNP 信息设计KASP引物序列，并在F1群体和其它草莓资源中检测其与花瓣脱落快慢的相关性；

(4)根据(1)中的结果，挑选花瓣脱落快和慢的各15个，组成混池，进行BulkedSegregant RNA sequencing(BSR)分析，并分别用欧氏距离和SNP-Index 方法对BSR数据进行生物信息学分析，鉴定出两种方法均能定位出的位点，包括位于2-2号染色体上的遗传位点，如附图1所示；

(5)根据(3)中分析结果，结合文献，从位于2-2号染色体的0-2.01Mb 区间中的365个基因中筛选出位于2-2号染色体中的候选基因 maker-Fvb2-2-augustus-gene-7.55；该基因有24个SNP，在776356bp处有一个A (甜查理及脱落快)到G(红颜及脱落快的混池)的SNP变异，提取该SNP位点处上下游100bp的序列(SEQ ID NO.1)，据此设计KASP引物；Fvb2-2_776356 的正向引物F1：5’-ACTATACCTGGTGAATAATGCCATCT-3’(SEQ ID NO.2)；正向引物F2：5’-CTATACCTGGTGAATAATGCCATCC-3’(SEQ ID NO.3)；反向引物R1：5’-AGCTTTGCAGAAAACGATAGCATTGCAA-3’(SEQ ID NO.4)，正向引物F1和F2的5’端分别连接荧光标签序列FAM (GAAGGTGACCAAGTTCATGCT)和HEX(GAAGGTCGGAGTCAACGGATT)；

(6)用上述KASP引物检测F1分离群体中花瓣脱落快和慢的基因型，PCR 体系为(以1μl为例)：DNA模板10ng，0.5μL 2×KASP master mixture和0.014μL 混合引物。PCR程序采用Touchdown PCR程序：94℃预变性15min，然后进行10个Touch down循环(94℃变性20s，61℃为起始退火温度，每个循环降低0.6℃，延伸时间为60s)，随后26个循环为94℃变性20s，55℃退火，延伸60s。

酶标检测PCR结果显示：13个样本中，花瓣脱落快的共有6个样本，基因型全部为GG，花瓣脱落慢的共有7个样本，其中6个为GA，1个为GG，标记与表型的符合率为92.3％，具体结果见表1。

表1 F1群体花瓣脱落及KASP引物检测结果

实施例2

将实施例1中得到的KASP引物进行草莓花瓣脱落快慢鉴定的广泛性验证，具体步骤如下：

(1)选取不同群体单株或草莓资源材料共17份，于开花季节统计花瓣脱落快慢；

(2)提取草莓材料基因组DNA，利用本发明开发的KASP标记引物进行 PCR扩扩增，PCR扩增和检测方法与实施例1中相同，结果见表2，17份草莓资源材料中花瓣脱落快慢的表型结果与基因型结果相符的有14个，占比82.4％。

表2草莓资源材料花瓣脱落及KASP引物检测结果

以上所述仅是本申请的具体实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本申请的保护范围。

序列表

<110> 湖北省农业科学院经济作物研究所

<120> 与草莓花瓣脱落快慢性状相关的KASP分子标记及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)

<223> r=A或G

<400> 1

ataggtgctt ttgatcactt tgaagatctt tcagggcact ctttcaccgc aactgagttt 60

gaagaattac cagctttgca gaaaacgata gcattgcaac rgatggcatt attcaccagg 120

tatagtgggt acatttgttt ggtaccttgt atgtcttcat ataagtttag gtatataaca 180

agtggtttat ctaacttaag c 201

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actatacctg gtgaataatg ccatct 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctatacctgg tgaataatgc catcc 25

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agctttgcag aaaacgatag cattgcaa 28