一组快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的引物及应用

摘要

本发明公开了一组快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的引物及应用，包括引物组：一组LDR引物LDR‑1、LDR‑2和一组PCR引物LDR‑UF、LDR‑UR，各条引物均为单链DNA分子；本发明将连接酶检测反应与聚合酶链式反应联用，可以检测长度低至40nt、高度降解的碎片化RNA中所含有的点突变，而现有逆转录‑荧光定量PCR技术只能检测长度在100nt以上的RNA模板。

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学与分子生物学领域，具体为快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的特异性引物及检测方法。

背景技术

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)所引发疾病(COVID-19)是新中国成立以来传播速度最快、感染范围最广、防控难度最大的重大突发公共卫生事件，也是世界卫生组织认定的全球大流行传染病。

新冠病毒属于单链正义RNA病毒，在复制过程中十分容易发生突变，目前研究者已经发布了近8万个新冠病毒基因序列。尽管绝大多数基因突变都不会影响病毒的毒性和传染性，但据报道，新冠病毒 S蛋白的D614G突变，可显著增强病毒的感染能力，并且降低了病毒对患者恢复期血清的敏感性。如何在病毒核酸检测时快速区分这些 SNP位点，一直是研究者关注的重要问题。

新冠病毒的遗传物质为单链RNA，相对双链DNA而言更加不稳定。当采样、核酸提取和保存过程中操作不当，或存在核酸酶、酸、碱等物质时，很容易降解，断裂为小片段。目前主要的核酸SNP检测手段主要包括荧光定量PCR和测序法等。

目前主流的核酸SNP检测手段包括探针法荧光定量PCR和测序法。测序法最为准确，但耗时较长，不利于临床快速检测。探针法荧光定量PCR检测RNA病毒上的点突变，首先需要将病毒RNA逆转录为cDNA，然后使用一对根据突变位点上下游设计的PCR引物，以及一条覆盖突变位点的Taqman-MGB荧光探针进行荧光定量PCR。由于Taqman探针需要设计在两条引物之间，探针法荧光定量PCR需要的模板长度一般不低于100nt，如果病毒核酸在提取和保存过程中受到破坏，碎片化程度较严重，则难以检测。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的缺陷，利用连接酶检测反应 (LDR)技术结合荧光定量PCR技术，提供快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的特异性引物及检测方法，以解决上述背景技术提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变的特异性引物，包括检测新冠病毒S基因的LDR 引物组LDR-1、LDR-2和PCR引物组LDR-UF、LDR-UR，各条引物均为单链DNA分子；所述LDR引物组包含2条引物，其中LDR-1 的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.1，LDR-2的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.2；所述PCR引物组包含2条引物，其中LDR-UF的核苷酸碱基序列为SEQ ID No.3，LDR-UR的核苷酸碱基序列为SEQ IDNo.4。

引物组在快速检测碎片化新冠病毒S基因点突变中的应用，

具体的检测方法如下：

步骤一：获取病毒RNA；

步骤二：以步骤一获取的RNA为模板，加入权利要求1所述的 LDR引物对LDR-1/LDR-2配制LDR反应混合液，进行LDR反应；

步骤三：使用权利要求1所述的PCR引物LDR-UF和LDR-UR 对步骤二的反应产物进行荧光定量PCR反应，然后进行结果评判。

所述步骤二中的LDR反应中，所用的耐热连接酶可以是Taq ligase或Tth ligase。

本发明的有益效果是：本发明可以检测长度低至40-50nt、高度降解的RNA中所含有的点突变，而现有逆转录-探针法荧光定量PCR 技术只能检测长度在100nt以上的RNA模板。

附图说明

图1为本发明LDR-qPCR反应原理图；

图2为本发明LDR引物探针设计图；

图3为本发明不同长度RNA模板LDR-qPCR扩增曲线图。

注：A.模板区50nt与探针区(50nt)完全匹配；B.模板区50nt 相对探针区(50nt)向上游移动5nt；C.模板区50nt相对探针区(50nt) 向上游移动10nt；D.模板区50nt与相对探针区(50nt)右移向下游移动5nt；E.模板区50nt与相对探针区(50nt)向下游移动右移10nt；F.NTC(不加模板)。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明提供一种技术方案：快速检测新冠病毒S基因点突变的特异性引物，包括一组LDR引物LDR-1、LDR-2和一组PCR引物 LDR-UF、LDR-UR，各条引物均为单链DNA分子；其核苷酸序列分别为表1中的SEQ No.1、SEQ No.2、SEQ No.3和SEQ No.4

具体的检测方法如下：

步骤一：获取待测样品中的病毒RNA；

步骤二：以步骤一获取的RNA为模板，同时设置野生型新冠病毒S基因RNA为对照，分别加入引物对LDR-1/LDR-2配制LDR反应混合液，进行LDR反应；

步骤三：使用引物对LDR-UF/LDR-UR对步骤二的反应产物进行荧光定量PCR反应，然后进行评判。

所述步骤二中LDR反应混合液包括：耐热DNA连接酶、RNA 模板、LDR引物、反应缓冲液和去离子水；所述步骤二中的LDR反应中，所用的耐热连接酶可以是Taq ligase或Tthligase；所述步骤二中的LDR反应液中，引物的工作浓度可以是0.5-10nmol/L；所述步骤二中的LDR反应程序为：①95℃3分钟，②95℃30秒，③58℃ 4分钟；其中②③重复30-40个循环。

所述步骤三中的评判方式为：如果待测样品RNA经过 LDR-qPCR反应后Ct值显著低于野生型，则说明样品RNA带有 D614G突变；反之则说明样品RNA不含有D614G突变。

实施例1：

检测长度仅为50nt的新冠病毒S基因模板。

1.操作步骤：

(1)将含有新冠病毒S基因D614G突变靶标片段的重组质粒进行体外转录，获取含有D614G点突变、长度为50nt RNA片段，用来模拟碎片化病毒RNA。

(2)将(1)中获取的RNA模板与引物对LDR-1/LDR2配制LDR 反应混合液；设置使用(1)同样方法获取的50nt野生型S基因RNA 作为对照，分别进行LDR反应。LDR反应混合液包括：耐热DNA 连接酶、RNA模板、LDR引物对、10X反应缓冲液和去离子水。LDR 反应混合液中各个成分的加入量见表2。然后开始进行LDR反应，反应程序为：①95℃3分钟，②95℃30秒，③58℃4分钟。其中步骤②③重复35个循环，具体反应程序见表3。

表2 LDR反应体系

表3 LDR反应程序

(3)使用引物LDR-UF和LDR-UR对步骤(2)的反应产物进行荧光定量PCR反应检测。

2.结果分析：

检测结果见附图3A所示:含有D614G突变的模板经过 LDR-qPCR反应后可观察到显著扩增，其Ct值比野生型低约8个循环，表明本发明所述特异性引物组，可以检测高度降解(片段长度50nt) 的新冠病毒S基因中D614G突变。

实施例2

模板长度小于引物组，仍可检测到突变：

1.操作步骤：

(1)使用不同引物将含有新冠病毒S基因靶标片段的重组质粒进行体外转录，获取含有D614G点突变、长度为50nt的不同RNA 片段，模拟与LDR引物探针区不完全匹配的碎片化病毒RNA(图2)。

(2)以(1)中获取的RNA为模板，与引物对LDR-1/LDR2配制LDR反应混合液，同时以50nt野生型S基因RNA作为对照，分别进行LDR反应。LDR反应体系和程序同表2与表3。

(3)使用引物LDR-UF和LDR-UR对步骤(2)的反应产物进行荧光定量PCR反应检测。

2.结果分析：

实验结果见附图3B-E所示。尽管模板和引物探针区域不完全匹配，但以含有D614G突变的RNA为模板的扩增曲线Ct值仍然比野生型低8个循环，表明使用本发明所述特异性引物组检测碎片化新冠病毒S基因中D614突变时，最低检测模板长度可以达到40nt，远低于普通探针法荧光定量PCR所需的模板长度。

上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。