用于非病毒递送用于基因编辑和视网膜基因治疗的质粒DNA的聚(β-氨基酯)纳米颗粒

摘要

公开了用于将编码基因编辑因子的核酸或与治疗性蛋白相关的核酸递送至细胞的可生物降解颗粒，以及用于在体内或离体基因编辑或用于治疗视网膜眼病的基因治疗的组合物、方法、系统和试剂盒。

说明书

联邦赞助研究或开发

本发明是在由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的拨款号EB016721、EB022148和EY001765以及美国科学基金会(National ScienceFoundation)的奖学金DGE-0707427和DGE-1232825的政府支持下完成的。美国政府对本发明具有某些权利。

背景

在基因编辑中，在体内或离体在活细胞的基因组中对DNA进行插入、缺失、修饰或替换。基因编辑可以用来纠正导致人类疾病的遗传突变。例如，CRISPR/Cas9系统可以指导位点特异性基因破坏。Cas9内切核酸酶在由单个引导RNA(single guide RNA，sgRNA)指定的位点处引入双链断裂，并且基因破坏是通过引入引起移码突变(frame-shift mutation)的插入/缺失(indel)或通过去除基因的大的区段发生的。虽然基因编辑平台(包括CRISPR/Cas9)具有巨大前景，但在体内或离体将基因编辑因子有效和/或高效地递送至细胞仍具有挑战性。

此外，基因治疗具有治疗获得性和遗传性致盲性疾病的潜在前景，因为迄今为止大多数鉴定出的疾病与视网膜色素上皮(RPE)细胞有关。参见Bainbridge等人,2006。简单地通过关闭或开启其功能来调节特定的基因靶已经成为增强干细胞分化或从体细胞重编程诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)的标准工具。参见Jia等人,2010；Nauta等人,2013。常规的基因治疗方法利用病毒载体来递送pDNA。然而，这种方法受到若干因素的限制。为了克服这些挑战并寻求一种替代的更安全的方法，已经进行了大量的尝试来配制和开发可生物降解的非病毒媒介物剂，以促进感兴趣的基因向靶位点的递送。然而，这些方法受到转染功效差的限制。

概述

在一些方面，本公开内容的主题提供了一种组合物，该组合物包含式(I)或式(II)的聚(β-氨基酯)(PBAE)：

和至少一种包含编码基因编辑蛋白或治疗性蛋白的核酸序列的DNA或RNA分子；

其中：

n和m各自独立地是1至10,000的整数；

每个R独立地是具有以下结构的二丙烯酸酯单体：

其中R

每个R*是选自由以下组成的组的三丙烯酸酯单体、四或六官能丙烯酸酯单体：

其中每个R'独立地是三价基团；每个R"独立地是包含伯胺、仲胺或叔胺的侧链单体；并且每个R'"独立地是包含伯胺、仲胺或叔胺的端基单体。

在其他方面，本公开内容的主题提供包含在药学上可接受的载体中的式(I)或式(II)的组合物的药物制剂。在特定方面，制剂包含式(I)或式(II)的PBAE的纳米颗粒或微米颗粒。

在又其他方面，本公开内容的主题提供包含式(I)或式(II)的组合物的试剂盒。在某些方面，试剂盒包含组合物的一个或更多个多剂量单位、药学上可接受的载体、用于施用组合物的装置、使用说明及其组合。

在一些方面，本公开内容的主题提供用于基因编辑的方法，该方法包括使细胞与式(I)或式(II)的组合物接触，其中该组合物包含至少一种包含编码基因编辑蛋白的核酸序列的DNA质粒。

在其他方面，本公开内容的主题提供一种用于治疗视网膜眼病的方法，该方法包括向需要相应治疗的受试者施用式(I)或式(II)的组合物，其中该组合物包含用于治疗视网膜眼病的治疗性蛋白。

在某些方面，视网膜眼病包括遗传性视网膜眼病。在特定方面，视网膜眼病选自由以下组成的组：年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括湿性黄斑变性和干性黄斑变性、2型利伯氏先天性黑蒙症(LCA2)、无脉络膜症、全色盲、色素性视网膜炎(RP)、斯塔加特病(Stargardtdisease，STGD)、乌谢尔综合征(Usher syndrome)、青少年X连锁视网膜劈裂症(XLRS)和糖尿病性视网膜病变。

本公开内容的主题的某些方面已经在上文陈述，其通过本公开内容的主题被全部或部分地阐述，当与所附实施例和附图一起考虑时，其他方面随着描述进行将变得明显，如在下文最佳描述的。

附图简述

本专利或申请文件包含至少一幅以彩色展示的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在依请求和支付必要费用后由主管局提供。

已经如此概括地描述了本公开内容的主题，现在将参考附图，附图不必按比例绘制，并且其中：

图1A是示出当eGFP基因与本公开内容的携带编码sgRNA的核酸(“sgGFP”)和编码Cas9的核酸的PBAE纳米颗粒(“PBAE NPs”)接触时，该基因的敲除的示意图；

图1B是示出通过CRISPR-纳米颗粒转染切除600bp终止盒(STOP cassette)的示意图。sg1表示sgRNA指导的切割位点。终止盒的切除允许红色增强纳米灯笼(Red-enhancedNanoLantern，ReNL)的编码序列的表达；

图2A是示出用本公开内容的携带编码Cas9的核酸、编码sgRNA的核酸或两种核酸(即，编码Cas9的核酸和编码sgRNA的核酸)的PBAE纳米颗粒转染的细胞中eGFP基因的敲除百分比的图；

图2B是示出经编辑的细胞的PCR扩增子的

图2C是比较用抗GFP siRNA处理的细胞(正方形)和用本公开内容的包含CRISPR组分的PBAE纳米颗粒处理的细胞(圆形)中GFP信号降低的图；

图2D提供由CRISPR/Cas9(通过PBAE纳米颗粒提供)编辑的细胞的Sanger测序的基因组DNA的代表性序列(SEQ ID NO:13；43-45)，其中仅观察到小的插入/缺失；

图2E示出包括图2C中描述的细胞的流式细胞术直方图。左图示出由siRNA处理导致的第1天荧光细胞数量的极小变化，而右图示出由CRISPR-纳米颗粒转染导致的第3天荧光细胞数量的大的变化。x轴和y轴分别与eGFP荧光强度和显示荧光强度的细胞数量相关；

图3A是示出通过CRISPR-纳米颗粒转染切除>400bp终止盒的示意图。sg1表示sgRNA指导的切割位点。终止盒的切除允许红色增强纳米灯笼的编码序列的表达；

图3B是比较未处理的(UT)细胞和用包封各种sgRNA((sg1)、(sg2)、(sg3)和(sg2+sg3))的PBAE纳米颗粒转染的细胞中具有切除的终止盒的细胞的百分比的图；

图3C是示出切除终止盒后截短的ReNL PCR产物的凝胶图像。UT为“未处理”，并且“sg1”为sgRNA指导的编辑；

图3D是带有sg1切除的终止盒的细胞的荧光显微照片；切除导致通过ReNL蛋白提供的荧光信号。比例尺＝200μm；

图4示出完整的ReNL系统示意图；

图5示出使用各种sgRNA的ReNL基因缺失的显微图像；

图6A示出代表性的直链聚(β-氨基酯)(PBAE)聚合物的结构；

图6B是代表仅携带Cas9质粒(由“*”标识)的纳米颗粒的制备的示意图；

图6C是代表仅携带sgRNA质粒(由

图6D示出携带Cas9质粒和sgRNA质粒的纳米颗粒的制备；

图7A和图7B示出BGDA系列超支化PBAE。聚合物由二丙烯酸酯单体(BGDA；“*”)、三丙烯酸酯单体(TMPTA；

图7C示出丙烯酸酯终止的基础聚合物(acrylate-terminated base polymers)的一锅合成。在示例性实施方案中，将二丙烯酸酯单体B7和三丙烯酸酯单体B8与侧链单体S4混合，以合成一系列具有增加的三丙烯酸酯摩尔分数和分支程度的BEAQ。直链聚合物每个分子具有两个封端结构，而支链聚合物中的每个三丙烯酸酯单体导致每个分支点有一个另外的封端部分。丙烯酸酯终止的基础聚合物的一锅合成在90℃在DMF中以200mg/mL进行24h。然后将聚合物在室温用单体E6封端1h，以得到最终产物；

图7D示出含有质粒DNA的BGDA纳米颗粒的代表性透射电子显微术(TEM)图像。比例尺＝100nm；

图8A、图8B、图8C、图8D、图8E和图8F示出代表性的聚合物特性。图8A示出不同分支的BGDA PBAE的分配系数(logP)和分布系数(logD)的预测特性。图8B示出聚合物和Yo-Pro-1碘化物在低pH的竞争结合测定。(n＝3个孔，平均值±SEM)。图8C示出在等渗中性缓冲液中的竞争DNA结合测定。(n＝3个孔，平均值±SEM)；图8D示出PBAE的滴定。图8E示出不同分支的PBAE在pH 4.5-8.5之间的最大缓冲点的有效pKa值。图8F示出不同分支的PBAE在低pH且等渗的中性缓冲液中的有效溶解度。混合多于一种单体使得能够在任一单体的状态之间中路微调聚合物特性。特性包括疏水性(通过logP和logD计算评估)、DNA结合、缓冲能力和有效pKa值；

图9A、图9B和图9C示出BGDA纳米颗粒的特性。图9A示出在25mM NaAc缓冲液，pH5.0中和以40w/w比稀释到150mM PBS中之后的Z-平均流体动力学直径测量值。图9B示出在150mM PBS,pH 7.4中评估的ζ电位测量值。(n＝3个制剂，平均值±SEM)。图9C示出干燥颗粒的TEM图像。所有图像的比例尺为100nm。无论分支程度，所测试的聚合物系列的纳米颗粒具有实际上相同的特性；

图10A、图10B、图10C、图10D、图10E、图10F、图10G和图10H示出在10％血清培养基中用BGDA PBAE体外转染HEK239T细胞或ARPE-19细胞。图10A示出在HEK293T细胞中的转染功效。图10B示出归一化的几何平均表达。图10C示出存活力并且图10D示出荧光显微镜图像。图10E示出在ARPE-19细胞中的转染功效。图10F示出归一化的几何平均表达。图10G示出存活力并且图10H示出荧光显微镜图像。比例尺200μm。(n＝4个孔，平均值±SEM)；视网膜ARPE-19细胞的转染功效明显比两种商业转染试剂Lipofectamine 2000和jetPrime以及先前优化的PBAE 557高得多；

图11A、图11B、图11C和图11D展示出对于BGDA PBAE的挑战性转染条件。用20w/w纳米颗粒高血清(50％)转染HEK293T细胞(图11A)和ARPE-19细胞(图11B)。在384孔板中40w/w纳米颗粒的低纳米颗剂量粒转染HEK293T(5ng)(图11C)和ARPE-19(10ng)(图11D)。在高血清条件和低纳米颗粒剂量，分支显著提高了在两种细胞系中的转染功效。

图12A、图12B、图12C、图12D、图12E、图12F、图12G和图12H示出聚合物特性和转染功效之间的相关性。(图12A-图12D)HEK293T细胞和(图12E-图12H)ARPE-19细胞；

图13A和图13B示出本公开内容的BGDA聚合物系列的化学特性。图13A示出本公开内容的丙烯酸酯终止的PBAE聚合物的BGDA系列的NMR谱

图13B示出BGDA系列聚合物的凝胶渗透色谱术折射率检测器轨迹。使用GPC和Waters2软件中的分析来计算每种聚合物相对于分子量在580Da至3.15MDa范围内的八种直链聚苯乙烯标准品的三阶曲线(R

图14A、图14B、图14C、图14D和图14E示出本公开内容的BGDA聚合物系列的水溶液特性(aqueous property)。图14A示出在不同的pH值评估聚合物疏水性的Marvin预测logD值。以140mM Cl-,Na/K+条件对NMR值M

图15A、图15B和图15C示出本公开内容的BGDA聚合物系列的DNA结合特性。对于两种缓冲条件，这些图示出荧光猝灭随聚合物浓度而变化，针对仲胺数目归一化的猝灭，针对叔胺数目归一化的猝灭，和针对胺总数归一化的猝灭。(图15A)在pH 5.0和低盐的酸性条件下，DNA结合的程度与叔胺数目/碱基对(bp)DNA最佳地成比例。(图15B)相比之下，在pH 7.4的中性等渗条件下，DNA结合的程度与仲胺数目/bp DNA最佳地成比例。(图15C)比较了直链(0％三丙烯酸酯)、中度分支聚合物(40％三丙烯酸酯)和高度分支聚合物(90％三丙烯酸酯)在pH 5至pH 7.4之间的结合差异；

图16A、图16B、图16C、图16D、图16E和图16F示出HEK293T和ARPE-19细胞中的BGDA纳米颗粒摄取。在相同的w/w比，与直链BGDA聚合物纳米颗粒相比，分支未强烈提高纳米颗粒的摄取。HEK293T高剂量纳米颗粒摄取(600ng剂量，20％标记的Cy5-DNA)的(图16A)摄取百分比和(图16B)几何平均值。HEK293T低剂量纳米颗粒摄取(300ng，20％标记的Cy5-DNA)的(图16C)摄取百分比和(图16D)几何平均值。ARPE-19低剂量纳米颗粒摄取(300ng，20％标记的Cy5-DNA)的(图16E)摄取百分比和(图16F)几何平均值。

图17A、图17B和图17C示出在高血清(50％)条件中的BGDA系列纳米颗粒转染。HEK293T细胞(图17A)转染功效高达97％和(图17B)几何平均表达。ARPE-19(图17C)转染功效高达67％。当考虑表达水平时，中度分支的BGDA PBAE优于直链BGDA聚合物；这种效应在低w/w比时尤其明显；

图18A、图18B、图18C、图18D和图18E示出在HEK239T细胞和ARPE-19细胞中的低剂量BGDA纳米颗粒转染。图18A示出通过Echo 550声学液体处理和纳米颗粒剂量滴定实现的极低的纳米颗粒体积分布。图18B示出在HEK239T细胞中的转染功效，并且图18C示出HEK239T细胞中针对未处理的细胞进行归一化的细胞计数。图18D示出在ARPE-19细胞中的转染功效，并且图18E示出ARPE-19细胞中针对未处理的细胞进行归一化的细胞计数。对于低剂量纳米颗粒转染测试的具有40％-60％三丙烯酸酯摩尔分数的支链BGDA聚合物在统计学上比直链BGDA聚合物更有效。当将细胞计数与八个未处理孔的平均细胞计数进行比较时，纳米颗粒制剂均未显示出高细胞毒性(细胞计数减少>30％)。值示出了每种条件三个孔的平均值±SEM。聚合物之间转染功效的差异通过与使用匹配的w/w比和DNA剂量的值的直链BGDA聚合物BGDA-0进行单因素ANOVA和多重比较在所有测试条件进行评估。单因素ANOVA用Geisser-Greenhouse球形校正和Dunnet多重比较校正来进行。示出的P值经过多重性调整；

图19示出HEK293T转染与按w/w衡量的(w/w scaled)聚合物特征相关。计算每种测试的w/w比的聚合物的仲胺、叔胺、总胺的数目和在pH5-7.4之间的缓冲能力。对于存活力，计算线性回归趋势线，以评估单个曲线是否拟合系列中所有聚合物的数据；

图20示出ARPE-19转染与按w/w衡量的聚合物特征相关。计算每种测试的w/w比的聚合物的仲胺、叔胺、总胺的数目和在pH 5-7.4之间的缓冲能力。对于存活力，计算线性回归趋势线，以评估单个曲线是否拟合系列中所有聚合物的数据；

图21A、图21B、图21C、图21D、图21E和图21F示出用各种分子量的直链和支链PEI转染HEK293T和ARPE-19，测试了在(图21A-图21C)HEK293T和(图21D-图21F)ARPE-19细胞中的最佳w/w比。几何平均表达示出为针对未处理对照细胞(值为1)归一化。归一化的存活力示出为未处理对照孔的百分比。(误差线示出n＝4个孔，平均值±SEM)；

图22A和图22B示出用对照纳米颗粒材料转染ARPE-19。为了公平地鉴定体外转染的最佳条件，对对照试剂测试了(图22A)600ng剂量DNA与两小时孵育，和(图22B)100ng剂量与24小时孵育。先前显示PBAE 557对ARPE-19细胞转染通常是有效的，我们重现了这点，显示出最多40％的转染。JetPRIME同样能够转染多达40％的细胞，而Liofectamine-2000提供仅20％的转染功效；

图23示出流式细胞术门控分析。FlowJo 10用于门控由Accuri C6流式细胞仪分析的细胞。单细胞群体被鉴定并被针对GFP表达或Cy5标记的质粒DNA的摄取进行2D门控。对于门控，未处理的群体被设置为<0.5％的假阳性；

图24示出无效的封端单体。所示出的封端结构被测试并证实有效地与丙烯酸酯终止的PBAE聚合物4-4-Ac反应，但所得聚合物对于将质粒DNA递送至HEK293T细胞完全无效。这些E-单体被排除在用于较难转染的RPE单层的转染功效研究的大文库封端之外；

图25示出基础聚合物PBAE的表征，通过2x乙醚沉淀后的

图26A和图26B示出本公开内容的PBAE的凝胶渗透色谱术表征。在合成后和溶解在DMSO中并用乙醚洗涤两次后，通过凝胶渗透色谱术对PBAE进行表征，以对比直链聚苯乙烯标准品评估分子量。示出用乙醚洗涤去除了未反应的单体单元以及低聚物，(图26A)增加聚合物数均分子量MN和(图26B)降低多分散性指数(PDI)；

图27A和图27B示出分化的RPE单层的有丝分裂后状态。接种在384孔板中的人类iPS细胞被允许在384孔板中的培养物中分化超过25天。(图27A)直至第10天，每孔细胞数增加，此时细胞数达到峰值，并且细胞开始分化。(图27B)与接种后第3天相比，在接种后第25天，细胞明显生长得更密集。在第25天，RPE单层还具有纹理外观。条形图示出每种条件下四个孔的平均值±SEM。对于20x图像，比例尺100μm；

图28A、图28B和图28C示出从胚胎干细胞的完全分化改变了细胞表型，并且示出最佳PBAE聚合物结构。比例尺为100μm。(图28A)用4-4-E2转染铺板后的D3 RPE细胞的代表性图像。(图28B)用完全PBAE文库转染D3 RPE细胞的热图；(图28C)用完全PBAE文库转染的D3存活力热图；

图29A、图29B、图29C、图29D、图29E和图29F示出商业试剂转染功效优化。在不同的试剂比和DNA剂量，2小时和24小时的孵育条件下测试Lipofectamine 3000和DNA-In，以鉴定各自的最佳条件。(图29A)Lipofectamine 3000转染最多3％的细胞，并且(图29B)与未处理的细胞相比，在50ng、2x试剂浓度剂量和24小时孵育期导致最小的细胞毒性。(图29C)显微镜图像示出组成型核GFP表达和少量表达mCherry的转染细胞。(图29D)DNA-In导致最多12％的转染功效以及(图29E)在150ng剂量和24小时孵育时间的可管理的细胞毒性。(图29F)DNA-In明显转染了更高比例的细胞，但大多数仍未被转染。条形图示出每种条件下四个孔的平均值±SEM。对于10x图像，比例尺200μm；

图30示出基础聚合物封端的GL261高通量筛选的转染功效和相对于未处理的细胞计数。20％三丙烯酸酯摩尔分数BGDA-TMPTA-B4聚合物(7,8-4-Ac)。384孔板，75ng DNA/孔，孵育2hr。转染功效通过Cellomics进行评估；

图31示出基础聚合物封端的B16-F10高通量筛选的转染功效和相对于未处理的细胞计数。20％三丙烯酸酯摩尔分数BGDA-TMPTA-B4聚合物(7,8-4-Ac)。384孔板，75ng DNA/孔，孵育2hr。转染功效通过Cellomics进行评估；

图32示出GL261小鼠神经胶质瘤细胞的转染功效、归一化的几何平均表达和相对存活力，其中96孔转染功效通过流式细胞术评估，400ng/孔和2hr孵育。7,8-4-XX聚合物是20％分支的单体，具有新的、扩展的封端文库。新的聚合物产生高达80％的转染，甚至在20w/w比时(参见7,8-4-A11聚合物)，相比之下，经典PBAE 446需要至少40w/w比，并且仅产生55％的转染。对于新的聚合物，几何平均表达也增加了，而存活力保持不变；

图33示出B16-F10小鼠黑素瘤细胞的转染功效、归一化的几何平均表达和相对存活力，其中96孔转染功效通过流式细胞术评估，600ng/孔和2hr孵育。7,8-4-XX聚合物是20％或40％分支的单体，具有新的、扩展的封端文库。新的聚合物产生高达95％的转染，甚至在10w/w比时(见7,8-4-A7聚合物)，相比之下，经典PBAE 446需要至少40w/w比，并且仅产生约55％的转染。对于新的聚合物，几何平均表达也增加了，而存活力保持不变；

图34示出在96孔板中以600ng DNA剂量2hr孵育转染的B16-F10细胞的图像；

图35示出在96孔板中以400ng DNA剂量2hr孵育转染的GL261细胞的图像；

图36示出归一化的DNA结合(另参见图8的相关数据)；

图37示出相对于三丙烯酸酯摩尔分数的最佳w/w比(上图)和相对于三丙烯酸酯摩尔分数的最佳胺密度(下图)(另参见图10的相关数据)；

图38示出ARPE-19细胞的基因表达和纳米颗粒特性的相关性；

图39A和图39B示出组合封端单体文库BEAQ合成。图39A示出高通量筛选。图39B示出最佳候选(top hit)确认；

图40A、图40B、图40C、图40D和图40F示出组合PBAE文库构建的示意图(图40A)在小瓶中合成直链基础聚合物PBAE以进行丙烯酸酯终止，然后通过1H NMR和GPC进行表征(图40B)使用Viaflo 96/384微孔板分配器将合成的聚合物分配到384孔圆底板中，并用每种基础聚合物封端。以不同的颜色方案示出的总共4种不同的基础聚合物被封端，每个母板(master plate)各包含36种封端单体。(图40C)然后从一个母板复制源板，并将它们储存在-80℃以备将来使用。(图40D)将封端的直链聚合物(板的左侧12列)与质粒DNA(板的右侧12列)混合以配制NP。(图40E)RPE单层转染使用自动化Viaflo微孔板分配器进行并与NP一起孵育48小时。(图40F)图像使用Cellomics捕获；

图41A、图41B、图41C、图41D和图41E示出顺序聚(β-氨基酯)(PBAE)文库构建和合成方案(图41A)从二丙烯酸酯和伯胺小单体合成直链PBAE以产生丙烯酸酯终止的聚合物，然后封端以产生直链封端的PBAE的合成方案。(图41B)实例PBAE 5-3-A12由单体B5、S3和封端A12形成。在文库合成中使用的(图41C)五种二丙烯酸酯单体和(图41D)三种侧链氨基醇。(图41E)经鉴定对转染有效的36种封端单体；

图42A和图42B示出以汇合的D25 RPE单层对PBAE纳米颗粒的体外高通量筛选。示出接种后第25天，将140种不同纳米颗粒的组合引入汇合的RPE单层后的(图42A)转染的RPE细胞百分比和(图42B)存活率百分比的热图。彩色比例尺是指基于从细胞群体总数中检测到的mCherry阳性细胞的数量计算的转染效率百分比和存活百分比；

图43A、图43B、图43C、图43D和图43E示出PBAE 5-3-A12表征，PBAE 5-3-A12表征。(图43A)通过DLS z平均值评估的直径测量值和(图43B)NTA示出，平均直径随着聚合物:DNAw/w比增加而降低。与30w/w纳米颗粒相比，90w/w纳米颗粒的DLS z平均测量值在统计学上更低。(图43C)不同w/w比的纳米颗粒之间的纳米颗粒ζ电位没有统计学差异。(图43D)与丙烯酸酯终止的聚合物相比，用单体A12封端提高了DNA结合。PBAE 5-3-A12在低至5w/w的w/w比完全阻滞DNA，相比之下，丙烯酸酯终止的聚合物仅在低至10w/w的比有效。(图43E)TEM示出5-3-A12纳米颗粒为球形。图示出三个独立制备样品的平均值。*p<0.01，**p<0.001，基于单因素ANOVA与Tukey事后检验；

图44A、图44B、图44C和图44D示出用从初步高通量筛选获得的最佳PBAE纳米颗粒候选在体外转染汇合的D25 RPE单层。(图44A)代表性的Z-堆叠共聚焦显微照片，示出在D25RPE单层中产生最高转染功效的用PBAE纳米颗粒(5-3-A12)转染的RPE单层的转染的RPE细胞(红色)和ZO-1蛋白(绿色)的顶端定位(apical localization)。细胞核用DAPI(蓝色)复染。直方图示出从初步筛选获得的前3个候选(5-3-A12、5-3-F3和5-3-F4)以及商业转染试剂(lipofectamine 3000和DNA-In)的(图44B)转染功效(图44C)相对存活力和(图44D)平均荧光强度。转染效率通过mCherry阳性细胞的百分比示出，使用为高内涵分析平台(HighContent Analysis platform)中的转染测定设计的特定算法进行定量。****p<0.001，基于student t检验。共聚焦显微照片比例尺：50μm；

图45A、图45B、图45C和图45D示出在共转染测定中测量的转染功效(图45A)用mCherry(红色)和GFP(绿色)构建体两者共转染的RPE单层的代表性Cellomics图像。直方图示出引入单独的mCherry或GFP或者用两种构建体共转染的细胞的(图45B)细胞％(图45C)细胞体面积和(图45D)细胞体尺寸；

图46A、图46B和图46C示出在亚汇合的D3 RPE单层中对PBAE纳米颗粒进行的体外高通量筛选。(图46A)示出mCherry转染的RPE细胞的示意性图像。热图示出接种后第3天将140种不同纳米颗粒的组合引入汇合的RPE单层后的(图46B)转染的RPE细胞百分比和(图46C)存活率百分比。彩色比例尺是指基于从细胞群体总数中检测到的mCherry阳性细胞的数量计算的转染效率百分比和存活百分比；

图47A、图47B、图47C、图47D、图47E和图47F示出rBEAQ与siRNA形成纳米颗粒并实现基因敲低。图47A示出rBEAQ-siRNA纳米颗粒对HEK293T的敲低和细胞存活力。图47B示出细胞摄取。图47C示出通过NTA测量的纳米颗粒流体动力学直径。图47D示出通过DLS测量的纳米颗粒ζ电位。图47E示出，当使用药物BSO阻断细胞内谷胱甘肽时，纳米颗粒介导的细胞毒性增加。图47F示出rBEAQ-siRNA纳米颗粒的TEM图像；

图48A、图48B和图48C示出rBEAQ siRNA结合和释放动力学。图48A示出Yo-Pro-1siRNA结合测定，表明聚合物分支增加了siRNA结合强度。图48B示出，siRNA敲低相对结合的EC50绘图显示出双相响应(biphasic response)。图48C示出rBEAQ纳米颗粒的凝胶阻滞测定随着在5mM谷胱甘肽还原环境中孵育时间的变化。

图49A、图49B、图49C、图49D和图49E示出含单体B7的rBEAQ使得能够有效地将DNA和siRNA共递送至HEK293T和Huh7细胞。疏水性R6,7,8-4-6聚合物系列使得能够有效地共递送DNA和siRNA。包封400ng总核酸的R6,8-4-6(0％B7)和R6,7,8-4-6纳米颗粒在293T(图49A)和Huh7(图49B)中的共递送功效。N＝4。(图49C)用共递送200ng siRNA和200ng DNA的R6,7,8_16纳米颗粒(10w/w制剂)处理的HEK-293T细胞的荧光显微术图像。比例尺100μm。(图49D)R6,7,8_64在10w/w完全包封质粒DNA和siRNA，如通过凝胶阻滞测定观察到的。(图49E)用共递送Cy3-siRNA、Cy5-DNA和未标记的GFP质粒DNA(0.5:0.4:0.1重量组成)的R6,7,8_64纳米颗粒处理的293T细胞在摄取后3h和24h的共聚焦显微术图像。在摄取后3h，可以观察到Cy3和Cy5信号共定位(白色箭头)。在摄取后24h，在胞质溶胶中可以观察到弥漫的Cy3-siRNA信号(白色星号)，而在细胞核中检测到一些Cy5-DNA信号(黄色箭头)，并且一些细胞明显表达GFP。比例尺20μm；

图50A、图50B和图50C示出抗GFP sgRNA和Cas9质粒的共递送实现CRISPR介导的基因敲除。(图50A)用以指定的核酸摩尔比包封Cas9DNA和sgRNA的R6,7,8_64 10w/w纳米颗粒转染HEK-293T细胞。N＝4。(图50B)CRISPR或siRNA处理的细胞的流式细胞术直方图。CRISPR处理产生了完全GFP阴性的群体(零)，而siRNA处理主要导致总体群体向较低GFP荧光(低)的变化。(图50C)CRISPR和siRNA处理的细胞的基因抑制动力学。N＝4；

图51A、图51B、图51C和图51D示出用于合成包括烃基或包括含有伯胺的氟化侧链单体(以提高胶体稳定性)的聚合物的代表性单体；

图52A、图52B、图52C和图52D示出用共聚焦显微术进行的溶酶体共定位评估。(图52A)用低(20w/w)和高(40w/w)的B8-0％和B8-50％纳米颗粒转染细胞并通过共聚焦显微术评估，示出溶酶体共定位程度的统计显著差异。通过单因素ANOVA与Dunnett校正的多重比较评估，与B8-50:40％w/w条件比较。(图52B)使用20w/w纳米颗粒处理24h后HEK293T细胞的代表性2D散布图。区域3表示共定位的像素强度。(图52C)转染后4h和24h之间，在两种细胞系中在所有条件下显示出溶酶体共定位程度的统计学显著增加(Holm-Sidak校正的多重t检验)(条示出n>100个细胞的平均值±SEM)。(图52D)转染后24h，用20w/w纳米颗粒转染的细胞的代表性的最大强度投影图像，以白色示出溶酶体共定位；

图53A、图53B和图53C示出通过共聚焦显微术评估的质粒DNA的核定位和eGFP的表达。

HEK293T细胞先用B8-50:20％w/w纳米颗粒转染24h，该纳米颗粒含有80％非编码的Cy5标记的质粒DNA和20％编码eGFPN1的质粒DNA。(图53A)最大强度投影展示出高水平的标记的质粒DNA保留在细胞中，溶酶体共定位最小。(图53B)来自20％未标记的质粒DNA的强eGFP表达。(图53C)单个z切片示出位于选定细胞的细胞核中的Cy5标记的质粒DNA(白色箭头)；

图54A、图54B、图54C、图54D、图54E、图54F、图54G、图54H、图54I和图54J示出BEAQ特性和存活力归一化的几何平均表达之间的相关性。将几何平均表达图针对每种聚合物的最大表达归一化并通过(A-E)HEK293T细胞和(F-J)ARPE-19细胞在该w/w比的存活力衡量。灰色短线曲线示出该细胞系的所有数据点的单一二次拟合和计算的R

图55示出DNA结合能力的凝胶阻滞测定(gel retention assay)。在酸性、低盐NaAc pH 5和等渗、pH 7.4PBS中形成的纳米颗粒的凝胶阻滞测定显示出与更高度分支的纳米颗粒相关联的更强结合，其中与B8-0％、B8-20％或B8-50％相比，B8-90％纳米颗粒示出最高程度的结合；

图56A、图56B、图56C和图56D示出在匹配条件下在10％和50％血清条件测试的代表性BEAQ系列聚合物在HEK293T和ARPE-19细胞中有效转染了相同百分比的细胞(A、C)。B)然而，对于表达水平，随着血清含量的增加，在HEK293T细胞中，直链聚合物(B8-0％)遭受了聚合物匹配的最大几何平均表达的75％的减少，而B8-60％三丙烯酸酯摩尔分数聚合物仅遭受了几何平均表达的21％的减少。D)类似地，在ARPE-19细胞中，直链聚合物(B8-0％)遭受了几何平均表达的68％的减少，而B8-20％三丙烯酸酯摩尔分数的支链聚合物的几何平均表达仅减少了30％。(误差线示出n＝4个孔，平均值±SEM)；

图57A、图57B和图57C示出在HEK-293T细胞中的低剂量BEAQ纳米颗粒转染。图57A)通过Echo 550声学液体处理和纳米颗粒剂量滴定实现的极低的纳米颗粒体积分布。对于不同的w/w比和总纳米颗粒剂量，针对未处理的细胞归一化的图57B)转染功效和图57C)细胞计数(随每孔总DNA的变化)。对于测试的低剂量纳米颗粒转染，具有40％-60％三丙烯酸酯摩尔分数的BEAQ在统计学上比直链B8-0％聚合物更有效。所有纳米颗粒制剂均未显示出高细胞毒性(归一化的细胞计数减少>30％)。值示出每种条件三个孔的平均值±SEM。聚合物之间转染功效的差异通过与使用匹配的w/w比和DNA剂量的值的B8-0％进行单因素ANOVA和多重比较在所有测试条件进行评估。单因素ANOVA用Geisser-Greenhouse球形校正和Dunnet多重比较校正来进行。

示出的P值经过多重性调整。(误差线示出n＝4个孔，平均值±SEM)；

图58A和图58B示出纳米颗粒定位和共定位的共聚焦显微术Z堆叠分析。我们假设，评估细胞内溶酶体共定位的位置可以影响所测量的共定位程度，因为更靠近玻璃表面的内吞体可能更成熟并且pH更低。为此目的，用共聚焦显微术获得Z-堆叠，并且对共定位系数的单独贡献通过转染后4小时)和24小时)该切片中可检测到的Cy5-DNA的面积来衡量；

图59示出纳米颗粒摄取后4小时，HEK293T细胞的共聚焦显微术最大强度投影。纳米颗粒80％用Cy5共价标记，并且20％编码eGFP。所有条件都显示出纳米颗粒的高度内化和最小的溶酶体共定位。溶酶体指示物pKa 4.6。比例尺50μm；

图60示出纳米颗粒摄取后4小时，ARPE-19细胞的共聚焦显微术最大强度投影。纳米颗粒80％用Cy5共价标记，并且20％未标记、编码eGFP。所有条件都显示出纳米颗粒的高度内化和最小的溶酶体共定位。溶酶体指示物pKa 4.6。比例尺50μm；

图61示出纳米颗粒摄取后24h，HEK293T的共聚焦显微术。纳米颗粒80％用Cy5共价标记，并且20％未标记、编码eGFP，在24小时仍产生可检测到的eGFP的稳健表达。所有条件都显示出纳米颗粒的高度内化，特别是与B8-50％:40w/w纳米颗粒相比，直链聚合物的溶酶体积累大得多。溶酶体指示物pKa 4.6。比例尺50μm；

图62示出纳米颗粒摄取后24小时，ARPE-19细胞的共聚焦显微术最大强度投影。纳米颗粒80％用Cy5共价标记，并且20％未标记、编码eGFP，在24小时仍产生可检测到的eGFP的稳健表达。所有条件都显示出纳米颗粒的高度内化，特别是与B8-50％:40w/w纳米颗粒相比，直链聚合物的溶酶体积累大得多。溶酶体指示物pKa 4.6。比例尺50μm；

图63A和图63B示出聚合物结构信息。(图63A)丙烯酸酯终止和封端的R6,8_20聚合物的H1-NMR谱(CDCl

图64A和图64B示出较低w/w的R6,8-4-6纳米颗粒制剂的敲低(图64A)和细胞毒性(图64B)。纳米颗粒包封了100nM siRNA剂量。GFP荧光的敲低针对用非靶向加扰RNA(scrambled RNA，scRNA)处理的细胞进行归一化；

n＝4；

图65A和图65B示出丙烯酸酯终止的聚合物的Yo-Pro结合测定。(图65A)增加聚合物分支增加了丙烯酸酯终止的聚合物的结合亲和力。(图65B)封端聚合物(E6)示出比丙烯酸酯终止的聚合物(Ac)更高的结合亲和力。N＝4；

图66A、图66B、图66C和图66D示出纳米颗粒表征。流体动力学直径(图66A)和ζ电位(图66B)证实了在低w/w制剂，含B7的聚合物形成了更小、带更多正电荷的纳米颗粒。通过DLS使用在PBS中稀释的纳米颗粒进行尺寸和ζ电位测量。N＝3。(图66C)含有DNA和siRNA的R6,7,8_64纳米颗粒的TEM图像。(图66D)R6,7,8_64纳米颗粒(10w/w)在含10％血清培养基中在4小时的时间跨度内仅中度聚集。N＝2；

图67示出共递送的DNA和siRNA的共聚焦显微术。将HEK-293T细胞用聚合物和核酸之间10w/w的比形成的聚合物R6,7,8_64纳米颗粒转染。Cy3-siRNA、Cy5-DNA和eGFP-DNA在纳米颗粒包封前以50:40:10的质量比预混合。在纳米颗粒暴露后3小时，许多内吞体明显包含siRNA和DNA各自的Cy3和Cy5信号。在处理后24小时，可检测到弥漫的Cy3-siRNA荧光，而Cy5-DNA荧光呈点状，并且一些细胞明显表达GFP。比例尺50μm；

图68示出用主要的商业上可获得的转染试剂进行的DNA和siRNA共递送。使用R6,7,8_64纳米颗粒(10w/w)和非病毒转染试剂Lipofectamine2,000TM、Lipofectamine 3,000TM、

图69示出，核酸共包封优于DNA和siRNA用它们各自先前优化的纳米颗粒制剂递送。R6,7,8_64纳米颗粒用各200ng的预先混合的质粒DNA和siRNA以10w/w配制(单NP)，然后将纳米颗粒添加至细胞。聚合物446(对于DNA递送最佳)和聚合物R646(对于siRNA递送最佳)分别与它们各自的负载一起配制，并且将每种纳米颗粒制剂分别添加至细胞，分别递送200ng的DNA和siRNA(双NP)。当在高w/w(对于446为60w/w，并且对于R646为120w/w)以及低w/w(对于446和R646分别为10w/w)配制NP时，单NP策略表现优于双NP策略。R6,7,8_64聚合物总是在10w/w使用，表明其较高的递送效率。在这一实验中使用了Huh 7细胞。N＝4。统计分析通过单因素ANOVA与Tukey事后检验进行评估；

图70A和图70B示出在含血清培养基中的R6,7,8_64纳米颗粒递送功效。将含有(A)siRNA或(B)Cas9 DNA和sgRNA的R6,7,8_64纳米颗粒(10w/w)施用至含有或不含有10％FBS的细胞培养基中的细胞。血清的存在显著降低了两种情况的转染。在添加至细胞之前，添加NaHCO

图71A、图71B、图71C和图71D示出PBAE与质粒DNA形成纳米颗粒，并在HEK293T和B16-F10细胞中实现转染。(图71A)分别用于转染HEK-293T和B16-F10细胞的446和7,8-4-J11的聚合物结构。(图71B)通过动态光散射测量的纳米颗粒流体动力学直径和ζ电位。446纳米颗粒以60w/w配制，而7,8-4-J11纳米颗粒以30w/w配制。(图71C)测量的通过纳米颗粒递送GFP的转染功效；使用600ng/孔剂量。条示出平均值+SEM；N＝4。(图71D)446和7,8-4-J11纳米颗粒的TEM图像；

图72A、图72B、图72C和图72D示出共递送Cas9和sg1质粒后CRISPR组分的表达动力学。在HEK-293T细胞中测量Cas9 mRNA(图72A，红色曲线)和蛋白表达(图72A，蓝色曲线；图72B)随时间的变化。(图72C)sgRNA和(图72D)ReNLmRNA表达动力学。对于qRT-PCR实验，N＝2(数据示出为平均值±SEM)；对于蛋白印迹，N＝1；

图73A、图73B、图73C和图73D示出DNA剂量滴定揭示了1-切割编辑和2-切割编辑的不同阈值表达要求。(图73A)DNA剂量从600ng降低至300ng未改变GFP阳性细胞的总百分比，但显著降低了表达的几何平均值。剂量降低显著降低了2-切割基因缺失编辑的功效(图73B)，但未显著降低1-切割iRFP敲除编辑的功效(图73C)。通过Holm-Sidak校正的多重t检验确定的统计显著性；**p<0.01，***p<0.001。数据示出为平均值+SEM；N＝4。(图73D)用不同DNA剂量处理的细胞的流式细胞术直方图；

图74A、图74B、图74C和图74D示出在易于转染的HEK-293T细胞和难以转染的B16-F10细胞中的1-切割编辑和2-切割编辑。(图74A)1-切割编辑效率与转染水平呈对数相关，如GFP报道基因的几何平均荧光所示，而2-切割编辑效率在293T细胞中呈线性相关。(图74B)在B16细胞中，转染后的短暂冷休克(cold shock)显著提高了转染功效以及2-切割编辑效率，但是在1-切割编辑效率中未观察到显著变化，如通过Holm-Sidak校正的多重t检验评估的；**p<0.01，***p<0.001。(图74C)B16细胞实现了最低水平的2-切割编辑；与293T细胞相比，1-切割编辑较低，但差异较小。(图74B)和(图74C)中的数据示出为平均值+SEM；N＝4。在流式细胞术直方图中观察到编辑的差异(图74D-图74E)；

图75A和图75B示出用于多重编辑的tRNA-gRNA表达系统。(图75A)多重sgRNA表达系统的示意图，其中多于一个tRNA-gRNA单元串联排列。初级RNA转录物由内源性tRNA机制加工，释放成熟的sgRNA。(图75B)编码sg2和sg3的tRNA-gRNA质粒与每个sgRNA由单独的U6启动子控制的质粒(sg2+sg3)相比，导致相似水平的2-切割编辑。统计分析通过单因素ANOVA与Tukey事后检验进行评估。数据表示为平均值±SEM；N＝4；

图76A和图76B示出B16-F10细胞的GFP转染筛选结果。荧光显微术图像(图76A)和流式细胞术结果(图76B)示出，支链PBAE聚合物7,8-4-J11(30w/w)比经典直链PBAE聚合物446(40w/w)更有效地转染B16细胞。数据表示为平均值±SEM；N＝4；

图77示出ReNL表达获得的显微术图像。用sg1或sg2+sg3的组合的2-切割CRISPR裂解，通过去除两个SV40聚A序列来开启ReNL的表达；

图78A、图78B、图78C和图78D示出CRISPR组分在B16细胞中的表达动力学。sgRNA(图78A)和ReNL(图78B)的mRNA表达水平。Cas9mRNA(C，红色曲线)和蛋白(图78C，蓝色曲线；图78D)表达水平随时间的变化。对于qRT-PCR实验，N＝2(数据示出为平均值±SEM)；对于蛋白印迹，N＝1；

图79A和图79B示出与商业转染试剂的比较。在(图79A)293T和(图79B)B16细胞中使用商业试剂和PBAE，通过ReNL发光测量的来自2-切割编辑的表达获得和细胞存活力。数据表示为平均值+SEM；N＝4；与PBAE处理组(分别为446或J11)相比，通过单因素ANOVA和Dunnett事后检验评估统计显著性；*p<0.05，****p<0.0001；

图80A、图80B、图80C和图80D示出1-切割编辑对比2-切割编辑的不同的转染水平敏感性。eGFP表达的流式细胞术结果(图80A)、ReNL功能获得表达(图80B)和iRFP敲除(图80C)与递送的DNA剂量半对数相关。Cas9和sgRNA的mRNA表达分别与DNA剂量对数相关(图80D)。数据示出为平均值±SEM；N＝4；并且

图81A和图81B示出在HEK-293T和Huh7细胞中共递送DNA和siRNA的R6,7,8-4-6纳米颗粒的聚合物介导的细胞毒性。(图81A)由共递送400ng总核酸的R6,7,8-4-6纳米颗粒以及R6,8-4-6纳米颗粒的最佳制剂介导的细胞毒性。(图81B)R6,7,8-4-6纳米颗粒在较高的w/w制剂介导高水平的毒性。N＝4。

详细描述

现将在下文中参考附图更全面地描述本公开内容的主题，在附图中示出了本发明的一些而不是全部实施方案。相同的数字在全文中指代相同的元件。本公开内容的主题可以以许多不同的形式来体现并且不应该被解释为局限于本文阐述的实施方案；相反，这些实施方案被提供以使得本公开内容将满足适用的法律要求。事实上，鉴于在前面的描述和相关的附图中呈现的教导的益处，本公开内容的主题所属领域中的技术人员将想到本文阐述的本公开内容的主题的许多修改和其他实施方案。因此，应该理解，本公开内容的主题不限于所公开的具体实施方案并且修改形式和其他实施方案意图被包括在所附权利要求书的范围内。

I.用于基因编辑和视网膜基因治疗的质粒DNA的非病毒递送的聚(β-氨基酯)纳米颗粒

在一些实施方案中，本公开内容的主题提供用于向细胞递送核酸，包括编码基因编辑因子或治疗性蛋白的核酸的可生物降解颗粒。在特定实施方案中，颗粒包含聚(β-氨基酯)(PBAE)聚合物，其与核酸(包括DNA或RNA)自组装。PBAE颗粒是可生物降解的，例如，它们在水中或水性溶液中降解。在某些实施方案中，降解是pH依赖性的。

在一些实施方案中，颗粒包含直链或支链PBAE聚合物(具有由二丙烯酸酯单体且任选地与三丙烯酸酯单体组合构成的主链)，以提供具有可变支链的聚合物。聚合物可以通过将包含仲胺或伯胺的侧链单体与丙烯酸酯单体(例如，二丙烯酸酯和三丙烯酸酯单体)缩合来制备。例如，在一些实施方案中，PBAE包含二丙烯酸酯(例如双酚A甘油(1甘油/苯酚)二丙烯酸酯(BGDA))和三丙烯酸酯(例如三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA))的主链。

在一些实施方案中，聚合物在其主链中包含叔胺，和/或在一些实施方案中，聚合物包含含有伯胺、仲胺和/或叔胺的侧链和/或端基，以与核酸复合。在一些实施方案中，仲胺或叔胺包含含二价胺的杂环基团。在一些实施方案中，侧链单体包含伯胺，但也可以包含仲胺和叔胺。在一些实施方案中，端基以伯胺和羟基为末端，内部放置仲胺。

颗粒可以与编码基因编辑内切核酸酶的质粒DNA复合，并且在一些实施方案中，颗粒可以与gRNA、编码gRNA的质粒DNA和/或置换DNA模板复合。在一些实施方案中，颗粒与多肽(例如，基因编辑内切核酸酶)复合。在这样的实施方案中，本公开内容的主题提供了可生物降解的纳米颗粒来引导对核酸(例如，DNA和/或RNA)的有效的位点靶向破坏、突变、缺失或修复。因此，本公开内容的主题提供了有效的基因治疗平台，包括离体或体内基因和/或转录本编辑。

A.包含式(I)和式(II)的聚(β-氨基酯)(PBAE)的组合物

在一些实施方案中，本公开内容的主题提供了用于向细胞递送基因的包含多组分可降解阳离子聚合物的组合物，包括颗粒。本公开内容的聚合物具有双相降解的特性，并且对聚合物结构的修饰可以导致治疗剂(例如，DNA质粒)释放的改变。在一些实施方案中，本公开内容的聚合物包括少数结构(minority structure)，例如封端基团，其不同于构成大部分聚合物主链的多数结构(majority structure)。在其他实施方案中，可生物还原的低聚物与可水解降解的低聚物形成嵌段共聚物。在又其他的实施方案中，端基/少数结构包含氨基酸或氨基酸链，而主链水解地降解和/或是可生物还原的。

在聚合期间使用的单体比例的小的变化与对聚合后使用的封端基团的化学结构的修饰的组合，可以影响向细胞递送基因的功效。此外，聚合物化学结构的改变，无论是在聚合物的主链中还是在封端基团中，或者在两者中，可以改变向细胞递送基因的功效。在一些实施方案中，聚合物分子量的小的变化或聚合物封端基团的变化，同时保持聚合物的主要链即主链不变，可以总体上增强或降低基因向细胞的递送。此外，组成聚合物主链或主要链的“R”基团可以选择为通过与同一聚合物分子内不同的生物降解机制降解。这些机制包括但不限于水解、生物还原、酶促和/或其他降解模式。

本公开内容的多组分可降解阳离子聚合物的特性可以被调节以赋予组合物一种或更多种以下特性：对颗粒的细胞特异性摄取和/或细胞内递送的独立控制；内吞体缓冲和内吞体逃逸的独立控制；DNA释放的独立控制；活性剂的触发释放；颗粒表面电荷的修饰；通过细胞细胞质的扩散增加；通过细胞细胞质的主动转运增加；细胞内核输入增加；细胞内相关DNA的转录增加；细胞内相关DNA的翻译增加；和/或细胞内相关治疗剂的持久性增加。

如果要包封亲水性肽/蛋白，则选择亲水性聚合物作为多组分材料。如果要包封疏水性肽/蛋白，则选择疏水性聚合物。聚合物主链、侧链和/或末端基团可以被修饰以增加聚合物的疏水性或亲水性。待包封的肽/蛋白可以首先溶解在合适的溶剂诸如DMSO或PBS中。然后，将其与在例如乙酸钠(NaAc)中的聚合物组合。然后根据所需的颗粒尺寸，用乙酸钠、OptiMem、DMEM、PBS或水稀释该溶液。将溶液涡旋混合，并且然后留置孵育一定时间段，以便进行颗粒组装。颗粒可以与包括质粒DNA在内的核酸自组装，以形成尺寸可以在50nm至500nm范围内的纳米颗粒。颗粒提供质粒DNA在体内或者离体对细胞的有效转染。

代表性的多组分可降解阳离子聚合物在以下美国专利和美国专利申请公布中公开，其中每一项通过引用以其整体并入本文：2018年6月28日公布的Green等人的美国专利申请公布号20180177881的Multicomponent Degradable Cationic Polymers；2015年9月10日公布的Green等人的美国专利申请公布号20150250881的Multicomponent DegradableCationic Polymers；2012年5月24日公布的Green等人的美国专利申请公布号20120128782的Multicomponent Degradable Cationic Polymers；2018年4月26日公布的Green等人的美国专利申请公布号20180112038的Poly(beta-amino ester)-co-polyethylene glycol(PEG-PBAE-PEG)Polymers for Gene and Drug Delivery；2018年2月1日公布的Green等人的美国专利申请公布号20180028455的Peptide/Particle Delivery Systems；2016年12月29日公布的Green等人的美国专利申请公布号20160374949的Peptide/Particle DeliverySystems；2016年12月29日公布的Green等人的美国专利申请公布号20120114759的Peptide/Particle Delivery Systems；2016年5月5日公布的Popel等人的美国专利申请公布号20160122390的ABiomimetic Peptide and Biodegradable Delivery Platformforthe Treatment of Angiogenesis-and Lymphangiogenesis-Dependent Diseases；2015年10月1日公布的Green等人的美国专利申请公布号20150273071的Bioreducible Poly(Beta-Amino Ester)s for siRNADelivery；2018年2月6日授权的Green等人的美国专利号9,884,118的Multicomponent Degradable Cationic Polymers；2017年8月1日授权的Green等人的美国专利号9,717,694的Peptide/particle Delivery Systems；和2015年3月31日授权的Green等人的美国专利号8,992,991的Multicomponent Degradable CationicPolymers；2012年10月16日授权的Langer等人的美国专利号8,287,849的BiodegradablePoly(beta-amino esters)and Uses Thereof。在WO2012/0128782、WO2012/0114759、WO2014/066811、WO2014/066898和US2016/0122390中描述了其他示例性PBAE聚合物，其中每一项通过引用以其整体并入本文。在实施方案中，颗粒包括PBAE的聚合物共混物，例如PBAE聚合物的混合物。

本公开内容的多组分可降解阳离子聚合物可以通过以下反应方案制备：

通常，本公开内容的多组分可降解阳离子聚合物包括衍生自二丙烯酸酯单体(下文称为“B”)、氨基醇侧链单体(下文称为“S”)和含胺封端单体(下文称为“E”)的主链。对于给定的聚合物材料，端基结构与聚合物主链结构和中间前体分子的侧链结构不同且分开。本公开内容的PBAE组合物可以命名为例如B5-S4-E7或547，其中R是B5，R”是S4，并且R”'是E7等，其中B代表主链，并且S代表侧链，随后是它们的烃链中的碳数。封端单体E根据其胺结构的相似性依次编号。

在其他实施方案中，本公开内容的聚合物具有由二丙烯酸酯构成的主链，并且任选地具有三丙烯酸酯单体，以提供具有可变支链的聚合物。参见，例如图7C。

更特别地，在一些实施方案中，本公开内容的主题提供了一种组合物，该组合物包含式(I)或式(II)的聚(β-氨基酯)(PBAE)：

和至少一种包含编码基因编辑蛋白或治疗性蛋白的核酸序列的DNA或RNA分子；

其中：

n和m各自独立地是1至10,000的整数；

每个R独立地是具有以下结构的二丙烯酸酯单体：

其中R

每个R*是选自由以下组成的组的三丙烯酸酯单体、四官能丙烯酸酯单体或六官能丙烯酸酯单体：

其中每个R'独立地是三价基团；每个R"独立地是包含伯胺、仲胺或叔胺的侧链单体；并且每个R'"独立地是包含伯胺、仲胺或叔胺的端基单体。

在一些实施方案中，基因编辑蛋白选自由以下组成的组：CRISPR相关核酸酶、Cre重组酶、Flp重组酶、兆核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、或其天然或工程化变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体。

在特定实施方案中，基因编辑蛋白是Cas9内切核酸酶。

在一些实施方案中，组合物还包含gRNA或编码gRNA的DNA。在某些实施方案中，Cas9内切核酸酶和gRNA被编码在同一质粒上。在其他实施方案中，Cas9内切核酸酶和gRNA被编码在不同的质粒上。

如下文更详细提供的，在一些实施方案中，治疗性蛋白选自由以下组成的组：CNGA3、CNGB3、GNAT2、sFLT01、Rab Escort蛋白(REP-1)、RS-1、RPE65、RPGR、MY07A、MERTK、ATP结合盒转运蛋白4(ABCA4)和SAR-421869。

在一些实施方案中，组合物还包含启动子。在这样的实施方案中，核酸可操作地连接到启动子。

在一些实施方案中，R选自由以下组成的组：

在特定实施方案中，R选自由以下组成的组：

在特定实施方案中，二丙烯酸酯是双酚A甘油二丙烯酸酯(BGDA)(B7)。

如上文提供的反应方案所示，二丙烯酸酯单体可以与含胺侧链单体缩合。在一些实施方案中，侧链单体包含伯胺，但是在其他实施方案中，包含仲胺和叔胺。侧链单体还可以包含C

在一些实施方案中，侧链单体R"选自由以下组成的组：

在特定实施方案中，侧链单体R"选自由以下组成的组：

PBAE聚合物还包含端基，该端基可以包括一个或更多个伯胺、仲胺或叔胺，并且可以包括芳族和非芳族碳环和杂环基团，诸如5个或6个原子的碳环和杂环基团。在一些实施方案中，端基可以包含一个或更多个醚、硫醚或二硫键(disulfide linkage)。

代表性的端基包括但不限于：

在特定实施方案中，PBAE由选自以下的端基单体构成：

在一些实施方案中，R'"是选自由以下组成的组的端基单体：

在其他实施方案中，R'"是选自由以下组成的组的端基单体：

在甚至更特定的实施方案中，R'和R'"的组合选自由以下组成的组：

在甚至还更特定的实施方案中，式(I)的PBAE选自由以下组成的组：

在某些实施方案中，式(I)的PBAE为：

在其他实施方案中，式(I)的PBAE为：

在又其他的实施方案中，式(I)的PBAE为：

在一些实施方案中，式(II)的PBAE为：

在一些实施方案中，叔丙烯酸酯单体是三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA)：

本领域普通技术人员将理解，可以使用其他三丙烯酸酯结构来提供必要的聚合物支链。

在某些实施方案中，式(I)的PBAE为547：

在一些实施方案中，n选自由以下组成的组：1至1,000的整数；1至100的整数；1至30的整数；5至20的整数；10至15的整数；和1至10的整数。

在特定实施方案中，组合物具有选自由75w/w、50w/w和25w/w组成的组的PBAE/DNA重量/重量比(w/w)。

在某些实施方案中，直链和/或支链PBAE聚合物具有5kDa至10kDa的分子量，或10kDa至15kDa的分子量，或15kDa至25kDa的分子量，或25kDa至50kDa的分子量。

在某些实施方案中，本公开内容的主题提供在药学上可接受的载体中的包含式(I)的PBAE组合物的药物制剂。

如本文使用的，“药学上可接受的载体”意图包括但不限于水、盐水、右旋糖溶液、人类血清白蛋白、脂质体、水凝胶、微米颗粒和纳米颗粒。这样的介质和剂用于药物活性组合物的用途是本领域熟知的，并且因此将各自以有效水平掺入组合物的另外的实例和方法不需要在此讨论。

在特定实施方案中，药物制剂还包含一种或更多种治疗剂。

在又其他的实施方案中，药物制剂还包含式(I)的PBAE的纳米颗粒或微米颗粒。在一些实施方案中，PBAE聚合物可以与包括质粒DNA在内的核酸自组装以形成纳米颗粒，纳米颗粒的尺寸可以在50nm至500nm的范围内，例如，尺寸为约50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm或500nm。

在实施方案中，颗粒具有在约50nm至约500nm或约50nm至约200nm范围内的至少一个尺寸(dimension)。示例性颗粒可以具有约50nm、约75nm、约100nm、约125nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约400nm或约500nm的平均尺寸(例如，平均直径)。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约50nm至约500nm、约50nm至约300nm、或约50nm至约200nm、或约50nm至约150nm、或约70nm至100nm的平均直径。在实施方案中，纳米颗粒具有约200nm至约500nm的平均直径。在实施方案中，纳米颗粒具有至少一个尺寸，例如，约50nm至约100nm的平均直径。纳米颗粒通常期望用于体内应用。例如，小于约200nm的纳米颗粒将更佳地在体内分布至靶组织。

在一些实施方案中，本公开内容的颗粒可以包含阳离子聚合物共混物或嵌段共聚物的其他组合。另外的聚合物包括聚己内酯(PCL)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸(PLA)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚-3-羟基丁酸酯(P3HB)、聚(羟基丁酸酯-共-羟基戊酸酯)和聚乙二醇(PEG)。在实施方案中，颗粒包括其他聚合物材料的共混物，以调节颗粒的表面特性。例如，共混物可以包括本领域中使用的不可降解聚合物，诸如聚苯乙烯。因此，在实施方案中，将一种或更多种以上的可降解聚合物共混以产生共聚物体系。在又其他的实施方案中，本公开内容的颗粒包括PBAE的聚合物共混物，例如PBAE聚合物的混合物。

在实施方案中，颗粒呈球形形状。在实施方案中，颗粒具有非球形形状。在实施方案中，颗粒具有长轴与短轴的纵横比在2和10之间的椭球形状。

在某些实施方案中，通过本公开内容的包封活性剂诸如DNA质粒的程序形成的纳米颗粒本身被包封到较大的纳米颗粒、微米颗粒或装置中。在一些实施方案中，这种较大的结构是可降解的，而在其他实施方案中，它是不可降解的，而是用作可以用纳米颗粒再填充的贮存器。这些较大的纳米颗粒、微米颗粒和/或装置可以用本领域技术人员所知的任何生物材料和方法来构建。在一些实施方案中，它们可以用本文描述的多组分可降解阳离子聚合物构建。在其他实施方案中，它们可以用FDA批准的生物材料，包括但不限于聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)构建。以PLGA和双重乳液(double emulsion)制备工艺为例，纳米颗粒是初级乳液中水相的一部分。在最终的PLGA纳米颗粒或微米颗粒中，纳米颗粒将保留在水相中并且保留在PLGA纳米颗粒或微米颗粒的孔/袋中。随着微米颗粒降解，纳米颗粒将被释放，从而允许包含活性剂的纳米颗粒的持续释放。在特定实施方案中，式(I)的PBAE的纳米颗粒或微米颗粒被包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米颗粒或微米颗粒中。

在实施方案中，本技术的颗粒在其表面上包含配体，该配体将颗粒特异性地靶向感兴趣的细胞。因此，这种颗粒将它的负载，即，编码基因编辑蛋白的核酸，主要递送至需要基因编辑的细胞。

在实施方案中，配体是抗体或其片段或部分。抗体或其片段或部分对感兴趣的细胞表面上的受体或其他靶具有结合特异性。如本文使用的，术语“抗体”包括抗体及其抗原结合部分。在一些实施方案中，配体是抗体(例如，单克隆或多克隆抗体)或抗体模拟物，诸如单结构域抗体、重组仅重链抗体(VHH)、单链抗体(scFv)、鲨鱼仅重链抗体(VNAR)、微蛋白(半胱氨酸结蛋白、扭结菌素(knottin))、DARPin、四连接素(Tetranectin)、亲和体(Affibody)；Transbody、Anticalin、AdNectin、Affilin、微体、肽适体、phylomer、stradobody、maxibody、evibody、fynomer、犰狳重复蛋白、Kunitz结构域、avimer、atrimer、probody、immunobody、triomab、troybody、pepbody、vaccibody、UniBody、DuoBody、Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2、肽模拟分子、或合成分子、或如美国专利号或专利公布号US 7,417,130、US2004/132094、US 5,831,012、US 2004/023334、US 7,250,297、US 6,818,418、US 2004/209243、US 7,838,629、US 7,186,524、US 6,004,746、US 5,475,096、US 2004/146938、US2004/157209、US 6,994,982、US 6,794,144、US 2010/239633、US 7,803,907、US 2010/119446和/或US 7,166,697中描述的，其内容特此通过引用以其整体并入。另参见StorzMAbs.2011May-Jun；3(3):310-317。

在实施方案中，配体特异性地结合肿瘤相关抗原或其表位。肿瘤相关抗原包括仅由其来源的肿瘤表达的独特肿瘤抗原、在许多肿瘤中表达但在正常成人组织中不表达的共有肿瘤抗原、以及也由产生肿瘤的正常组织表达的组织特异性抗原。肿瘤相关抗原可以是例如胚胎抗原、具有异常翻译后修饰的抗原、分化抗原、突变癌基因或肿瘤抑制因子的产物、融合蛋白或肿瘤病毒蛋白(oncoviral protein)。肿瘤相关抗原还包括改变的糖脂和糖蛋白抗原，诸如含神经氨酸的鞘糖脂(例如，GM2和GD2，在黑素瘤和一些脑肿瘤中表达)；血型抗原，特别是T和唾液酸化Tn抗原，可在癌中异常表达；和黏蛋白，诸如CA-125和CA-19-9(在卵巢癌上表达)或糖基化不足的MUC-1(在乳腺癌和胰腺癌上表达)。使用结合肿瘤相关抗原或其表位的配体，允许将表达基因编辑蛋白的核酸递送至癌细胞；例如，在癌细胞中，基因编辑蛋白可以缺失或失活负责癌细胞增殖的基因。

可以使用任何可用的方法将配体化学缀合至颗粒。用于配体结合的官能团包括COOH、NH

在实施方案中，通过使用含有与蛋白上的胺反应的n-氢-琥珀酰亚胺(NHS)酯的交联剂，将配体缀合至颗粒。可选地，采用含有与含胺、氢硫基或组氨酸的蛋白反应的活性卤素的交联剂，或含有与胺或氢硫基基团反应的环氧化物的交联剂，或马来酰亚胺基团和氢硫基基团之间的交联剂。在实施方案中，使用将蛋白配体的羧基基团缀合至PLGA的EDC/NHS(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺)化学将配体和蛋白复合物缀合(例如，官能化)至颗粒。在一些实施方案中，配体可以用位点特异性官能团(例如，诸如游离半胱氨酸)进行工程化，以提供与颗粒一致的、位点导向的附接。位点导向的附接可以是与所选聚合物的官能团(包括胺)附接。在这些实施方案中，配体的功能结构域可以朝向环境并离开颗粒表面。这些实施方案还提供了更适合于现货供应的药品的受控取向。

所得的纳米颗粒无细胞毒性，并且可生物降解，在水性条件下半衰期为1h和7h之间。此外，冷冻干燥的纳米颗粒当在室温、4℃或-20℃储存时稳定长达两年。

在一些实施方案中，本公开内容的主题还包括使用和储存本文描述的聚合物和颗粒的方法，由此将防冻剂(包括但不限于糖)添加至聚合物和/或颗粒溶液中，并且将其冻干并以粉末储存。这样的粉末被设计成保持稳定，并且易于用水性缓冲液重构，如本领域技术人员所能利用的。

B.药物制剂

在一些实施方案中，本公开内容的主题提供了一种药物制剂，该药物制剂包含在药学上可接受的载体中的组合物，该组合物包含式(I)或式(II)的聚(β-氨基酯)(PBAE)和至少一种包含编码基因编辑蛋白或治疗性蛋白的核酸序列的DNA或RNA分子。

在一些实施方案中，药物制剂还包含式(I)或式(II)的PBAE的纳米颗粒或微米颗粒。在某些实施方案中，式(I)或式(II)的PBAE的纳米颗粒或微米颗粒被包封在聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)纳米颗粒或微米颗粒中。

C.试剂盒

在一些实施方案中，本公开内容的主题提供了一种试剂盒，该试剂盒包含在药学上可接受的载体中的组合物，该组合物包含式(I)或式(II)的聚(β-氨基酯)(PBAE)和至少一种包含编码基因编辑蛋白或治疗性蛋白的核酸序列的DNA或RNA分子。在某些实施方案中，试剂盒还包含组合物的一个或更多个多剂量单位、药学上可接受的载体、用于施用组合物的装置、使用说明及其组合。

D.基因编辑方法

在一些实施方案中，本公开内容的主题提供了用于基因编辑的方法，该方法包括使细胞与包含式(I)或式(II)的聚(β-氨基酯)(PBAE)和至少一种包含编码基因编辑蛋白或治疗性蛋白的核酸序列的DNA或RNA分子的组合物接触。在特定实施方案中，基因编辑内切核酸酶引导位点特异性靶DNA破坏、突变、缺失或修复。在一些实施方案中，组合物与细胞在体内接触。在其他实施方案中，组合物与细胞离体接触。

因此，本公开内容的颗粒提供了核酸(例如，编码基因编辑因子的核酸)对细胞的有效转染，以提供有效的体内或离体基因编辑。因此，在一些实施方案中，颗粒携带编码基因编辑蛋白(基因编辑内切核酸酶)的DNA或mRNA。例如，颗粒可以携带编码基因编辑蛋白的质粒DNA，并且必要时还可以携带引导RNA。引导RNA(例如，gRNA)可以被编码在质粒上或以RNA形式提供。在一些实施方案中，纳米颗粒还提供用于向基因组中重组或插入(例如，用于敲入)的模板核酸。

靶DNA可以是疾病或紊乱的原因，例如由于遗传突变(包括但不限于单核苷酸多态性或SNP)。在一些实施方案中，颗粒递送基因编辑因子以指导一种或更多种取代的(例如，突变的)、纠正的、截短的、功能丧失的、功能获得的和/或移码的蛋白的产生。在一些实施方案中，纳米颗粒携带编码基因编辑因子的DNA，该基因编辑因子指导基因区段的缺失。

细胞可以是真核细胞，诸如动物细胞或植物细胞，包括哺乳动物细胞，诸如人类细胞。在一些实施方案中，包括对于离体核酸递送，细胞是干细胞或祖细胞。细胞可以是多能的(multipotent)或多潜能的(pluripotent)。在一些实施方案中，细胞是干细胞，诸如胚胎干细胞或成体干细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞。在一些实施方案中，包括对于体内核酸递送，细胞(例如，靶细胞)是癌细胞、恶性细胞或疾病细胞。

在一些实施方案中，将颗粒直接递送至生物体，诸如哺乳动物受试者，从而指导体内基因编辑。对于体内基因编辑，颗粒可配制成用于各种施用模式，包括全身施用及表面(topical)施用或局部施用。

因此，药物组合物可以配制成用于通过任何合适的途径向患者施用，包括静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用、淋巴内施用和肿瘤内施用。

在一些实施方案中，组合物被冻干，并在施用前重构。

在各种实施方案中，纳米颗粒携带编码基因编辑蛋白(基因编辑内切核酸酶)的核酸(例如，DNA或RNA(例如，mRNA))。例如，在一些实施方案中，纳米颗粒携带编码基因编辑蛋白的质粒DNA，并且在一些实施方案中，携带引导RNA(例如，gRNA)。引导RNA可以被编码在质粒上或以RNA形式提供。在一些实施方案中，纳米颗粒还提供核酸(例如，模板)，该核酸(例如，模板)是用于向基因组中重组或插入的功能基因或其部分(例如，以提供“敲入”)。用于基因编辑的因子可以在单个质粒上提供，或者在一些实施方案中，编码在不同的质粒上。

在一些实施方案中，纳米颗粒包含核糖核蛋白。也就是说，在一些实施方案中，纳米颗粒包含多肽(例如，基因编辑内切核酸酶(例如，CRISPR蛋白(例如，Cas9或Cas9样蛋白))和gRNA。

基因编辑内切核酸酶在靶DNA分子中产生切口或双链断裂，这使基因失活或导致蛋白的非活性、活性降低或显性阴性形式的表达(从基因表达)。在一些实施方案中，基因编辑蛋白修复基因中的一个或更多个突变或缺失基因区段，这可以由gRNA与CRISPR/Cas9系统来引导。

本技术提供了包含编码基因编辑蛋白的核酸的颗粒。基因编辑蛋白可以是以下中的一种或更多种：成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)相关核酸酶、Cre重组酶、Flp重组酶、兆核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或其天然或工程化变体、家族成员、直系同源物、片段或融合构建体。

在实施方案中，基因编辑蛋白涉及CRISPR。至少在U.S.8,697,359和U.S.9,637,739中描述了CRISPR，其中每一项特此通过引用以其整体并入。在本技术的实施方案中，本文提供的颗粒包含编码CRISPR相关核酸酶例如Cas9内切核酸酶的核酸。虽然各种CRISPR/Cas系统已被广泛用于各种类型和物种的细胞的基因组编辑，但重组和工程化的核酸结合蛋白，诸如Cas9和Cas9样蛋白，可用于本技术(例如，在体外)。发现Cas9蛋白是细菌适应性免疫系统的组成部分(参见，例如，Barrangou等人(2007)“CRISPR provides acquiredresistance against viruses in prokaryotes”Science 315:1709-1712，通过引入并入本文)。Cas9是一种RNA引导的内切核酸酶，利用在引导RNA(gRNA)和外来DNA之间的RNA:DNA碱基配对来提供序列特异性，从而靶向和消化细菌中的外来DNA。最近，Cas9/gRNA复合物(例如，Cas9/gRNA RNP)已被用于基因组编辑(参见例如，Doudna等人(2014)“The newfrontier of genome engineering with CRISPR-Cas9”Science 346:6213，通过引入并入本文)。

在一些实施方案中，不同的CRISPR蛋白(例如，Cas9蛋白(例如，来自各种物种的Cas9蛋白及其修饰形式))可以有利于在各种提供的方法中使用，以便利用不同CRISPR蛋白的各种特性(例如，不同的PAM序列偏好；无PAM序列要求；增加或降低的结合活性；细胞毒性水平的增加或降低；增加或降低体外RNP形成的效率；增加或降低引入细胞(例如活细胞，例如活原代细胞)中的能力等)。来自不同物种的CRISPR蛋白可能需要靶DNA中不同的PAM序列。因此，对于选择的特定CRISPR蛋白，PAM序列要求可能不同于上述5’-XGG-3’序列。在一些实施方案中，蛋白是具有扩大的PAM相容性的xCas蛋白(例如，识别包括NG、GAA和GAT在内的宽范围的PAM序列的Cas9变体)，例如，如Hu等人(2018)“Evolved Cas9variants withbroad PAM compatibility and high DNA specificity”Nature 556:57-63中描述的，通过引用以其整体并入本文。

在一些实施方案中，该技术包括使用其他RNA引导的基因编辑核酸酶(例如Cpf1及其修饰形式、Cas13及其修饰形式)。例如，在一些实施方案中，使用其他RNA引导的核酸酶(例如，Cpf1及其修饰形式)提供了优势——例如，在一些实施方案中，不同核酸酶的特征适用于本文描述的方法(例如，其他RNA引导的核酸酶对不同PAM序列偏好具有偏好；其他RNA引导的核酸酶使用不同于cr/tracrRNA复合物的单个crRNA进行操作；其他RNA引导的核酸酶用较短的引导RNA进行操作，等等)。在一些实施方案中，该技术包括使用Cpf1蛋白，例如，如美国专利第9,790,490号中描述的，其全部内容通过引用并入本文。

已经从各种各样的物种鉴定出许多Cas9直系同源物，并且这些蛋白仅共有几个相同的氨基酸。所有鉴定出的Cas9直系同源物具有相同或相似的结构域结构，包括一个中心HNH内切核酸酶结构域和一个分裂的RuvC/RNaseH结构域。Cas9蛋白共有4个具有保守结构的基序。基序1、2和4是RuvC样基序，并且基序3是HNH基序。在一些实施方案中，合适的多肽(例如，Cas9)包含具有4个基序的氨基酸序列，基序1-4中的每一个与已知Cas9和/或Csn1氨基酸序列的基序1-4具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％的氨基酸序列同一性。

许多细菌表达Cas9蛋白变体。来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9是目前最常用的；其他一些Cas9蛋白与酿脓链球菌(S.pyogenes)Cas9具有高水平的序列同一性，并使用相同的引导RNA。其他的更多样化，使用不同的gRNA，并且还识别不同的PAM序列(蛋白特异性的2-5个核苷酸序列，与RNA特异性的序列相邻)。Chylinski等人对来自一大组细菌的Cas9蛋白进行了分类(RNA Biology 10:5,1-12；2013，通过引用并入本文)，并且大量Cas9蛋白列在其补充图1和补充表1中，将其通过引用并入本文。另外的Cas9蛋白在Esvelt等人,Nat Methods.2013November；10(11):1116-21和Fonfara等人,“Phylogeny ofCas9 determines functional exchangeability of dual-RNA and Cas9 amongorthologous type II CRISPR-Cas systems.”Nucleic Acids Res.42:2577-90(2014)中描述，其中每一项通过引用并入本文。

来自各种物种的Cas9蛋白以及由此修饰的Cas9蛋白可用于本文描述的技术。虽然广泛使用酿脓链球菌和嗜热链球菌(S.thermophilus)Cas9分子，但是在本技术的实施方案中可使用基于本文所列其他物种的Cas9蛋白的Cas9分子、来源于或基于本文所列其他物种的Cas9蛋白的Cas9分子。因此，该技术提供了用来自其他物种的Cas9和修饰的CRISPR蛋白分子对酿脓链球菌和嗜热链球菌Cas9和修饰的CRISPR(例如，Cas9)蛋白分子的替代，例如：

另参见美国专利申请公布第20170051312号的图3、图4、图5，通过引用并入本文。

在一些实施方案中，本文描述的技术包括使用CRISPR蛋白和/或来源于任何Cas9蛋白(例如，如上所列)的CRISPR蛋白及其对应的引导RNA或其他相容的引导RNA。来自嗜热链球菌LMD-9CRISPR1系统的Cas9已显示出在人类细胞中起作用(参见例如，Cong等人(2013)Science 339:819，通过引入并入本文)。此外，Jinek在体外显示了来自嗜热链球菌和无害李斯特菌(L.innocua)的Cas9直系同源物可以由双重酿脓链球菌gRNA引导以裂解靶质粒DNA。

在一些实施方案中，本技术包括来自酿脓链球菌的Cas9蛋白，例如，在细菌中编码的或为了在微生物或哺乳动物细胞中表达而密码子优化的。例如，在一些实施方案中，本文使用的Cas9与酿脓链球菌Cas9的序列至少约50％相同，例如，与以下通过引用并入本文的由GenBank登录号WP_010922251提供的序列(SEQ ID NO:2)至少50％相同：

>II型CRISPR RNA引导的内切核酸酶Cas9[酿脓链球菌]

在一些实施方案中，该技术包括使用与编码由SEQ ID NO:2描述的蛋白的核苷酸序列约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的核苷酸序列。

在一些实施方案中，本文使用的CRISPR蛋白的Cas9部分与酿脓链球菌Cas9的序列至少约50％相同，例如，与SEQ ID NO:2至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％相同。

在一些实施方案中，多肽(例如，基因编辑核酸酶)是Cas蛋白、CRISPR蛋白或Cas样蛋白。如本文使用的，“Cas蛋白”和“CRISPR蛋白”以及“Cas样蛋白”包括多肽、酶活性和具有与本领域已知蛋白相似活性或由本领域已知基因编码的多肽，例如，Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Cas13、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、C2c1、C2c2、其同源物或其修饰形式，例如，包括本领域已知的这些Cas蛋白、CRISPR蛋白和/或Cas样蛋白中的任一种。

在实施方案中，该技术包括使用多肽(例如，V型/VI型蛋白)诸如Cpf1或C2c1或C2c2以及V型/VI型蛋白诸如Cpf1或C2c1或C2c2的同源物和直系同源物来提供CRISPR蛋白。实施方案包括Cpf1、修饰的Cpf1(例如，修饰的Cpf1)和涉及Cpf1、修饰的Cpf1和嵌合的Cpf1的CRISPR系统。在一些实施方案中，多肽(例如，V型/VI型蛋白)诸如Cpf1或C2c1或C2c2来自例如以下的属：链球菌属(Streptococcus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、Nitratifractor、葡萄球菌属(Staphylococcus)、Parvibaculum、罗氏菌属(Roseburia)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、Sphaerochaeta、乳杆菌属(Lactobacillus)、真杆菌属(Eubacterium)、棒杆菌属(Corynebacter)、肉杆菌属(Carnobacterium)、红细菌属(Rhodobacter)；李斯特菌属(Listeria)、Paludibacter、梭菌属(Clostridium)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、Clostridiaridium、纤毛菌属(Leptotrichia)、弗朗西斯菌属(Francisella)、军团菌属(Legionella)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、Methanomethyophilus、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、创伤球菌属(Helcococcus)、钩端螺旋体属(Letospira)、脱硫弧菌属(Desulfovibrio)、脱硫弯曲杆菌属(Desulfonatronum)、丰佑菌科(Opitutaceae)、肿块芽孢杆菌属(Tuberibacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacilus)、甲基杆菌属(Methylobacterium)或氨基酸球菌属(Acidaminococcus)。在一些实施方案中，多肽(例如，V型/VI型蛋白)诸如Cpf1或C2c1或C2c2来例如以下的自生物体：变形链球菌(S.mutans)、无乳链球菌(S.agalactiae)、似马链球菌(S.equisimilis)、血链球菌(S.sanguinis)、肺炎链球菌(S.pneumonia)；空肠弯曲杆菌(C.jejuni)、大肠弯曲杆菌(C.coli)；N.salsuginis、N.tergarcus；耳葡萄球菌(S.auricularis)、肉葡萄球菌(S.carnosus)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitides)、淋病奈瑟氏菌(N.gonorrhoeae)；单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)；肉毒梭菌(C.botulinum)、艰难梭菌(C.difficile)、破伤风梭菌(C.tetani)或索氏梭菌(C.sordellii)。参见例如，美国专利第9,790,490号，通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，可使用Cpf1蛋白，如美国专利申请公布第20180155716号中描述的，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的差异是在非保守区域，如通过以下中列出的序列的序列比对鉴定出的：Chylinski等人,RNA Biology 10:5,1-12；2013(例如，在其补充图1及补充表1中)；Esvelt等人,Nat Methods.2013November；10(11):1116-21和Fonfara等人,Nucl.Acids Res.(2014)42(4):2577-2590，其中每一项通过引用并入本文。

因此，在一些实施方案中，Cas9多肽是天然存在的多肽。在一些实施方案中，Cas9多肽不是天然存在的多肽(例如，嵌合多肽、被修饰的天然存在的多肽，例如通过包含一个或更多个核苷酸取代、缺失、插入的工程化核酸产生的一个或更多个氨基酸取代而修饰)。

在一些实施方案中，该技术涉及为CRISPR蛋白衍生物的蛋白。在一些实施方案中，该蛋白是II型Cas9蛋白。在一些实施方案中，Cas9已经被工程化以部分地去除核酸酶结构域(例如，“死Cas9”或“Cas9切口酶”；参见例如，Nature Methods 11:399-402(2014)，通过引用并入本文)。在一些实施方案中，RNP蛋白是来自酿脓链球菌系统之外的CRISPR系统的蛋白，例如，V型Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3蛋白及其衍生物。

在一些实施方案中，多肽是嵌合或融合多肽，例如包含两个或更多个功能结构域的多肽。例如，在一些实施方案中，嵌合多肽与RNA相互作用(例如，结合)以形成RNP(上文所述)。RNA将多肽引导至靶核酸内的靶序列。因此，在一些实施方案中，嵌合多肽结合靶核酸。

在一些实施方案中，该技术包括使用RNA靶向蛋白(例如Cas13和/或修饰的Cas13)，其按照与Cas9相似的机制起作用。除了靶向基因组DNA之外，Cas9和其他CRISPR相关蛋白(例如，Cas13)也通过gRNA引导靶向RNA(参见例如，Abudayyeh等人(2017)“RNAtargeting with CRISPR-Cas13”Nature 550:280，通过引入并入本文)。因此，在一些实施方案中，gRNA与Cas9或其他RNA引导的核酸酶(例如，2类VI型RNA引导的RNA靶向CRISPR-Cas效应子(例如，Cas13)、Cpf1等)复合来修饰(例如，编辑)RNA(例如，RNA转录物和非编码RNA)。因此，在一些实施方案中，该技术涉及使用与CRISPR蛋白(例如，RNA靶向的加亲和标签的Cas13)复合的引导RNA来修饰(例如，编辑)靶RNA。

在实施方案中，颗粒还包含编码或包含crRNA和/或tracrRNA之一或两者的核酸。crRNA包含定位靶DNA的特定区域的引导RNA以及与tracrRNA结合的区域；这些一起形成活性复合物。在一些实施方案中，crRNA和tracrRNA组合成单个引导RNA(guide RNA)(sgRNA)。

因此，在一些实施方案中，该技术涉及包含两种RNA分子的CRISPR蛋白/RNA RNP复合物：(1)CRISPR RNA(crRNA)，具有与靶核苷酸序列互补的核苷酸序列；和(2)反式活化crRNA(tracrRNA)。在这种模式下，CRISPR蛋白(例如，Cas9)起RNA引导的核酸酶的作用，它利用crRNA和tracrRNA两者来识别和裂解靶序列。最近，模拟退火的crRNA/tracrRNA结构的单个嵌合引导RNA(sgRNA)比crRNA/tracrRNA得到了更广泛的使用，因为该gRNA方法提供了只有两种组分(例如，CRISPR蛋白和sgRNA)的简化系统。因此，RNP与核酸的序列特异性结合可以由双重RNA复合物(例如，“dgRNA”)引导，例如，在两个独立的RNA中包含crRNA和tracrRNA，或者由单个RNA中包含crRNA和tracrRNA的嵌合单个引导RNA(例如，“sgRNA”)引导。(参见例如，Jinek等人(2012)“A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonucleasein Adaptive Bacterial Immunity”Science 337:816-821，通过引用并入本文)。

如本文使用的，crRNA(2-RNA dgRNA系统)或sgRNA(单个引导系统)的靶向区域被称为“引导RNA”(gRNA)。在一些实施方案中，gRNA包含以下、由以下组成或基本由以下组成：10个至50个碱基，例如15个至40个碱基，例如15个至30个碱基，例如15个至25个碱基(例如10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个碱基)。本领域已知用于确定为CRISPR蛋白提供最有效的靶识别的gRNA长度的方法。参见例如，Lee等人(2016)“TheNeisseria meningitidis CRISPR-Cas9 SystemEnables Specific Genome Editing inMammalian Cells”Molecular Therapy 24:645(2016)，通过引用并入本文。

因此，在一些实施方案中，gRNA是短的合成RNA，其包含用于结合CRISPR蛋白(例如，修饰的CRISPR蛋白)的“支架序列”(蛋白结合区段)和用户定义的“DNA靶向序列”(核酸靶向区段)，该DNA靶向序列长度为约20个核苷酸，并且与靶核酸的靶位点互补。

在一些实施方案中，核酸靶向特异性由以下两个因素确定：1)与gRNA靶向序列和直接位于靶序列下游的前间区序列邻近基序(PAM)匹配的核酸(例如，DNA)序列。一些RNP复合物(例如，CRISPR蛋白/gRNA(例如，Cas9/gRNA或修饰的Cas9/gRNA))识别包含前间区序列邻近基序(PAM)序列和包含与gRNA互补的约20个碱基的相邻序列的DNA序列。典型的PAM序列对于来自酿脓链球菌的Cas9是NGG或NAG，并且对于来自脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9是NNNNGATT。在一些实施方案中，该技术包括使用具有扩展的PAM识别的Cas9(例如，xCas9蛋白；参见例如，Hu等人(2018)“Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibilityand high DNA specificity”Nature 556:57，通过引入并入本文)。在通过gRNA与靶序列杂交识别靶核酸中的靶位点后，CRISPR蛋白(例如，Cas9)通过固有核酸酶活性裂解核酸序列。为了基因组编辑和其他目的，来自酿脓链球菌的CRISPR/Cas系统被最经常使用。使用该系统，人们可以通过设计包含与PAM 5′-相邻的DNA序列(例如，包含约20个核苷酸的DNA序列)互补的核苷酸序列的gRNA来靶向给定的靶核酸(例如，用于编辑或其他操作)。本领域已知用于确定PAM序列的方法，所述PAM序列为Cas9(并因此为修饰的Cas9)提供有效的靶识别。参见，例如Zhang等人(2013)“Processing-independent CRISPR RNAs limit naturaltransformation in Neisseria meningitidis”Molecular Cell 50:488-503，通过引用并入本文；Lee等人，同上，通过引用并入本文。

在一些示例性实施方案中，crRNA包含根据SEQ ID NO:1的序列

NNNNNNNNNNNNrGrUrUrUrArArGrArGrCrUrArUrGrCrUrGrUrUrU rUrG

其中“NNNNNNNNNNNN”代表与靶序列互补的核酸靶向序列。

在一些实施方案中，tracrRNA包含天然存在的tracrRNA的序列，例如，由通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号的图6、图35和图37以及SEQ ID NO:267-272和431-562提供的。

在一些实施方案中，crRNA包含与tracrRNA杂交形成双链体结构的序列，例如，由通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号的图7以及SEQ ID NO:563-679提供的序列。在一些实施方案中，crRNA包含由通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号的图37提供的序列。在一些实施方案中，crRNA的双链体形成区段与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号的SEQ ID NO:431-679中列出的tracrRNA分子之一或其互补序列至少约60％相同。

因此，在一些实施方案中，包含在dgRNA系统中的示例性(但非限制性)核苷酸序列包括通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的任一序列，如SEQID NO:431-562，或与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的任何序列配对的其互补序列，SEQ ID NO:563-679，或可以杂交形成蛋白结合区段的其互补序列。

在一些实施方案中，单分子gRNA(例如，sgRNA)包含两个互补的核苷酸片段，它们杂交形成dsRNA双链体。在一些实施方案中，sgRNA(或编码sgRNA的DNA)与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的tracrRNA分子(如SEQ ID NO:431-562)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸上至少约60％相同。在一些实施方案中，sgRNA(或编码sgRNA的DNA)与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的tracrRNA分子(如SEQ ID NO:563-679)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸上至少约60％相同。当确定合适的同源对时，可以通过考虑物种名称和碱基配对(对于蛋白结合结构域的dsRNA双链体)来常规确定合适的天然存在的crRNA和tracrRNA对。

在一些实施方案中，gRNA包含第一区段(在本文也称为“核酸靶向区段”或“核酸靶向序列”)和第二区段(在本文也称为“蛋白结合区段”或“蛋白结合序列”)。在一些实施方案中，核酸靶向区段是和/或包括DNA靶向区段。在一些实施方案中，核酸靶向序列是和/或包括DNA靶向序列。在一些实施方案中，核酸靶向区段是和/或包括RNA靶向区段。在一些实施方案中，核酸靶向序列是和/或包括RNA靶向序列。

gRNA的核酸靶向区段(例如，DNA靶向区段或RNA靶向区段)包含与靶核酸中的序列互补的核苷酸序列(例如，在DNA或RNA中的靶位点处)。换句话说，gRNA的核酸靶向区段与靶核酸(例如，DNA或RNA)通过杂交(例如，互补碱基配对)以序列特异性方式相互作用。如此，核酸靶向区段的核苷酸序列可以变化，并确定核酸靶向RNA与靶核酸(例如，DNA或RNA)将相互作用的靶核酸(例如，DNA或RNA)内的位置。gRNA的核酸靶向区段可以被修饰(例如，通过遗传工程)以与靶核酸(例如，DNA或RNA)内的任何期望序列杂交。

在一些实施方案中，核酸靶向区段(例如，DNA靶向区段或RNA靶向区段)具有约8个核苷酸至约100个核苷酸的长度。在一些实施方案中，核酸靶向区段(例如，DNA靶向区段或RNA靶向区段)包含核酸靶向序列(例如，DNA靶向序列或RNA靶向序列)，并且在一些实施方案中，包含另外的核酸。例如，核酸靶向区段可以具有的长度为约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约40nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt或约12nt至约19nt。例如，核酸靶向区段可以具有的长度为约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约19nt至约70nt、约19nt至约80nt、约19nt至约90nt、约19nt至约100nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt、约20nt至约60nt、约20nt至约70nt、约20nt至约80nt、约20nt至约90nt或约20nt至约100nt。

在一些实施方案中，与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的核酸靶向区段(例如，DNA靶向区段或RNA靶向区段)的核苷酸序列(核酸靶向序列)可以具有至少约12nt的长度。例如，与靶核酸的靶序列互补的核酸靶向区段的核酸靶向序列可以具有的长度为至少约12nt、至少约15nt、至少约18nt、至少约19nt、至少约20nt、至少约25nt、至少约30nt、至少约35nt或至少约40nt。例如，与靶核酸的靶序列互补的核酸靶向区段的核酸靶向序列可以具有的长度为约12个核苷酸(nt)至约80nt、约12nt至约50nt、约12nt至约45nt、约12nt至约40nt、约12nt至约35nt、约12nt至约30nt、约12nt至约25nt、约12nt至约20nt、约12nt至约19nt、约19nt至约20nt、约19nt至约25nt、约19nt至约30nt、约19nt至约35nt、约19nt至约40nt、约19nt至约45nt、约19nt至约50nt、约19nt至约60nt、约20nt至约25nt、约20nt至约30nt、约20nt至约35nt、约20nt至约40nt、约20nt至约45nt、约20nt至约50nt或约20nt至约60nt。与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的核酸靶向区段的核苷酸序列(核酸靶向序列)可以具有至少约12nt的长度。

在另外的实施方案中，与靶核酸的核苷酸序列(靶序列)互补的核酸靶向区段(例如，DNA靶向区段或RNA靶向区段)的核苷酸序列(核酸靶向序列)可以具有约8个核苷酸至约30个核苷酸的长度。例如，核酸靶向区段可具有的长度为约8个核苷酸(nt)至约30nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt、约8nt至约18nt、约8nt至约15nt或约8nt至约12nt，例如，8nt、9nt、10nt、11nt或12nt。

在一些实施方案中，与靶核酸的靶序列互补的核酸靶向区段(例如，DNA靶向区段或RNA靶向区段)的核酸靶向序列的长度为8-20个核苷酸。在一些实施方案中，与靶核酸的靶序列互补的核酸靶向区段的核酸靶向序列的长度为9-12个核苷酸。

核酸靶向区段(例如，DNA靶向区段或RNA靶向区段)的核酸靶向序列和靶核酸(例如，DNA或RNA)的靶序列之间的互补性百分比可以是至少60％(例如，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或100％)。在一些实施方案中，核酸靶向区段的核酸靶向序列和靶核酸的靶序列之间的互补性百分比在靶核酸互补链的靶序列的7个连续的最5’核苷酸上为100％。在一些实施方案中，核酸靶向区段的核酸靶向序列和靶核酸的靶序列之间的互补性百分比在约20个连续核苷酸上为至少60％。在一些实施方案中，核酸靶向区段的核酸靶向序列和靶核酸的靶序列之间的互补性百分比在靶DNA互补链的靶序列的14个连续的最5′-核苷酸上为100％，并且在剩余部分上低至0％。在这种情况下，核酸靶向序列可以被认为长度是14个核苷酸。在一些实施方案中，核酸靶向区段的核酸靶向序列和靶核酸的靶序列之间的互补性百分比在靶核酸互补链的靶序列的7个连续的最5′-核苷酸上为100％，并且在剩余部分上低至0％。在这种情况下，核酸靶向序列可以被认为长度是7个核苷酸。

gRNA的蛋白结合区段与多肽例如CRISPR蛋白或修饰的CRISPR蛋白(例如，Cas9或Cas9样多肽和/或其修饰形式)相互作用。gRNA通过上述核酸靶向区段将结合的多肽引导至靶核酸(例如，靶DNA或靶RNA)内的特定核苷酸序列。gRNA的蛋白结合区段包含两个区段，这两个区段包含彼此互补的核苷酸序列。蛋白结合区段的互补核苷酸杂交形成双链RNA双链体。

dgRNA包含两个单独的RNA分子。dgRNA的两个RNA分子中的每一个包含彼此互补的区段，使得两个RNA分子的互补核苷酸杂交形成蛋白结合区段的双链RNA双链体。

在一些实施方案中，活化物RNA(activator-RNA)的双链体形成区段与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的活化物RNA(tracrRNA)分子(如SEQID NO:431-562)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸的区段上至少约60％相同。例如，活化物RNA的双链体形成区段(或编码活化物RNA的双链体形成区段的DNA)与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的tracrRNA序列(如SEQ ID NO:431-562)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸的区段上至少约60％相同、至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。

在一些实施方案中，标靶人RNA(targeter-RNA)的双链体形成区段与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的标靶人RNA(crRNA)序列(如SEQ IDNO:563-679)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸的区段上至少约60％相同。例如，标靶人RNA的双链体形成区段(或编码标靶人RNA的双链体形成区段的DNA)与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的crRNA(如SEQ ID NO:563-679)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸的区段上至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。

可以包含在双分子核酸靶向RNA(dgRNA)中的核苷酸序列的非限制性实例包括通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的任何序列，如SEQ ID NO:431-562，或与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的任何序列配对的其互补序列，如SEQ ID NO:563-679，或可以杂交形成蛋白结合区段的其互补序列。

单分子核酸靶向RNA(sgRNA)包含两个彼此互补的核苷酸区段(标靶人RNA和活化物RNA)，通过间插核苷酸(“接头”或“接头核苷酸”)共价连接，并杂交形成蛋白结合区段的双链RNA双链体(dsRNA双链体)，从而产生茎环结构。标靶人RNA和活化物RNA可以通过标靶人RNA的3’末端和活化物RNA的5’末端共价连接。可选地，标靶人RNA和活化物RNA可以通过标靶人RNA的5’末端和活化物RNA的3’末端共价连接。

单分子核酸靶向RNA的接头可以具有约3个核苷酸至约100个核苷酸的长度。例如，接头可以具有的长度为约3个核苷酸(nt)至约90nt、约3个核苷酸(nt)至约80nt、约3个核苷酸(nt)至约70nt、约3个核苷酸(nt)至约60nt、约3个核苷酸(nt)至约50nt、约3个核苷酸(nt)至约40nt、约3个核苷酸(nt)至约30nt、约3个核苷酸(nt)至约20nt或约3个核苷酸(nt)至约10nt。例如，接头可以具有的长度为约3nt至约5nt、约5nt至约10nt、约10nt至约15nt、约15nt至约20nt、约20nt至约25nt、约25nt至约30nt、约30nt至约35nt、约35nt至约40nt、约40nt至约50nt、约50nt至约60nt、约60nt至约70nt、约70nt至约80nt、约80nt至约90nt或约90nt至约100nt。在一些实施方案中，单分子核酸靶向RNA的接头为4nt。

示例性的单分子核酸靶向RNA包含两个互补的核苷酸区段，它们杂交形成dsRNA双链体。在一些实施方案中，单分子核酸靶向RNA(或编码该区段的DNA)的两个互补核苷酸区段中的一个与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的活化物RNA(tracrRNA)分子(如SEQ ID NO:431-562)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸的区段上至少约60％相同。例如，单分子核酸靶向RNA(或编码该区段的核酸(例如，DNA))的两个互补核苷酸区段中的一个与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的tracrRNA序列(如SEQ ID NO:431-562)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸的区段上至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。

在一些实施方案中，单分子核酸靶向RNA(或编码该区段的核酸)的两个互补核苷酸区段中的一个与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的标靶人RNA(crRNA)序列(如SEQ ID NO:563-679)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸的区段上至少约60％相同。例如，单分子DNA靶向RNA(或编码该区段的DNA)的两个互补核苷酸区段中的一个与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号中列出的crRNA序列(如SEQ ID NO:563-679)之一或其互补序列在至少8个连续核苷酸的区段上至少约65％相同、至少约70％相同、至少约75％相同、至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同、至少约98％相同、至少约99％相同或100％相同。

对于sgRNA和dgRNA两者，与天然存在的tracrRNA和crRNA具有广泛同一性(约至少50％同一性)的人工序列与CRISPR蛋白和修饰的CRISPR蛋白(例如，Cas9、Cas9样蛋白、修饰的Cas9和修饰的Cas9样蛋白)一起发挥作用，以将RNP以序列特异性递送至靶核酸，特别地条件是核酸靶向RNA的蛋白结合结构域的结构是保守的。因此，与天然存在的核酸靶向RNA的蛋白结合结构域的RNA折叠和RNA二级结构相关的信息和建模为设计人工蛋白结合结构域(在dgRNA或sgRNA中)提供了指导。作为非限制性实例，功能性人工核酸靶向RNA可以基于天然存在的RNA的核酸靶向区段的蛋白结合区段的结构来设计(例如，包括沿着RNA双链体的相同或相似数量的碱基对，并且包括与天然存在的RNA中存在的相同或相似的“凸起”区域)。本领域普通技术人员可以容易地产生来自任何物种的任何天然存在的crRNA:tracrRNA对的结构；因此，在一些实施方案中，当使用来自给定物种的Cas9(或相关Cas9)时，人工核酸靶向RNA被设计成模拟该物种的天然结构。因此，在一些实施方案中，合适的核酸靶向RNA是人工设计的RNA(非天然存在的)，其包含蛋白结合结构域，该结构域被设计成模拟天然存在的核酸靶向RNA的蛋白结合结构域的结构。在示例性实施方案中，蛋白结合区段具有约10个核苷酸至约100个核苷酸的长度；例如，蛋白结合区段具有的长度为约15个核苷酸(nt)至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt。

可以使用各种计算机工具来分析和设计核酸，例如，用于核酸的Vector NTI(Invitrogen)和用于蛋白的比较序列分析的AlignX。此外，RNA结构和折叠的计算机模拟建模可以使用Vienna RNA包的算法来执行，并且RNA二级结构和折叠模型可以分别用RNAfold和RNAcofold来预测，并且用VARNA来可视化。参见，例如，Denman(1993),Biotechniques15,1090；Hofacker和Stadler(2006),Bioinformatics 22,1172；以及Darty和Ponty(2009),Bioinformatics 25,1974，其中每一项通过引用并入本文。

因此，如本文描述，在一些实施方案中，该技术提供了包括和/或包括使用包含多肽和一个或更多个RNA的RNP的方法、系统、试剂盒、组合物、用途等。在一些实施方案中，RNA包含与靶核酸中的核苷酸序列互补(例如，至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或100％互补)的区段(例如，包含6-10个核苷酸，例如，包含6个、7个、8个、9个或10个核苷酸)。

在一些实施方案中，RNA包含含有与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号的SEQ ID NO:431-682中列出的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:431-562)中的任一种在至少8个连续核苷酸上至少60％相同的核苷酸序列(例如支架序列，例如与多肽相互作用(例如结合)的序列)的区段。在一些实施方案中，RNA包含与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号的SEQ ID NO:563-682中列出的核苷酸序列中的任一种在至少8个连续核苷酸上至少60％相同的核苷酸序列(例如支架序列，例如与多肽相互作用(例如结合)的序列)。

在一些实施方案中，多肽包含含有与通过引用并入本文的美国专利申请公布第20170051312号的SEQ ID NO:1-256和795-1346所列的氨基酸序列中的任一种的氨基酸7-166或731-1003至少约75％相同的氨基酸序列的区段。

当Cas9与其gRNA(或其组成部分)缔合，例如形成核糖核蛋白(RNP)时，它能够通过单链切口、双链断裂和/或DNA结合来修饰核酸(例如，DNA和/或RNA)的特定区域。

因此，在一些实施方案中，该技术包括使用包含CRISPR蛋白的核糖核蛋白(RNP)。在一些实施方案中，该技术包括使用RNP复合物，该RNP复合物包含Cas9或Cas9样蛋白和一种或更多种RNA分子(例如，gRNA(例如，核酸靶向RNA、活化物RNA和标靶人RNA、crRNA和tracrRNA；dgRNA；sgRNA))。在一些实施方案中，该技术包括使用核糖核蛋白(RNP)复合物，该复合物包含本文描述的Cas9或Cas9样蛋白和一种或更多种RNA分子(例如，gRNA(例如，核酸靶向RNA、活化物RNA和标靶人RNA、crRNA和tracrRNA；dgRNA；sgRNA))。

在一些实施方案中，该技术包括使用多于一种RNP，例如以在核酸中产生多于一种双链断裂。例如，在一些实施方案中，该技术包括使用包含CRISPR蛋白(例如，Cas9或Cas9样蛋白)和第一RNA分子或第一组RNA分子(例如，gRNA(例如，核酸靶向RNA、活化物RNA和标靶人RNA、crRNA和tracrRNA；dgRNA；sgRNA))的第一RNP和包含CRISPR蛋白(例如，Cas9或Cas9样蛋白)和第二RNA分子或第二组RNA分子(例如，gRNA(例如，核酸靶向RNA、活化物RNA和标靶人RNA、crRNA和tracrRNA；dgRNA；sgRNA))的第二RNP。

RNA通过包含与靶核酸的靶序列互补的核苷酸序列，为RNP复合物提供靶特异性。复合物的多肽(例如，CRISPR蛋白)提供结合和核酸酶活性。换句话说，多肽借助于其与至少核酸靶向RNA的蛋白结合区段相关联，而被引导至核酸序列(例如，DNA序列(例如，染色体序列、染色体外序列(例如，附加体(episomal)序列、微环(minicircle)序列、线粒体序列、叶绿体序列等)、cDNA序列)或RNA序列(例如，转录物序列、功能性RNA序列))。

在实施方案中，本技术的颗粒还包含含有同源模板的核酸(例如，“供体核酸”)。同源模板可以是包含靶DNA的野生型形式的修复模板，或者同源模板可以包含靶DNA的突变形式。例如，同源模板可以包含与基因编辑内切核酸酶的靶位点10kb内的序列至少约70％同源的多核苷酸。当使用同源模板时，CRISPR允许将同源序列插入特定的靶DNA位置，从而修复突变的基因和/或以其他方式修饰基因组序列。

在一些实施方案中，该技术包括使用供体核酸，例如DNA分子。在一些实施方案中，供体分子参与同源引导修复(HDR)途径，用来自供体的序列“修复”双链断裂。以这种方式，CRISPR可用于在靶位点处进行特定核酸序列的靶向插入，例如，以产生“敲入”。

在一些实施方案中，供体核酸是双链的。在一些实施方案中，供体核酸是单链的。在一些实施方案中，供体DNA分子是线性分子(例如，不是环状分子，诸如质粒DNA)。

供体DNA分子可以具有任何期望的序列。在一些实施方案中，供体核酸包含含有待敲入靶基因座的核酸的部分(例如，在一些实施方案中，供体核酸包含含有插入序列的部分)。在一些实施方案中，供体DNA分子的至少一个末端上的最3'核苷酸是C。在一些实施方案中，供体DNA分子的一个且仅一个末端上的最3'核苷酸是C。在一些实施方案中，供体DNA分子的至少一个末端上的最3'核苷酸是G。在一些实施方案中，供体DNA分子的一个且仅一个末端上的最3'核苷酸是G。在一些实施方案中，供体DNA分子的至少一个末端上的最3'核苷酸是A。在一些实施方案中，供体DNA分子的一个且仅一个末端上的最3'核苷酸是A。在一些实施方案中，供体DNA分子的至少一个末端上的最3'核苷酸是T。在一些实施方案中，供体DNA分子的一个且仅一个末端上的最3'核苷酸是T。

在一些实施方案中，线性供体(例如，DNA)分子具有10个至1000个核苷酸(nt)范围内的长度(例如，15nt至500nt、20nt至500nt、30nt至500nt、33nt至500nt、35nt至500nt、40nt至500nt、45nt至500nt、50nt至500nt、15nt至250nt、20nt至250nt、30nt至250nt、33nt至250nt、35nt至250nt、40nt至250nt、45nt至250nt、50nt至250nt、15nt至150nt、20nt至150nt、30nt至150nt、33nt至150nt、35nt至150nt、40nt至150nt、45nt至150nt、50nt至150nt、15nt至100nt、20nt至100nt、30nt至100nt、33nt至100nt、35nt至100nt、40nt至100nt、45nt至100nt、50nt至100nt、15nt至50nt、20nt至50nt、30nt至50nt、33nt至50nt、35nt至50nt、40nt至50nt或45nt至50nt)。在一些实施方案中，线性供体核酸具有1Kbp或更长的长度(例如，1Kbp至10Kbp(例如，1Kbp、1.5Kbp、2Kbp、2.5Kbp、3Kbp、3.5Kbp、4Kbp、4.5Kbp、5Kbp、5.5Kbp、6Kbp、6.5Kbp、7Kbp、7.5Kbp、8Kbp、8.5Kbp、9Kbp、9.5Kbp或10Kbp))。

在一些实施方案中，一种方法包括将主题线性供体DNA分子引入细胞(例如，根据本文提供的纳米颗粒技术)。

在一些实施方案中，线性供体DNA分子包含3'-突出端。例如，在一些实施方案中，线性供体DNA分子包含具有在1个至6个核苷酸(nt)范围内(例如，1nt至5nt、1nt至4nt、1nt至3nt、1nt至2nt、2nt至6nt、2nt至5nt、2nt至4nt、2nt至3nt、3nt至6nt、3nt至5nt、3nt至4nt、4nt至6nt、4nt至5nt、5nt至6nt、1nt、2nt、3nt、4nt、5nt或6nt)的长度的3'-突出端。在一些实施方案中，线性供体DNA分子不具有3'-突出端。因此，在一些实施方案中，线性供体DNA分子包含具有在0至6个核苷酸(nt)范围内(例如，0至5nt、0至4nt、0至3nt、0至2nt、0至1nt、1nt至6nt、1nt至5nt、1nt至4nt、1nt至3nt、1nt至2nt、2nt至6nt、2nt至5nt、2nt至4nt、2nt至3nt、3nt至6nt、3nt至5nt、3nt至4nt、4nt至6nt、4nt至5nt、5nt至6nt、1nt、2nt、3nt、4nt、5nt或6nt)的长度的3'-突出端。

在实施方案中，核酸编码Cre-重组酶或FLP-重组酶。这两种酶靶向特定的识别序列(对于Cre为LoxP位点，并且对于FLP为FRT位点)，并缺失/切除位于识别序列之间的DNA。Cre和FLP可用于敲除先前被工程化以在其基因组中含有LoxP或FRT位点的模式生物体中的基因活性。因此，本技术可用于创建敲除动物。

在实施方案中，核酸编码兆核酸酶。至少在U.S.7,842,489中描述了兆核酸酶，将其通过引用特此并入。兆核酸酶是内切脱氧核糖核酸酶，其特征在于12个至40个碱基对的大的识别位点，统计上在给定的基因组中应只出现一次。通过蛋白工程化定制其靶识别结构域，兆核酸酶可以以高度特异性的方式替换、消除或修饰序列。

在一些实施方案中，核酸编码TALEN。至少在US 2011/0145940和U.S.9,393,257中描述了TALEN，将其通过引用特此并入。TALEN是融合蛋白，包含转录活化因子样效应子(TALE)DNA结合结构域和DNA核酸酶结构域(其切割DNA链)。TALE可以被工程化成结合任何期望的DNA序列。因此，TALEN通过其DNA核酸酶结构域在特定位置处切割DNA。

在实施方案中，核酸编码ZFN。至少在US 2005/0208489中描述了ZFN，将其通过引用特此并入。ZFN是通过将锌指DNA结合结构域与DNA裂解结构域融合而产生的人工限制性酶。锌指结构域设计为靶向特定的DNA序列。因此，ZFN通过其DNA裂解结构域能够精确修饰基因和/或基因组序列。在实施方案中，本技术的颗粒还包含含有同源模板的核酸，所述同源模板可以是包含靶DNA的野生型形式的修复模板，或者可以包含靶DNA的突变形式。因此，在实施方案中，ZFN允许将同源序列插入特定的靶DNA位置，从而修复突变的基因和/或以其他方式修饰基因组序列。

在实施方案中，基因编辑蛋白包含核定位序列或线粒体定位序列。

E.用于治疗视网膜眼病的基因治疗方法

一般来说，基因治疗包括将基因或基因修饰技术治疗性递送至细胞，以治疗潜在的疾病或状况。这种技术包括用健康的基因拷贝替换引起疾病或状况的突变基因，使突变基因失活或“敲除”突变基因或引入对抗该疾病或介导该状况的新基因。在一些实施方案中，本公开内容的主题提供了一种用于治疗视网膜眼病包括遗传性视网膜眼病的方法。

在某些实施方案中，将纳米颗粒靶向(通过生物材料选择、纳米颗粒生物物理特性和/或靶向配体)与治疗性基因对特定细胞类型(例如，癌细胞)的转录靶向组合。转录靶向包括设计包含在感兴趣的细胞或组织类型中具有活性的启动子的核酸负载，使得递送的纳米颗粒以组织特异性方式表达核酸负载。为此，在一些实施方案中，核酸可操作地连接至组成型启动子或癌症特异性启动子。

“启动子”是一种指导RNA聚合酶的结合并从而促进RNA合成的DNA序列。当启动子能够指导核酸序列的转录时，核酸序列“可操作地连接”至启动子。启动子对于与其可操作地连接的核酸序列可以是天然或非天然的。将序列可操作地连接在一起的技术是本领域熟知的。如本文使用的，术语“组成型启动子”是指允许其相关基因在多种细胞类型中连续转录的非调节的启动子。合适的组成型启动子是本领域已知的，并且可以与本公开内容结合使用。

在一些实施方案中，用颗粒转染细胞以用于离体基因治疗。在一些实施方案中，将颗粒直接递送至生物体，诸如哺乳动物受试者，从而指导体内基因治疗。

在特定实施方案中，本公开内容的颗粒将包含编码SR39胸苷激酶的核酸序列的质粒DNA携带至癌细胞。细胞可以是真核细胞，诸如动物细胞或植物细胞。在另外的实施方案中，动物细胞是哺乳动物细胞(例如，人类细胞)。

在包括用于将核酸离体递送至细胞的一些实施方案中，细胞是干细胞或祖细胞。细胞可以是多能的(multipotent)或多潜能的(pluripotent)。在一些实施方案中，细胞是干细胞，诸如胚胎干细胞或成体干细胞。在一些实施方案中，细胞是造血干细胞。

对于体内基因治疗，颗粒可被配制成用于各种施用模式，包括全身施用及表面施用或局部施用。因此，药物组合物可以配制成用于通过任何合适的途径向患者施用，包括静脉内施用、动脉内施用、皮下施用、皮内施用、淋巴内施用和肿瘤内施用。在一些实施方案中，组合物被冻干，并在施用前重构。

在特定实施方案中，视网膜眼病选自：年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括湿性黄斑变性和干性黄斑变性、2型利伯氏先天性黑蒙症(LCA2)、无脉络膜症、全色盲、色素性视网膜炎(RP)、斯塔加特病(STGD)、乌谢尔综合征、青少年X连锁视网膜劈裂症(XLRS)和糖尿病性视网膜病变。

本公开内容的组合物可以通过直接注射到前房中(前房注射)、结膜下注射、玻璃体内注射和视网膜下注射来施用。特别地，组合物被递送至视网膜色素上皮(RPE)的一个或更多个细胞。

在表1中总结了用于视网膜眼病基因治疗的代表性方法。参见Samiy,GeneTherapy for Retinal Diseases,J.Ophthalmic Vis Res.2014Oct-Dec；9(4):506-509；Campa等人,The Role of Gene Therapy in the Treatment of Retinal Diseases:AReview,Current Gene Therapy,2017,17,194-213。

更特别地，在一些实施方案中，本公开内容的主题提供一种用于治疗视网膜眼病的方法，该方法包括向需要相应治疗的受试者施用式(I)或式(II)的组合物，其中该组合物包含用于治疗视网膜眼病的治疗性蛋白。

在一些实施方案中，视网膜眼病包括遗传性视网膜眼病。在特定实施方案中，视网膜眼病选自由以下组成的组：年龄相关性黄斑变性(AMD)，包括湿性黄斑变性和干性黄斑变性、2型利伯氏先天性黑蒙症(LCA2)、无脉络膜、全色盲、色素性视网膜炎(RP)、斯塔加特病(STGD)、乌谢尔综合征、青少年X连锁视网膜劈裂症(XLRS)和糖尿病性视网膜病变。

在某些实施方案中，治疗性蛋白选自由以下组成的组：CNGA3、CNGB3、GNAT2、sFLT01、Rab Escort蛋白(REP-1)、RS-1、RPE65、RPGR、MY07A、MERTK、ATP结合盒转运蛋白4(ABCA4)和SAR-421869。

在又更多的某些实施方案中，与视网膜眼病相关的核酸通过选自由房内注射、结膜下注射、玻璃体内注射和视网膜下注射组成的组的注射技术施用。在特定实施方案中，组合物被递送至受试者的视网膜色素上皮(RPE)的一个或更多个细胞。

如本文使用的，术语“治疗”可以包括逆转、缓解疾病、紊乱或状况，抑制疾病、紊乱或状况的进展，预防或降低该术语适用的疾病、紊乱或状况的可能性或该疾病、紊乱或状况的一种或更多种症状或表现。预防是指使疾病、紊乱、状况、或其症状或表现或其严重性的恶化不发生。因此，本公开内容的化合物可以预防性施用，以防止或减少疾病、紊乱或状况的发生或复发。

如本文使用的，术语“抑制”及其语法衍生是指本公开内容的化合物，例如本公开内容的式(I)化合物，阻断、部分地阻断、干扰、降低或减少癌细胞生长和/或转移的能力。因此，本领域普通技术人员将理解，术语“抑制”包括癌细胞生长和/或转移的完全和/或部分降低，例如降低至少10％，在一些实施方案中，降低至少20％、30％、50％、75％、95％、98％，并且最多且包括100％。

通过本公开内容的方法在其许多实施方案中治疗的受试者合意地是人类受试者，然而应当理解的是，本文描述的方法对于所有脊椎动物物种有效，所有脊椎动物物种意图被包括在术语“受试者”中。因此，“受试者”可以包括用于医疗目的，诸如用于现存状况或疾病的治疗或用于状况或疾病的发作的预防性治疗的人类受试者，或用于医疗目的、兽医目的或发育目的的动物受试者。适合的动物受试者包括哺乳动物，哺乳动物包括但不限于，灵长类动物，例如人类、猴、猿等；牛科动物，例如，家牛、公牛等；羊(ovine)，例如，绵羊(sheep)等；羊(caprine)，例如，山羊(goat)等；猪类(porcines)，例如，猪、畜牧猪(hogs)等；马科动物(equines)，例如，马、驴、斑马等；猫科动物，包括野生猫和家养猫；犬类(canine)，包括狗；兔类动物，包括家兔、野兔等；和啮齿类动物，包括小鼠、大鼠等。动物可以是转基因动物。在某些实施方案中，受试者是人类，包括但不限于胎儿、新生儿、婴儿、少年和成年的受试者。此外，“受试者”可以包括罹患或怀疑罹患状况或疾病的患者。因此，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用。术语“受试者”也指来自受试者的生物体、组织、细胞或细胞集合。

通常，活性剂或药物递送装置的“有效量”指引起所期望的生物响应所需的量。如将由本领域普通技术人员所理解的，剂或装置的有效量可以取决于这样的因素而变化：如所期望的生物学终点、待递送的剂、药物组合物的组成、靶组织等。

术语“组合”以其最广泛的含义使用，并且意指向受试者施用至少两种剂，更特别地式(I)化合物和至少一种治疗剂和/或成像剂。更特别地，术语“组合”是指同时施用两种(或更多种)活性剂来治疗疾病状态例如单一疾病状态。如本文使用的，活性剂可以组合并以单一剂型施用，可以同时以单独剂型施用，或者可以作为在相同或不同的日期交替或依次施用的单独剂型施用。在本公开内容的主题的一种实施方案中，活性剂被组合并以单一剂型施用。在另一种实施方案中，活性剂以单独剂型施用(例如，其中期望改变一种的量而不改变另一种的量)。单一剂型可包括用于治疗疾病状态的另外的活性剂。

此外，本文描述的式(I)或式(II)的组合物可以单独施用或与增强式(I)或式(II)的组合物稳定性的辅助剂组合施用，单独施用或与一种或更多种治疗剂和/或成像剂组合施用，在某些实施方案中促进含有它们的药物组合物的施用，提供增加的溶解或分散，增加抑制活性，提供辅助治疗等，包括其他活性成分。有利的是，这种组合疗法使用较低剂量的常规治疗剂，因此避免了当这些剂用作单一疗法时引起的可能的毒性和不利副作用。

式(I)或式(II)的组合物和至少一种另外的治疗剂的施用时机可以改变，条件是实现这些剂的组合的有益效果。因此，措辞“与...组合”是指同时、依次或其组合地施用式(I)或式(II)的组合物和至少一种另外的治疗剂。因此，被施用式(I)或式(II)的组合物和至少一种另外的治疗剂的组合的受试者可以在相同的时间(即，同时地)或在不同的时间(即，在同一天或在不同天、以任一顺序依次地)接受式(I)或式(II)的组合物和至少一种另外的治疗剂，条件是在受试者中实现两种剂的组合的效果。

当依次施用时，剂可以在彼此的1分钟、5分钟、10分钟、30分钟、60分钟、120分钟、180分钟、240分钟或更长的时间内被施用。在其他实施方案中，被依次施用的剂可以在彼此的1天、5天、10天、15天、20天或更多天内被施用。在式(I)的组合物与至少一种另外的治疗剂被同时施用的情况下，它们可以作为各自包含式(I)的组合物或至少一种另外的治疗剂的分开的药物组合物被施用至受试者，或者它们可以作为包含两种剂的单一药物组合物被施用至受试者。

当组合施用时，引起特定生物响应的剂中的每一种的有效浓度可以小于每种剂在单独施用时的有效浓度，从而允许一种或更多种剂的剂量相对于如果该剂作为单一的剂施用将需要的剂量的减少。多于一种剂的作用可以，但不必是，累加的或协同的。剂可以被施用多于一次。

在一些实施方案中，当组合施用时，两种或更多种药物可以具有协同效应。如本文使用的，术语“协同”、“协同的”、“协同地”及其衍生，诸如“协同效应”或“协同组合”或“协同组合物”是指式(I)的组合物和至少一种另外的治疗剂的组合的生物活性大于当单独施用时各种剂的生物活性之和的情况。

协同可以用“协同指数(SI)”来表示，协同指数通常可以通过F.C.Kull等人,Applied Microbiology 9,538(1961)描述的方法，从通过以下式确定的比率来确定：

Q

其中：

Q

Q

Q

Q

一般来说，当Q

F.定义

尽管本文中采用了特定术语，但它们仅用于一般的和描述性的意义，而非用于限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

如本文使用的，术语“CRISPR活性”是指与CRISPR系统相关的活性。这种活性的实例是序列特异性结合、双链核酸酶活性、切口酶活性、转录活化、转录抑制、核酸甲基化、核酸去甲基化和重组酶。

此外，如本文使用的，术语“CRISPR系统”是指CRISPR蛋白和核酸的集合，当组合时(例如，形成RNP(例如，CRISPR复合物))，产生至少CRISPR相关的活性(例如，双链DNA的靶基因座特异性、双链裂解)。例如，在一些实施方案中，“CRISPR系统”集合地指参与CRISPR相关(“Cas”)基因的表达和/或指导其活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因、dCas基因、Cas切口酶、Cas同源物、Cpf1基因、Cas13的序列，和/或任何前述的修饰形式；tracr(反式活化CRISPR)序列(例如，tracrRNA或活性部分tracr RNA)；cr(CRISPR)序列(例如，crRNA或活性部分crRNA)；和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。在该技术的一些实施方案中，术语“引导序列”和“引导RNA”(gRNA)可互换使用。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或更多个元件源自I型、II型或II型CRISPR系统。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或更多个元件源自包含内源CRISPR系统的特定生物体，诸如酿脓链球菌。通常，CRISPR系统的特征在于促进CRISPR RNP复合物形成(例如，在体外或在体内)并将其引导至靶序列位点(例如，在细胞中(例如，在引入RNP之后)和/或在体外)的元件。

如本文使用的，术语“CRISPR复合物”是指CRISPR蛋白和核酸(例如，RNA)，它们相互缔合形成具有功能活性的聚集体(例如，RNP)。CRISPR复合物的一种实例是野生型Cas9(有时称为Csn1)蛋白或Cas9样蛋白，其结合到对靶基因座特异的引导RNA。

如本文使用的，术语“CRISPR蛋白”是指包含核酸(例如，RNA(例如，gRNA))结合结构域和效应子(例如，核酸酶)结构域的蛋白(例如，Cas9(例如，酿脓链球菌Cas9)及其修饰形式)。核酸结合结构域与第一核酸分子相互作用，第一核酸分子具有能够与期望靶核酸杂交的区域(例如，引导RNA)或与具有能够与期望靶核酸杂交的区域(例如，crRNA)的第二核酸缔合。在一些实施方案中，CRISPR蛋白包含核酸酶结构域(例如，DNA酶或RNA酶结构域)、一个或更多个另外的DNA结合结构域、解旋酶结构域、蛋白-蛋白相互作用结构域、二聚化结构域、亲和标签以及一个或更多个其他结构域。在一些实施方案中，“CRISPR蛋白”是指形成结合上述第一核酸分子的复合物的多于一种蛋白。因此，一种CRISPR蛋白可以与例如引导RNA结合，并且另一种CRISPR蛋白可以具有内切核酸酶活性。这些都被认为是CRISPR蛋白，因为它们作为复合物的一部分起作用，复合物与单一蛋白诸如Cas9执行相同的功能。在一些实施方案中，CRISPR蛋白包含核定位信号(NLS)，核定位信号允许CRISPR蛋白被转运至细胞核。

如本文使用的，“核酸”或“核酸序列”是指嘧啶和/或嘌呤碱基(优选地分别是胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及腺嘌呤和鸟嘌呤)的聚合物或低聚物(参见AlbertL.Lehninger,Principles of Biochemistry,在793-800页(Worth Pub.1982)，通过引入并入本文)。本技术设想了任何脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分及其任何化学变体，诸如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等。聚合物或低聚物在组成上可以是异源的或同源的，并且可以从天然存在的来源分离，或者可以人工或合成产生。此外，核酸可以是DNA或RNA或其混合物，并且可以以单链或双链形式(包括同源双链体、异源双链体和杂交体状态)长期或瞬时存在。在一些实施方案中，核酸或核酸序列包含其他种类的核酸结构，诸如，例如，DNA/RNA螺旋、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸(参见例如，Braasch和Corey,Biochemistry,2002,41(14),4503-4510，通过引用并入本文，以及美国专利第5,034,506号，通过引用并入本文)、锁核酸(LNA；参见Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638，通过引用并入本文)、环己烯基核酸(参见Wang,J.Am.Chem.Soc.,2000,122,8595-8602，通过引用并入本文)和/或核酶。因此，术语“核酸”或“核酸序列”也可以涵盖包含非天然核苷酸、修饰的核苷酸和/或非核苷酸构建模块(其可以表现出与天然核苷酸相同的功能(例如，“核苷酸类似物”))的链；此外，如本文使用的术语“核酸序列”是指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，以及基因组DNA或RNA或者合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的，并代表有义或反义链。

此外，术语“核酸”、“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“寡核苷酸”可互换使用。这些指任何长度的聚合形式的核苷酸(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的基因座(loci；locus)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。该术语还涵盖具有合成主链的核酸样结构，参见例如Eckstein,1991；Baserga等人,1992；Milligan,1993；WO 97/03211；WO 96/39154；Mata,1997；Strauss-Soukup,1997；和Samstag,1996，其中每一项通过引用并入本文。多核苷酸可以包含一个或更多个修饰的核苷酸，诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在修饰，则对核苷酸结构的修饰可以在聚合物组装之前或之后赋予。核苷酸序列可以被非核苷酸组成部分插入。在聚合之后，多核苷酸可诸如通过与标记组分缀合被进一步修饰。

如本文使用的术语“核苷酸类似物”是指修饰的或非天然存在的核苷酸，包括但不限于具有改变的堆积相互作用的类似物，诸如7-脱氮嘌呤(例如，7-脱氮-dATP和7-脱氮-dGTP)；具有替代氢键构型的碱基类似物(例如，诸如美国专利第6,001,983号中描述的Iso-C和Iso-G以及其他非标准碱基对，通过引用并入本文)；非氢键类似物(例如，非极性芳香核苷类似物，诸如如2,4-二氟甲苯，由B.A.Schweitzer和E.T.Kool,J.Org.Chem.,1994,59,7238-7242；B.A.Schweitzer和E.T.Kool,J.Am.Chem.Soc.,1995,117,1863-1872描述，其中每一项通过引用并入本文)；“通用”碱基，诸如5-硝基吲哚和3-硝基吡咯；以及通用嘌呤和嘧啶(分别诸如“K”和“P”核苷酸；P.Kong等人,Nucleic Acids Res.,1989,17,10373-10383；P.Kong等人,Nucleic Acids Res.,1992,20,5149-5152，其中每一项通过引用并入本文)。核苷酸类似物包括糖部分上具有修饰的核苷酸，诸如双脱氧核苷酸和2'-O-甲基核苷酸。核苷酸类似物包括脱氧核糖核苷酸的修饰形式以及核糖核苷酸的修饰形式。

如本文使用的，术语“肽核酸”意指掺入肽样聚酰胺主链的DNA模拟物。

如本文使用的，术语“％序列同一性”是指在比对两个序列并引入空位(gap)(如有必要)以获得最大同一性百分比后，核酸序列中与参考序列中的对应核苷酸相同的核苷酸或核苷酸类似物的百分比。因此，在根据该技术的核酸比参考序列长的情况下，核酸中未与参考序列对齐的额外核苷酸不被考虑用于确定序列同一性。用于比对的方法和计算机程序在本领域中是熟知的，包括BLAST、Align 2和FASTA。

术语“同源性”和“同源”是指同一性的程度。可以存在部分同源性或完全同源性。部分同源序列是与另一序列小于100％相同的序列。

如本文使用的术语“序列变异”是指在两个核酸之间核酸序列中的一个或多于一个差异。例如，野生型结构基因与该野生型结构基因的突变形式的序列差异可以在于存在一个或更多个单碱基取代或者一个或更多个核苷酸的缺失和/或插入。结构基因的这两种形式被称作彼此序列不同。可以存在结构基因的第二突变形式。该第二突变形式被称作与野生型基因和基因的第一突变形式两者序列不同。

如本文使用的，术语“互补”或“互补性”用于指通过碱基配对规则相关联的多核苷酸(例如，核苷酸诸如寡核苷酸或靶核酸的序列)。例如，序列“5'-A-G-T-3'”与序列“3'-T-C-A-5'”互补。互补性可以是“部分的”，其中核酸碱基中仅一些根据碱基配对规则匹配。或者，在核酸之间可以存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。这在扩增反应中以及依赖于核酸之间结合的检测方法中是特别重要的。任一术语也可用于指单个核苷酸，尤其是在多核苷酸的背景下。例如，可注意到与寡核苷酸的其余部分和另一条核酸链之间的互补性相反或相比，寡核苷酸中的特定核苷酸与核酸链中的核苷酸互补或缺乏互补。

在一些背景下，术语“互补性”和相关术语(例如，“互补的”、“互补”)是指核酸序列中可以通过氢键结合另一核酸序列的核苷酸，例如能够通过Watson-Crick碱基配对或其他碱基配对进行碱基配对的核苷酸。可以形成碱基对的核苷酸，例如彼此互补的核苷酸，是这样的对：胞嘧啶和鸟嘌呤、胸腺嘧啶和腺嘌呤、腺嘌呤和尿嘧啶、以及鸟嘌呤和尿嘧啶。互补性百分比不需要在核酸序列的整个长度上计算。互补性百分比可以限于核酸序列碱基配对的特定区域，例如，从第一个碱基配对的核苷酸开始，并且到最后一个碱基配对的核苷酸结束。如本文使用的核酸序列的互补序列是指这样的寡核苷酸，该寡核苷酸当与核酸序列对齐使得一个序列的5’端与另一序列的3’端配对时呈“反向平行缔合(antiparallelassociation)”。通常不存在于天然核酸中的某些碱基可以包含在本发明的核酸中，并且包括，例如，肌苷及7-脱氮鸟嘌呤。互补性不需要是完全的；稳定的双链体可以包含错配碱基对或不匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以考虑许多变量凭经验确定双链体稳定性，所述变量包括，例如，寡核苷酸的长度、寡核苷酸的碱基组成和序列、离子强度以及错配碱基对的发生率。

本领域理解，多核苷酸的序列不必与其靶核酸的序列100％互补，就可以与靶核酸“杂交”或“特异性地杂交”。此外，多核苷酸可以在一个或更多个区段上杂交，使得间插的或相邻的区段不参与杂交事件(例如，环结构或发夹结构)。多核苷酸可以包含与它们所靶向的靶核酸序列中的靶区域至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的序列互补性。例如，核酸的20个核苷酸中的18个核苷酸与靶区域互补并因此特异性地杂交的核酸，将代表90％的互补性。在该实例中，剩余的非互补核苷酸可以是聚簇的或散布有互补核苷酸，并且不需要彼此相邻或与互补核苷酸相邻。核酸中特定核酸序列区段之间的互补性百分比可以通过以下常规地确定：使用本领域已知的BLAST程序(基础局部比对检索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人,J.Mol.Biol.,1990,215,403-410；Zhang和Madden,Genome Res.,1997,7,649-656，其中每一项通过引用并入本文)，或通过使用缺省设置的Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8for Unix,GeneticsComputer Group,University Research Park,Madison Wis.)，其使用Smith和Waterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482-489，通过引用并入本文)的算法。

因此，在一些实施方案中，“互补”是指第一核酸碱基序列在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个核酸碱基的区域上与第二核酸碱基序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或两个序列在严格杂交条件下杂交。“完全互补”是指第一核酸的每个核酸碱基能够与第二核酸中对应位置处的每个核酸碱基配对。例如，在某些实施方案中，其中每个核酸碱基与核酸具有互补性的寡核苷酸在8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或更多个核酸碱基的区域上具有与核酸的互补序列相同的核酸碱基序列。

如本文使用的，术语“错配”意指第一核酸的核酸碱基不能够与第二核酸中对应位置处的核酸碱基配对。

如本文使用的，术语“杂交”用于指互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间缔合的强度)受诸如核酸之间互补程度、涉及条件的严格性和形成的杂交体的Tm等因素的影响。“杂交”方法涉及一种核酸与另一种核酸(互补核酸，例如具有互补核苷酸序列的核酸)的退火。包含互补序列的两个核酸聚合物找到彼此并通过碱基配对相互作用“退火”或“杂交”的能力是公认的现象。Marmur和Lane,Proc.Natl.Acad.Sci.USA46:453(1960)和Doty等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 46:461(1960)(其中每一项通过引用并入本文)对“杂交”过程的初步观察，随后这一过程被改进为现代生物学的基本工具。例如，杂交和洗涤条件现在是熟知的，并在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor(1989)，特别是其中第11章和表11.1；以及Sambrook,J.和Russell,W.,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor(2001)中示例，其中每一项通过引用并入本文。温度和离子强度的条件确定杂交的“严格性”。

如本文使用的，“双链核酸”可以是核酸的一部分、较长核酸的一个区域或整个核酸。“双链核酸”可以是，例如但不限于，双链DNA、双链RNA、双链DNA/RNA杂交体等。具有二级结构(例如，碱基配对的二级结构)和/或更高级结构(例如，茎环结构)的单链核酸包含“双链核酸”。例如，三链体结构被认为是“双链的”。在一些实施方案中，任何碱基配对的核酸为“双链核酸”。

如本文使用的，术语“基因组基因座”或“基因座”(多于一个“基因座”)是基因或核酸(例如，DNA或RNA)序列在染色体上的特定位置。

术语“基因”是指包含产生具有非编码功能的RNA(例如核糖体RNA或转移RNA)、多肽或前体所必需的控制和编码序列的DNA序列。RNA或多肽可以由全长编码序列或编码序列的任何部分编码，条件是保留所需的活性或功能。因此，“基因”是指编码在生物体中发挥功能作用的多肽或RNA链的DNA或RNA或其部分。为了该技术的目的，可以认为基因包括调节基因产物产生的区域，无论这种调节序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、翻译调控序列诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附接位点和基因座控制区。

术语“野生型”是指具有从天然存在的来源分离的基因或基因产物的特征的基因或基因产物。野生型基因是在群体中最常观察到的基因，因此被任意指定为基因的“正常”或“野生型”形式。相比之下，术语“修饰的”、“突变的”或“多态的”指当与野生型基因或基因产物相比时，显示出序列和/或功能特性的改变(即，改变的特征)的基因或基因产物。注意，可以分离到天然存在的突变体；它们通过以下事实鉴定出，即当与野生型基因或基因产物相比时，它们具有改变的特征。

如本文使用的，术语“敲除”是由染色体基因座中编码的遗传信息的破坏导致的遗传修饰。

如本文使用的，术语“敲入”是由不同核酸序列替换染色体基因座中编码的遗传信息导致的遗传修饰。

如本文使用的，术语“敲除生物体”是生物体的细胞中有显著比例的细胞含有敲除的生物体。

如本文使用的，术语“敲入生物体”是生物体的细胞中有显著比例的细胞含有敲入的生物体。

如本文使用的，术语多肽的“功能衍生物”是与所述多肽具有相同的定性生物学特性的化合物。“功能衍生物”包括但不限于多肽片段和多肽及其片段的衍生物，条件是它们与对应多肽具有相同的生物活性。术语“衍生物”涵盖多肽的氨基酸序列变体、其共价修饰及融合物。“融合”多肽是包含与另一种异源多肽融合或键合的多肽或其部分(例如，一个或更多个结构域)的多肽。

如本文使用的，术语“变体”应被理解为意指表现出具有不同于自然界中出现的模式的性质。

术语“非天然存在的”或“工程化的”可互换使用，并表示人手的参与。当述及核酸分子或多肽时，该术语意指，该核酸分子或多肽至少基本上不含它们在自然界中并如在自然界中发现的与之天然相关的至少一种其他组分。

如本文使用的，术语“核酸酶缺陷”是指包含降低的核酸酶活性、最小化和/或消除的核酸酶活性、改变的核酸酶活性(例如，切口酶)、检测不到的核酸酶活性和/或不具有核酸酶活性的蛋白，例如，由于降低、最小化、改变和/或消除蛋白的核酸酶活性的氨基酸取代。在一些实施方案中，核酸酶缺陷蛋白被描述为“死亡(dead)”蛋白，并且可以被指定为附加到蛋白名称的“d”(例如，dCas9)。

本文使用的术语“寡核苷酸”定义为包含两个或多个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，优选地至少5个核苷酸，更优选地至少约10个至15个核苷酸，并且更优选地至少约15个至50个核苷酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或50个或更多个核苷酸)的分子。确切的大小将取决于许多因素，这些因素继而取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以以包括化学合成、DNA复制、逆转录、PCR或其组合的任何方式产生。

因为单核苷酸以这样的方式进行反应产生寡核苷酸，所述方式使得一个单核苷酸戊糖环的5'磷酸经由磷酸二酯键在一个方向上附接至其相邻单核苷酸戊糖环的3'氧，所以如果寡核苷酸的5'磷酸未附接连至单核苷酸戊糖环的3'氧，则寡核苷酸的该末端被称为“5'末端”，且如果寡核苷酸的3'氧未附接至随后的单核苷酸戊糖环的5'磷酸，则寡核苷酸的该末端被称为“3'末端”。如本文使用的，核酸序列即使在较大的寡核苷酸的内部，也可被称为具有5'末端和3'末端。当沿着核酸链在5'至3'方向移动时，如果第一区域的3'末端在第二区域的5'末端之前，则沿着核酸链的第一区域被称为另一区域的上游。

当两个不同的、不重叠的寡核苷酸与同一线性互补核酸序列的不同区域退火，且一个寡核苷酸的3'末端指向另一个寡核苷酸的5'末端时，前者可称为“上游”寡核苷酸，并且后者可称为“下游”寡核苷酸。类似地，当两个重叠的寡核苷酸与同一线性互补核酸序列杂交，第一寡核苷酸定位成使得其5'末端在第二寡核苷酸的5'末端的上游，并且第一寡核苷酸的3'末端在第二寡核苷酸的3'末端的上游时，第一寡核苷酸可以称为“上游”寡核苷酸，并且第二寡核苷酸可以称为“下游”寡核苷酸。

术语“肽”和“多肽”以及“蛋白”在本文中可互换地使用，并且指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可包括编码和非编码的氨基酸、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸以及具有修饰的肽主链的多肽。

如本文使用的，术语“核糖核蛋白”，缩写为“RNP”，是指包含多肽(例如，CRISPR蛋白或具有CRISPR活性或类似于CRISPR蛋白的活性的蛋白(例如，Cas9、Cpf1或其他Cas9样蛋白、Cas9同源物、Cas13和/或任何前述物的任何修饰形式))和核糖核酸(例如，gRNA(例如，sgRNA、dgRNA))的多分子复合物。在一些实施方案中，多肽和核糖核酸通过非共价相互作用结合。

术语“保守氨基酸取代”是指具有相似侧链的氨基酸残基在蛋白中的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸由甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸由丝氨酸和苏氨酸组成；一组具有含酰胺侧链的氨基酸由天冬酰胺和谷氨酰胺组成；一组具有芳族侧链的氨基酸由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸组成；一组具有碱性侧链的氨基酸由赖氨酸、精氨酸和组氨酸组成；一组具有酸性侧链的氨基酸由谷氨酸和天冬氨酸组成；并且一组具有含硫侧链的氨基酸由半胱氨酸和甲硫氨酸组成。示例性的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸/异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。

如本文使用的，术语“重组”意指，特定核酸(DNA或RNA)是克隆、限制、聚合酶链式反应(PCR)和/或连接步骤的各种组合的产物，产生具有与天然系统中存在的内源核酸不同的结构编码或非编码序列的构建体。编码多肽的DNA序列可以由cDNA片段或一系列合成寡核苷酸组装而成，以提供能够由细胞或无细胞转录和翻译系统中包含的重组转录单位表达的合成核酸。包含相关序列的基因组DNA也可用于重组基因或转录单位的形成。非翻译的DNA序列可以存在于开放阅读框的5'或3'，其中这些序列不干扰编码区的操作或表达，并且确实可以通过各种机制起作用以调控期望产物的产生。可选地，编码非翻译的RNA(例如，DNA靶向RNA)的DNA序列也可以被认为是重组的。因此，例如，术语“重组”核酸是指非天然存在的核酸，例如，通过人工干预将两个本来分开的序列区段人工组合而制成。这种人工组合通常通过化学合成手段或通过人工操纵分离的核酸区段(例如，通过遗传工程技术)来实现。通常这样做，以用编码相同氨基酸、保守氨基酸或非保守氨基酸的密码子替换密码子。可选地，进行其以将期望功能的核酸区段连接在一起以产生期望的功能组合。这种人工组合通常通过化学合成手段或通过人工操纵分离的核酸区段(例如，通过遗传工程技术)来实现。当重组多核苷酸编码多肽时，编码多肽的序列可以是天然存在的(“野生型”)或可以是天然存在的序列的变体(例如，突变体)。因此，术语“重组”多肽不一定指其序列不是天然存在的多肽。而是，“重组”多肽由重组DNA序列编码，但是多肽的序列可以是天然存在的(“野生型”)或非天然存在的(例如，变体、突变体等)。因此，“重组”多肽是人类干预的结果，但可以是天然存在的氨基酸序列。

“载体”或“表达载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体(BAC)或黏粒，其上可以附接另一个DNA区段，例如“插入序列”，以使附接的区段在细胞中复制。

当外源DNA例如重组表达载体已经被引入细胞内时(例如，根据本文提供的技术)，细胞已经被外源DNA“遗传修饰”或“转化”或“转染”。在一些实施方案中，外源DNA的存在导致长期或瞬时的遗传变化。转化DNA可以整合(共价连接)到细胞的基因组中，或可以不整合。例如，在原核生物、酵母和哺乳动物细胞中，转化DNA可以保持在附加体元件诸如质粒上。就真核细胞而言，稳定转化的细胞是这样的细胞，其中转化DNA已经变成整合到染色体中，使得它通过染色体复制被子细胞遗传。这种稳定性通过真核细胞建立包含含有转化DNA的子细胞群体的细胞系或克隆的能力展示。“克隆”是通过有丝分裂从单个细胞或共同祖先衍生的细胞群体。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。

合适的遗传修饰方法(也称为“转化”)包括例如，病毒或噬菌体感染、转染、接合、原生质体融合、脂质体转染、电穿孔、磷酸钙沉淀法、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术(particle gun technology)、磷酸钙沉淀法、直接微注射和/或纳米颗粒介导的核酸递送(例如，根据本文描述的可生物降解聚合物纳米颗粒技术；另参见，例如，Panyam和Labhasetwar(2012),Advanced Drug DeliveryReviews,64(补充):61-71，通过引入并入本文)。遗传修饰方法的选择通常取决于被转化细胞的类型和转化发生的环境(例如，体外、离体或体内)。对这些方法的一般性讨论可见于Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第三版,Wiley&Sons,1995，通过引用并入本文。

如本文使用的“靶核酸”(例如，“靶DNA”或“靶RNA”)是包含“靶位点”或“靶基因座”、“靶序列”和/或“靶片段”的多核苷酸(核酸(例如，DNA或RNA)、基因、染色体、基因组等)。术语“靶位点”、“靶序列”和“靶基因座”在本文中可互换地使用，以指存在于靶DNA或靶RNA中的核酸序列，只要存在足够的结合条件，核酸靶向RNA的核酸靶向区段将与之结合。合适的DNA/RNA或RNA/RNA结合条件包括细胞中通常存在的生理条件。其他合适的DNA/RNA或RNA/RNA结合条件(例如，在无细胞系统中的条件)是本领域已知的；参见，例如，本文引用的Sambrook，并通过引用并入。靶DNA或RNA与核酸靶向RNA互补和杂交的链被称为“互补链”，并且靶核酸与“互补链”互补(并且因此与核酸靶向RNA不互补)的链被称为“非互补的链”或“非互补链”。

如本文使用的，术语“靶位点”、“靶序列”和“靶基因座”是指核酸分子内被核酸切割实体(例如，RNP(例如，包含CRISPR蛋白(例如，Cas9或修饰的Cas9或其他Cas9样CRISPR蛋白和/或其修饰形式)的CRISPR复合物或CRISPR系统))识别(例如，与gRNA互补)和裂解的位点。

如本文使用的，术语“靶片段”或“靶核酸片段”是在靶核酸中侧翼为两个“靶位点”或“靶基因座”或“靶序列”的核酸。在一些实施方案中，靶片段通过在靶核酸的两个靶位点处产生双链断裂从而从靶核酸切除并释放靶片段来产生。

RNP中与多肽结合并将多肽靶向至靶核酸内特定位置的RNA分子在本文中称为“核酸靶向RNA”或“核酸靶向RNA多核苷酸”(在本文中也称为“引导RNA”或“gRNA”)。核酸靶向RNA包含两个区段，“核酸靶向区段”和“蛋白结合区段”。在一些实施方案中，gRNA包含两个RNA(例如，dgRNA，例如crRNA和tracrRNA)，并且在一些实施方案中，gRNA包含一个RNA(例如，sgRNA)。

“区段”意指分子的区段或片段或部分或区域，例如，RNA、DNA中核苷酸的连续区段或蛋白的连续区段。区段也可以指复合物的区段或片段或部分或区域，使得区段可以包含多于一个分子的区域。例如，在一些实施方案中，核酸靶向RNA的蛋白结合区段(如下所述)是一个RNA分子，并且因此蛋白结合区段包含该RNA分子的一个区域。在其他情况下，核酸靶向RNA的蛋白结合区段(如下所述)包含沿着互补区域杂交的两个单独分子。作为说明性的非限制性实例，包含两个单独分子的核酸靶向RNA的蛋白结合区段可以包含(i)长度为100个碱基对的第一RNA分子的碱基对40-75；和(ii)长度为50个碱基对的第二RNA分子的碱基对10-25。“区段”的定义，除非在特定上下文中另外特别定义，否则不限于特定数量的总碱基对，不限于来自给定RNA分子的任何特定数量的碱基对，不限于复合物中特定数量的单独分子，并且可以包括具有任何总长度的RNA分子区域，并且可以包括或可以不包括与其他分子互补的区域。

核酸靶向区段(或“核酸靶向序列”)包含与靶核酸(靶核酸的互补链)内的特定序列互补的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸靶向区段是包含与靶DNA(靶DNA的互补链)内的特定序列互补的核苷酸序列的DNA靶向区段。在一些实施方案中，核酸靶向区段是包含与靶RNA(靶RNA的互补链)内的特定序列互补的核苷酸序列的RNA靶向区段。蛋白结合区段(或“蛋白结合序列”)与RNP的多肽相互作用。核酸靶向RNA的蛋白结合区段包含两个互补的核苷酸区段，它们彼此杂交形成双链RNA双链体(dsRNA双链体)。

核酸靶向RNA和多肽形成RNP复合物(例如，通过非共价相互作用结合)。核酸靶向RNA通过包含与靶核酸序列互补的核苷酸序列来为RNP复合物提供靶特异性。RNP复合物的多肽提供位点特异性结合，并且在一些实施方案中，提供核酸酶活性(例如，用于在靶核酸中产生双链断裂和/或用于在靶核酸中产生单链断裂(“切口”))。换句话说，RNP的多肽借助于其与核酸靶向RNA的蛋白结合区段的缔合而被引导至靶核酸中的靶核苷酸序列(例如，染色体核酸中的靶序列、染色体外核酸(例如，附加体核酸、微环等)中的靶序列、线粒体核酸中的靶序列、叶绿体核酸中的靶序列、质粒中的靶序列、转录物中的靶序列、功能RNA中的靶序列、RNA基因组中的靶序列等)。

在一些实施方案中，核酸靶向RNA包含两个单独的RNA分子(例如，两个RNA多核苷酸，例如，“活化物RNA”和“标靶人RNA”)，并且在本文中被称为“双分子核酸靶向RNA”或“两分子核酸靶向RNA”或“双引导RNA”或“dgRNA”。在其他实施方案中，核酸靶向RNA是单个RNA分子(例如，单个RNA多核苷酸)，并且在本文中被称为“单分子核酸靶向RNA”、“单引导RNA”或“sgRNA”。术语“核酸靶向核糖核酸”或“引导RNA”或“gRNA”包括性地指双分子核酸靶向RNA(dgRNA)和单分子核酸靶向RNA(sgRNA)两者。

示例性的两分子核酸靶向RNA包括crRNA样(“CRISPR RNA”或“标靶人RNA”或“crRNA”或“crRNA重复序列”)分子和对应的tracrRNA样(“反式作用CRISPR RNA”或“活化物RNA”或“tracrRNA”)分子。crRNA样分子(标靶人RNA)包含核酸靶向RNA的核酸靶向区段(单链)和形成核酸靶向RNA的蛋白结合区段的dsRNA双链体的一半的区域(“双链体形成区段”)两者。对应的tracrRNA样分子(活化物RNA)包含形成核酸靶向RNA的蛋白结合区段的dsRNA双链体的另一半的区域(双链体形成区段)。换句话说，crRNA样分子的一部分与tracrRNA样分子的一部分互补并杂交，以形成核酸靶向RNA的蛋白结合结构域的dsRNA双链体。如此，每个crRNA样分子可称为具有对应的tracrRNA样分子。crRNA样分子还提供单链DNA靶向区段。

因此，crRNA样分子(例如，crRNA)和tracrRNA样分子(例如个tracrRNA)杂交(作为对应的对)以形成核酸靶向RNA。给定的crRNA或tracrRNA分子的确切序列是其中存在这些RNA分子的物种的特征。各种crRNA和tracrRNA是本领域已知的。双分子核酸靶向RNA(dgRNA)可以包含任何对应的crRNA和tracrRNA对。单分子核酸靶向RNA(sgRNA)可以包含任何对应的crRNA和tracrRNA对。

术语“活化物RNA”在本文中用于指双分子核酸靶向RNA的tracrRNA样分子(例如，tracrRNA)。术语“标靶人RNA”在本文中用于指双分子核酸靶向RNA的crRNA样分子(例如，crRNA)。术语“双链体形成区段”在本文中用于指通过与对应的活化物RNA或标靶人RNA分子的区段杂交而有助于形成dsRNA双链体的活化物RNA或标靶人RNA的区段。换句话说，活化物RNA包含与对应标靶人RNA的双链体形成区段互补的双链体形成区段。如此，活化物RNA包含双链体形成区段，而标靶人RNA包含DNA靶向RNA的双链体形成区段和核酸靶向区段两者。因此，双分子核酸靶向RNA可以包含任何对应的活化物RNA和标靶人RNA对。

本说明书和权利要求书中的术语“样品”以其最广泛的含义使用。一方面，它意味着包括样本或培养物(例如，微生物培养物)。另一方面，它意味着包括生物样品和环境样品两者。样品可以包括合成来源的样本。在一些实施方案中，样品包含核酸(例如，DNA和/或RNA)和任选地缓冲剂、盐、防腐剂、稳定剂、染料等。

如本文使用的，“生物样品”是指生物组织或流体或其级分或组分的样品(例如，分子(例如，蛋白、氨基酸、核酸、核苷酸、脂质、代谢物、糖、辅因子等)、细胞器、膜等)。例如，生物样品可以是从动物(包括人类)获得的样品；流体、固体或组织样品；以及液体和固体食物和饲料产品和材料，诸如乳制品、蔬菜、肉和肉副产品以及废物。生物样品可以从所有各种科的家养动物以及野化或野生的动物获得，包括但不限于诸如有蹄类动物、熊、鱼、兔类动物、啮齿动物等。生物样品的实例包括组织切片、血液、血液级分、血浆、血清、尿或来自其他外周来源或细胞培养物、细胞集落、单细胞或单细胞集合的样品。此外，生物样品包括上文提及的样品的汇集或混合物。生物样品可以通过从受试者取出细胞样品来提供，但是也可以通过使用先前分离的样品来提供。例如，可以通过常规活检技术从怀疑患有疾病的受试者取出组织样品。在一些实施方案中，血液样品取自受试者。来自患者的生物样品意指来自怀疑受疾病影响的受试者的样品。

环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、水和工业样品，以及从食品和乳制品加工仪器、设备、装备、器皿、一次性和非一次性物品获得的样品。这些实例不应被解释为限制可适用于本发明的样品类型。

如本文使用的，“部分”是指某物可以分成的两个或更多个部分之一，诸如例如寡核苷酸、分子、化学基团、结构域、探针等的各个部分。

如本文使用的，词语“存在(presence)”或“不存在(absence)”(或者，可选地，“存在(present)”或“不存在(absent)”)以相对意义用于描述特定实体(例如，核酸)的量或水平。例如，当一种核酸被称为“存在”于测试样品中时，这意味着该核酸的水平或量高于预定阈值；相反，当一种核酸被称为在测试样品中“不存在”时，这意味着该核酸的水平或量低于预定阈值。预定阈值可以是与用于检测核酸的特定测试相关的可检测性的阈值或任何其他阈值。当在样品中“检测到”核酸时，核酸“存在于”样品中；当核酸“未被检测到”时，核酸“不存在于”样品中。此外，在其中“检测到”核酸或在其中“存在”核酸的样品是核酸“阳性”样品。在其中“未检测到”核酸或在其中“不存在”核酸的样品是核酸“阴性”样品。

如本文使用的，“增加”或“降低”是指变量的值相对于该变量的先前测量值、相对于预先建立的值和/或相对于标准对照值的可检测到的(例如，测量的)正或负变化。增加是相对于变量的先前测量值、预先建立的值和/或标准对照值，优选地至少10％、更优选地50％、还更优选地2倍、甚至更优选地至少5倍、并且最优选地至少10倍的正变化。类似地，降低是变量的先前测量值、预先建立的值和/或标准对照值优选地至少10％、更优选地50％、还更优选地至少80％、并且最优选地至少90％的负变化。指示数量变化或差异的其他术语，诸如“更多”或“更少”，在本文中以与上述相同的方式使用。

“系统”表示真实的或抽象的一组组成部分，包括整体，其中每个组成部分与整体中的至少一个其他组成部分相互作用或相关。

如本文使用的，术语“单体”是指能够进行聚合从而为大分子或聚合物的基本结构贡献结构单元的分子。

“聚合物”是高相对分子质量的分子，其结构主要包含源自低相对分子质量的分子(即单体)的单元的多于一个重复。

如本文使用的，“低聚物”包括若干单体单元，例如，与潜在可以包含不受限数量的单体的聚合物形成对比。二聚体、三聚体和四聚体是低聚物的非限制性实例。

此外，如本文使用的，术语“纳米颗粒”是指这样的颗粒，所述颗粒具有在约1nm至约1000nm的范围内的至少一个尺寸，包括在1nm和1000nm之间的任何整数值(包括约1nm、2nm、5nm、10nm、20nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、200nm、500nm和1000nm以及在中间的所有整数和整数之间的分数)。在一些实施方案中，纳米颗粒具有至少一个尺寸，例如，约100nm的直径。在一些实施方案中，纳米颗粒具有约200nm的直径。在其他实施方案中，纳米颗粒具有约500nm的直径。在又其他的实施方案中，纳米颗粒具有约1000nm(1μm)的直径。在这样的实施方案中，颗粒也可称为“微米颗粒”。因此，术语“微米颗粒”包括具有在约1微米(μm)，即1×10

本领域普通技术人员将理解，适用于本发明公开的方法的纳米颗粒可以存在于各种形状，包括但不限于，球状、棒状、盘状、锥体、立方体、圆柱体、纳米螺旋体(nanohelixes)、纳米弹簧、纳米环、棒形纳米颗粒、箭形纳米颗粒、泪滴形纳米颗粒、四足形纳米颗粒、棱柱形纳米颗粒，以及多于一种其他几何形状和非几何形状。在特定实施方案中，本公开内容的纳米颗粒具有球形。

“缔合”：当两个实体如本文描述彼此“缔合”时，它们通过直接或间接共价或非共价相互作用连接。优选地，缔合是共价的。期望的非共价相互作用包括氢键、范德华相互作用、疏水相互作用、磁相互作用、静电相互作用等。

“生物相容的”：如本文使用的术语“生物相容的”意图描述对细胞无毒性的化合物。如果化合物在体外添加至细胞导致小于或等于20％的细胞死亡，且化合物在体内的施用不引起炎症或其他这样的副作用，则化合物是“生物相容的”。

“可生物降解”：如本文使用的，“可生物降解”化合物是如下那些：当化合物被引入细胞中时，通过细胞机制或通过水解被分解(break down)成细胞可重利用或处理而对细胞没有显著毒性作用的组分(即，当在体外将该组分添加至细胞时，少于约20％的细胞被杀死)。组分优选地不引起体内炎症或其他副作用。在某些优选的实施方案中，被依赖以分解可生物降解化合物的化学反应未被催化。

“肽”或“蛋白”：“肽”或“蛋白”包含一串由肽键连接在一起的至少三个氨基酸。术语“蛋白”和“肽”可互换使用。肽可以指单独的肽或肽的集合。本发明的肽优选地仅含有天然氨基酸，尽管可选地可以使用本领域已知的非天然氨基酸(即，自然界中不存在但可以掺入多肽链中的化合物)和/或氨基酸类似物。此外，本发明的肽中的一个或更多个氨基酸可通过以下来修饰：例如，通过添加化学实体诸如碳水化合物基团，磷酸基团，法呢基基团(farnesyl group)，异法呢基基团(isofarnesyl group)，脂肪酸基团，用于缀合、官能化或其他修饰的接头等。在优选的实施方案中，肽的修饰导致更稳定的肽(例如，更大的体内半衰期)。这些修饰可以包括肽的环化、D-氨基酸的掺入等。任何修饰都不应大幅干扰肽的期望的生物活性。

“多核苷酸”或“寡核苷酸”：多核苷酸或寡核苷酸是指核苷酸的聚合物。通常，多核苷酸包含至少三个核苷酸。聚合物可以包括天然核苷(即，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤和2-硫代胞苷)、化学修饰的碱基、生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)、嵌入的碱基(intercalated base)、修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)或修饰的磷酸基团(例如，硫代磷酸酯键和5'-N-亚磷酰胺键)。

“小分子”：如本文使用的，术语“小分子”是指具有相对低的分子量并且不是蛋白、多肽或核酸的有机化合物，无论是天然存在的还是人工产生的(例如，通过化学合成)。通常，小分子具有小于约1500g/mol的分子量。此外，小分子通常具有多于一个碳碳键。已知的天然存在的小分子包括但不限于青霉素、红霉素、紫杉醇、环孢菌素和雷帕霉素。已知的合成小分子包括但不限于氨苄青霉素、甲氧西林、磺胺甲噁唑和磺胺类。

尽管认为本领域普通技术人员很好地理解以下涉及式(I)的化合物的术语，但阐述以下定义以有助解释本公开内容的主题。这些定义意图补充和说明而非排除在回顾本公开内容后对本领域普通技术人员将明显的定义。

如本文使用的，术语被取代的，不论前面有术语“任选地”或没有，以及取代基，是指将分子上的一种官能团改变为另一种官能团的能力，如本领域技术人员所理解的，条件是所有原子的化合价被保持。当在任何给定的结构中多于一个位置可以被多于一个选自指定基团的取代基取代时，所述取代基可以在每个位置处是相同的或不同的。取代基还可以被进一步取代(例如，芳基基团取代基本身可以具有另一个取代基，诸如另一个芳基基团，所述另一个芳基基团在一个或更多个位置处被进一步取代)。

在取代基团或连接基团通过它们从左至右书写的常规化学式被指定的情况下，它们同样涵盖将由从右至左书写结构得到的化学上相同的取代基，例如-CH

当使用术语“独立地选自”时，所述及的取代基(例如，R基团，诸如基团R

当涉及本文的取代基的基团使用时，术语“一(a)”、“一(an)”或“一(a(n))”意指至少一个。例如，在化合物被“一(an)”烃基或芳基取代的情况下，化合物任选地被至少一个烃基和/或至少一个芳基取代。此外，在部分被R取代基取代的情况下，基团可以被称为“R-取代的”。在部分是R-取代的情况下，该部分被至少一个R取代基取代并且每个R取代基任选地是不同的。

被命名的“R”或基团通常将具有本领域公认为对应于具有该名称的基团的结构，除非本文另外指明。为了说明的目的，如上文阐述的某些代表性的“R”基团在下文定义。

本公开内容的化合物的描述受本领域技术人员已知的化学键合的原则限制。因此，在基团可以被许多取代基中的一个或更多个取代的情况下，这些取代被选择以遵守化学键合的原则并且提供这样的化合物，该化合物不是固有地不稳定的和/或对于本领域普通技术人员将被认为可能在环境条件下(诸如含水的、中性的和若干已知的生理条件)是不稳定的。例如，杂环烃基或杂芳基经由环杂原子、依照本领域技术人员已知的化学键合的原则被附接至分子的剩余部分，从而避免固有地不稳定的化合物。

除非另外明确定义，否则如本文使用的“取代基团”包括本文定义的选自以下部分中的一种或更多种的官能团：

如本文使用的，术语烃是指包含氢和碳的任何化学基团。烃可以是被取代的或未被取代的。如将对本领域技术人员已知的，在进行任何取代时，所有化合价必须被满足。烃可以是不饱和、饱和、支链、非支链、环状、多环或杂环的。例示性的烃在下文另外定义并且包括，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、环丙基、烯丙基、乙烯基、正丁基、叔丁基、乙炔基、环己基等。

除非另外说明，否则单独的或作为另一取代基的部分的术语“烃基”意指直链(即，非支链)或支链的、无环或环状的烃基团或其组合，烃基可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，并且可以包括二价和多价基团，具有指定的碳原子数(即，C

代表性的饱和烃基团包括但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、仲戊基、异戊基、新戊基、正己基、仲己基、正庚基、正辛基、正癸基、正十一烷基、十二烷基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基及其同系物和异构体。

“支链”是指其中低级烃基诸如甲基、乙基或丙基被附接至直链烃基链的烃基基团。“低级烃基”是指具有1个至约8个碳原子例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个碳原子的烃基基团(即，C

烃基基团可以任选地被一个或更多个烃基基团取代基取代(“被取代的烃基”)，所述一个或更多个烃基基团取代基可以是相同的或不同的。术语“烃基基团取代基”包括但不限于烃基、被取代的烃基、卤素、芳基氨基、酰基、羟基、芳基氧基、烃氧基、烃基硫代、芳基硫代、芳基烃基氧基、芳基烃基硫代、羧基、烃氧基羰基、氧代、以及环烃基。沿着烃基链可以存在任选地插入的一个或更多个氧、硫或被取代的或未被取代的氮原子，其中氮取代基是氢、低级烃基(本文中也称为“烃基氨基烃基”)或芳基。

因此，如本文使用的，术语“被取代的烃基”包括如本文定义的烃基基团，其中烃基基团中的一个或更多个原子或官能团被另外的原子或官能团替换，所述另外的原子或官能团包括例如烃基、被取代的烃基、卤素、芳基、被取代的芳基、烃氧基、羟基、硝基、氨基、烃基氨基、二烃基氨基、硫酸酯、氰基以及巯基。

除非另外说明，否则单独的或与另一术语组合的术语“杂烃基”意指具有1个至20个碳原子或杂原子的稳定的直链或支链的烃基团、或具有3个至10个碳原子或杂原子的环烃基团或其组合，杂烃基由至少一个碳原子和至少一个选自由O、N、P、Si和S组成的组的杂原子组成，并且其中氮、磷和硫原子可以任选地被氧化且氮杂原子可以任选地被季铵化。杂原子O、N、P和S和Si可以被放置在杂烃基基团的任何内部位置处或被放置在其中烃基基团被附接至分子的剩余部分处的位置。实例包括但不限于-CH

如上所述，杂烃基基团，如本文使用的，包括经通过杂原子被附接至分子的剩余部分的那些基团，诸如-C(O)NR’、-NR’R”、-OR’、-SR、-S(O)R和/或-S(O

“环状”和“环烃基”是指具有约3个至约10个碳原子(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个碳原子)的非芳族的单环或多环环体系。环烃基基团可以任选地是部分不饱和的。环烃基基团还可以任选地被如本文定义的烃基基团取代基、氧代和/或亚烃基取代。沿着环烃基链可以存在任选地被插入的一个或更多个氧、硫或被取代的或未被取代的氮原子，其中氮取代基是氢、未取代的烃基、被取代的烃基、芳基或取代的芳基，因此提供杂环基团。代表性的单环环烃基环包括环戊基、环己基和环庚基。多环环烃基环包括金刚烷基、八氢萘基、萘烷、樟脑、莰烷和降金刚烷基(noradamantyl)以及稠环体系诸如二氢化萘和四氢化萘等。

如本文使用的，术语“环烃基烃基”，是指通过如上文定义的亚烃基部分例如C

术语“环杂烃基”或“杂环烃基”是指包含一个或更多个杂原子的非芳族的环体系、不饱和的或部分不饱和的环体系，诸如3元至10元的被取代的或未被取代的环烃基环体系，并且任选地可以包含一个或更多个双键，所述一个或更多个杂原子可以是相同的或不同的并且选自由氮(N)、氧(O)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)组成的组。

环杂烃基环可以任选地被稠合至或以其他方式被附接至其他环杂烃基环和/或非芳族的烃环。杂环包括具有一个至三个独立地选自氧、硫和氮的杂原子的那些杂环，其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化并且氮杂原子可以任选地被季铵化。在某些实施方案中，术语杂环是指非芳族的5元、6元或7元的环或多环基团，其中至少一个环原子是选自O、S和N的杂原子(其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化)，包括但不限于，双环或三环基团，包括具有一个和三个之间的独立地选自氧、硫和氮的杂原子的稠合的六元环，其中(i)每个5元环具有0至2个双键，每个6元环具有0至2个双键，并且每个7元环具有0至3个双键，(ii)氮和硫杂原子可以任选地被氧化，(iii)氮杂原子可以任选地被季铵化，并且(iv)任何上文的杂环都可以被稠合至芳基环或杂芳环。代表性的环杂烃基环体系包括，但不限于吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌啶基、哌嗪基、二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、硫代吗啉基、噻二嗪基(thiadiazinanyl)、四氢呋喃基等。

除非另外说明，否则单独的或与其他术语组合的术语“环烃基”和“杂环烃基”分别代表“烃基”和“杂烃基”的环状形式。此外，对于杂环烃基，杂原子可以占据杂环被附接至分子的剩余部分的位置。环烃基的实例包括但不限于环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烃基的实例包括但不限于，1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。术语“亚环烃基”和“亚杂环烃基”分别指环烃基和杂环烃基的二价衍生物。

不饱和的烃基具有一个或更多个双键或三键。不饱和的烃基基团的实例包括但不限于，乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高级的同系物和异构体。被限制于烃基团的烃基基团被称为“同烃基(homoalkyl)”。

更特别地，如本文使用的术语“烯基”是指由具有至少一个碳-碳双键的C

如本文使用的术语“环烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的环烃。环烯基基团的实例包括环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯、环己烯基、1,3-环己二烯、环庚烯基、环庚三烯基和环辛烯基。

如本文使用的术语“炔基”是指由包含至少一个碳-碳三键的、具有设计的数目的碳原子的、直链或支链的C

单独的或另一取代基的一部分的术语“亚烃基”是指由具有1个至约20个碳原子(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个碳原子)的烃基基团衍生的直链或支链的二价脂肪族烃基团。亚烃基基团可以是直链、支链或环状的。亚烃基基团还可以任选地是不饱和的和/或被一个或更多个“烃基基团取代基”取代的。沿着亚烃基基团可以存在任选地被插入的一个或更多个氧、硫或被取代的或未被取代的氮原子(在本文中也称为“烃基氨基烃基”)，其中氮取代基是如先前描述的烃基。示例性的亚烃基基团包括亚甲基(-CH

单独的或作为另一取代基的一部分的术语“亚杂烃基”是指由杂烃基衍生的二价基团，例如但不限于，-CH

除非另外说明，否则术语“芳基”意指，可以是单环或被稠合在一起或共价地连接的多环(诸如1个至3个环)的芳族烃取代基。术语“杂芳基”是指包含1个至4个选自N、O和S的杂原子(在多环的情况下在每个单独的环中)的芳基基团(或芳环)，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且氮原子任选地被季铵化。杂芳基基团可以通过碳或杂原子被附接至分子的剩余部分。芳基和杂芳基基团的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。用于上述芳基和杂芳基环体系中的每一个的取代基选自下文描述的可接受的取代基的组。术语“亚芳基”和“亚杂芳基”分别指芳基和杂芳基的二价形式。

为简洁起见，术语“芳基”在与其他术语(例如，芳基氧基、芳基硫代氧基、芳基烃基)组合使用时包括如上文定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语“芳基烃基”和“杂芳基烃基”意图包括其中芳基或杂芳基基团被附接至烃基基团的那些基团(例如，苄基、苯乙基、吡啶基甲基、呋喃基甲基等)，所述烃基包括其中(例如，亚甲基基团)碳原子已经被例如氧原子替换的那些烃基基团(例如，苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。然而，如本文使用的术语“卤代芳基”意图仅包括被一个或更多个卤素取代的芳基。

在杂烃基、杂环烃基或杂芳基包括特定数目的成员(例如“3元至7元”)的情况下，术语“成员”是指碳或杂原子。

此外，如本文使用的，通常由以下式代表的结构：

是指包含取代基R基团的环结构，例如，但不限于3-碳、4-碳、5-碳、6-碳、7-碳等、脂族和/或芳族环状化合物，包括饱和的环结构、部分饱和的环结构和不饱和的环结构，其中R基团可以存在或不存在，并且当存在时，一个或更多个R基团可以各自在环结构的一个或更多个可用的碳原子上被取代。R基团的存在或不存在以及R基团的数目通过变量“n”的值被确定，所述变量“n”的值是通常具有在从0至环上可用于取代的碳原子的数目的范围内的值。每个R基团，如果多于一个，则在环结构的可用的碳上而不是在另一个R基团上被取代。例如，其中n是0至2的以上结构将包括化合物组，所述化合物组包括但不限于：

代表环状的环结构中的键的虚线指示该键在环中可以存在或不存在。也就是说，代表环状的环结构中的键的虚线指示环结构选自由饱和的环结构、部分饱和的环结构和不饱和的环结构组成的组。

符号

当芳族环或杂环芳族环的被命名的原子被定义为“不存在的”时，该被命名的原子被直连键替换。

以上术语中的每一个(例如，“烃基”、“杂烃基”、“环烃基”和“杂环烃基”、“芳基”、“杂芳基”、“膦酸酯”和“磺酸酯”以及它们的二价衍生物)意图包括所指示的基团的被取代的和未被取代的形式两者。下文提供用于每种类型的基团的任选的取代基。

用于烃基、杂烃基、环烃基、杂环烃基单价和二价衍生基团(包括那些通常称为亚烃基、烯基、亚杂烃基、杂烯基、炔基、环烃基、杂环烃基、环烯基和杂环烯基的基团)的取代基可以是选自但不限于以下的各种基团中的一种或更多种：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-卤素、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO

类似于以上描述的用于烃基基团的取代基，用于芳基和杂芳基基团(以及其二价衍生物)的示例性取代基是不同的，并且选自例如：卤素、-OR’、-NR’R”、-SR’、-SiR’R”R’”、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO

在芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地形成式-T-C(O)-(CRR’)

如此形成的新的环的单键中的一个可以任选地被双键替换。可选择地，在芳基环或杂芳基环的相邻原子上的两个取代基可以任选地被式-(CRR’)

如本文使用的，术语“酰基”是指其中羧基的-OH已经被另一个取代基替换的并且具有通式RC(＝O)-的有机酸基团，其中R是如本文定义的烷基、烯基、炔基、芳基、碳环、杂环、或芳族杂环基团。如此，术语“酰基”特别地包括芳基酰基基团，诸如2-(呋喃-2-基)乙酰基)-和2-苯基乙酰基基团。酰基基团的特定实例包括乙酰基和苯甲酰基。酰基基团还意图包括酰胺、-RC(＝O)NR’，酯、-RC(＝O)OR’，酮、-RC(＝O)R’和醛、-RC(＝O)H。

术语“烃氧基(alkoxyl)”或“烃氧基(alkoxy)”在本文中可互换地使用，并且指通过氧原子附接至母体分子部分的饱和的(即，烷基-O-)或不饱和的(即，烯基-O-和炔基-O-)基团，其中术语“烷基”、“烯基”和“炔基”是如先前描述的并且可以包括C

如本文使用的术语“烃氧基烃基”是指烃基-O-烃基醚，例如，甲氧基乙基或乙氧基甲基基团。

“芳基氧基”是指芳基-O-基团，其中芳基基团如先前所描述，包括被取代的芳基。如本文使用的术语“芳基氧基”可以指苯氧基或己氧基和烃基、被取代的烃基，卤素或烃氧基取代的苯氧基或己氧基。

“芳基烃基”是指芳基-烃基-基团，其中芳基和烃基如先前所描述，并且包括被取代的芳基和被取代的烃基。示例性的芳基烃基基团包括苄基、苯基乙基和萘基甲基。

“芳基烃基氧基”是指芳基烃基-O-基团，其中芳基烃基基团如先前所描述。示例性的芳基烃基氧基基团是苄氧基，即C

“烃氧基羰基”是指烃基-O-C(＝O)-基团。示例性的烃氧基羰基基团包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丁氧基羰基和叔丁氧基羰基。

“芳基氧基羰基”是指芳基-O-C(＝O)-基团。示例性的芳基氧基羰基基团包括苯氧基-羰基和萘氧基-羰基。

“芳基烃氧基羰基”是指芳基烃基-O-C(＝O)-基团。示例性的芳基烃氧基羰基基团是苄氧基羰基。

“氨基甲酰基”是指式-C(＝O)NH

如本文使用的，术语羰基二氧基(carbonyldioxyl)，是指式-O-C(＝O)-OR的碳酸酯基团。

“酰基氧基”是指酰基-O-基团，其中酰基如先前所描述。

术语“氨基”是指-NH

如本文使用的“氨基烃基”是指共价结合至亚烃基连接基的氨基基团。更特别地，如本文使用的术语烃基氨基、二烃基氨基和三烃基氨基分别指通过氮原子被附接至母体分子部分的一个、两个或三个如先前定义的烃基基团。术语烃基氨基是指具有结构-NHR'的基团，其中R'是如先前定义的烃基基团；而术语二烃基氨基是指具有结构-NR'R”的基团，其中R'和R”各自独立地选自由烃基基团组成的组。术语三烃基氨基是指具有结构-NR’R”R”’的基团，其中R'、R”和R”'各自独立地选自由烃基基团组成的组。此外，R'、R”和/或R”'合起来可以任选地是-(CH

氨基基团是-NR'R”，其中R'和R”典型地选自氢、被取代的或未被取代的烃基、被取代的或未被取代的杂烃基、被取代的或未被取代的环烃基、被取代的或未被取代的杂环烃基、被取代的或未被取代的芳基、或被取代的或未被取代的杂芳基。

术语烃基硫醚和硫代烃氧基是指通过硫原子被附接至母体分子部分的饱和的(即，烷基-S-)或不饱和的(即，烯基-S-和炔基-S-)基团。硫代烃氧基部分的实例包括但不限于，甲硫基、乙硫基、丙硫基、异丙基硫代、正丁基硫代等。

“酰基氨基”是指酰基-NH-基团，其中酰基如先前所描述。“芳酰基氨基”是指芳酰基-NH-基团，其中芳酰基如先前所描述。

术语“羰基”是指-C(＝O)-基团，并且可以包括由通式R-C(＝O)H表示的醛基团。

术语“羧基”是指-COOH基团。这样的基团在本文中也称为“羧酸”部分。

术语“氰基”是指-C≡N基团。

如本文使用的术语“卤代”、“卤化物”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘基团。此外，诸如“卤代烃基”的术语意图包括单卤代烃基和多卤代烃基。例如，术语“卤代(C

术语“羟基”是指-OH基团。

术语“羟基烃基”是指被-OH基团取代的烃基基团。

术语“巯基”是指-SH基团。

如本文使用的术语“氧代”意指被双键结合至碳原子或另一元素的氧原子。

术语“硝基”是指-NO

术语“硫代”是指其中碳原子或氧原子被硫原子替换的本文先前描述的化合物。

术语“硫酸酯(sulfate)”是指-SO

如本文使用的，术语硫代羟基或硫醇，是指式-SH的基团。

更特别地，术语“硫化物”是指具有式-SR的基团的化合物。

术语“砜”是指具有磺酰基基团-S(O

术语“亚砜”是指具有亚磺酰基基团-S(O)R的化合物。

术语脲基是指式-NH-CO-NH

贯穿说明书和权利要求书，给定的化学式或名称将涵盖所有互变异构体、同类物(congener)和光学与立体异构体以及外消旋混合物，其中这样的异构体和混合物存在。

本公开内容的某些化合物可具有不对称碳原子(光学或手性中心)或双键；可以依据绝对立体化学被定义为(R)-或(S)-或对于氨基酸被定义为D-或L-的对映异构体、外消旋体、非对映异构体、互变异构体、几何异构体、立体异构体形式，并且单独的异构体被包括在本公开内容的范围内。本公开内容的化合物不包括本领域中已知为太不稳定而不能合成和/或分离的化合物。本公开内容意图包括呈外消旋的、scalemic和光学纯的形式的化合物。光学活性的(R)-和(S)-异构体或D-和L-异构体可以使用手性合成子或手性试剂来制备，或使用常规技术来拆分。当本文描述的化合物包含烯键或其他几何不对称性中心时，并且除非另外指定，否则意图的是该化合物包括E几何异构体和Z几何异构体两者。

除非另外说明，否则本文描绘的结构还意图包括该结构的所有立体化学形式；即，对于每个不对称中心的R和S构型。因此，本发明的化合物的单一的立体化学异构体以及对映异构体和非对映异构体混合物在本公开内容的范围内。

对本领域技术人员将明显的是，本公开内容的某些化合物可以以互变异构体形式存在，化合物的所有这样的互变异构体形式在本公开内容的范围内。如本文使用的，术语“互变异构体”，是指平衡地存在并且容易从一种异构体形式转化为另外的形式的两种或更多种结构异构体中的一种。

除非另外说明，否则本文描绘的结构还意图包括仅在一个或更多个同位素富集的原子的存在方面不同的化合物。例如，通过氘或氚替换氢或通过

本公开内容的化合物还可以在构成这样的化合物的原子中的一个或更多个处包含非天然比例的原子同位素。例如，化合物可以用诸如例如氚(

本公开内容的化合物可以以盐存在。本公开内容包括这样的盐。适用的盐形式的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲基磺酸盐、硝酸盐、马来酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、延胡索酸盐、酒石酸盐(例如(+)-酒石酸盐、(-)-酒石酸盐或其混合物，包括外消旋混合物)、琥珀酸盐、苯甲酸盐和与氨基酸诸如谷氨酸的盐。这些盐可以根据本领域技术人员已知的方法制备。还包括碱加成盐，诸如钠盐、钾盐、钙盐、铵盐、有机氨基盐或镁盐或类似的盐。当本公开内容的化合物包含相对碱性的官能团时，可以通过使中性形式的这样的化合物与纯的或在合适的惰性溶剂中的足够量的期望的酸接触或通过离子交换来获得酸加成盐。可接受的酸加成盐的实例包括源自以下无机酸的那些：如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、一氢碳酸(monohydrogencarbonic)、磷酸、一氢磷酸(monohydrogenphosphoric)、二氢磷酸(dihydrogenphosphoric)、硫酸、一氢硫酸(monohydrogensulfuric)、氢碘酸或亚磷酸等，以及源自以下有机酸的盐：如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、延胡索酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸(p-tolylsulfonic)、柠檬酸、酒石酸、甲基磺酸等。还包括氨基酸(诸如精氨酸等)的盐和有机酸(如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等)的盐。本公开内容的某些特定化合物包含碱性官能团和酸性官能团两者，其允许化合物被转化为碱加成盐或酸加成盐。

中性形式的化合物可以通过使盐与碱或酸接触并且以常规方式分离母体化合物来再生。化合物的母体形式在某些物理特性(诸如在极性溶剂中的溶解度)上不同于各种盐形式。

本公开内容的某些化合物可以以非溶剂化的形式以及溶剂化的形式(包括水合形式)存在。通常，溶剂化的形式等效于非溶剂化的形式并且被涵盖在本公开内容的范围内。本公开内容的某些化合物可以以多晶形或无定形形式存在。通常，所有物理形式对于本公开内容所设想的用途是等效的并且被意图在本公开内容的范围内。

除了盐形式，本公开内容还提供呈前药形式的化合物。本文描述的化合物的前药是在生理学条件下容易经历化学变化以提供本公开内容的化合物的那些化合物。此外，前药可以通过化学方法或生物化学方法在离体环境中被转化为本公开内容的化合物。例如，前药当被放置于具有合适的酶或化学试剂的经皮贴剂储库(transdermal patchreservoir)中时可以被缓慢地转化为本公开内容的化合物。

术语“保护基团”是指封闭化合物的一些或全部反应性部分并且防止这样的部分参与化学反应直至保护基团被去除的化学部分，例如，在T.W.Greene,P.G.M.Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版John Wiley&Sons(1999)中列出和描述的那些部分。在使用不同的保护基团的情况下，可以有利的是，每个(不同的)保护基团可通过不同的手段去除。在完全不同的反应条件下裂解的保护基团允许差异性去除这样的保护基团。例如，保护基团可以通过酸、碱和氢解来去除。诸如三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、乙缩醛和叔丁基二甲基甲硅烷基的基团是酸不稳定的，并且可以用于在用Cbz基团(其可通过氢解移除)和Fmoc基团(其是碱不稳定的)保护的氨基基团存在的情况下保护羧基和羟基反应性部分。羧酸和羟基反应性部分可以用碱不稳定的基团(诸如，而不限于，甲基、乙基和乙酰基)封闭，在胺存在的情况下用酸不稳定的基团(诸如氨基甲酸叔丁酯)封闭，或用氨基甲酸酯(carbamates)(其对酸和碱两者稳定但可通过水解移除)封闭。

羧酸和羟基反应性部分还可以用可水解去除的保护基团(诸如苄基基团)封闭，而能够与酸氢键键合的胺基团可以用碱不稳定的基团(诸如Fmoc)封闭。羧酸反应性部分可以用可氧化去除的保护基团(诸如2,4-二甲氧基苄基)封闭，而共存的氨基基团可以用氟化物不稳定的甲硅烷基氨基甲酸酯(silyl carbamate)封闭。

烯丙基封闭基团在酸保护基团和碱保护基团存在的情况下是有用的，因为前者是稳定的并且可以随后通过金属或π酸催化剂(pi-acid catalyst)去除。例如，烯丙基封闭的羧酸可以在酸不稳定的氨基甲酸叔丁基酯或碱不稳定的乙酸酯胺保护基团存在的情况下用钯(O)-催化的反应脱保护。保护基团的又另一种形式是化合物或中间体可以被附接至的树脂。只要残基被附接至树脂，该官能团就被封闭并且不能发生反应。在从树脂释放后，官能团可用于反应。

典型的封闭/保护基团包括但不限于以下部分：

遵循长期存在的专利法公约，术语“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”当用于本申请(包括权利要求书)时是指“一个或更多个”。因此，例如，述及“受试者(a subject)”包括多于一个受试者，除非上下文与(例如，多于一个受试者)明确相反，等等。

贯穿本说明书和权利要求书，术语“包含/包括(comprise)”、“包含/包括(comprises)”和“包含/包括(comprising)”用于在非排他性含义，除非在上下文另有要求时。同样地，术语“包括/包含(include)”及其语法变体意图是非限制性的，使得列表中项目的列举不排除可被取代或添加至所列项目的其他类似的项目。

为了本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的表示量、尺寸、维度、比例、形状、配方、参数、百分比、数量、特征、及其他数值的所有数字在所有情况下都应理解为由术语“约”修饰，即使术语“约”可能未明确地与该值、量或范围一起出现。因此，除非相反地指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数不是且不需要是精确的，而是如所期望的可以是近似的和/或更大或更小，反映公差、转换因子、四舍五入、测量误差等，以及本领域技术人员已知的其他因素，取决于本公开内容的主题寻求获得的期望特性。例如，当术语“约”述及值时可以意图包括与特定的量在一些实施方案中±100％、在一些实施方案中±50％、在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％、以及在一些实施方案中±0.1％的差异，因为此类差异对于进行本公开内容的方法或采用本公开内容的组合物是适当的。

此外，当与一个或更多个数值或数值范围结合使用时，术语“约”应理解为指所有此类数值，包括范围内的所有数值以及通过将边界延伸至高于和低于所列出的数值的范围的修改。通过端点列举的数值范围包括归入该范围内的所有数值，例如全部的整数，包括其分数(例如，1至5的列举包括1、2、3、4和5，以及其分数，例如1.5、2.25、3.75、4.1等)以及在该范围内的任何范围。

实施例

以下实施例已被包括在内以提供本领域普通技术人员用于实践本公开内容的主题的代表性实施方案的指导。鉴于本公开内容和本领域技术人员的一般水平，本领域技术人员可以理解，以下实施例仅意图是示例性的，且可以采用许多变化、修改和改变而不偏离本公开内容的主题的范围。以下合成的描述和特定实施例仅意图用于说明的目的，并且不应解释为以任何方式限制通过其他方法制备本公开内容的化合物。

实施例1

1.1.概述.CRISPR/Cas9系统是强大的基因组编辑工具，可以指导位点特异性的基因破坏。Cas9内切核酸酶在由单个引导RNA(sgRNA)指定的位点引入双链断裂，并且基因破坏是通过引入引起移码突变(基因敲除)的插入/缺失或通过去除基因的大的区段(基因缺失)发生的。Cas9-sgRNA复合物识别基因组DNA中的靶位点，然后Cas9切割基因组DNA。CRISPR/Cas9系统作为基因治疗平台具有巨大潜力。然而，安全且有效的递送仍然是一项挑战。

聚(β-氨基酯)(PBAE)是一类可生物降解的阳离子聚合物，在与核酸复合后自组装成纳米颗粒。因此，在一些实施方案中，本公开内容的物质提供了PBAE纳米颗粒，用于将编码Cas9和sgRNA的质粒DNA共递送至细胞以介导基因敲除和缺失。图6描绘了PBAE-DNA纳米颗粒的形成。图6中还示出了代表性的PBAE聚合物，命名为446。

1.2方法.为了评估基因敲除的效率，使用PBAE纳米颗粒将两种分别编码Cas9蛋白和抗eGFP sgRNA的质粒递送至组成型表达一种不稳定形式的eGFP的HEK-293T细胞。eGFP的敲除通过流式细胞术进行评估，并通过

1.3结果.本公开内容的纳米颗粒系统在转染后三天实现了高水平的eGFP敲除(>70％，如通过荧光的几何平均值评估的)，并且在整个实验中(转染之后超过3周)保持了这种水平的基因沉默。感兴趣的是，CRISPR介导的敲除导致细胞群体完全为eGFP阴性。这种基因表达的二元关闭与通过递送短干扰RNA(siRNA)实现的基因表达下调形成鲜明对比，后者导致群体基础上的基因表达降低，并且仅具有瞬时效果。

现在参考图2A-图2E，在一些实施方案中，本公开内容的主题展示，PBAE纳米颗粒使得能够通过NHEJ之后的小的插入/缺失敲除基因，并且与siRNA介导的基因沉默相比产生持续的二元效应。重要的是，PBAE纳米颗粒介导的基因敲除导致长期且二元的基因沉默。

本公开内容的PBAE纳米颗粒也实现了成功的基因缺失。最佳的sgRNA序列导致600bp的DNA区段缺失，这在45％的处理细胞中开启了可检测到的ReNL表达。编辑区域的PCR扩增子证实，ReNL表达需要整个终止盒的缺失。参见图3A-图3D。此外，如图4和图5所示，在体外在新型报道系统中，靶向基因区段侧翼的两种sgRNA的共递送使得能够基因缺失并获得ReNL表达的功能。该系统允许通过ReNL的生物发光成像来鉴定有效的体外和体内CRISPR编辑。

基因敲除效率使用组成型表达不稳定形式的eGFP(参见图1A中“未编辑的”)的HEK-293T细胞进行评估。用携带两种质粒的聚(β-氨基酯)(PBAE)纳米颗粒转染细胞，这两种质粒分别编码Cas9蛋白和抗eGFP gRNA(图2E)。eGFP的敲除(图1A中的“敲除”)通过流式细胞术进行评估，并通过

基因缺失功效使用一种HEK-293T细胞系进行评估，该细胞系包含位于由两个SV40终止子序列组成的转录终止盒下游的红色增强纳米灯笼(ReNL)报道基因(参见图1B中的上部构建体)。用携带编码Cas9蛋白和抗终止盒gRNA的质粒的PBAE纳米颗粒转染细胞。基因缺失通过ReNL报道基因活性进行评估，该活性发生在终止盒(参见图1B中的下部构建体)成功缺失之后。

在基因敲除实验(在图1A中示意)中，纳米颗粒系统在转染后三天实现了高水平的eGFP敲除(>70％，如通过荧光的几何平均值评估的，图2A)。这种水平的基因沉默在整个实验中得以保持：转染之后的三周。感兴趣地，CRISPR介导的敲除导致细胞群体完全为eGFP阴性。这种基因表达的二元沉默与通过递送短干扰RNA(siRNA)实现的基因表达下调形成鲜明对比，后者导致群体基础上的基因表达降低，并且仅提供瞬时效果。(图3C和图2E)。

PBAE纳米颗粒系统在基因缺失研究(在图1B中示意)中也是有效的。抗终止盒gRNA(anti-STOP cassette gRNA)有效地缺失了整个600bp终止盒，这通过PCR扩增证实(图2B)。整个终止盒的缺失在45％的处理细胞中开启了可检测到的ReNL表达(图3D和图3B)。该系统使用ReNL的生物发光成像鉴定了有效的体外和体内CRISPR编辑两者。

1.4总结.本公开内容的主题展示，共递送分别编码Cas9和sgRNA的质粒的PBAE纳米颗粒可以实现高度的基因敲除和缺失。该系统是多功能的，因为可以设计靶向任何基因(或另一个基因组序列)的sgRNA并掺入到纳米颗粒中以用于基因敲除。此外，本公开内容的主题显示，PBAE纳米颗粒可以实现基因缺失的更具挑战性的基因组编辑程序，这对于诱导非编码基因的功能丧失是重要的。本公开内容的PBAE纳米颗粒代表了用于基因治疗应用的有前景的工具和作为用于体外和体内CRISPR编辑的报道系统的有用方法。

此外，在一些实施方案中，本公开内容的主题展示了体内CRISPR编辑。例如，小鼠黑素瘤细胞(B16-F10)和胶质母细胞瘤细胞(GL261)被诱导表达iRFP-终止-ReNL报道系统。这些细胞在体内的成功编辑可以使用ReNL生物发光来可视化。将单独的Cas9和sgRNA质粒双重递送至B16-F10细胞和GL261细胞产生低基因缺失(通过流式细胞术确定的<5％ReNL荧光)。在又其他的实施方案中，将Cas9和sgRNA克隆到单个载体中可以提高效率。如下文所提供的，新型超支化PBAE纳米颗粒制剂的大型组合文库也已被筛选，并且与经典的PBAE相比，可以表现出更高的转染功效。

实施例2

图7A至图7C示出用于纳米颗粒组装的BGDA系列超支化PBAE聚合物的合成。将二丙烯酸酯单体(双酚A甘油二丙烯酸酯，BGDA；“*”)和三丙烯酸酯单体(三羟甲基丙烷三丙烯酸酯，TMPTA”；

图7C示出丙烯酸酯终止的基础聚合物的一锅合成，在90℃在DMF中以200mg/mL进行24小时。然后在室温用封端E6(※)将聚合物封端1小时，以产生封端的超支化PBAE。

更具体地，BGDA系列超支化PBAE的合成在图7A-图7C中提供。如图7A所示，将二丙烯酸酯单体BGDA和三丙烯酸酯单体TMPTA与侧链单体S4混合，以合成一系列具有增加的三丙烯酸酯摩尔分数和分支程度的PBAE。如图7B所示，直链PBAE每个分子具有两个封端结构(红色)，而支链PBAE中的每个三丙烯酸酯单体导致每个分支点有一个另外的封端部分。图7C示出丙烯酸酯终止的基础聚合物的一锅合成，在90℃在DMF中以200mg/mL进行24小时。然后在室温用单体E6将聚合物封端1小时，以产生封端的超支化PBAE。

代表性的聚合物特性在图8A-图8F中示出。图8A示出不同分支的BGDA PBAE的分配系数(logP)和分布系数(logD)的预测特性。图8B示出聚合物和Yo-Pro-1碘化物在低pH的竞争结合测定。(n＝3个孔，平均值±SEM)。图8C示出在等渗中性缓冲液中的竞争DNA结合测定。(n＝3个孔，平均值±SEM)；图8D示出PBAE的滴定。图8E示出不同分支的PBAE在pH 4.5-8.5之间的最大缓冲点的有效pKa值。图8F示出不同分支的PBAE在低pH和等渗中性缓冲液中的有效溶解度。混合多于一种单体使得能够在任一单体的状态之间中路微调聚合物特性。特性包括疏水性(通过logP和logD计算评估)、DNA结合、缓冲能力和有效pKa值。

另外的BGDA纳米颗粒特性在图9A-图9C中示出。图9A示出在25mM NaAc缓冲液，pH5.0中和以40w/w比稀释到150mM PBS中之后的Z-平均流体动力学直径测量值。图9B示出在150mM PBS,pH 7.4中评估的ζ电位测量值。(n＝3个制剂，平均值±SEM)。图9C示出干燥颗粒的TEM图像。所有图像的比例尺为100nm。无论分支程度，所测试的聚合物系列的纳米颗粒具有实际上相同的特性。

在图10A-图10H中示出在10％血清培养基中用BGDA PBAE体外转染HEK239T细胞或ARPE-19细胞。图10A示出转染功效。图10B示出归一化的几何平均表达。图10C示出存活力并且图10D示出荧光显微镜图像。图10E示出在ARPE-19细胞中的转染功效。图10F示出归一化的几何平均表达。图10G示出存活力并且图10H示出荧光显微镜图像。比例尺200μm。(n＝4个孔，平均值±SEM)。对视网膜ARPE-19细胞的转染功效明显比两种商业转染试剂Lipofectamine 2000和jetPrime以及先前优化的PBAE557高得多。

图11A-图11D展示出对于BGDA PBAE的挑战性转染条件。用20w/w纳米颗粒高血清(50％)转染HEK293T细胞(图11A)和ARPE-19细胞(图11B)。在384孔板中40w/w纳米颗粒的低纳米颗剂量粒转染HEK293T(5ng)(图11C)和ARPE-19(10ng)(图11D)。在高血清条件和低纳米颗粒剂量，分支显著提高了在两种细胞系中的转染功效。

图12A-图12H示出聚合物特性和转染功效之间的相关性。(图12A-图12D)HEK293T细胞和(图12E-图12H)ARPE-19细胞。

在表2中提供了BGDA系列聚合物的另外的结构特性。

本公开内容的聚合物系列的另外的特征在图13至图24中示出。图13A-图13B示出本公开内容的BGDA聚合物系列的化学特性。图13A示出本公开内容的丙烯酸酯终止的PBAE聚合物的BGDA系列的NMR谱

图13B示出BGDA系列聚合物的凝胶渗透色谱术折射率检测器轨迹。使用GPC和Waters2软件中的分析来计算每种聚合物相对于分子量在580Da至3.15MDa范围内的八种直链聚苯乙烯标准品的三阶曲线(R

图14A、图14B、图14C、图14D和图14E示出本公开内容的BGDA聚合物系列的水溶液特性。图14A示出在不同的pH值评估聚合物疏水性的Marvin预测logD值。以140mM Cl-,Na/K+条件对NMR值M

图15A-图15C示出本公开内容的BGDA聚合物系列的DNA结合特性。对于两种缓冲条件，这些图示出荧光猝灭随聚合物浓度而变化，针对仲胺数目归一化的猝灭，针对叔胺数目归一化的猝灭，和针对胺总数归一化的猝灭。(图15A)在pH 5.0和低盐的酸性条件下，DNA结合的程度与叔胺数目/碱基对(bp)DNA最佳地成比例。(图15B)相比之下，在pH 7.4的中性等渗条件下，DNA结合的程度与仲胺数目/bp DNA最佳地成比例。(图15C)比较了直链(0％三丙烯酸酯)、中度分支聚合物(40％三丙烯酸酯)和高度分支聚合物(90％三丙烯酸酯)在pH 5至pH 7.4之间的结合差异。

图16A-图16F示出HEK293T和ARPE-19细胞中的BGDA纳米颗粒摄取。在相同的w/w比，与直链BGDA聚合物纳米颗粒相比，分支未强烈提高纳米颗粒的摄取。HEK293T高剂量纳米颗粒摄取(600ng剂量，20％标记的Cy5-DNA)的(图16A)摄取百分比和(图16B)几何平均值。HEK293T低剂量纳米颗粒摄取(300ng，20％标记的Cy5-DNA)的(图16E)摄取百分比和(图16F)几何平均值。ARPE-19低剂量纳米颗粒摄取(300ng，20％标记的Cy5-DNA)的(图16E)摄取百分比和(图16F)几何平均值。

图17A-图17C示出在高血清(50％)条件中的BGDA系列纳米颗粒转染。HEK293T细胞(17A)转染功效高达97％和(17B)几何平均表达。ARPE-19(17C)转染功效高达67％。当考虑表达水平时，中度分支的BGDA PBAE优于直链BGDA聚合物；这种效应在低w/w比时尤其明显。

图18A-图18E示出在HEK239T细胞和ARPE-19细胞中的低剂量BGDA纳米颗粒转染。图18A示出通过Echo 550声学液体处理和纳米颗粒剂量滴定实现的极低的纳米颗粒体积分布。图18B示出在HEK239T细胞中的转染功效，并且图18C示出HEK239T细胞中针对未处理的细胞进行归一化的细胞计数。图18D示出在ARPE-19细胞中的转染功效，并且图18E示出ARPE-19细胞中针对未处理的细胞进行归一化的细胞计数。对于低剂量纳米颗粒转染测试的具有40％-60％三丙烯酸酯摩尔分数的支链BGDA聚合物在统计学上比直链BGDA聚合物更有效。当将细胞计数与八个未处理孔的平均细胞计数进行比较时，纳米颗粒制剂均未显示出高细胞毒性(细胞计数减少>30％)。值示出了每种条件三个孔的平均值±SEM。聚合物之间转染功效的差异通过与使用匹配的w/w比和DNA剂量的值的直链BGDA聚合物BGDA-0进行单因素ANOVA和多重比较在所有测试条件进行评估。单因素ANOVA用Geisser-Greenhouse球形校正和Dunnet多重比较校正来进行。示出的P值经过多重性调整。

图19示出HEK293T转染与按w/w衡量的聚合物特征相关。计算每种测试的w/w比的聚合物的仲胺、叔胺、总胺的数目和在pH 5-7.4之间的缓冲能力。对于存活力，计算线性回归趋势线，以评估单个曲线是否拟合系列中所有聚合物的数据。

图20示出ARPE-19转染与按w/w衡量的聚合物特征相关。计算每种测试的w/w比的聚合物的仲胺、叔胺、总胺的数目和在pH 5-7.4之间的缓冲能力。对于存活力，计算线性回归趋势线，以评估单个曲线是否拟合系列中所有聚合物的数据。

图21示出用对照纳米颗粒材料转染HEK293T和ARPE-19。

图22A和图22B示出用对照纳米颗粒材料转染ARPE-19。为了公平地鉴定体外转染的最佳条件，对对照试剂测试了(图22A)600ng剂量DNA与两小时孵育，和(图22B)100ng剂量与24小时孵育。先前显示PBAE 557对ARPE-19细胞转染通常是有效的，我们重现了这点，显示出最多40％的转染。JetPRIME同样能够转染多达40％的细胞，而Liofectamine-2000提供仅20％的转染功效。

图23示出流式细胞术门控分析。FlowJo 10用于门控由Accuri C6流式细胞仪分析的细胞。单细胞群体被鉴定并被针对GFP表达或Cy5标记的质粒DNA的摄取进行2D门控。对于门控，未处理的群体被设置为<0.5％的假阳性。

无效的封端单体在图24中示出。所示出的封端结构被测试并证实有效地与丙烯酸酯终止的PBAE聚合物4-4-Ac反应，但所得聚合物对于将质粒DNA递送至HEK293T细胞完全无效。这些E-单体被排除在用于较难转染的RPE单层的转染功效研究的大文库封端之外。

图25示出基础聚合物PBAE的表征，通过2x乙醚沉淀后的

图26A-图26B示出本公开内容的PBAE的凝胶渗透色谱术表征。在合成后和溶解在DMSO中并用乙醚洗涤两次后，通过凝胶渗透色谱术对PBAE进行表征，以对比直链聚苯乙烯标准品评估分子量。示出用乙醚洗涤去除了未反应的单体单元以及低聚物，(图26A)增加聚合物数均分子量MN和(图26B)降低多分散性指数(PDI)。

图27A-图27B示出分化的RPE单层的有丝分裂后状态。接种在384孔板中的人类iPS细胞被允许在384孔板中的培养物中分化超过25天。(图27A)直至第10天，每孔细胞数增加，此时细胞数达到峰值，并且细胞开始分化。(图27B)与接种后第3天相比，在接种后第25天，细胞明显生长得更密集。在第25天，RPE单层还具有纹理外观。条形图示出每种条件下四个孔的平均值±SEM。对于20x图像，比例尺100μm。

图28A、图28B和图28C示出从胚胎干细胞的完全分化改变了细胞表型，并且示出最佳PBAE聚合物结构。比例尺为100μm。(图28A)用4-4-E2转染铺板后的D3 RPE细胞的代表性图像。(图28B)用完全PBAE文库转染D3 RPE细胞的热图；(图28C)用完全PBAE文库转染的D3存活力热图。

图29A-F示出商业试剂转染功效优化。在不同的试剂比和DNA剂量，2小时和24小时的孵育条件下测试Lipofectamine 3000和DNA-In，以鉴定各自的最佳条件。(图29A)Lipofectamine 3000转染最多3％的细胞，并且(图29B)与未处理的细胞相比，在50ng、2x试剂浓度剂量和24小时孵育期导致最小的细胞毒性。(图29C)显微镜图像示出组成型核GFP表达和少量表达mCherry的转染细胞。(图29D)DNA-In导致最多12％的转染功效以及(图29E)在150ng剂量和24小时孵育时间的可管理的细胞毒性。(图29F)DNA-In明显转染了更高比例的细胞，但大多数仍未被转染。条形图示出每种条件下四个孔的平均值±SEM。对于10x图像，比例尺200μm。

用于制备本公开内容的支链聚合物的代表性基础单体在图7A中示出。聚合物可以如下命名，例如，对于单体BGDA、TMPTA-S4-丙烯酸酯，基础聚合物命名为7,8-4丙烯酸酯。

图30示出基础聚合物封端的GL261高通量筛选的转染功效和相对于未处理的细胞计数。20％三丙烯酸酯摩尔分数BGDA-TMPTA-B4聚合物(7,8-4-Ac)。384孔板，75ng DNA/孔，孵育2hr。转染功效通过Cellomics进行评估。

图31示出基础聚合物封端的B16-F10高通量筛选的转染功效和相对于未处理的细胞计数。20％三丙烯酸酯摩尔分数BGDA-TMPTA-B4聚合物(7,8-4-Ac)。384孔板，75ng DNA/孔，孵育2hr。转染功效通过Cellomics进行评估。

图32示出GL261小鼠神经胶质瘤细胞的转染功效、归一化的几何平均表达和相对存活力，其中96孔转染功效通过流式细胞术评估，400ng/孔和孵育2hr。7,8-4-XX聚合物是20％分支的单体，具有新的、扩展的封端文库。新的聚合物产生高达80％的转染，甚至在20w/w比时(参见7,8-4-A11聚合物)，相比之下，经典PBAE 446需要至少40w/w比，并且仅产生55％的转染。对于新的聚合物，几何平均表达也增加了，而存活力保持不变。

图33示出B16-F10小鼠神经黑素瘤细胞的转染功效、归一化的几何平均表达和相对存活力，其中96孔转染功效通过流式细胞术评估，600ng/孔和孵育2hr。7,8-4-XX聚合物是20％或40％分支的单体，具有新的、扩展的封端文库。新的聚合物产生高达95％的转染，甚至在10w/w比时(见7,8-4-A7聚合物)，相比之下，经典PBAE 446需要至少40w/w比，并且仅产生约55％的转染。对于新的聚合物，几何平均表达也增加了，而存活力保持不变。

图34示出在96孔板中以600ng DNA剂量2hr孵育转染的B16-F10细胞的图像。

图35示出在96孔板中以400ng DNA剂量2hr孵育转染的GL261细胞的图像。

聚合物合成的单体比率在表3中提供。本公开内容的BGDA系列聚合物的

表5.主链聚合物胺密度计算值。

表6呈现了用于合成在RPE细胞中进行筛选的PBAE文库的单体。从小分子二丙烯酸酯和伯胺单体合成丙烯酸酯终止的聚合物，然后用组织成不同结构类别的37种单体进行高通量封端。

表7提供了最小有效(minimally effective)封端单体。基础聚合物4-4-Ac在用表7中的单体封端后，在HEK293T细胞中进行预筛选。

在一些实施方案中，筛选了具有扩展的封端分子的可变超支化链PBAE。因此，通过高通量筛选，鉴定出PBAE中的超支化与更有效的封端分子的组合。更特别地，在一些实施方案中，在B16-F10黑素瘤细胞中以低纳米颗粒剂量测试BGDA-40％分支的聚合物，以鉴定在较低w/w比的有效得多的超支化聚合物中的最佳封端结构。下表示出用纳米颗粒转染后两天，表达CAG-mCherry报道质粒DNA的每个孔中作为所有细胞中的百分比的转染功效。热图示出通过基于Cellomics Arrayscan图像的转染定量分析的每种细胞两个重复孔的平均值。将B16-F10黑素瘤细胞铺板于384孔板中，并用以指定w/w比制备的纳米颗粒转染，以鉴定在低w/w比(特别是20w/w或更低)产生转染的用扩展的封端文库封端的支链聚合物结构。

实施例3

3.1引言.以可重复的方式合成高度分支的聚合物具有挑战性，但与更常用的直链聚酯胺相比，高度分支的聚合物因展示出提高的基因转染效率而显示出很大潜力。Zhao T等人(2014)。支链聚阳离子的分子柔性允许与核酸更强的相互作用，这可以改进纳米颗粒形成。Cutlar L,Zhou D,等人(2015)。

本公开内容的主题部分地提供了高度分支的聚(β-氨基酯)(PBAE)的文库的合成，所述高度分支的聚(β-氨基酯)(PBAE)能够与质粒DNA自组装以形成能够具有高转染功效的多聚物纳米颗粒(polyplex nanoparticles)，与本领域已知的直链聚酯胺相比具有显著的改进。

3.2方法

在DMSO中，以总乙烯基:胺单体总体为2.2:1的比使用分步增长迈克尔加成反应然后封端合成BEAQ，并进行醚纯化。用Bruker 500MHz NMR波谱仪在CDCl

对HEK293T、ARPE-19、B16-F10、GL261细胞进行转染测试。用Cy5标记的质粒DNA或报道基因构建体使用流式细胞术评估细胞摄取和转染。

3.3.结果.随着封端部分密度和分支结构变化，BEAQ更有效地结合核酸。与对等的直链和低分支聚合物相比，BEAQ展示出高得多的转染功效，并且与商业试剂和上一代PBAE纳米颗粒相比，在RPE细胞中的转染功效高两倍。BEAQ显示出转染所需的一致的最佳叔胺密度，而最佳仲胺密度随聚合物结构变化。扩展的BEAQ文库在包括B16-F10、GL261、A549在内的多种其他细胞类型中实现了高转染，在低w/w比时功效更高。

图36示出归一化的DNA结合(另参见图8的相关数据)。

图37(上图)示出相对于三丙烯酸酯摩尔分数的最佳w/w比。

图37(下图)示出相对于三丙烯酸酯摩尔分数的最佳胺密度(另参见图10的相关数据)。

图38示出ARPE-19细胞的基因表达和纳米颗粒特性的相关性。

图41A和图41B示出组合封端单体文库BEAQ合成。图41A示出高通量筛选。图41B示出最佳候选确认。

实施例4

4.1引言.由于负载尺寸、刚度和细胞内功能位点的差异，在同一纳米颗粒系统中功能性共递送质粒DNA和RNA寡核苷酸具有挑战性。共递送上调基因表达的质粒DNA与短RNA诸如敲低基因表达的短干扰RNA(siRNA)或实现CRISPR/Cas9基因编辑的短引导RNA(sgRNA)，可在新型组合基因治疗中有用。

本公开内容的主题提供了可生物还原的支链聚(β-氨基酯)(PBAE)的文库的合成，所述可生物还原的支链聚(β-氨基酯)(PBAE)能够与质粒DNA和短RNA诸如siRNA或sgRNA自组装以形成能够具有高转染功效的多聚物纳米颗粒，与本领域已知的直链聚酯胺相比具有显著的改进。

4.2方法.

在DMSO中，以总乙烯基:胺单体总体为2.2:1的比使用逐步增长迈克尔加成反应然后封端合成BEAQ，并进行醚纯化。合成的rBEAQ通过以下进行表征：

测试组成型表达不稳定的eGFP的HEK293T和Huh7细胞的转染和siRNA敲低。用Cy5标记的siRNA或报道基因构建体使用流式细胞术评估细胞摄取和转染。

4.3结果.rBEAQ在siRNA诱导的基因敲低、细胞存活力和细胞摄取方面表现出双相响应；直链和高度分支的聚合物表现不佳，而中等分支的聚合物在所有三类中表现最佳。添加BGDA单体(此处表示为B7)增加了在低w/w比测试的两种细胞系中的共递送，并且最佳制剂表现得与商业试剂同样好或更好。Cas9 DNA和sgRNA的共递送导致在HEK293T细胞中的CRISPR基因敲除。

图47A、图47B、图47C、图47D、图47E和图47F示出rBEAQ与siRNA形成纳米颗粒并实现基因敲低。图47A示出rBEAQ-siRNA纳米颗粒对HEK293T的敲低和细胞存活力。图47B示出细胞摄取。图47C示出通过NTA测量的纳米颗粒流体动力学直径。图47D示出通过DLS测量的纳米颗粒ζ电位。图47E示出，当使用药物BSO阻断细胞内谷胱甘肽时，纳米颗粒介导的细胞毒性增加。图47F示出rBEAQ-siRNA纳米颗粒的TEM图像。

图48A、图48B和图48C示出rBEAQ siRNA结合和释放动力学。图48A示出Yo-Pro-1siRNA结合测定，表明聚合物分支增加了siRNA结合强度。图48B示出，siRNA敲低相对结合的EC50绘图显示出双相响应。图48C示出rBEAQ纳米颗粒的凝胶阻滞测定随着在5mM谷胱甘肽还原环境中孵育时间的变化。

图49A、图49B和图49C示出含单体B7的rBEAQ使得能够有效地将DNA和siRNA共递送至HEK293T和Huh7细胞。图49A示出对HEK293T的共递送功效。图49B示出对Huh7细胞的共递送功效。图49C示出共递送至HEK293T细胞的荧光显微照片。比例尺＝100μm。

图50A示出通过rBEAQ纳米颗粒共递送sgRNA和Cas9质粒实现的CRISPR基因编辑。

实施例5

5.1.概述.尽管在各种基因递送工具的开发方面的重大进展，但是将基因有效地递送到难以转染的细胞中仍然是一个挑战。与病毒载体相比，非病毒和合成聚合物纳米颗粒在基因递送方面提供了一系列优势，并且由于其使用安全、易于合成和高度细胞类型特异性而需求量大。本公开内容的主题展示了筛选可生物降解的聚合物纳米颗粒(NP)的高通量筛选(HTS)平台的用途，所述可生物降解的聚合物纳米颗粒(NP)能够高效且低毒性地转染人类视网膜色素上皮(RPE)细胞。与商业上可获得的转染试剂相比，本公开内容的NP可以更有效地将质粒DNA(pDNA)递送至RPE单层，而不干扰RPE细胞的整体基因表达谱。本公开内容的主题建立了HTS平台，并鉴定了可用于向人类RPE单层高效非病毒基因递送的合成聚合物，使得能够对细胞信号传导和发育途径进行基因功能丧失和获得的研究。该平台可用于鉴定用于各种视网膜细胞类型的最佳聚合物、聚合物与DNA的重量比以及NP的剂量。

5.2引言.基因治疗具有治疗获得性和遗传性致盲性疾病的潜在前景，因为迄今为止大多数鉴定出的疾病与RPE有关。参见Bainbridge等人,2006。简单地通过关闭或开启其功能来调节特定的基因靶已经成为增强干细胞分化或从体细胞重编程诱导性多潜能干细胞(iPSC)的标准工具。参见Jia等人,2010；Nauta等人,2013。考虑到其高效基因递送的潜力，常规应用的基因治疗利用病毒载体来递送pDNA。然而，在另一方面，这种方法受到若干不同因素的限制，诸如(a)插入诱变的潜力，参见Baum等人,2006，(b)在胞质溶胶中易于被核酸酶降解，参见Sasaki和Kinjo,2010，或只能适应递送特定大小的pDNA。参见Bitner等人,2011；den Hollander等人,2008；和Liu等人,2007。

为了克服这些挑战并寻求一种替代的更安全的方法，已经进行了大量的尝试来配制和开发可生物降解的非病毒媒介物剂，以促进感兴趣的基因向靶位点的递送。由于质粒DNA和细胞膜两者上的电荷分布是显著地负的，因此阳离子聚合物通常仅通过强静电相互作用浓缩负载(pDNA)并形成NP而展示出有效的细胞内递送。参见Mastrobattista和Hennink,2011。由于这种策略是附加型的，因此它通常被认为是将基因递送到亚细胞靶中的最安全的方法。参见Lundstrom,2003。

为此，多年来已经配制和研究了一系列不同的阳离子聚合物，以用于有效的非病毒基因递送策略。参见Boylan等人,2012；Cheng等人,2013；de la Fuente M等人,2010；Kim等人,2004；Read等人,2005；Wang等人,2011；Yu等人,2009。尽管阳离子聚合物展示出优于病毒基因递送模式的优势，但阳离子聚合物的应用受到一个重要因素的限制，即，转染功效低。参见Pack等人,2005。聚(β-氨基酯)(PBAE)，一类合成的阳离子聚合物，最近被发现可用作非病毒基因递送剂。PBAE是优选的聚合物，因为它们易于合成，并且展示出与其DNA对应物的有效结合。PBAE在生理条件下也可水解降解，并且因此在细胞施用后表现出最小的细胞毒性。PBAE已被显示在体外和体内成功转染成人和胚胎干细胞(参见Yang等人,2009)和小鼠RPE细胞。参见Sunshine等人,2012。此外，先前的研究还表明PBAE根据其化学结构具有细胞类型特异性。参见Shmueli等人,2012；Sunshine等人,2009。因此，鉴于其结构稳定性和简单的合成方案，PBAE是进行这项研究的理想载体。RPE细胞由视网膜背侧的单层色素上皮细胞和双极上皮细胞组成。RPE细胞的细胞环境的任何损害导致许多遗传性和获得性疾病，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)。参见Strauss,2005。由于RPE对于光感受器的更新和维持也是不可或缺的，并且由于PR和RPE两者在视网膜细胞群体中占主导地位，因此RPE细胞可以是许多眼病的治疗目标。此外，由于许多眼病导致整体遗传失衡，参见Kawa等人,2014；Wang等人,2012，因此基因治疗是恢复受损视网膜中基因表达的关键。尝试将基因递送到原代RPE细胞或RPE细胞系中在本领域并不新鲜。然而，尽管采用了若干种不同的非病毒策略来通过聚合物载体或脂质体载体递送DNA，但成功率非常低。参见Abul-Hassan等人,2000；Bejjani等人,2005；Chaum等人,1999；Jayaraman等人,2012；Liu等人,2011；Mannermaa等人,2005；Mannisto等人,2005；Mannisto等人,2002；Peeters等人,2007；Peng等人,2011。

本公开内容的主题提供了高通量筛选平台，用于筛选潜在的PBAE纳米颗粒，以评估其在体外在iPS衍生的人类RPE细胞中的转染功效。不希望受限于任何一种特定的理论，认为阳离子PBAE-pDNA NP复合物可以通过调节亲水性和端基化学而被有效递送至RPE单层。因此，合成了具有不同主链和端基化学的四种PBAE基础聚合物的文库。通过电泳测定检查了PBAE与其DNA对应物结合的能力。为了探索不同PBAE化学结构对递送效率的影响，使用在CAG启动子下编码mCherry报道物的pDNA用140种不同的PBAE组合转染25天龄的RPE单层。在高内涵分析平台中对结果进行评价，在高内涵分析平台中获取图像，并使用特定算法进行数据分析。

5.3结果

5.3.1聚合物合成

最初，配制一组稳定的纳米颗粒。具有封端聚合物与pDNA的不同组合的NP制剂通过强静电相互作用产生。使用了表达由相同CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白(CAG)异源启动子驱动的mCherry报道物或nuc-GFP报道物的两种不同的质粒，如在HTS的材料和方法部分描述的。在直链PBAE合成完成后，所有随后的步骤，包括封端反应、用封端聚合物制备源板、用所需的pDNA形成稳定的NP、转染的自动化分配和HCA图像捕获过程，以384孔的形式对所有的NP组合进行(图40)。将一系列用各种不同的氨基末端结构封端的不同的基础聚合物进行组合，以制备144种不同的PBAE NP制剂的组合文库。整个文库中的聚合物命名法“N1-N2-XN”分别表示基础聚合物编号(N)-侧链编号(N)-封端氨基末端类型(X)和编号(N)(图42)。

5.3.2对RPE单层的高通量自动化NP转染

为了评估成熟RPE单层(接种后第25天)中PBAE/pCAGG-mCherry纳米颗粒的转染功效，对所有144种不同的纳米颗粒组合进行了高通量筛选测定，如图42中解释的。这允许在HCA平台上对转染功效(图42A)和存活率(图42B)的直接可视化，其中收集图像并使用适于测量转染功效或存活率的特定算法分析数据。用未经任何封端反应的聚合物转染的细胞被包括作为对照。热图表明，转染功效取决于PBAE的侧链封端化学而有显著差异(图42A)。一些主要的PBAE结构5-3-A12、5-3-F3和5-3-F4分别导致42％、37％和34％的阳性转染细胞。感兴趣的是，这些特定的聚合物也展示出显著更高的细胞存活率(分别为90％、97％和98％；图42B)。然而，这些最佳聚合物的细胞存活特性与它们转染RPE单层的能力并不成正比，因为一些其他的PBAE展示出极低的转染功效，而不论它们的高细胞存活特性。具有相同封端分子的不同PBAE对显示出显著不同的转染效率，表明转染功效还取决于另外的参数，诸如亲水性的程度和总体NP稳定性(例如，3-5-A12的转染功效为3.8％，而5-3-A12的转染功效为42％)。此外，虽然PBAE 5-3-A12在第25天对单层RPE细胞展示出最高的转染效率(42％)和较高的存活率(90％)，但在第3天的分化早期阶段，同一聚合物在分化RPE细胞中产生较低的转染率(33％)和较低的存活率(30％)(图28)。这一结果表明，在“分化的”RPE细胞的不同阶段之间，特定制剂的整体转染功效和对细胞存活率的影响显著不同。

5.3.3 5-3-A12纳米颗粒的生物物理表征

为了进一步研究展示出高效率pCAGG-mCherry递送的PBAE纳米颗粒的生物物理特性，通过动态光散射(DLS)和纳米颗粒追踪分析(NTA)方法测量了5-3-A12纳米颗粒的粒径。还测量了ζ电位。所有参数在不同的重量比(w/w)进行测量。通过DLS方法测量的粒径展示出49nm至191nm的相当宽的分布，并且通过NTA方法测量的粒径展示出115nm至149nm的分布(图43A、图43B)。证实了先前的报道，本公开内容的主题表明，具有较小尺寸的纳米颗粒导致转染率增加，参见Gan等人,2005，如在转染优化过程期间，在较低的w/w比观察到比较高的w/w比更高的转染率。无论如何，与其他主要纳米颗粒相比，5-3-A12纳米颗粒在任何w/w比的转染效率总是更高。考虑到具有不同粒径的5-3-A12纳米颗粒的转染效率相当，我们的结果表明，5-3-A12纳米颗粒的转染效率不仅仅受粒径的控制。与粒径不同，5-3-A12纳米颗粒在任何给定尺寸均展示出相当相似的表面电荷分布，其范围从+25mV至+30mV，如通过ζ电位测量的(图43C)。凝胶电泳研究展示出完整的PBAE/pCAGG-mCherry纳米颗粒复合物形成(图43D)。为了进一步巩固观察到的生物物理结果，进行了透射电子显微镜(TEM)分析。TEM成像证实通过自组装过程形成稳定的PBAE/pCAGGmCherry纳米颗粒，纳米颗粒的尺寸与DLS和NTA的结果一致(图43E)。

5.3.4 5-3-A12纳米颗粒转染功效的验证

为了进一步检查和验证主要的PBAE/pCAGG-mCherry纳米颗粒转染RPE单层的能力，在8孔室盖玻片中使用已经优化的转染条件分别转染25天龄的RPE单层。还用Lipofectamine 3000和DNA-In转染RPE单层，以测试(和比较)作为对照的转染功效。用主要的纳米颗粒(5-3-A12)观察到高达42％的转染效率，其比DNA-In的转染效率高26％，并比Lipofectamine-3000高41％，以及所有其他聚合物的可比较的转染效率(图44A-图44B)。感兴趣的是，尽管5-3-A12在人类RPE单层中实现了最高的转染，但它对于小鼠感光细胞和人类视网膜神经节细胞是最低效的聚合物(数据未示出)，表明其细胞类型特异性，并且仅适用于人类RPE单层。为了确保转染效率的差异不是由聚合物纳米颗粒的潜在毒性引起的，还检查了在优化的转染剂量下，PBAE/pCAGG-mCherry纳米颗粒对细胞存活力的影响。结果表明，与单独的未经处理的细胞相比，大多数PBAE/pCAGG-mCherry纳米颗粒制剂未对细胞存活力产生负面影响(图44C)。唯一的例外是一种商业试剂DNA-In，它显示出略微降低的细胞存活力(约80％)。先前的研究报道了质粒DNA递送需要更高剂量的PBAE，重量比高达50:1，以在癌细胞中达到最佳转染效率，这也可以导致细胞死亡增加。参见Sunshine等人,2009。然而，在本研究中，由于较小的尺寸，用最佳PBAE形成稳定纳米颗粒所需的PBAE(3:1)要少得多。此外，由于细胞类型的特异性，我们观察到RPE单层的最低的细胞死亡。考虑到对不同细胞的最低毒性作用，这提供了使用PBAE进行pDNA递送的额外优势。还定量了平均荧光强度，这是一种总蛋白产生的量度。在这方面，以任何形式转染(通过PBAE或通过商业试剂)的RPE单层展示出基本相似水平的mCherry强度，而不论它们被转染的细胞百分比水平是否相当(图44D)。转染效率描述了被转染的细胞的百分比，而不论单个细胞之间蛋白产生水平的差异。相比之下，平均荧光强度考虑单个细胞产生蛋白的差异，并通过细胞总数将其归一化。因此，平均荧光强度是转染后蛋白产生水平的更佳预测。此外，在分化过程期间，也对随时间推移的细胞总数进行计数，并测量在不同DNA剂量lipofectamine和DNA-In转染RPE单层的相对细胞计数和功效。尽管随时间推移的细胞数和总的转染后存活率是可接受的，但在任何给定的DNA剂量，与5-3-A12 PBAE相比，转染功效较低。

5.3.5用5-3-A12纳米颗粒将多于一个基因递送到RPE单层中

由于使用纳米颗粒进行多于一个基因递送非常具有挑战性，并且以前的任何研究均未报道使用PBAE纳米颗粒进行多于一个基因递送，因此评价了5-3-A12聚合物将多于一个基因递送到RPE单层中的转染功效。为此，使用了在相同启动子(CAGG)下编码两种不同报道基因(mCherry和核GFP)的两种单独的pDNA构建体，并优化了共转染测定。转染后48小时产生共转染细胞群体中接受一种或两种报道基因的细胞的比较数据(图45A)。采用了两种不同的转染策略：两种构建体同时转染(共转染)，或在不同时间转染(顺序转染)。分析每种条件的转染后数据的转染功效(图45B)、细胞体面积(图45C)和细胞体形状(图45D)。数据表明，在共转染条件下，约50％的细胞群体接受了含有mCherry pDNA的NP，并且约25％的细胞群体接受了含有nuc-GFP pDNA的NP，并且其余25％的细胞获得了两种质粒。相比之下，顺序转染的条件更有利于含有mCherry pDNA的NP，其中多于97％的细胞群体接受了含有mCherry pDNA的NP。虽然在两种转染条件下，接受一种质粒优于另一种的偏好性明显不同，但如预期的，在两种情况下都未观察到细胞体形状或细胞体尺寸的明显变化。这些结果表明，5-3-A12聚合物不干扰触发细胞/核形态的固有细胞途径，并鼓励非病毒基因递送应用。

5.4.讨论

最成功的体外质粒DNA基因递送研究是在RPE衍生细胞系上建立的，该细胞系比原代RPE单层更容易转染。Vercauteren等人,2011。在本研究中，使用了hiPSc衍生的RPE细胞(因为它们被认为比RPE细胞系更类似于原代RPE，Klimanskaya等人，2004)以研究使用可生物降解和非病毒基因递送方法在原代RPE单层中进行瞬时蛋白表达的效用。为此，建立了高通量平台来筛选从各种聚合物产生的NP将基因递送到人类干细胞衍生的RPE单层中的能力。使用该系统，鉴定了可用于向人类RPE单层高效非病毒基因递送的合成聚合物，使得能够对细胞信号传导和发育途径进行基因功能丧失和获得的研究。由于聚合物的自组装过程非常复杂(Molla和Levkin，2016)，因此组合适当的物理、化学和生物特性来产生用于基因递送的有效聚合物是非常重要的。因此，高通量并行产生和筛选这种纳米载体的大文库是鉴定有效且无毒性基因递送载体的非常有效和有力的方法。尽管对hiPSC RPE细胞作为细胞治疗和体外疾病建模的来源的极大兴趣，但是尚未有报道使用PBAE纳米颗粒对这些细胞进行基因递送的研究。本公开内容的主题展示，与RPE细胞的情况一样，用与任何商业转染试剂(lipofectamine或DNA-In)复合的质粒DNA转染hiPSC-RPE细胞非常困难。对于RPE单层，使用DNA-In实现了最高的质粒DNA转染效率，效率为约10％，而用lipofectamine 3000转染效率甚至更低(低于5％)。

此外，在本公开内容的高通量筛选测定中，虽然大多数PBAE对亚汇合的RPE群体(接种后第3天)展示出较好范围(～10％至～50％)的转染，但是大多数PBAE未能转染汇合的RPE单层群体(接种后第25天)，此时细胞达到多边形形态。相比之下，来自筛选的最佳候选(5-3-A12、5-3-F3和5-3-F4)能够有效地将pDNA递送到亚汇合RPE细胞和汇合后单层(多边形)RPE细胞两者中。虽然这种差异的原因尚不清楚，但认为这是一种相依赖性的(phasedependent)细胞类型特异性事件，其中阳离子聚合物的相互作用偏好随着细胞膜结构随时间的变化而变化。为了理解这一点，需要对不同的转染剂、经修饰的PBAE的比率和pDNA/PBAE比率进行进一步的优化研究。无论如何，我们的结果表明，5-3-A12 PBAE纳米颗粒符合成功的非病毒基因治疗剂的所有标准，易于内化到细胞中，避免内吞降解，并成功地将pDNA递送到细胞核中进行表达。尽管没有对PBAE NP的体外摄取进行具体表征；然而，ZO-1标记的共聚焦成像数据排他性地表明，具有多边形形状的RPE单层摄取了颗粒。在共转染测定中，虽然对于pmCherry或pNucGFP的转染偏好很小，但顺序转染的RPE单层的结果表明，已经转染的细胞对新纳米颗粒的再摄取接受性较低或更困难。这一结论是基于这样的事实，即在顺序转染的细胞中，当细胞首先用mCherry构建体转染时，mCherry转染的细胞群体数目明显超过GFP转染的细胞群体。然而，无论转染的类型如何，PBAE纳米颗粒对细胞体的形状或尺寸都没有影响，这从我们的共转染测定中可以清楚。这一观察还表明，尽管PBAE纳米颗粒可以将多于一个基因递送到RPE单层中，但它们经常受到重复性差和共转染效率低的阻碍，尤其是当细胞被顺序转染时。结果还表明，PBAE纳米颗粒5-3-A12可以以相对较低的细胞毒性优先地将pDNA递送到人类RPE细胞单层中。尽管作用机制(MoA)目前尚不清楚，但当前研究的结果为可生物降解的PBAE纳米颗粒的转化应用，尤其是用于RPE功能障碍的转化应用提供了重要的见解和前景。由于总表面电荷分布是细胞毒性的重要决定因素(参见Frohlich,2012；Tomita等人,2011)，因此可能有两种不同的理论导致5-3-A12纳米颗粒的细胞毒性效应低。(1)在任何给定的w/w比，5-3-A12在表面上的总电荷分布(范围从+25mV至+30mV)，这有助于与细胞表面的带负电荷的组分相互作用，并且比初步筛选期间使用的任何其他聚合物更有效地使细胞膜不稳定；和(2)在5-3-A12和pDNA之间的静电相互作用在5-3-A12中引入足够数目的可用胺基团，这可能导致ζ电位值增加。

本公开内容的主题通过使用qRT PCR测定的低通量(96孔)形式验证了来自mCherry+和mCherry-细胞群体两者的已知RPE标志物的表达模式。这个目的是评价PBAE对任何已知的固有RPE基因途径可能的干扰。预计转染后基因表达模式没有变化，因为所用的pDNA表达的外源报道基因对RPE标志物没有任何已知的功能。然而，与从未转染孔收集的样品相比，从转染孔收集的样品(无论其转染状态)观察到了不同的基因表达模式。

5.5.材料和方法：

5.5.1聚合物合成和表征

单体从表4中列出的供应商处购买。丙烯酸酯单体在4℃与干燥剂一起储存，而胺单体在室温与干燥剂一起储存。对于聚合物3-5-Ac、4-4-Ac和4-5-Ac以1.1:1的B:S单体比，并且对于聚合物5-3-Ac以1:1.05的单体比在90℃合成纯的PBAE聚合物，持续24小时。合成后，将纯的聚合物以200mg/mL的浓度溶解在无水DMSO中，然后以1:10的溶剂比在乙醚中沉淀两次，通过使溶剂涡旋并在3000rcf离心。允许聚合物在真空条件下干燥24小时，此时将它们聚集并以200mg/mL溶解在无水DMSO中，并允许在真空条件下保持另外24小时以去除另外的乙醚。最后，将丙烯酸酯终止的聚合物等分并储存在-20℃直到用于封端反应。

对于聚合物表征，将初始的纯的聚合物和去除乙醚后的纯的聚合物样品留出用于通过1H NMR和凝胶渗透色谱术(GPC)进行表征。使用带有自动进样器、styragel柱和折射率检测器的Waters系统，对在乙醚中双重沉淀之前和之后的聚合物样品进行GPC，以确定相对于直链聚苯乙烯标准品的MN、MW和PDI。如前所述进行GPC测量，流量略有变化(0.5mL/min)，并且样品运行时间增加至每个样品75分钟。参见Bishop等人,2013。在乙醚沉淀和干燥后，通过1H NMR(Bruker 500MHz)对聚合物进行分析，以确认丙烯酸酯峰的存在。对于NMR，将纯聚合物溶解在作为内标的含0.05％v/v四甲基硅烷(TMS)的CDCl

5.5.2聚合物文库制备

通过高通量、半自动化合成技术，使用Viaflo 384制备用于转染筛选实验的PBAE聚合物(图40)。对于封端反应，将25μL的无水DMSO中浓度为0.2M的封端分子分配到深孔384孔板的源孔中，然后分配到封端反应384孔深孔板(240μL体积)的以多种颜色显示的组中的对应重复孔中。将无水DMSO中的200mg/mL的丙烯酸酯终止的基础聚合物解冻，并分配到含有36种不同封端分子的孔和仅含有DMSO的单个孔中，用作丙烯酸酯终止的聚合物对照。允许封端反应在室温在温和的摇床上进行2小时，之后将封端的PBAE聚合物在无水DMSO中稀释至50mg/mL，并在384孔纳米颗粒源板的左侧等分至每孔5μL。将纳米颗粒源板密封并与干燥剂一起储存在-20℃，直到需要转染。在对384孔板中的PBAE文库进行大规模筛选后，使用上述相同的方案从冷冻的基础聚合物合成更大批次的最佳PBAE结构。然后将封端聚合物等分到单独的管中，并与干燥剂一起储存在-20℃。

对于封端，选择100mg/mL聚合物浓度和0.1M的50μL反应体积，足以在两小时时间段实现有效反应。对于最初研究，将在0.2M和0.0625M之间滴定的封端分子E1与100mg/mL的基础聚合物PBAE 4-5-Ac反应两小时。然后将反应后的聚合物在乙醚中沉淀两次以去除过量的封端单体，干燥并使用1H NMR进行评估，以通过5.5-6.5ppm之间的丙烯酸酯部分峰的消失来确定封端反应的效率。这些结果展示，对于封端分子E1，有效的封端浓度低至0.05M。考虑到封端分子之间反应性水平不同，使用0.1M的封端分子浓度进行平行大规模封端反应。

5.5.3纳米颗粒表征

最佳PBAE结构5-3-A12的流体动力学直径在三种不同的w/w比进行表征，以评估w/w比对纳米颗粒特性的影响。对于动态光散射(DLS)测量，纳米颗粒最初在25mM NaAc,pH5.0中形成，然后以1:6稀释到PBS中的10％FBS中，并且动力学使用Malvern ZetasizerNanoZS(Malvern Instruments,Marlvern,UK)用173°的检测角度在一次性微型比色杯中进行分析。对于ζ电位，纳米颗粒的制备和稀释与DLS相同，但使用相同的Malvern ZetasizerNanoZS在25℃在一次性ζ比色杯中通过电泳光散射进行分析。对于纳米颗粒追踪分析，纳米颗粒如前所述在25mM NaAc,pH 5中形成，然后在150mM PBS中以1:500稀释，使用NanosightNS300。评估PBAE:DNA结合强度的凝胶阻滞测定使用1％琼脂糖凝胶如前所述的进行，参见Tzeng等人,2016。将丙烯酸酯终止的PBAE 5-3-Ac与最佳PBAE结构5-3-A12在0至50的w/w比进行比较，以展示封端的PBAE结构的提高的结合。

透射电子显微术(TEM)图像使用Philips CM120(Philips Research,BriarcliffsManor,New York)在400方目碳涂覆的TEM格栅上获得。在25mM NaAc,pH 5.0中以0.045μg/μL的DNA浓度和90w/w比的聚合物制备样品，然后允许30μL涂覆TEM格栅20分钟。然后将格栅短暂浸入超纯水中，吸干并允许在成像前完全干燥。

5.5.4pDNA设计

对于体外转染，编码mCherry开放阅读框的质粒通过PCR扩增mCherry-N1质粒(目录号632523；Clontech)来创建。由于该质粒没有起始位点，因此在正向引物中添加了起始子ATG。PCR扩增后，将mCherry插入定向pENTR-D-TOPO gateway入门载体(目录号K240020；Invitrogen)。通过PCR选择阳性菌落，并通过测序证实。将100ng纯化的入门质粒与pCAGG-DV目的载体混合，pCAGG-DV目的载体通过在LR克隆酶II(目录号11791019)存在的条件下，将含有ccdB基因侧翼的attR重组位点的gateway盒掺入pCAGEN载体(Addgene#11160)而创建。重组后，选择克隆并测序。

5.5.5从hPSC分化和培养RPE

RPE单层如我们实验室先前所述(Maruotti等人,2013；Maruotti等人,2015)从组成型表达H2B-核-GFP的EP1-GFP人类iPS细胞系分化。简而言之，然后将待分化的iPS细胞以60,000个细胞/cm

5.5.6体外纳米颗粒介导的基因递送

在转染当天，弃去旧培养基，并替换为25μL新鲜RPE培养基。为了形成PBAE/DNA纳米颗粒，在25mM乙酸钠缓冲液(NaAc，pH5)中稀释pDNA，并等分到384纳米颗粒源板右半部分的单个孔中。然后使用Viaflo微孔板分配器将384孔圆底源孔位置(示意图-1D)左半部分的封端PBAE平行重悬于25mM NaAc中。在短暂离心(1000rcf持续1分钟)后，然后将独特PBAE结构的溶液转移到含有3:1(体积/体积)比的pDNA(示意图-1D)的384孔圆底源孔位置的右半部分中，产生定义的重量-重量(w/w)比在20-100之间的PBAE:DNA。然后将含有PBAE/DNA混合物的纳米颗粒源板短暂离心(1000rcf持续1分钟)。然后，为了将纳米颗粒分配至细胞，将每个孔中5μL体积的NP添加至RPE单层(示意图-1E)，并在37℃的培养箱中与细胞一起孵育2小时；然后用50μL新鲜RPE培养基替换所有的纳米颗粒和培养基。在允许报道基因表达48小时后，细胞核用Hoechst染色，并使用基于自动化荧光的成像系统(HCA Cellomics VTI；Thermofisher scientific)获得图像。转染的细胞被鉴定为既表达内源性核GFP又表达mCherry的细胞，并且确定每种NP和条件的转染细胞的百分比以及细胞存活力。商业转染试剂Lipofectamine

5.5.7免疫染色

将待分化的iPS细胞以230万个细胞/cm

5.5.8共表达测定

为了评估最佳PBAE纳米颗粒共递送两种质粒的能力，将缺乏核GFP表达的EP1细胞如上所述铺在384孔板中，并分化25天成为RPE单层。将质粒CAGG-mCherry和CAGGnucGFP如上所述的稀释在25mM NaAc中，并用于在384孔板中以80w/w的比和200ng/孔的DNA剂量形成PBAE5-3-A12纳米颗粒。对于共递送条件，将质粒在25mM NaAc中预混合，然后与PBAE复合，并与相同的纳米颗粒一起添加至RPE单层。对于顺序转染实验，在铺板后第25天，将仅与质粒CAG-mCherry一起形成的纳米颗粒以100ng/孔的剂量添加至细胞，并且仅含质粒CAG-GFP的纳米颗粒在第26天添加至细胞。培养基更换如上所述进行。在第28天，用Hoechst33342将细胞核染色后，评估GFP和mCherry的转染功效。

5.5.10使用HCS studio 2.0软件进行成像和分析

图像在ArrayScan VTi HCA Reader(ThermoFisher Scientific)上使用10x或20x的放大倍数获得。对于分析，使用了ThermoScientific

5.5.11统计学分析

平均值以及标准差(一式三份)用于数据分析。单因素ANOVA检验用于结果比较。为了找出组间差异，通过事后Dunnett多重比较检验分析数据。****p<.0001；***p<.001；**p<.01；*p<.05的P值被认为是统计学显著的。Graph pad prism软件(v.7.0)用于数据分析。

5.5.12总结

总之，公开了使用组合化学方法对基于PBAE的可生物降解纳米颗粒进行的高通量筛选和开发，该纳米颗粒是用于将pDNA递送至人类iPSc-RPE单层的有效载体。通过筛选总共140种具有不同化学结构的合成PBAE，鉴定出导致在体外显著增加的pDNA递送效率的主要PBAE结构。本公开内容的结果表明，PBAE可以有效地与pDNA复合成纳米颗粒，并保护pDNA免受环境核酸酶的降解，并且最终有效地递送至RPE单层。不希望受限于任何一个特定的理论，本公开内容的结果支持一个假设，即PBAE介导的pDNA递送效率可以通过调节PBAE端基化学来调节。使用人类iPSc-RPE单层作为模式细胞类型，鉴定了一些PBAE聚合物，它们允许以相当于或甚至超过商业试剂如Lipofectamine 3000和DNA-In的水平有效地递送pDNA。不同于不可降解的lipofectamine 3000和DNA-In，基于PBAE的纳米颗粒的可生物降解性质促进了体外应用和临床转化。总之，本公开内容的结果突出了基于PBAE的纳米颗粒作为用于将pDNA递送到难以转染的细胞RPE单层中的新型非病毒基因载体的前景。

实施例6

6.1.概要.尽管利用了合理和组合驱动的方法来进行纳米颗粒工程化，但开发用于转染不同细胞群体的高效非病毒基因递送载体仍然是一个挑战。在本研究中，由小分子丙烯酸酯和胺单体通过A2+B2/B3+C1迈克尔加成反应合成了具有明确支链结构的多官能聚酯，并且然后用含胺小分子封端以评估聚合物支链结构对转染的影响。这些支链聚(酯胺)四元共聚物(BEAQ)对于将质粒DNA递送至视网膜色素上皮细胞非常有效，并且与先前报道的主要的直链聚(β-氨基酯)相比展示出多于一种改进，特别是对于需要提高效率的有限体积应用。具有中等分支程度的BEAQ展示出在与治疗性基因递送应用进一步相关的高血清条件和低纳米颗粒剂量的情况下用于递送是最佳的。系列中每种聚合物的定义的结构特性，包括叔胺含量，与细胞转染功效和存活力相关。阐述了可以应用于下一代可生物降解聚合物的合理设计的趋势。

6.2.背景.安全且有效地将基因递送至特定细胞群体具有通过精确地递送DNA或RNA使得能够开启或关闭基因表达从而使医学发生革命性变化的潜力。虽然病毒载体特别是腺相关病毒(AAV)已在某些疾病的DNA治疗性递送方面显示出益处，但是AAV的临床水平生产仍然是一个巨大的挑战，1,2核酸携带能力是有限的，并且患者预先存在的免疫力会限制合格的患者群体。3,4相比之下，基于非病毒纳米颗粒的基因递送方法具有生产成本更低、免疫原性更低以及实现比AAV更大的核酸运载能力的潜力。然而，由于全身递送和细胞内递送效率低，非病毒基因递送系统对许多细胞类型的递送受功效低的困扰，这阻碍了向临床的转化。5虽然已经展示非病毒载体能够在体内有效递送，但是仍然需要开发更有效的增强的纳米颗粒，特别是对于施用途径限制剂量的应用。

聚酯是一类已被用于非病毒基因递送的聚合物，在体外和体内对多种细胞类型具有高功效。6-9特别是通过迈克尔加成反应合成聚(β-氨基酯)(PBAE)是相对容易实现的，并且已经合成了大量的直链聚合物文库以探索用于基因递送目的的可能的聚合物结构的方案空间(solution space)。10-12然而，直到最近，仅开发了直链PBAE将核酸递送至哺乳动物细胞的能力，尽管展示了在多种聚合物系统诸如聚乙烯亚胺(PEI)13和聚(甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙酯)(PDMAEMA)中分支聚合物常常比其直链对应物递送质粒DNA更有效。14,15使用三丙烯酸酯单体通过迈克尔加成反应合成支链聚合物的最新进展已经产生了对于将核酸递送至多种细胞类型(包括癌细胞、14,15皮肤细胞、16神经细胞17和间充质干细胞)高度有效的聚合物。17在支链PBAE的合成中，先前的这些研究中许多未能评估整个可能的w/w比范围内支链聚合物相比直链聚合物的功效，或仅利用了分子量和阳离子度不够高的直链聚合物结构来实现有效的基因递送。16,19

带有β-氨基基团的聚酯可快速生物降解，并可通过选择组成单体来微调诸如疏水性、分子量和阳离子电荷的特性。这些特征使得某些结构能够对基因递送非常有效，但是通常需要大量经验筛选来鉴定有效的结构。对于聚酯来说，PBAE在水性溶液中的生物降解性不典型的短，主链酯键的典型键半衰期为4-6h，18使得该聚合物能够在24h内降解为无毒的亲水性低聚物。可以调节疏水性以用于转染不同细胞类型，19并且分子量可以通过调节乙烯基与胺的总比率来调节。11,20

直链丙烯酸酯终止的PBAE聚合物也可以用各种小分子伯胺封端，通过向聚合物添加仲胺以及伯胺来增加聚合物的阳离子电荷。21

尽管聚乙烯亚胺(PEI)分支结构改变了聚合物的阳离子特性(直链聚合物主要含有仲胺，而支链聚合物在每个分支点含有一个叔胺，并且在每个新的端基含有一个伯胺)，但PBAE合成方案中的分支不会显著改变相同分子量的聚合物结构中存在的叔胺。然而，对于PBAE，分支结构可以增加封端官能团的密度，并且这些分子先前已经被显示出大大增强直链聚合物的转染功效。18,21在其他聚合物系统中的分支已被进一步假设为增强由聚合物溶胀介导的内吞体逃逸的“针效应(needle effect)”，这可以帮助解释功效的这种增加。22-24

在此，我们呈现了一种新的聚合物系列支链聚(酯胺)四元共聚物(BEAQ)的合成和表征。它们包含四种组成单体，其比率以可预测的方式影响聚合物种类的阳离子特性和疏水性。本研究建立在聚(酯胺)材料诸如直链PBAE、12聚(胺-共-酯)(PACE)三元共聚物25和聚(亚烷基马来酸酯巯基胺)(PAMA)26的成功基础上，已经展示了胺结合核酸、酯键促进核酸释放和减少毒性的效用以及调节阳离子密度和疏水性的能力。我们利用A2+B2/B3迈克尔加成反应主要合成了具有明确分支程度的丙烯酸酯终止聚合物，然后用C单体对其封端，以探索分支结构对转染功效和纳米颗粒特性的影响。这进一步使得我们能够并入对含胺小分子端基的精细控制，以用于聚合物和纳米颗粒表面特性的工程化以及假设的细胞特异性递送。18,27-29因此，四元共聚物的四种组分控制降解性、疏水性、分支和阳离子度，它们对递送功效和细胞毒性具有很大影响。30我们对每种聚合物在各种条件下的质粒DNA结合进行了定量评估，以展示DNA结合的增加可归因于由多个封端以及分支结构引起的阳离子度的增加。进一步显示，分支在通常使多聚物纳米颗粒不稳定的条件下提高了DNA结合和转染功效。

6.3.实验部分

6.3.1.材料.三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TMPTA/B8，CAS 15625895)、双酚A甘油(1甘油/苯酚)二丙烯酸酯(BGDA/B7，CAS 4687-94-9)和2-(3-氨基丙基氨基)乙醇(E6，CAS4461-39-6)购自Sigma-Aldrich，并且未进一步纯化地使用。4-氨基-1-丁醇(S4，CAS13325-10-05)购自Alfa Aesar。丙烯酸酯单体在4℃与干燥剂一起储存，而胺单体在室温与干燥剂一起储存。质粒peGFP-N1(Addgene 2491)用于转染功效筛选。Cy5-胺(230C0)购自Lumiprobe(Hallandale Beach,FL)，以10μg/μL的浓度溶解在DMSO中，并且以小的等分试样储存于-20℃。如前所述，使用NHSPsoralen用荧光团Cy5-胺以约1个荧光团/50个碱基对的密度标记质粒DNA(eGFP-N1)。31

6.3.2.聚合物合成.根据表6-S1中的比，以2.2:1的总的乙烯基/胺比和200mg/mL的单体浓度在无水DMF中合成BEAQ。首先将二丙烯酸酯单体(B7)称量到20mL闪烁瓶中，然后添加三丙烯酸酯单体(B8)。将无水DMF添加至瓶中，并将单体充分涡旋到溶液中并加热至90℃，然后添加伯胺单体S4。在合成计算中，单体纯度是根据每批次的供应商表征来计算的。在没有任何报告的纯度信息的情况下，假设单体B7纯度为90％。然后将单体溶液在90℃搅拌24h，之后将聚合物从烘箱中取出，并在室温在黑暗中与单体E6(2-(3-氨基丙基氨基)乙醇)在无水DMF中的溶液(最终浓度0.2M)混合1h。然后将封端聚合物溶液在乙醚中沉淀两次(10×体积，然后5×体积)，并在真空条件下干燥3天。最终将聚合物以100mg/mL重新溶解在无水DMSO中，并以小体积等分试样储存于-20℃。聚合物根据三丙烯酸酯的摩尔分数命名；因此B8-50％对应于在二丙烯酸酯(B7)、三丙烯酸酯(B8)、氨基(S4)和二氨基(E6)单体之间形成的50％三丙烯酸酯摩尔分数的聚合物，其中三丙烯酸酯(B8)单体占初始单体混合物中乙烯基部分的50％。

6.3.3聚合物表征.在封端反应之前，从反应瓶中对丙烯酸酯终止的聚合物取样，并在10×体积的乙醚中沉淀两次，以回收纯聚合物。然后将丙烯酸酯终止的聚合物在真空条件下干燥2h，并在CDCl

6.3.4聚合物缓冲能力.通过滴定溶解在10mL酸化的100mM NaCl中的10mg(100μL，100mg/mL)聚合物，从pH 3.0至pH 11，评估封端聚合物缓冲能力随聚合物结构的变化。18对于滴定，使用SevenEasy pH计(Mettler Toledo)确定pH，并在逐步添加100mM氢氧化钠后评估pH。

我们以前已经展示，25kDa支链聚乙烯亚胺在7.4至5的pH范围内具有6.2mmol H+/g聚合物的缓冲能力。参见J.C.Sunshine,D.Y.Peng,J.J.Green,Uptake and transfectionwith polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure,butlargely independent of nanoparticle physical and chemical properties,Mol.Pharm.9(11)(2012)3375-83。这相当于6.2nmol H+/mg聚乙烯亚胺，意味着聚乙烯亚胺在1w/w比将具有6.2nmol H+/μg DNA的缓冲能力。在高于通常的最佳w/w比(对于HEK293T和ARPE-19为3w/w和4w/w)(图16)，PEI将具有24.8nmol H+/μg DNA或37.2nmol H+/μg DNA的最佳缓冲能力，取决于细胞类型。

6.3.5.聚合物溶解度极限.将聚合物以指定的最大浓度溶解在pH 7.4,150mM PBS或pH5.0,25mM NaAc中，并等分(50μL)至圆底96孔板(n＝3个孔)。然后将聚合物在其各自的缓冲液中逐步稀释，并且用板读取器(Biotek Synergy 2)在600nm处获得吸光度测量值(不透明度指示溶解度极限)。就绘制聚合物溶解度而言，将0.5的吸光度测量值定义为最大溶解度点(图14)。

6.3.6.DNA结合测定.Yo-Pro-1碘化物结合测定的运行类似于先前公布的结果，33其中DNA和Yo-Pro-1碘化物(Thermo Fisher)均在25mM NaAc,pH 5.0或150mM PBS,pH 7.4中稀释至1μM(3.1μg/mL质粒)的浓度，然后与聚合物混合，在不透明的黑色孔板中得到100μL孔体积。孵育30min后，然后使用板读取器(Biotek Synergy 2)测量绿色通道荧光。如前所述运行凝胶电泳结合实验，9在25mM NaAc缓冲液,pH 5.0或150mM PBS,pH7.4中制备纳米颗粒，用30％甘油稀释以用于加载到1％琼脂糖凝胶中。

6.3.7纳米颗粒表征.按照转染方法部分中概述的相同浓度，为每种纳米颗粒制剂独立制备三个样品。纳米颗粒在25mM NaAc,pH 5.0中的流体动力学直径随后使用MalvernZetasizer NanoZS(Malvern Instruments,Marlvern,UK)用173°的检测角度在一次性微量比色杯中通过动态光散射(DLS)进行确定。然后将样品以稀释系数6稀释在150mM PBS中并再次测量，以确定纳米颗粒在中性等渗缓冲液中的流体动力学直径，然后使用相同的Malvern zetasizer NanoZS在25℃在一次性ζ比色杯中通过电泳光散射来确定ζ电位。透射电子显微术(TEM)图像使用Philips CM120(Philips Research,Briarcliffs Manor,NewYork)在400方目碳涂覆的TEM格栅上获得。在25mM NaAc,pH 5.0中以0.045μg/μL的DNA浓度和40w/w比的聚合物制备样品，然后允许30μL涂覆TEM格栅20min。然后将格栅短暂浸泡在超纯水中以去除多余的干燥的盐，吸干，并且在成像前允许在真空条件下完全干燥。

6.3.8.细胞培养.HEK293T和ARPE-19细胞购自ATCC(Manassas,VA)，并且分别在补充有10％热灭活胎牛血清和1％青霉素/链霉素的高葡萄糖DMEM或DMEM/F12中培养。对于所述的96孔板转染功效实验，在转染前24h，将细胞铺在CytoOne 96孔组织培养板(USAScientific,Ocala,FL)中，12,000个细胞/孔于100μL完全培养基中。对于所述的384孔板转染实验，在转染前24h，将细胞以25μL完全培养基中的2,500个细胞/孔铺在384孔组织培养板(Santa Cruz,sc-206081)中。通过MycoAlert测试(Lonza)定期确认细胞为支原体阴性。

6.3.9.转染和细胞摄取.对于96孔板转染，通过将合成的聚合物和eGFP-N1质粒溶解在25mM乙酸钠(NaAc)pH 5.0中，然后以1:1的体积比混合，形成纳米颗粒。将纳米颗粒在室温孵育5min，然后向每个含有100μL完全培养基的细胞孔中添加20μL纳米颗粒溶液，并允许孵育2h，此时将培养基替换。转染后约48h，使用流式细胞术，用带有HyperCyt自动进样器的BD Accuri C6流式细胞仪，并在FlowJo中以2D相对于未处理的细胞进行门控，对转染细胞百分比和几何平均表达进行转染功效评估(图23)。转染后约24h，使用MTS Celltiter96Aqueous One(Promega,Madison,WI)细胞增殖测定评估细胞存活力。对于低剂量纳米颗粒的384孔板转染，将DMSO中的合成聚合物溶解在25mM NaAc缓冲液中至浓度为7.5μg/μL，然后在384孔聚丙烯纳米颗粒源板中与溶解在25mM NaAc缓冲液中的DNA混合。然后使用Echo 550液体处理器将纳米颗粒以低体积分配至细胞板。允许报道物表达2天后，在用Hoechst 33342染色后，使用带有活细胞成像模块的Cellomics Arrayscan VTI对板进行扫描和分析。如前所述，使用20％Cy5标记的DNA在96孔板中进行基于流式细胞术的细胞摄取研究。32为了去除细胞膜外缔合但未经历内吞作用的缔合的纳米颗粒，将细胞在胰蛋白酶消化后用150mM PBS中的50μg/mL硫酸肝素洗涤一次，并转移至圆底96孔板。32

6.3.10.共聚焦显微术.在转染前2天，将细胞铺在Nunc Lab-Tek 8室硼硅酸盐盖玻片孔板(155411；Thermo Fisher)上，50,000个细胞/孔(ARPE-19)或25,000个细胞/孔(HEK293T)于250μL补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的无酚红DMEM中。使用Cy5标记的质粒DNA和eGFP-N1质粒DNA以0.8/0.2质量比按照上述20或40w/w的比制备纳米颗粒，然后以1500ng DNA/孔的总剂量添加至细胞并孵育2h。对于成像，将细胞用1:5,000稀释的Hoechst33342(H3570；Thermo Fisher)染色30min用于细胞核可视化，并用1:2500稀释的pKa 4.6的Cell Navigator Lysosome Staining染料(AAT Bioquest，22658)在无酚红DMEM中染色。然后用无酚红的DMEM洗涤细胞两次，并在37℃在5％CO

6.3.11.数据分析和图表.FlowJo用于流式细胞术分析，并且Cellomics HCSStudio(Thermo Fisher)用于基于图像采集的转染分析。聚合物结构在ChemDraw(PerkinElmer,Boston,MA)和Marvin(ChemAxon,Cambridge,MA)中进行表征，以确定logP和logD值。归一化的50％血清转染功效的计算通过将在50％血清培养基中获得的转染百分比或几何平均转染功效除以相同纳米颗粒(B8％和w/w比)制剂在10％血清中获得的转染百分比或几何平均转染功效来进行。质粒DNA与溶酶体的共聚焦显微术共定位在Zen Blue中作为强度加权的共定位进行评估，然后通过每张图像的质粒DNA的单个图像面积进行归一化，用于统计定量。

6.3.12.统计学.Prism 8(Graphpad,La Jolla,CA)用于所有统计分析和曲线绘制。除非另外指明，否则统计检验以整体α值0.05进行。除非另外说明，否则在所述已经进行的检验中，没有统计显著性标记表示没有统计显著性。统计显著性表示如下：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

6.4结果

6.4.1.支链聚(酯胺)四元共聚物的合成和表征.

6.4.1.1.丙烯酸酯终止的聚合物的合成.通过从小分子二丙烯酸酯(BGDA/B7)、三丙烯酸酯(TMPTA/B8)和氨基醇(S4)单体的逐步增长A2+B2/B3迈克尔加成反应合成了一系列具有不同分支程度的支链聚(酯胺)四元共聚物(BEAQ)(图7和表6-S1)。在A2+B2/B3+C的合成方案中，A2对应于能反应两次的伯胺单体(S4)，B2对应于能反应两次的二丙烯酸酯单体(称为B7)，B3对应于能反应三次的三丙烯酸酯单体(称为B8)，并且C是指由于过量存在而反应一次的封端单体。我们通过1H NMR(图13)在5.5ppm和6.5ppm之间丙烯酸酯峰的存在证实，每种聚合物在24h的合成后主要是丙烯酸酯终止的。用1H NMR分析丙烯酸酯终止的聚合物结构也使得能够确定聚合物特性，包括每种聚合物的实际三丙烯酸酯摩尔分数以及每个聚合物分子的封端部分的数目(表6-1)。

通过精确地改变三丙烯酸酯单体的摩尔分数，同时保持相同的2.2:1的乙烯基与胺的摩尔比，能够仔细地调节所得聚合物中的分支程度，如通过1H NMR评估的。此外，通过以相同纯度计的总的乙烯基与胺的比合成每个系列的聚合物，每个系列的聚合物中的数均(MN)分子量都非常接近4kDa，如通过凝胶渗透色谱术(GPC)示出的(表6-1)。

6.4.1.2.聚合物的封端修饰.PBAE已被具有仲胺和叔胺的小分子单体“封端”，这增加了总的聚合物胺密度，产生具有沿着聚合物主链的叔胺的直链聚合物，并且仅在直链聚合物的两端胺密度更大。12,21,34,35以前显示出增加直链PBAE结构转染功效的大部分小分子封端21在pH 5和pH7增加聚合物的阳离子度，这是因为用伯胺单体进行封端向直链PBAE添加至少两个仲胺的事实。在此，我们利用单体2-(3-氨基丙基氨基)乙醇(称为E6)进行封端，因为它已被显示是直链聚合物的有效封端基团，并且对多种细胞系无细胞毒性。33,35与先前报道的支链聚合物方案(包括支链PBAE方案)相比，这种封端分子仅增加聚合物的仲胺含量。通过1H NMR证实所有BEAQ是完全封端的，并且根据NMR谱估计的每个聚合物分子的封端部分的数均范围为直链聚合物的2至90％三丙烯酸酯摩尔分数聚合物的7(表6-1)。值得注意的是，对于高三丙烯酸酯摩尔分数的聚合物，在这些聚合物中封端分子质量分数贡献达到近30％，而支链PBAE具有约5％的封端单体质量分数，封端单体质量分数对于较高分子量的支链聚合物进一步降低(表6-1)。中等分支的BEAQ的多分散性通过以稀释浓度合成而最小化，而三丙烯酸酯摩尔分数>60％的超支化BEAQ的高多分散性与其他超支化聚合物合成方案一致。36

6.4.1.3.聚合物系列疏水性.系列中具有已知Mn和单体组成的每种聚合物的化学特性以计算机进行预测，以评估用TMPTA进行分支对聚合物疏水性的影响。疏水性被评估为在中性和酸性pH值的预测分配系数(logP)和电离影响分布系数(logD)(图8A和图14)，展示出分支增加了在此使用的单体的BEAQ亲水性，并且pH敏感性电离在聚合物溶解度中发挥重要作用。假设分支降低了聚合物的logP和logD值，因为支链结构中更多数目的E6单体封端部分增加了亲水性羟基基团和带电仲胺的普遍性；由于含有双酚基团的二丙烯酸酯单体B7的质量分数同样降低，具有高分支程度的聚合物的疏水性进一步经受降低。我们通过基于吸光度的测定实验证实了疏水性的这一预测降低，以表明在低pH和生理pH条件两者下，具有至少40％三丙烯酸酯摩尔分数的BEAQ的可溶性高于直链B8-0％聚合物的两倍(图14)。

6.4.1.4.聚合物系列缓冲能力.聚合物的滴定展示出在假设的内吞体逃逸特性的生理pH范围内(5至7.4)的缓冲能力，因为三丙烯酸酯摩尔分数较大的BEAQ在该范围内具有较大的缓冲能力(图8D)。在5至8的pH范围内的有效pKa值被计算为滴定曲线导数(定义为Δ(-OH)/Δ(pH))的最大归一化缓冲能力的pH(图14B)。展示出有效pKa随着分支适度增加，从约6.0增加至6.75(图14C)。这些结果是由于聚合物主链中额外的叔胺密度和随着分支增加在端基中额外仲胺的存在的联合影响。18相对于基础聚合物结构计算的叔胺密度(表6-S4)表明，二丙烯酸酯B7+S4聚合物重复单元具有的叔胺密度比三丙烯酸酯B8+S4×2重复单元低得多，并且高二丙烯酸酯B7含量聚合物中叔胺的物理间隔大于高三丙烯酸酯B8含量聚合物。然而，在用单体E6封端后，叔胺密度在所有合成的聚合物中是相似的，而分别对于B8-0％和B8-90％，随着三丙烯酸酯摩尔分数从0.851mmol/克聚合物增加至4.194mmol/克聚合物，仲胺密度显著增加(表6-S5)。

6.4.1.5.聚合物系列DNA结合.通过Yo-Pro-1碘化物竞争结合测定对BEAQ/DNA结合强度相互作用的评估进一步展示了聚合物结构中分支的影响(图8B、图8C)。在pH 5，直链和支链聚合物在结合质粒DNA方面同样有效，而在pH 7.4的等渗中性缓冲液中，对于DNA结合，支链聚合物统计上表现优于直链聚合物(表6-S6)。为了评估BEAQ的DNA结合强度的增加是否主要可归因于支链结构或胺含量的变化，我们根据每种聚合物的已知结构特征计算了Yo-Pro-1碘化物猝灭随着每个碱基对DNA的仲胺、叔胺和总胺含量的变化(图15)。针对叔胺含量归一化的DNA结合有效地浓缩了在pH 5的结合测定结果，而在中性等渗缓冲液中的DNA结合针对仲胺含量的归一化最有效地浓缩了结果以拟合一条曲线(图15A、图15B)。凝胶电泳DNA阻滞测定相似地与这些结果一致，表明分支提高了DNA结合，特别是在中性等渗缓冲液中(图55)。这些结果表明，在低pH，BEAQ主链叔胺在聚合物与DNA的复合中发挥重要作用，但在稀释到中性溶液中之后，在BEAQ封端结构中仲胺主要负责结合质粒DNA。然而，对在低pH和中性pH的结合之间的差异的进一步分析确实揭示，支链聚合物的封端密度的增加并不是在中性pH的结合增加的唯一原因。将结合功效的差异随着每碱基对DNA的总胺的变化进行放大，揭示了支链聚合物在保持DNA结合方面更有效是以可归因于结构变化而不是胺含量增加的方式(图36)。

6.4.2.纳米颗粒特性.评估流体动力学直径的聚合物/DNA多聚物纳米颗粒的动态光散射(DLS)测量值展示了纳米颗粒特性相对于分支的有效独立性。在25mM NaAc,pH 5.0中以与DNA40 w/w的比形成的聚合物纳米颗粒的DLS测量值显示，所有聚合物形成的纳米颗粒的流体动力学直径为约50-100nm，在6倍稀释到150mM PBS中后，直径保持在约100nm(图9A)。所有纳米颗粒制剂显示出约+15mV的相似ζ电位值(图9B)。通过TEM分析选定的制剂，显示干燥的纳米颗粒直径在30nm和60nm之间(图9C)。值得注意的是，当通过TEM评估时，直链0％三丙烯酸酯摩尔分数(B8-0％)颗粒最小，为32±3nm，相比之下B8-50％纳米颗粒的平均值为54±6nm，这可能可归因于由具有较高的B7分数/较低的三丙烯酸酯单体B8分数的较少分支的聚合物的增加的疏水作用驱动的略微增强的分子间的聚合物相互作用。

6.4.3.细胞转染.

6.4.3.1.纳米颗粒的摄取不受分支结构的影响.我们假设，每个聚合物分子的封端部分的数目增加将导致细胞摄取增加，因为已展示与丙烯酸酯终止和侧链单体终止的直链PBAE相比，封端的直链PBAE提高细胞摄取。21此外，已表明封端结构传达细胞类型特异性，21,27，以及部分地贡献PBAE在生理相关的pH范围内的缓冲能力。18为了评估与直链PBAE相比，增加BEAQ的每个聚合物分子的封端部分的数目是否会产生更大的细胞摄取，我们通过流式细胞术评估了HEK293T和ARPE-19细胞对由Cy5标记的质粒DNA形成的中等荧光团标记密度的纳米颗粒的细胞摄取。所有聚合物对介导质粒DNA的细胞摄取普遍有效，其中相对于未处理的细胞门控的高于95％的细胞测试为DNA摄取呈阳性(图16)。在相等的w/w比，与直链聚合物相比，这些支链聚合物未显示出显著提高的细胞摄取。因此，每个聚合物分子的2-(3-氨基丙基氨基)乙醇封端部分的数目增加并不像假设的那样介导更高的细胞摄取。

6.4.3.2.BEAQ纳米颗粒介导高转染功效.为了评估BEAQ向易于转染和难以转染细胞类型两者有效递送质粒DNA的能力，选择HEK293T细胞和ARPE-19视网膜色素上皮细胞进行报道基因eGFP-N1的转染研究。在这两种细胞系中，通过流式细胞术评估，BEAQ纳米颗粒在完全培养基中分别实现高达99％和77％的转染功效，据我们所知，这比在这两种细胞系中使用非病毒方法报道的任何转染功效高(图10)。在商业试剂中，我们进行了充分的测试和优化，包括25kDa的支链聚乙烯亚胺(BPEI)、4kDa的直链聚乙烯亚胺(LPEI)、JetPRIME和Lipofectamine 2000(图22和图21)。在ARPE-19细胞中，JetPRIME以约40％的转染得到具有可接受的存活力的最高水平的转染。直链PEI得到稍高的转染，但代价是显著的细胞毒性。用报道的BEAQ聚合物在ARPE-19细胞中实现的最大转染水平同样高于我们先前优化的最佳直链PBAE 557制剂，我们发现该直链PBAE 557制剂仅转染了这些细胞的40％-45％，保持细胞毒性<30％。37先前显示该直链PBAE 557制剂在小鼠组视网膜下注射后导致体内转染，这些BEAQ纳米颗粒在体内可能以类似的方式发挥作用。37

6.4.3.3.BEAQ中的中度分支提高了在生理血清条件下的稳定性.由于血清蛋白的屏蔽效应和聚集效应，因此在生理血清条件下的有效递送仍然是基于阳离子纳米颗粒的基因递送的一个挑战。38为了评估纳米颗粒在这些条件下的性能，评价了BEAQ在纳米颗粒孵育2h期间在50％血清培养基中孵育的HEK293T和ARPE-19细胞中的转染(图17)。在这些挑战性的转染条件(这些条件更近似地模拟了体内系统施用)下，与它们的直链对应物相比，BEAQ展示出统计学上显著提高的转染功效，在低w/w比时在两种细胞系中尤其显著(图11A、图11B)。最佳的BEAQ-50支链聚合物能够在50％血清条件下转染98％和65％的HEK293T和ARPE-19细胞。在将50％血清中的转染功效结果针对10％血清条件中的匹配结果归一化后，在此报道的BEAQ纳米颗粒在HEK293T细胞和ARPE-19细胞中保持80％和70％的几何平均表达，而转染细胞的百分比没有降低(图56)。

6.4.3.4.中度的分支提高了在低质粒剂量的转染.在低纳米颗粒剂量的转染同样更好地模拟了在生物流体中施用和稀释后在体内遇到的条件。在非常低的纳米颗粒剂量，在384孔板中质粒浓度在16pM和256pM之间(0.25-4pg/细胞)，与在两种细胞系中优化的对应直链PBAE相比，中度分支的三丙烯酸酯摩尔分数BEAQ显示出统计上更高的转染(图57和图18)。总的来说，通过对测试的所有w/w比的统计评估，B8-40％和B8-50％在两种细胞系中表现最佳。对于低DNA剂量转染，最佳w/w比发生了显著的变化，使得60w/w BEAQ纳米颗粒在极低剂量(≤5ng/孔)显示出优于20w/w颗粒的转染。在任何条件下，细胞存活力未受到强烈影响。

6.4.4.分支降低了摄取后溶酶体积累程度.用Cy5标记的质粒DNA转染HEK293T和ARPE-19细胞，然后在纳米颗粒处理后4h和24h时用共聚焦显微术评估溶酶体共定位，展示出与直链B8-0％聚合物相比，当通过B8-50％BEAQ递送时，内化的DNA较少与溶酶体共定位(图52)。为了准确定量遍及整个细胞体积的溶酶体的共定位，在两个时间点采集Z-堆叠，并使用每个切片的纳米颗粒面积来衡量各自对计算的z-堆叠溶酶体相关系数的贡献(图58)。在每种条件采集的Z-堆叠的代表性的未裁剪的(uncropped)最大强度投影图像显示出高水平的Cy5-DNA摄取，所有条件的溶酶体共定位有限(图59和图60)。所有测试的纳米颗粒制剂展示，在纳米颗粒处理后的4h和24h之间，溶酶体共定位在统计学上显著增加(图52C)；然而，对于B8-50％BEAQ纳米颗粒，溶酶体积累的变化程度较低，特别是对于测试的较高40％w/w比，其在两种细胞类型中导致在24h在溶酶体中检测到的内化DNA少于20％。直链B8-0％聚合物在24h时的溶酶体共定位程度(0.4)仍然远低于我们先前测量的PLL(0.78)和BPEI(0.7)的共定位程度，尽管BPEI在每个单位的基础上更有效地缓冲质子的能力。39该结果支持两亲性聚酯以不同于聚乙烯亚胺的方式介导溶酶体逃避的观点，因为它们对溶酶体的逃避程度与其缓冲能力不成比例。在纳米颗粒处理后24h，对于所有条件可以看到从20％未标记质粒DNA部分表达eGFP的细胞(图61和图62)。Cy5标记的质粒DNA也可在一些细胞的细胞核中检测到，这些细胞通常在24h的时间点也强烈表达eGFP(图53)。然而，对来自Z-堆叠的单个切片的分析确实揭示，大多数内化的质粒DNA在处理后24h没有定位至细胞核，即使在其避免了溶酶体降解时。

6.4.5.差异分支的BEAQ的转染趋势.我们分析了每种聚合物在测试的多种w/w比的转染功效随着聚合物浓度和已知比缓冲能力以及仲胺、叔胺和总胺含量的变化。为了说明总体群体表达和聚合物对存活力的影响，我们通过存活力衡量几何平均表达值，并针对每种聚合物结构的最大几何平均表达值归一化，以得到存活力归一化的表达。然后针对每种感兴趣的变量绘制存活力归一化的表达(图54)。所有BEAQ在归一化的几何平均表达中展示出明显的双相趋势。对来自所有聚合物的数据拟合单一二次曲线后，揭示了叔胺密度随叔胺/碱基对DNA的变化是预测转染功效最佳w/w比的最重要的化学特性。特别地，对于HEK293T和ARPE-19细胞，跨所有结构的所有聚合物数据的单一曲线二次拟合分别得到0.761和0.615的R

6.5.讨论

已经展示，在许多阳离子聚合物系统中，分支产生增强的转染，并且通过使用具有三官能胺单体40的单体或三官能三丙烯酸酯单体的单体来产生支链聚合物，在PBAE中研究了分支。17在此，我们寻求通过将完全有效的直链PBAE与对等的支链物质进行公平的比较以探索支链可藉以提高这些聚合物转染功效的确切特性。为此目的，我们合成了一系列具有明确分支程度的聚合物，通过NMR和GPC进行了定量。这些BEAQ值得注意的部分原因是用所选E6单体封端(特别是通过向聚合物结构添加仲胺)影响胺密度的方式。我们假设，与直链PBAE相比，BEAQ中的分支结构和高封端部分质量分数将由于其增加的仲胺阳离子性而在中性pH显示出提高的DNA结合，并且在较低的w/w比将更有效地递送。通过计算方法和实验方法显示，BEAQ由于亲水性封端部分的比例(prevalence)增加而更易溶于水并且在生理pH范围内缓冲更有效。我们进一步计算了每种聚合物的有效pKa值，以展示分支影响最大缓冲能力的pH点。鉴于长期以来的假设，即聚阳离子在pH 5-7.4范围内的滴定能力是“质子海绵假说”驱动的内吞体逃逸的原因，39,41-44缓冲能力的直接变化和有效pKa允许评价这些聚合物在基因递送中的缓冲的重要性。通过定量竞争DNA结合测定，我们通过将结合功效针对每种聚合物的特定胺含量归一化，展示了分支提高的DNA结合随着通过额外的封端单体增加的仲胺含量以及分支结构而变化。重要的是，在稀释到中性等渗缓冲液中后，BEAQ比直链聚合物在结合核酸方面有效得多。使用两种充分表征的细胞系人类胚胎肾细胞系HEK293T和人类视网膜色素上皮细胞系ARPE-19，这些聚合物展示出极高的转染功效(分别高达99％和77％)，而在所使用的剂量没有明显的细胞毒性。与直链聚合物相比，BEAQ没有展示出更高的纳米颗粒摄取，但确实提高了转染功效并降低了所需的w/w比，有效地提高了给定聚合物质量的聚合物转染效率。由于高度分支的B8-80％和B8-90％聚合物具有最大的缓冲能力和最相关的有效pKa值(接近pH 7)，但转染功效最低，我们的结果进一步表明，缓冲能力和内吞体逃逸可能不是介导该聚合物系统成功转染的限速步骤。这些结果加强了其他研究组在替代聚合物系统中的发现，即在pH 4-7.4之间的聚合物缓冲能力是必需的，但其本身并不是用于转染的充分特性。45在极低纳米颗粒剂量的更具挑战性的转染条件下或在生理血清条件下，中度分支的BEAQ在统计学上显示出优于对等的直链PBAE，并在所报道的条件下具有极高的转染功效。在超低质粒DNA剂量，与先前报道的最佳纳米颗粒相比，质粒DNA递送的效率相当显著，以前报道的最佳纳米颗粒包括PBAE三元共聚物，其包含烃基侧链以提高胶体稳定性，显示为了以相似功效转染HeLa细胞需要本文使用的大致3×的DNA剂量。46此外，在生理血清条件下，与文献中报道的相比，这些BEAQ纳米颗粒展示出令人印象深刻的转染程度。氟化PAMAM树枝状大分子被报道，当将其纳米颗粒添加至50％血清中的细胞时，其转染功效降低至在10％血清中的转染功效的30％。47相比之下，BEAQ纳米颗粒在与10％血清转染匹配的条件下保持>70％的几何平均表达。其他非病毒转染试剂类似地被报道在生理血清条件下促进转染，但在10％血清中通常仅产生相同颗粒的平均表达水平的30％-40％。48也就是说，即使在非病毒转染的这种相对较高的功效水平，与用于有效转导的已经演化超过十亿年的病毒载体相比，非病毒载体的效率仍有很大的提高空间。在测试的5-10ng质粒DNA/孔的低剂量，孔中的每个细胞可获得约200000-400000个质粒。

质粒/细胞如下计算。在低纳米颗粒剂量的384孔转染实验中，中度分支的BEAQ以5ng/孔的剂量在HEK293T细胞中产生82％的转染功效，并且以10ng/孔的剂量在ARPE-19细胞中产生42％的转染功效。细胞以每孔2500个细胞的密度接种，并假设在转染当天分裂一次以产生每孔5000个细胞。eGFP-N1质粒的大小为4733bp且分子量为约3124kDa，意味着在5ng剂量存在9.64x10

基于每个多聚物纳米颗粒有约10个质粒的最近估计，31,49在此剂量，每个细胞仍可以添加超过20,000个纳米颗粒，这是高的感染复数(multiplicity of infection,MOI)。在较高剂量转染条件下，估计每个细胞有被内化的5000个数目的来自多聚物纳米颗粒的质粒，并且估计这些质粒中有1/5到达核膜，因此纳米颗粒的摄取似乎是体外有效转染的一个重要困难。32与高效病毒相比，此处测试的低纳米颗粒剂量远高于产生相似表达水平的腺病毒(1-1000)和各种慢病毒(1-200)所用的MOI数量级。50,51相比之下，天然存在的AAV通常以高达100000的高得多的MOI使用，以在难以转导的细胞系中实现相似的基于可检测报道基因的转染水平。52,53Spark Therapeutics最近完成了一项成功的III期临床试验，该试验使用AAV的视网膜下递送，用于第一种FDA批准的基因治疗，voretigene neparvovec-rzyl，展示了非整合基因治疗的临床潜力。54鉴于BEAQ和AAV的MOI水平相似，再加上用于临床应用的AAV的规模化生产的挑战1,2和AAV负载能力的限制，用这种BEAQ系统进行附加型质粒DNA的非病毒递送可能是向RPE细胞临床递送DNA的可行策略。

逃离内吞体和避免溶酶体降解仍然是纳米材料旨在实现胞质递送的一个重要困难。对siRNA的脂质纳米颗粒的内吞体逃逸的估计揭示，内化到内吞体中的负载通常少于2％到达胞质溶胶，55,56这已经通过一些最近的脂质纳米颗粒制剂得到改善，在HeLa细胞中产生高达15％的逃逸。57多聚物纳米颗粒类似地受内吞体逃逸功效低的困扰，经典材料诸如聚乙烯亚胺和聚赖氨酸几乎完全保留在酸化的囊泡中，并经历溶酶体降解，尽管前一材料特别具有缓冲氢离子的能力。41在内化后，向酸性溶酶体的转运快速发生，纳米颗粒通常在内化后1h内到达溶酶体室。58与大多数其他聚合材料的这些发现形成对比，我们展示BEAQ在很大程度上避免了溶酶体降解，在处理后24h，与在酸化囊泡中检测到的40％-50％的直链聚合物递送的DNA相比，在酸化囊泡中可检测到<20％的标记的质粒DNA。这些结果是有前途的，因为它们展示分支可以提高这些聚合物实现内吞体逃逸的能力，内吞体逃逸仍然是有效基因递送的主要困难。最后，我们展示了随着疏水性和阳离子性变化的聚合物结构如何与最佳聚合物/DNA质量比和转染功效直接相关，因为这些变量已在其他聚合物系统中被重复显示对产生稳健的转染至关重要。30为了鉴定这些聚合物和转染功效之间的结构-功能关系，我们分析了存活力和几何平均表达随单个聚合物特性(包括缓冲能力、每bp质粒DNA的仲胺、叔胺和总胺含量)的变化。据我们所知，这是第一次报道这种类型的分析，并对使聚阳离子对转染有效的特征产生了洞察。特别是，我们展示了在整个分支范围内，每bp质粒DNA的最佳叔胺数目接近恒定，而最佳仲胺数目随着分支程度增加。随着对精确的期望聚合物结构的进一步了解，交替共聚物的固相合成是一种选择，已用于合成用于基因递送的精确定义的聚合物。59聚合物的降解速率也可能在转染差异中发挥作用，因为组成单体的差异可以影响特定的降解速率。18对基因递送可能高度有效的BEAQ的总的可能方案空间是巨大的，因为有许多二丙烯酸酯、侧链氨基和封端氨基单体可用，这些单体已被显示产生对不同细胞类型的转染有效的直链聚合物。通过此处和先前出版物14中概述的指南合成BEAQ将使得各种聚合物的快速原型化成为可能，这可以产生进一步的核酸有效递送的改进以及对聚合物结构/功能关系的洞察。本发明提供的用于产生BEAQ的方法同样可以容易地扩展到包括使用分支单体和其他三丙烯酸酯单体使用以及四官能度或更大的官能度，诸如季戊四醇四丙烯酸酯或二季戊四醇五-/六-丙烯酸酯，以进一步增加结构多样性。

6.6.总结

成功地合成和表征了支链聚(酯胺)四元共聚物(BEAQ)，并展示其比主要的非病毒基因递送材料(包括优化的直链PBAE、BPEI、JetPRIME和Lipofectamine 2000)具有多于一种增强。与直链类似物相比，具有中等分支程度的BEAQ显示出更紧密地结合质粒DNA，在中性等渗缓冲液中稀释后保持DNA结合，并且在水性介质中具有更高的溶解度。从二丙烯酸酯(B7)和三丙烯酸酯(B8)单体形成的支链聚合物对质粒DNA递送非常有效，并且中等分支的BEAQ在生理相关的高血清浓度保持最佳功效。化学结构分析突出了约20nmol H+/μg DNA的缓冲pH的能力以及每碱基对DNA约40个叔胺的叔胺含量的关键参数的重要性。通过差异性控制聚合物分支，发现BEAQ对向难以转染的人类细胞进行非病毒基因递送是有效的。BEAQ具有作为治疗性基因递送载体的前景，并且这些发现对下一代核酸递送聚合材料的设计、鉴定和优化具有重要意义。

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表6-S2.针对丙烯酸酯峰(5.5-6.5ppm，3H)归一化的所有聚合物的

表6-S4.主链聚合物胺密度计算。计算由单体B7+S4、B8+2*S4和乙烯亚胺组成的聚合物重复单元的分子量。然后将胺密度确定为胺数目/聚合物主链分子量(Da)。分支单体(B8)产生具有最高叔胺密度/单元质量的聚合物，而B7单体产生具有较低叔胺密度的聚合物。

表6-S6.Yo-Pro-1碘化物竞争结合测定。RM单因素ANOVA通过Geisser-Greenhouse校正和Dunnett检验校正的多重比较对比直链、0三丙烯酸酯摩尔分数聚合物来进行。示出了在测试的75μg/mL BEAQ的浓度的多重比较评估结果，对于每种聚合物n＝3个孔的重复。

实施例7

7.1.概述

由于质粒DNA和RNA寡核苷酸的物理特性以及它们的细胞内功能位置的差异，在同一纳米颗粒系统中功能性共递送质粒DNA和RNA寡核苷酸具有挑战性。在本研究中，我们合成了一系列可还原的支链酯-胺四元共聚物(rBEAQ)，并研究了它们共包封和递送DNA质粒和RNA寡聚物的能力。rBEAQ被设计为利用聚合物的分支、可还原性和疏水性，以便以低的聚合物与核酸的w/w比成功地在纳米颗粒中共复合DNA和RNA，并实现高递送效率。我们验证了这种新型可生物降解聚合物的合成，表征了这些聚合物与不同核酸形成的自组装纳米颗粒，并展示了纳米颗粒能够实现安全、有效和高效的DNA-siRNA共递送以及利用Cas9 DNA和sgRNA共递送的非病毒CRISPR介导的基因编辑。

7.2背景

将外源遗传物质引入哺乳动物细胞已在实验室中广泛用于调节基因表达和诱导细胞重编程、1分化、2,3和程序性细胞死亡。4-6最近，这些技术已经开始进入临床并标志着基因医学新范式的开始。7,8传统的基因治疗涉及将DNA(通常以质粒或微环状DNA的形式)递送到靶细胞中9。RNA寡核苷酸诸如短干扰RNA(siRNA)可以实现靶特异性基因沉默，10,11并且单引导RNA(sgRNA)与Cas9内切核酸酶复合，通过CRISPR/Cas9系统实现位点特异性基因编辑。12,13这些核酸的生物功能主要取决于它们成功的细胞内递送。14

尽管已经广泛报道了递送质粒DNA或siRNA的非病毒载体，但是很少有研究能够在同一纳米颗粒系统中功能性地共递送两者。这可能具有挑战性，因为DNA和RNA寡核苷酸在大小(5000bp对比20bp)和刚性上有很大不同。15,16在本研究中，我们合成了一系列可还原的支链酯-胺四元共聚物(rBEAQ)，并研究了它们形成可以功能性地共递送质粒DNA和RNA寡核苷酸的纳米颗粒的能力。基于最近的研究设计了rBEAQ，所述研究展示，在多种聚合物载体系统中，超支化阳离子聚合物在DNA 17-20和寡核苷酸21,22递送方面优于其直链对应物。支链聚合物结构可以增加每个聚合物分子的电荷密度，从而允许更强的核酸结合亲和力。23二硫键是另一种有用的官能性，因为它们能够在还原性细胞溶质环境中实现环境触发的负载释放。它们可以以聚合物侧链、24聚合物链之间的交联部分、25和聚合物主链的部分26被掺入到递送载体中，并且已经成功地用在若干siRNA递送系统中。最后，增加聚合物疏水性已被显示改进纳米颗粒稳定性并增加DNA 27以及siRNA递送功效。28

使用容易的一锅迈克尔加成反应，我们能够通过简单地调整单体比率来调节聚合物的可还原性和疏水性。我们发现，核酸结合亲和力、释放动力学、纳米颗粒摄取和功能性核酸递送可以以高度受控的方式进行调节。我们的纳米颗粒系统能够实现高达77％的DNA转染和66％的siRNA介导的敲低。更重要的是，Cas9 DNA和sgRNA的递送实现了40％的基因敲除，进一步突出了这种共递送系统的稳健性。

7.3.材料和方法

7.3.1.材料.2-羟乙基二硫化物(CAS 1892291)、三乙胺(CAS 121448)、丙烯酰氯(CAS 814686)、双酚A甘油(1甘油/苯酚)二丙烯酸酯(B7；CAS4687949)、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(B8；CAS 15625895)、2-(3-氨基丙基氨基)乙醇(E6；CAS 4461396)、L-丁硫氨酸-亚砜亚胺(CAS 83730534)和溶剂购自Sigma Aldrich(St.Louis,MO)。4-氨基-1-丁醇(S4；CAS133251005)购自Alfa Aesar(Tewksbury,MA)。质粒pCAGGFPd2(14760)和piRFP670-N1(45457)购自Addgene(Cambridge,MA)。PB-CMV-MCS-EF1a-RFP PiggyBac质粒(PB512B-1)和PiggyBac转座酶表达质粒(PB200A-1)购自System Biosciences(Palo Alto,CA)。阴性对照siRNA(1027281)购自Qiagen(Germantown,MD)。GFP siRNA靶向序列5′-GCA AGC TGA CCCTGA AGT TC-3′(SEQ ID NO:3)(P-002048-01)购自Dharmacon(Lafayette,CO)。Cy5标记的siRNA(SIC005)购自Sigma Aldrich。

7.3.2.聚合物合成.使用类似于Kozielski等人26的方法合成可生物还原单体2,2-二硫烷二基双(乙烷-2,1-二基)二丙烯酸酯(BR6)。简而言之，在存在过量三乙胺的条件下，用丙烯酰氯将2-羟乙基二硫化物丙烯酸酯化(在二氯甲烷中的摩尔比为1:1.1)。过滤出沉淀物后，用水洗涤产物，用硫酸钠干燥，并通过旋转蒸发去除溶剂。

对于聚合物合成，根据表7-S1中列出的B单体摩尔比，将单体BR6、B7、B8和S4溶解在无水二甲亚砜(DMSO)中，总乙烯基/胺比为2.2:1，浓度为150mg/mL。在90℃搅拌过夜反应后，聚合物通过在室温与单体E6(DMSO中的最终浓度为0.2M)反应1h进行封端。封端聚合物通过两次乙醚洗涤来纯化，之后在真空室中去除剩余的溶剂。将聚合物以100mg/mL溶解在DMSO中，并以等分试样在-20℃与干燥剂一起储存。

7.3.3.Yo-Pro-1碘化物核酸结合测定.将Yo-Pro-1碘化物荧光染料(Invitrogen)与siRNA以0.5μM Yo-Pro和0.5μM siRNA的最终浓度在25mM乙酸钠(NaAc,pH 5.0)中混合。将聚合物溶解在NaAc中，并且在96孔黑色底板中将每孔25μL聚合物溶液与75μL RNA/Yo-Pro溶液混合。将溶液在37℃孵育20min，然后在荧光多板读取器(Biotek Synergy 2)上读取荧光读数。为了测量还原条件下随时间的siRNA结合，将聚合物浓度设定在最低浓度，在该浓度每种聚合物实现>80％的猝灭。将聚合物/siRNA/Yo-Pro溶液与10μL谷胱甘肽溶液(最终浓度5mM)混合并在37℃孵育。在指定的时间点读取荧光读数。

7.3.4.聚合物表征：NMR和GPC.聚合物结构通过核磁共振波谱术(NMR)在CDCl

7.3.5.凝胶阻滞测定.通过将聚合物和siRNA分别溶解在所需浓度的NaAc缓冲液中来合成纳米颗粒。将溶液以1:1的体积比混合，并允许纳米颗粒在室温自组装10min，然后在37℃，存在5mM谷胱甘肽或150mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)的条件下孵育纳米颗粒。在各时间点取样并冷冻于-80℃以停止反应。对于共包封质粒DNA和siRNA的R6,7,8_64纳米颗粒的凝胶阻滞测定，核酸首先以1:1的体积比预混合，并且然后与聚合物混合以允许纳米颗粒自组装。聚合物剂量从10w/w至0w/w(游离核酸)不等。使用30％甘油作为加载缓冲液，将样品加载到1％琼脂糖凝胶上。凝胶电泳在TAE缓冲液中在100伏进行15min，之后凝胶在UV下成像。

7.3.6.纳米颗粒表征.如上所述制备纳米颗粒，并稀释于150mM PBS中，以在中性等渗缓冲液中确定颗粒尺寸和表面电荷。流体动力学直径使用NanoSight NS300通过纳米颗粒追踪分析在PBS中以1:500稀释进行测量，而ζ电位在Malvern Zetasizer NanoZS(Malvern Panalytical)上通过电泳光散射在PBS中以1:6稀释进行测量。为了表征纳米颗粒在生理条件随时间的稳定性，还使用Malvern Zetasizer Pro(Malvern Panalytical)在含10％血清的细胞培养基中以1:6稀释测量纳米颗粒尺寸，每小时一次，持续9h。透射电子显微术(TEM)图像用Philips CM120 TEM(Philips Research)获得。在25mM NaAc中以1.8mg/mL的聚合物浓度制备纳米颗粒，将30μL添加至400方目碳涂覆的TEM格栅，并允许格栅涂覆20min。然后用超纯水冲洗格栅，用乙酸双氧铀(0.5％于蒸馏水中)复染，并允许在成像前完全干燥。

7.3.7.细胞培养和细胞系制备.HEK-293T人类胚胎肾细胞和Huh7人类肝细胞癌细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；ThermoFisher)中培养。使用PiggyBac转座子/转座酶系统产生组成型表达蛋白半衰期为2小时的不稳定形式的GFP(GFPd2 29)的细胞系。通过标准的限制性酶克隆将GFPd2基因插入到PiggyBac质粒中，构建了GFPd2 PiggyBac转座子质粒(PB-CAG-GFPd2Addgene115665)。然后使用下文描述的方法将转座子质粒与PiggyBac转座酶表达质粒共转染到细胞中。细胞经历两次转染，并且然后生长五代以允许来自瞬时转染的荧光信号消退。通过荧光辅助细胞分选(FACS)分离阳性表达细胞，并使从单细胞生长的集落生长以建立稳定表达的细胞系。

7.3.8.转染.将细胞以每孔100μL完全培养基中15000个细胞的密度接种到96孔组织培养板上并允许其粘附过夜。在即将转染之前如上所述形成纳米颗粒。对于仅递送siRNA的实验，每个纳米颗粒条件用加扰的对照RNA(scRNA)或靶向GFP的siRNA(siGFP)配制，最终RNA浓度为每孔100nM。对于共递送siRNA和DNA的实验，除了分别100nM scRNA或siGFP之外，纳米颗粒以最终剂量为每孔200ng的DNA配制，最终总核酸剂量为每孔400ng。通过在NaAc缓冲液中以1:1的体积比预混合核酸，然后与聚合物溶液混合，形成共包封DNA和siRNA的纳米颗粒。用100μL无血清培养基替换细胞培养基，然后添加纳米颗粒。然后，每孔添加20μL纳米颗粒，并与细胞一起孵育2h，此时将纳米颗粒/培养基混合物用新鲜的完全培养基替换。转染后1天，使用BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)通过流式细胞术评估GFPd2荧光的敲低。通过将用siGFP处理的孔的荧光的几何平均值针对使用递送scRNA的相同纳米颗粒制剂转染的孔的荧光的几何平均值归一化来定量敲低。对于共递送实验，DNA转染被定量为当阳性表达iRFP的细胞针对未处理的对照进行门控时的百分比(N＝4)。其中使用碳酸氢钠(NaHCO

方案7-1.单体结构和提出的聚合物功能机制

7.3.9细胞摄取和存活力.将Cy5标记的siRNA以1:5稀释在未标记的siRNA中，并如上所述用于配制纳米颗粒。将纳米颗粒添加至无血清培养基中的细胞中并孵育2h，此时用PBS洗涤细胞一次并通过胰蛋白酶消化分离。进一步用肝素(PBS中50μg/mL)洗涤细胞以去除粘附至细胞的纳米颗粒，重悬于FACS缓冲液(PBS中的2％FBS)中，并通过流式细胞术定量纳米颗粒的摄取。转染后24h，按照制造商的说明，使用MTS CellTiter 96Aqueous One细胞增殖测定(Promega)评估细胞存活力。处理的细胞的细胞存活力针对未处理的细胞的细胞存活力归一化；N＝4。

7.3.10用L-丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)抑制谷胱甘肽.将L-丁硫氨酸-亚砜亚胺(BSO)以2000μM溶解在细胞培养基中。铺板后允许细胞静置3h，此时用50μL BSO溶液替换50μL培养基，最终BSO浓度为1000μM，这已被显示有效抑制细胞内谷胱甘肽水平。30将细胞与含有1000μM BSO的完全培养基一起孵育24h，在即将转染前用无血清BSO培养基替换所述含有1000μM BSO的完全培养基。细胞与纳米颗粒一起孵育2h后，用新鲜的含BSO的完全培养基补充并孵育24h，此时进行细胞存活力和流式细胞术测定。

7.3.11共聚焦显微术.在转染前1天，将HEK-293T细胞铺在Nunc Lab-Tek 8室硼硅酸盐盖玻片孔板(155411；ThermoFisher)上，30000个细胞/孔于300μL补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的无酚红DMEM中。使用预先混合的1w/w核酸比的Cy3标记的siRNA和Cy5标记的质粒DNA，如上所述制备R6,7,8_64纳米颗粒(10w/w)。如前所述制备Cy5标记的质粒DNA31,32并与未标记的eGFP-N1质粒DNA以4w/w的比混合。然后将纳米颗粒稀释到培养基中，并以1000ng/孔的总核酸剂量添加至细胞并孵育2h。成像前，用Hoechst 33342以1:5000的稀释对细胞进行染色，用于细胞核可视化。使用Zeiss LSM 780显微镜通过Zen Blue软件和63×油浸镜头，在Nyquist极限分辨率，在140μm边的区域采集图像。使用的特定激光通道是405nm二极管、488nm氩、561nm固态和639nm二极管激光器。遍及所有图像采集均保持激光强度和探测器增益设置。

7.3.12CRISPR基因编辑.用于靶向GFP的sgRNA的体外转录的模板由IDT合成为gBlock(序列在表7-S2中列出)。根据制造商的说明，使用MEGAshortscript T7转录试剂盒(Invitrogen)进行体外转录，并使用MEGAclear转录净化试剂盒(Invitrogen)纯化sgRNA产物。Cas9质粒DNA(41815)12购自Addgene并由Aldeveron(Fargo,ND)扩增。对于共递送转染，使用如上所述的R6,7,8_64纳米颗粒递送DNA和sgRNA。除非另有说明，否则在转染后5天使用流式细胞术评估基因敲除。

7.3.13.统计学.Prism 6(Graphpad,La Jolla,CA)用于所有统计分析和曲线绘制。统计检验以整体α值0.05进行。除非另外说明，否则在所述已经进行的检验中，没有统计显著性标记表示没有统计显著性。所使用的统计检验和实验重复的数量列在每个图的说明中。统计显著性表示如下：*p<0.05；**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

7.4结果和讨论

7.4.1.聚合物合成和表征.聚合物按照容易的一锅迈克尔加成反应合成，其中丙烯酸酯单体BR6和B8与含胺单体S4共聚(方案7-1)。用单体E6封端后，这类聚合物被称为R6,8_N，其中N表示聚合物主链中分支的B8单体含量(即，R6,8_20含有20％的B8)。在含有另外的二丙烯酸酯单体B7的聚合物系列中，B8单体含量保持恒定在20％，并且聚合物被称为R6,7,8_M，其中M表示聚合物主链中B7单体的含量。对于丙烯酸酯终止的基础聚合物合成，将B单体和S单体以150mg/mL溶解在无水DMSO中(单体浓度>400mg/mL导致完全凝胶化)，并允许逐步聚合反应在90℃搅拌进行过夜。基础聚合物的化学结构通过NMR谱确定，通过在5.5-6.5ppm处的3个不同的丙烯酸酯峰证实聚合物是丙烯酸酯终止的(图63)。在室温用单体E6对聚合物进行封端1h，并通过这些峰的消失来确认。分子量数据从GPC分析获得，其显示随着B8含量的增加，Mn和Mw值两者通常都增加(表7-1)。对于B8含量固定在20％的R6,7,8-4-6聚合物，分子量没有随B7含量的变化而显著变化，表明分子量在很大程度上受三丙烯酸酯单体B8贡献的聚合物分支和交联效应控制。

7.4.2.siRNA递送：基因敲低、细胞摄取和细胞毒性.R6,8-4-6聚合物用于在稳定表达具有短半衰期的不稳定形式的GFP(GFPd2)的HEK-293T细胞中递送靶向GFP的siRNA(siGFP)。29在100nM siRNA剂量和180聚合物siRNAw/w比，R6,8_20实现了75％的敲低，细胞毒性可忽略不计(图47)。R6,8_N系列中除R6,8_80外的所有支链聚合物实现了显著高于直链聚合物(R6,8_0)的敲低。R6,8_20和R6,8_40的敲低水平达到峰值(图64)，并且对于纳米颗粒摄取观察到相同的趋势(图47B)。先前的研究已经展示，随着聚合物分子量的增加，纳米颗粒摄取和转染功效增加。33,34在我们的聚合物系统中不是这种情况，因为R6,8_60和R6,8_80具有最高的分子量，但实现了相对较差的敲低。这可能是部分地由于增加聚合物分支导致由可还原BR6单体含量减少引起的细胞存活力降低。事实上，当用L-丁硫氨酸亚砜亚胺(BSO)预处理细胞以抑制主要的细胞内还原剂谷胱甘肽的产生时，35纳米颗粒介导的细胞毒性显著增加(图47E)。这种增加的毒性超过了单独的纳米颗粒或BSO处理的累加效应，表明谷胱甘肽阻断后细胞无法还原二硫键导致了更高水平的细胞死亡，并证实了我们的假设，即聚合物的可还原性通过使其快速降解为相对无毒的低聚物而减弱了细胞毒性。因此，rBEAQ纳米颗粒的可生物还原性被设计成既能在进入胞质溶胶时实现环境触发的负载释放，又能作为一种机制，通过到达细胞内的目标后快速将支链聚合物分解成更小的组分，限制支链聚合物的潜在细胞毒性。为了阐明中度分支的聚合物藉以实现最高敲除水平的机制，我们评估了纳米颗粒的物理特性。系列中的所有聚合物形成流体动力学直径约100nm的纳米颗粒(图47C)。由直链聚合物形成的纳米颗粒具有负的表面电荷，并且ζ电位通常随着聚合物支链的增加而变得越来越正(图47D)。这可能是由于支链增加导致每个聚合物分子中含仲胺的端基数目增加的事实，所述仲胺在pH 5NaAc缓冲液中带正电荷。中等分支的聚合物纳米颗粒的阳离子电荷增加在体外可能有助于纳米颗粒摄取和siRNA介导的敲低，这与许多公布的报道一致。36-38然而，这一趋势不适用于极高度分支的聚合物，部分原因是这些纳米颗粒制剂导致高水平的细胞毒性。

7.4.3.siRNA结合和环境触发释放.使用Yo-Pro-1碘化物(Yo-Pro)的竞争性结合测定用于评估R6,8-4-6聚合物的siRNA结合强度。Yo-Pro染料在结合核酸时发荧光，并且在聚合物对siRNA的结合超过染料后荧光的猝灭被用作结合强度的量度。增加聚合物分支增加了siRNA结合强度，这在封端聚合物(图48A)和丙烯酸酯终止的聚合物(图65A)中都可以观察到。将敲低随siRNA结合的聚合物EC50 w/w的变化(其中较低的EC

7.4.4.siRNA和DNA的共递送.由于中度分支的聚合物已经显示出保持强的核酸结合亲和力，同时在还原性胞质环境中有效地释放siRNA负载，因此我们假设它们可能适用于质粒DNA和siRNA的共递送。使用R6,8_20(用于siRNA递送的最佳聚合物)来包封各200ng的siGFP siRNA和编码iRFP670的质粒DNA。R6,8_20纳米颗粒能够实现有效的向HEK-293T细胞的共递送(图49A)，导致66％的siRNA介导的敲低和77％的DNA转染，细胞毒性可忽略不计(图81A)。相同的制剂在较难转染的Huh7细胞中实现了低得多的递送效率(23％敲低和5％转染；图49B)，提示需要开发更有效的共递送聚合物。为此目的，我们通过以表7-S1中所示的比掺入单体B7来合成R6,7,8-4-6聚合物系列，从而研究了聚合物疏水性的影响。选择B7是因为它含有双酚A基团，该基团已被显示通过疏水作用结合DNA 42，并能够实现高效DNA转染。27,43,44含B7的聚合物在非常低的w/w有效地复合核酸，形成直径为约150nm且ζ电位为+6mV至+16mV的纳米颗粒(图66)。R6,7,8_64纳米颗粒(10w/w)在模拟生理条件的完全细胞培养基中在若干小时内相当稳定，通过动态光散射评估的流体动力学直径倍增时间>4h(图66D)。相比之下，B7含量为0％的R6,8-4-6聚合物形成大得多的纳米颗粒(270nm)，在10w/w时ζ电位为-11mV。与之前用于siRNA复合的R6,8-4-6聚合物相比，含B7的聚合物以显著较低的w/w制剂使用，因为R6,7,8-4-6聚合物比R6,8-4-6聚合物导致显著较高的细胞毒性，将它们的用途限制在非常低的w/w制剂(图81B)。然而，在HEK-293T细胞中，含B7的聚合物能够在10w/w实现更高水平的敲低和转染(图49A、图49C)，尽管当R6,8-4-6聚合物以较高的w/w使用时，差异不太明显。更引人注目的是，在所有w/w制剂，与R6,8-4-6相比，R6,7,8-4-6聚合物在Huh7细胞中实现了显著更高的共递送，最佳制剂实现了53％的敲低和37％的转染(图49B)。凝胶阻滞测定展示，R6,7,8_64在10w/w时完全凝聚质粒DNA和siRNA两者，并且降低聚合物剂量导致在5w/w时siRNA释放和1w/w时DNA释放(图49D)。我们使用共聚焦激光扫描显微术进一步探索了siRNA和DNA的细胞内递送位置，这展示了内化的siRNA和DNA的不同命运。在纳米颗粒处理后的早期3h时间点，大多数内吞体具有siRNA和DNA两者，而在处理后24h，在大多数细胞中可检测到弥漫的胞质siRNA，并且偶尔的z切片揭示细胞核中有一些Cy5标记的质粒DNA(图49E)。使用荧光标记的质粒DNA和编码荧光报道蛋白GFP的未标记质粒DNA的混合物，我们还能够在转染后24h检测到一部分表达GFP的细胞，GFP在处理后3h在细胞中是检测不到的(图67)。研究表明，针对DNA递送优化的聚合物对siRNA可能不是最佳的，并且反之亦然。45这可能是由于DNA和siRNA之间的大小和电荷密度以及它们的细胞内作用位点的差异。Bishop等人利用聚合物包覆的金纳米颗粒系统来解决这个问题，在该系统中，使用不同的聚合物以逐层合成方案将siRNA和DNA吸附到纳米颗粒上；该研究中的最佳制剂导致在人类脑癌细胞中34％的敲低和14％的转染。46另一项使用聚(L-赖氨酸)多聚物将siRNA和DNA共递送至HEK-293T细胞的研究显示出>80％的敲低，但仅实现了<10％的DNA转染。47本文报道的递送系统在HEK-293T细胞和较难转染的Huh7人类肝癌细胞两者中实现了显著较高的共递送。与几种主要的商业上可获得的非病毒转染试剂相比，这些聚合物易于通过单步自组装配制成纳米颗粒，并能够更有效地共递送DNA和siRNA两者(图68)。

我们进一步比较了本文提供的系统的DNA-siRNA共递送功效与使用先前针对单独递送每种核酸优化的纳米颗粒制剂的功效(图69)。在后一种策略中，质粒DNA使用聚合物446以60w/w进行包封(先前针对DNA递送优化的48)，并且siRNA使用聚合物R646以120w/w进行包封(先前针对siRNA递送优化的49)。这两种纳米颗粒分别配制，并在纳米颗粒形成后添加至细胞。在单纳米颗粒策略中，相同量的核酸被预混合并共包封在R6,7,8_64纳米颗粒(10w/w)中。我们的结果显示，使用双纳米颗粒递送策略，siRNA敲低水平显著低于单纳米颗粒共递送策略实现的siRNA敲低水平，而DNA转染水平相似。此外，当使用聚合物446和R646以10w/w配制纳米颗粒以便与聚合物R6,7,8_64直接比较时，siRNA和DNA递送水平都显著较低。这些结果表明，在同一纳米颗粒系统中共包封多于一种核酸负载类型具有较高的转染效率以及较大的配制简单性的优点；这对于潜在的临床转化尤其重要，因为这可以大大简化合成和监管批准过程。

7.4.5.用于CRISPR介导的基因编辑的Cas9 DNA和sgRNA的共递送.接下来，我们将Cas9质粒DNA和靶向GFP的sgRNA共包封在我们的纳米颗粒中，以便在一个可生物降解的纳米颗粒中进行CRISPR/Cas9基因编辑系统的细胞内递送。基因敲除(其可以通过GFP荧光的降低来评估)取决于两种组分的共递送，因为Cas9内切核酸酶必须与sgRNA组装以形成功能性核糖核蛋白(RNP)复合物。这是对共递送的严格考验，

因为这两种组分必须存在于同一细胞中以及同时保持生物活性，以便进行编辑。我们的结果显示，R6,7,8_64纳米颗粒能够在HEK-293T细胞中实现40％的基因敲除(图50A)。单独递送任一种组分都未导致可觉察的敲除水平，证实了共递送的必要性。最佳的sgRNA-Cas9质粒摩尔比为33。感兴趣的是，我们在CRISPR处理的细胞中观察到明显的GFP阴性群体(GFP零)，而在用GFP siRNA处理的细胞中没有观察到明显的GFP阴性群体(图50B)。siRNA介导的基因沉默下调(downshift)了整个处理细胞群体的GFP荧光，而CRISPR介导的敲除完全关闭了一部分细胞的GFP。动力学研究显示，siRNA介导的基因沉默迅速消退，并且荧光在11天后恢复到处理前水平(图50C)。相比之下，CRISPR介导的沉默在5天后达到峰值，并在整个测试期间保持恒定。我们的结果表明，由siRNA敲低或CRISPR敲除介导的基因沉默可以适用于不同的治疗目的。前者较快发生，并在整个处理细胞群体中导致显著但短暂的下调。后者需要更长的时间才能达到峰值水平，但可以在较小部分的群体中产生持续且二元性的下调。值得注意的是，迄今为止所有转染实验是在无血清培养基中进行的。据广泛报道，血清的存在可能通过诱导多聚物破裂和聚集而降低转染功效。50

相反，一些研究也展示血清蛋白的存在可能阻止纳米复合物的分解。51为了研究我们的纳米颗粒系统在血清条件下的性能，R6,7,8_64纳米颗粒(10w/w)用siRNA或Cas9DNA和sgRNA配制，并施用至完全培养基(10％血清)中的细胞。血清的存在显著降低了两种情况下的转染功效(图70)。然而，当将NaHCO

7.5.概述

我们合成了一系列新的可还原的支链酯-胺四元共聚物(rBEAQ)，它们能够在同一可生物降解的自组装纳米颗粒系统中共递送质粒DNA和RNA寡核苷酸。我们的最佳制剂在HEK-293T细胞中实现了77％的DNA转染和66％的siRNA介导的敲低，并且在Huh7细胞中实现了37％的转染和53％的敲低。更重要的是，Cas9 DNA和sgRNA在同一非病毒纳米颗粒中的共递送实现了40％的CRISPR/Cas9介导的基因敲除。据我们所知，这是首次通过Cas9质粒和sgRNA的共递送实现CRISPR介导的基因编辑。本文报道的质粒DNA和RNA寡核苷酸的有效共递送，以及利用可生物还原性、疏水性和聚合物分支在不同细胞类型中实现有效共递送的能力，可以证明对诸如新型组合基因治疗和基因组编辑等应用有用。

表7-S1.R6，8-4-6和R6，7，8-4-6聚合物系列的主链B单体组成。

表7-S2.sgRNA体外转录模板的DNA序列。

7.6参考文献

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实施例8

8.1概述

CRISPR/Cas9系统是功能强大的基因编辑工具，具有广泛的应用，但CRISPR组分的安全且有效的细胞内递送仍然是一个挑战。在本研究中，我们利用可生物降解的聚(β-氨基酯)纳米颗粒来分别共递送sgRNA和编码Cas9的质粒DNA，以实现1-切割编辑(1-cut edit)后的基因敲除以及2-切割编辑(2-cut edit)后的基因缺失。我们设计了一种报道系统，允许容易地评价两种类型的编辑：基因敲除可以通过iRFP荧光的降低来评估，而一种表达终止盒的缺失开启红色增强纳米灯笼荧光/发光双重报道物。纳米颗粒实现了高达70％的由小的插入/缺失引起的基因敲除，以及45％的在600bp缺失编辑后的功能获得表达。2-切割编辑的效率比1-切割编辑对Cas9和sgRNA表达水平更敏感，这在进行纳米颗粒转染筛选时，通过报道基因的几何平均荧光被最佳地预测。我们的发现展示了用于基因编辑的有前途的可生物降解纳米颗粒制剂，并为不同类型的基因编辑的筛选和转染要求提供了新的见解，并且可适用于为CRISPR/Cas9平台设计各种非病毒递送系统。

8.2背景

CRISPR/Cas9基因编辑系统由赋予靶序列特异性的短引导RNA(sgRNA)与Cas9内切核酸酶复合组成，用于实现位点特异性的DNA裂解。

病毒载体已被展示是递送有效的，但对于临床前和临床研究两者来说，生产更具挑战性，并且受限于负载大小。这产生了问题，因为Cas9基因长度超过4kb，因此使用AAV(包装能力～4.7kb)的递送有时需要将不同的CRISPR组分包装在单独的病毒颗粒中，引入了复杂性并潜在地降低了功效。

虽然若干研究已经报道了非病毒CRISPR质粒递送的策略，

8.3结果

8.3.1用于基因递送的聚合物纳米颗粒

使用先前已经显示在将质粒DNA递送至多种细胞时有效的聚合物446

8.3.2 1-切割编辑后的基因敲除

用包封两种质粒的纳米颗粒转染组成型表达不稳定形式的GFP的293T细胞，所述两种质粒分别编码Cas9内切核酸酶和靶向GFP的sgRNA。成功的基因敲除通过GFP荧光的降低来评估。两种质粒的纳米颗粒共递送实现了共表达，产生70％的基因敲除，而单独递送任一组分的制剂具有可忽略不计的效果(图2A)。动力学研究揭示，基因敲除在第3天达到最大水平并保持超过3周(图2C)。对用组合纳米颗粒或单独的每种组分处理的细胞进行

8.3.3 2-切割终止盒缺失后的功能获得编辑

我们设计了一种基于Ai9小鼠

通过630bp的缺失来去除两个SV40序列的sgRNA(sg1)导致了ReNL表达的开启，而去除任一单独SV40序列的sgRNA(sg2或sg3)产生可忽略不计的表达。含有由两个U6启动子控制的sg2和sg3序列的质粒(sg2+sg3)也导致表达的开启，尽管其水平略低于sg1(图3B)。用每种sgRNA处理的细胞的基因组DNA被针对紧邻终止盒周围的800bp区域进行PCR扩增。PCR产物的凝胶电泳证实，开启表达需要完全去除两个SV40终止子序列(去除>400bp)。感兴趣的是，对于用sg2+sg3质粒组合处理的细胞，观察到约500bp的微弱条带，表明在一部分编辑中仅一个SV40序列缺失。这表明，通过sgRNA质粒组合实现的较低水平的基因缺失是由于单个SV40去除的情况(图3C)。

用Cas9和sg1质粒组合转染的细胞的RT-qPCR揭示，Cas9 mRNA水平在所有评价的时间点保持相对恒定(图72A)。蛋白印迹随同一时间过程的变化显示，转染后Cas9蛋白水平稳定积累(图72B)。48小时后sgRNA水平达到平台期(图72C)，并且在终止盒去除后，在ReNLmRNA水平观察到相同的趋势(图72D)。

8.3.4 1-切割编辑和2-切割编辑的表达阈值

为了评估分别实现1-切割敲除编辑和2-切割功能获得编辑所需的表达水平，我们改变了纳米颗粒中递送的质粒DNA的剂量。使用GFP报道物来测量转染水平，并且结果显示，将总DNA剂量从600ng降低到300ng未改变阳性表达GFP的细胞的百分比，但是荧光的几何平均值降低了近50％(图73A)。这种效应可以在流式细胞术直方图中观察到，因为与600ng处理相比，300ng处理产生了更大的具有低GFP荧光的细胞群体(图73D，左图)。降低总的DNA剂量显著降低了2-切割缺失编辑的水平(图73B)，但未显著改变1-切割敲除编辑的水平(图73C)。

我们在更宽的范围内改变递送的总DNA剂量，以便更彻底地探索转染功效对基因编辑水平的影响(图74A)。将编辑百分比随GFP几何平均荧光的变化绘图，揭示了1-切割编辑的对数关系(R

还对B16-F10鼠黑素瘤细胞进行了1-切割敲除iRFP表达和2-切割功能获得编辑，与293T细胞相比，实现了较低水平的转染(图71)。GFP表达的较低几何平均值最明显地反映在2-切割编辑的结果中，其中在B16细胞中观察到的ReNL荧光比293T细胞低1个数量级(图74C和图74D)。感兴趣的是，较低转染功效的影响对于1-切割iRFP敲除实验来说较不明显。尽管与293T细胞相比，在B16中观察到较低的敲除水平，但差异小得多(B16为12％，而293T为33％)。这验证了之前通过剂量滴定以及温度调节实验观察到的结果，并证实了我们的假设，即与双-切割编辑相比，单-切割敲除编辑需要较低的表达阈值。在mRNA水平上，Cas9和sgRNA两者的表达水平在293T细胞中比B16细胞高一个数量级(图72和图78)。

标准转染试剂也用于评估2-切割编辑效率。对于这两种细胞系，商业上可获得的阳离子聚合物转染试剂

8.3.5多重tRNA-gRNA表达系统

为了促进用于多重CRISPR编辑的更简单的方法，我们设计了一种tRNA-gRNA表达系统

8.4讨论

在这项研究中，我们展示了共递送两种分别编码Cas9和sgRNA的DNA质粒的直链和支链PBAE纳米颗粒可以在1-切割敲除和2-切割基因缺失应用中实现有效的基因编辑。我们创建了一种新型报道系统，可用于评估两种类型的编辑：iRFP荧光报道物可以在1-切割编辑后通过插入/缺失被沉默，而ReNL报道物上游的表达终止盒可以使用2-切割编辑进行缺失，以用于功能获得性ReNL表达。该表达盒被克隆到piggyBac转座子系统中，并可用于产生稳定表达的细胞系，以研究体外基因编辑功效，消除了培养我们的报道系统所基于的Ai9小鼠原代细胞的需要

最近的若干研究已经展示了使用聚合物纳米颗粒(包括不同的PBAE制剂

我们评价了包封Cas9和sgRNA质粒的两种类型的PBAE纳米颗粒，以用于基因编辑复合物的细胞内递送。其中一种是已广泛公布的直链PBAE聚合物446，其在多种细胞类型中显示出功效，并且另一种是新开发的支链PBAE聚合物7,8-4-J11，并且发现两者对于开发用于基因编辑的有效的可生物降解纳米颗粒都是有用的。阳离子聚合物和阴离子DNA自组装成直径为100-200nm的具有正ζ电位(12-25mV)的纳米颗粒(图71)。先前的报道显示，通过在纳米颗粒组装之前预先混合质粒可以实现高水平的共递送。

对Cas9和sgRNA表达动力学的评价揭示，Cas9 mRNA在整个测试时间段(4.5-48hr)保持高水平，而sgRNA表达在48hr达到峰值水平(图72)。实际Cas9蛋白水平在20hr后达到高水平并稳定积累，这与以前使用脂质转染试剂进行Cas9质粒递送的报道一致，

我们通过滴定递送的总DNA剂量，进一步探索了1-切割编辑和2-切割编辑的转染要求。感兴趣的是，将总DNA剂量从600ng降低至300ng显著降低了2-切割编辑的水平，但未影响1-切割编辑的水平(图73)。事实上，2-切割编辑的EC

单-切割编辑和双-切割编辑的表达阈值对不同细胞类型中的基因编辑有重要意义。为了展示这一点，我们比较了易于转染的HEK-293T细胞和较难转染的B16-F10细胞中的基因编辑效率。尽管通过转染的总细胞百分比评估，每种细胞系的最佳纳米颗粒制剂实现了>80％的转染，但是通过GFP报道物的归一化的几何平均表达评估，293T细胞的表达水平高1个数量级(图1)。这种差异反映在2-切割编辑的水平上，因为B16细胞在终止盒缺失后显示出非常低水平的ReNL表达(图74)。相比之下，两个细胞系之间1-切割iRFP敲除的编辑效率差异小得多(与2-切割编辑的近44倍差异相比，差异<3倍)。这些结果进一步验证了我们的假设，即2-切割编辑的效率与DNA表达水平有更强的相关性。

最后，我们设计并实现了一种tRNA-gRNA质粒，其中多重sgRNA的表达受单个U6启动子控制。在这些tRNA-gRNA串联重复序列中，开启ReNL荧光所需的两种sgRNA的表达，与每种sgRNA由其自身的U6启动子控制的质粒相比，能够实现相似水平的编辑(图75)。这种表达系统具有易于合成的优点，因为使用单个Golden Gate组装反应可以串联排列6个以上的sgRNA。

总之，我们展示了，共递送编码Cas9和sgRNA的质粒的PBAE纳米颗粒可以实现1-切割敲除以及2-切割缺失编辑。我们设计了一种新型报道系统，可藉以容易地评价这两种编辑模式。2-切割缺失事件需要比1-切割基因敲除编辑高得多的转染水平，我们通过滴定递送的DNA剂量、用短暂冷休克处理转染的细胞以及比较两种转染功效不同的细胞系的编辑效率展示了这一点。本文优化的PBAE/DNA纳米颗粒具有用于基于DNA的非病毒基因编辑的前景。此外，本文呈现的结果对广泛用于CRISPR/Cas9基因编辑的下一代非病毒递送载体的设计和筛选具有重要意义。

8.5材料和方法

8.5.1材料

用作聚合物合成用的单体的小分子如下获得：双酚A甘油(1甘油/苯酚)二丙烯酸酯(B7；411167)、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(B8；246808)、2-(3-氨基丙基氨基)乙醇(E6；09293)和N,N-二乙基二乙烯三胺(J11；518832)

8.5.2聚合物合成

聚合物446通过单体B4和S4以1.1:1的摩尔比在90℃搅拌进行反应过夜来合成。将B4-S4聚合物以167mg/mL溶解在无水THF中，并以3:2的体积比添加至单体E6(THF中0.5M)，并在室温反应1小时。将封端聚合物在乙醚中洗涤两次，以去除未反应的单体和低聚物。在真空干燥室中去除溶剂，并将聚合物以100mg/mL溶解在DMSO中，然后与干燥剂一起储存于-20℃。聚合物7,8-4-J11通过单体B7、B8和S4以2.2:1的总乙烯基:胺的比和200mg/mL的单体浓度在无水DMSO中在90℃搅拌进行反应过夜来合成；丙烯酸酯单体组成按摩尔分数计为80％B7和20％B8。聚合物封端和纯化按照与聚合物446相同的程序进行，但使用单体J11。

8.5.3纳米颗粒表征

纳米颗粒流体动力学直径使用Malvern Zetasizer NanoZS(MalvernInstruments)通过动态光散射(DLS)进行测量。在25mM乙酸钠(NaAc),pH5.0中制备样品，并且然后在150mM PBS中1:6稀释，以确定在中性等渗缓冲液中的流体动力学直径。ζ电位在同一仪器上通过电泳光散射来测量。透射电子显微术(TEM)图像使用Philips CM120(PhilipsResearch)在400方目碳涂覆的TEM格栅上拍摄。将样品在25mM NaAc中以1.8mg/mL的聚合物浓度以30w/w制备，并且允许30μL涂覆TEM格栅20分钟。然后用超纯水冲洗格栅，并允许在成像前完全干燥。

8.5.4细胞培养和细胞系制备

将HEK-293T和B16-F10细胞在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；ThermoFisher)中培养。使用PiggyBac转座子/转座酶系统诱导细胞以便组成型表达荧光蛋白构建体。使用限制性酶克隆将GFPd2基因克隆到PB-CMV-MCS-EF1a-RFP质粒中，以创建包含GFPd2基因的PiggyBac转座子质粒。将包含iRFP和转录终止序列的序列克隆到PBCAG-eGFP质粒骨架中，并使用限制性酶克隆将ReNL基因插入到该质粒中，以产生包含iRFP-STOP-ReNL序列的PiggyBac转座子质粒(质粒可在Addgene获得)。使用如下所述的纳米颗粒将每种转座子质粒与PiggyBac转座酶质粒共转染到HEK-293T和/或B16-F10细胞中。允许来自未整合到细胞基因组中的DNA的荧光蛋白信号在5次传代后消退，之后使用荧光辅助细胞分选(FACS)分离阳性细胞。将细胞进一步再扩增3代，并再次分选，以产生稳定表达的细胞系。

8.5.6sgRNA设计和制备

单引导RNA使用CRISPR.mit.edu平台设计，并以包含U6启动子、独特的20bp靶向序列和双链体优化的sgRNA支架的gBlock从IDT订制。

根据Xie等人

8.5.7转染

将细胞以每孔15,000个细胞(HEK-293T)或每孔10,000个细胞(B16-F10)铺在100μL完全培养基中，并允许其粘附过夜。将聚合物和DNA分别以所需浓度溶解在25mM NaAc中，并且然后通过移液混合在一起。允许纳米颗粒自组装10分钟，并且然后每孔添加20μL纳米颗粒溶液和每孔600ng DNA，最终体积为120μL，除非另有说明；对于使用CRISPR/Cas9系统的转染实验，hCas9和sgRNA质粒以1:1的重量比使用。将纳米颗粒与细胞在37℃一起孵育2小时，此时去除培养基和纳米颗粒并用新鲜的完全培养基替换。商业上可获得的转染试剂

转染和基因编辑的功效使用BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)通过流式细胞术进行评价。通过将处理孔的荧光几何平均值针对仅用Cas9质粒转染的孔的荧光几何平均值归一化来对CRISPR敲除进行定量。荧光增加被定量为当针对未处理对照门控时阳性表达荧光蛋白的细胞的百分比。基因缺失实验中的基因编辑也使用Promega

8.5.8Surveyor测定

使用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒(ThermoFisher)从用Cas9-sgRNA质粒组合转染的细胞和未转染的对照分离基因组DNA。对预测的切割位点侧翼的660bp区域进行PCR扩增，并且PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。将400ng的PCR扩增子进行杂交，并按照制造商的说明，使用

8.5.9进行Sanger测序以检测基因编辑

使用NEB PCR克隆试剂盒将用于Surveyor测定的PCR产物克隆到质粒载体中，并转化到DH5α感受态大肠杆菌(NEB)中。使30个菌落在5mL液体培养基中生长过夜，并且分离质粒DNA并通过Sanger测序进行表征。

8.5.10qRT-PCR

收集在12孔板中用Cas9-sgRNA质粒组合转染的细胞，并使用miRNeasy微型试剂盒(Qiagen)提取包括小RNA(＜100nt)的总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)对RNA进行逆转录，并使用SYBR Green PCR主混合物(ThermoFisher)在StepOnePlus实时PCR系统(ThermoFisher)上运行qRT-PCR。qPCR程序如下：95℃10min；40个循环的95℃15秒、55℃30秒和60℃30秒。用于qRT-PCR的引物在表8-S1中列出。结果示出为相对于β-肌动蛋白的表达倍数。

8.5.11蛋白印迹

将12孔板中转染的细胞在1X RIPA缓冲液和1X蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物(ThermoFisher)的溶液中进行裂解。通过离心使裂解物澄清，使用Pierce Micro BCA测定(ThermoFisher)确定蛋白浓度，并使样品在DTT存在的条件下在Laemmli样品缓冲液(Bio-Rad)中变性。将50μg蛋白加载到4％-15％TGX预制蛋白凝胶(Bio-Rad)中。然后使用PiercePower Blotter(ThermoFisher)将蛋白转移至PVDF膜。在室温，将膜在5％脱脂牛奶中封闭1hr，并在4℃用抗Cas9的一抗(Cell Signaling Technologies14697；1∶500)或抗β-肌动蛋白的一抗(Abcam ab8226；1∶10,000)进行孵育(probe)过夜。施加二抗在室温持续1hr(m-IgGK BP-HRP；Santa-Cruz Sc-516102；1∶1000)。将膜用Amersham ECL蛋白印迹检测试剂(GE Healthcare)显色，并使用ImageQuant LAS 4000CCD成像仪(GE Healthcare)进行成像。

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表8-S1.PCR引物序列。

表8-S2.保藏于Addgene的质粒

表8-S3.用于产生多重tRNA-gRNA质粒的DNA和引物序列。通过使用SpeI和HindIII的限制性酶克隆，将pGTR序列克隆到骨架质粒中。然后pGTR质粒被用作扩增用于GoldenGate组装的gRNA-tRNA序列的PCR模板。为了合成包含sg2和sg3两者的多重质粒，PCR扩增子使用以下引物对来产生：tRNA-start_F+sg2_R(扩增子1)；sg2_F+sg3_R(扩增子2)；sg3_F+gRNA-end_R(扩增子3)。然后纯化扩增子1-3，通过Golden Gate组装进行连接，并使用XbaI和HindIII的限制性酶克隆法克隆到包含单个U6启动子的骨架载体中。

参考文献

在说明书中提到的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献表示本公开内容的主题所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用并入本文，其程度如同每个单独出版物、专利申请、专利和其他参考文献被具体和单独指明通过引用并入的相同程度。将理解，虽然一些专利申请、专利和其他参考文献在本文中被提及，但此类参考文献并不构成对任何这些文件形成本领域公知常识的部分的承认。

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虽然为了清楚理解的目的通过说明和实例的方式相当详细地描述了前述主题，但是本领域技术人员将理解，在所附权利要求书的范围内可以进行某些改变和修改。

序列表

<110> 约翰霍普金斯大学

<120> 用于非病毒递送用于基因编辑和视网膜基因治疗的质粒DNA的聚(β-氨基酯)纳米颗粒

<130> JHU-36914-601

<150> US 62/743,883

<151> 2018-10-10

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 合成的

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(12)

<223> n是a、c、g或u

<400> 1

nnnnnnnnnn nnguuuaaga gcuaugcugu uuug 34

<210> 2

<211> 1368

<212> PRT

<213> 酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)

<400> 2

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

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Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

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Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

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260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

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Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

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Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

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Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

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Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

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Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

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Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

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Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

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530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

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645 650 655

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660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

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690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

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740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

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Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala

1010 1015 1020

Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe

1025 1030 1035

Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala

1040 1045 1050

Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu

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Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val

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Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr

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Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys

1100 1105 1110

Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

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Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val

1130 1135 1140

Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys

1145 1150 1155

Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1160 1165 1170

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys

1175 1180 1185

Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu

1190 1195 1200

Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly

1205 1210 1215

Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val

1220 1225 1230

Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys

1250 1255 1260

His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys

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Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala

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Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn

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Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala

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Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

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Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr

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Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

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<223> 合成的

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

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<212> DNA

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<220>

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<220>

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gtatagcata cattatacg 19

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<220>

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<210> 35

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<220>

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<220>

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caatgtataa gcttaaaaaa aaaagcaccg actcg 35

<210> 43

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<220>

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<210> 44

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<220>

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