星形α螺旋阳离子聚多肽用于基因递送和抗炎基因治疗

摘要

急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是临床上一类危重症呼吸系统疾病，位于革兰氏阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是诱导急性肺损伤的主要病因。在被革兰氏阴性菌感染后，炎症因子反应失控会导致急性肺损伤。在由脂多糖诱导的急性肺损伤和各类脓毒症中，巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor，MIF）发挥了重要作用。MIF会促进免疫细胞产生大量促炎性细胞因子、加重ALI。RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术作为一种高效、低毒、特异性强的基因治疗方法，在人类疾病治疗中显示出巨大潜力。利用RNAi技术沉默MIF的表达可用来治疗ALI。然而，要发挥siRNA的沉默功效需要借助高效的基因载体高效递送siRNA至靶细胞内。
　　α螺旋阳离子聚多肽是一类新型、高效的基因递送载体，这类聚多肽具有优良的穿膜性能，它的α螺旋二级结构使其主要通过“打孔”模式穿透生物膜，其中侧基为胍基的聚多肽的穿膜能力比Arg9、HIV-Tat等经典细胞穿膜肽提高了1～2个数量级。由于α螺旋阳离子聚多肽可以在细胞膜和溶酶体/内含体膜上“打孔”，因此可以高效地递送核酸分子进胞并逃避内含体/溶酶体，实现高效的基因转染。但高剂量使用或与细胞长时程接触时，聚多肽会在生物膜上打出过多的孔道，使其遭受不可修复的损伤，造成显著的细胞毒性，因此需要一种可行方法来降低其细胞毒性。本课题组前期研究发现阳离子聚多肽的拓扑结构能够改变聚多肽的基因的压缩能力、穿膜能力和基因转染效率，星形拓扑结构聚多肽既能够增强基因转染又可以降低细胞毒性。
　　结合以上理解，本文从以下两个方面开展研究：
　　（1）我们采用氨基为末端的第三代PAMAM树枝状大分子作为大分子引发剂引发POB-L-Glu-NCA聚合，构建一种具有三维星形结构的α螺旋阳离子聚多肽（DPP）。DPP具有高正电荷密度的聚多肽外层，能很好压缩DNA形成直径100nm左右的复合物。在COS-7细胞中，DPP表现出高效的基因转染，高出转染试剂PEI11倍；DPP的HeLa细胞摄取量较PEI提高2倍；4℃时DPP摄取量为37℃时的50％，表明50%复合物是通过非内吞机制入胞，氯丙嗪处理使摄取量减少30%，说明还有一部分复合物是通过网格蛋白介导的内吞途径入胞；在HeLa和COS-7细胞中，DPP细胞毒性都显著低于PEI。体内转染实验表明DPP在黑色素瘤内具有良好的转染效率，比PEI复合物高31倍。
　　（2）我们利用DPP内部的PAMAM空腔来包载疏水抗炎药物——酮洛芬，同时利用表面聚多肽来包裹巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）siRNA，用于治疗小鼠急性肺损伤。DPP对酮洛芬的包封率达到32.4%同时能够很好地复合siRNA，形成直径200nm左右的纳米粒。在小鼠巨噬细胞中，DPP/siMIF复合物基因沉默效率达到70%且显著优于LPP/siMIF复合物和PEI/siMIF复合物。在小鼠ALI模型，DPP/siMIF复合物基因沉默效率达到62%，肺部炎症介质IL-1β和TNF-α分泌水平分别下降了46%和48%，其中，联合给药组DK/siMIF复合物体现出协同效应，炎症介质IL-1β和TNF-α分泌水平分别下降了70%和75%；DK/siMIF复合物给药组肺部干湿重比率，髓过氧化酶活性分别下降了27%和69%；经过DK/siMIF复合物治疗后，小鼠肺部病理切片观察小鼠肺部炎症细胞减少，坏死充血明显减少，肺泡结构完整。因此，基因治疗联合药物治疗是一种治疗ALI的潜在新型疗法。
　　本文以α螺旋阳离子聚多肽拓扑结构为研究点，利用树枝状大分子PAMAM三维结构特点，通过NCA开环聚合反应，合成三维星形α螺旋阳离子聚多肽（DPP）作为基因和药物载体。DPP解决了聚多肽过高穿膜活性导致细胞毒性过大的问题，拓展了阳离子聚多肽的生物医学应用范围。对小鼠急性肺损伤的治疗中，我们通过DPP共递送MIF siRNA抗炎基因和抗炎药物酮洛芬抑制炎症反应，这为临床探索基因和药物联合治疗急性肺损伤提供了实验依据。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 基因治疗及基因转染

1.2 siRNA肺部给药用于小鼠治疗急性肺损伤

1.3 论文研究思路

参考文献

第二章 星形α螺旋阳离子聚多肽的制备及应用

2.1 引言

2.2 实验原料和方法

2.3 结果与讨论

2.4 本章小结

参考文献

第三章 星形α螺旋阳离子聚多肽共递送巨噬细胞迁移抑制因子siRNA及酮洛芬用于治疗小鼠急性肺损伤

3.1 引言

3.2 实验原料和方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

参考文献

第四章 结论与展望

4.1 结论

4.2 展望

致谢

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