对PD-1具有提高的结合亲和力的PD-L1变体

摘要

本发明涉及对PD‑1具有提高的结合亲和力的PD‑L1变体。本发明还涉及用于制备PD‑L1变体的方法和用于筛选PD‑L1变体的方法。本发明的PD‑L1变体通过用不同的氨基酸序列取代野生型PD‑L1的一部分氨基酸序列来实现最优化，从而极大地提高对PD‑1的结合亲和力，并通过使突变位点减到最少来大大降低免疫原性产生的可能性。

说明书

技术领域

本发明涉及对PD-1具有增强的结合亲和力并因此有效抑制野生型PD-L1和PD-1之间的结合的PD-L1变体，以及制备所述变体的方法。

背景技术

治疗癌症的药物大致分为小分子药物和大分子药物。大分子药物由于其高特异性而作为治疗剂受到关注，而小分子药物由于其缺乏特异性而具有相对大的副作用。

最近在学术文献中的报告表明，阻断免疫检查点抑制蛋白，特别是PD-1和PD-L1之间的结合在癌症治疗中是有效的，并且PD-1和PD-L1比其他免疫检查点抑制蛋白引起的副作用更少(J.Naidoo等人(2015),Annals of Oncology,Lucia Gelao等人(2014)Toxins,Gorge K.Philips等人(2015),International Immunology)。

主要的医药公司，包括Bristol-Myers Squibb，已经努力通过PD-1/PD-L1免疫检查点抑制来开发治疗药物，并且正在开发用于抗癌治疗的药物，例如抗体形式的YERVOY(伊匹单抗)和OPDIVO(纳武单抗)。

因为PD-1和PD-L1不仅在癌细胞中表达，而且还在人免疫细胞中表达，抗体药物可以杀死健康免疫细胞，从而引起自身免疫疾病。

而且，作为大分子蛋白的抗体由于其体积大(150kDa)，所以很难穿透细胞。因此，需要具有突出的细胞穿透能力的治疗剂以抑制肿瘤和肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)之间的PD-1/PD-L1结合。

通过之前研究中的筛选，发现了PD-L1变体。然而，这些变体具有相对低的结合亲和力并且含有许多突变，从而当在治疗药物中使用时引发了免疫原性。因此，需要开发以高亲和力结合PD-1的PD-L1变体。

提供背景技术的描述仅仅是为了更好地理解本发明的背景，而不应被认为对应于本领域技术人员已知的现有技术。

发明详述

本发明要解决的问题

本发明的发明人认真而深入地进行了研究，以发现对PD-1具有高结合亲和力并因此有效抑制野生型PD-L1和PD-1之间结合，同时使免疫原性的可能性最小化的PD-L1变体。结果，本发明发现了用其他最佳氨基酸取代野生型PD-L1序列中的一些氨基酸极大地改善了所得PD-L1变体对PD-1的亲和力，并且尽可能少的突变位点降低了免疫原性的可能性。基于该发现已经完成了本发明。

因此，本发明的一个目标是提供对PD-1具有增强的结合亲和力的PD-L1变体。

本发明的另一个目标是提供编码PD-L1变体的核酸分子。

本发明的另一个目标是提供包含核酸分子的载体。

本发明的另一个目标是提供包含载体的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供包含变体、核酸分子或载体的组合物。

本发明的另一个目的是提供用于制备所述变体的方法。

本发明的又一个目的是提供用于筛选变体的方法。

根据本文的详细描述、权利要求书和附图，本发明的其他目标和优点将变得更加明显。

解决问题的方法

本发明的一个方面提供了对PD-1具有增强的结合亲和力的PD-L1变体。

本发明的发明人认真而深入地进行了研究，以发现对PD-1具有高结合亲和力并因此有效抑制野生型PD-L1和PD-1之间结合，同时使免疫原性的可能性最小化的PD-L1变体。结果，本发明发现了野生型PD-L1序列中的一些氨基酸被其他最佳氨基酸取代极大改善了所得PD-L1变体对PD-1的亲和力，并且尽可能少的突变位点降低了免疫原性的可能性。

如本文所使用的，术语“PD-L1(或程序性死亡配体1)变体”是指包含与野生型PD-L1序列相比，其中一个或多于一个氨基酸被取代、缺失或添加的经突变的变体。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体旨在包含具有与SEQ ID NO:123中所示的野生型PD-L1序列相比，一些氨基酸被取代、缺失或添加的序列的变体。

本发明的PD-L1变体与SEQ ID NO:123中所示的野生型PD-L1的氨基酸序列具有至少50％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％，更优选至少80％和最优选至少90％的同源性。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中的一些氨基酸和所述野生型PD-L1序列中第169位的E169D的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体还包含位于以下位置的一个或多于一个氨基酸取代，所述位置选自SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中的第41、73、117、124、130、139、195、198、201、213和218位。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第195位的R195K、R195A、R195I、R195T、R195V、R195F、R195L、R195R或R195M的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第198位的P198S、P198T或P198H的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第41、117、124和195位的分别为M41V、N117S、L124S或R195A的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第195位的R195K的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第73和195位的分别为Q73R和R195I的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第130和195位的分别为T130A和R195I的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第117和198位的分别为N117S和P198H的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第195和213位的分别为R195I和L213P的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第139、198和201位的分别为A139S、P198T和N201S的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含SEQ ID NO:123所示的野生型PD-L1序列中第218位的N218D的氨基酸取代。

根据本发明优选的实施方案，PD-L1变体包含选自SEQ ID NO:90、94、95、97、100、102、103、104、107、和108至122所示的序列的序列。

本发明的另一方面提供了编码PD-L1变体的核酸分子、包含所述核酸分子的载体或包含所述载体的宿主细胞。

本发明的核酸分子可以是分离的或重组的核酸分子。这样的核酸分子的实例包括单链和双链DNA和RNA及其相应的互补序列。分离的核酸可以是从天然来源分离的。在这种情况下，将分离的核酸与存在于要从中分离核酸的对象的基因组中的周边基因序列分离。分离的核酸可以为由模板酶促或化学合成的核酸，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸。在这种情况下，由该过程产生的核酸可以理解为分离的核酸分子。分离的核酸分子代表分离片段形式或作为较大核酸构建体的部分的核酸分子。当核酸与另一核酸序列以功能关系排列时，核酸是“可操作地连接的”。例如，当作为前蛋白，即前分泌多肽表达时，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接。将影响多肽序列转录的启动子或增强子可操作地连接至编码序列，或将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，当作出这些排列时促进翻译。通常，术语“可操作地连接”是指待连接的DNA序列彼此相邻。对于分泌前导序列，术语“可操作地链接”是指分泌前导序列在同一前导框中彼此相邻存在。但是，增强子不需要是连续的。通过在方便的限制性内切酶位点连接来进行连接。在不存在这样的位点的情况下，根据本领域已知的合适方法使用合成的寡核苷酸衔接体或接头。

如本文所使用的，术语“载体”用于指可以将核酸序列插入其中以引入可以在其中复制的细胞中的运载体。核酸序列可以是“外源的”或“异源的”。载体包括质粒、黏粒和病毒(例如噬菌体)。本领域技术人员可以通过标准的重组技术来构建载体(Maniatis等人,Molecular Cloning,实验室手册,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988；和Ausubel等人,In:Current Protocols in Molecular Biology,John,Wiley&Sons,Inc,NY,1994等)

如本文所使用的，术语“表达载体”是指含有编码至少一部分能够被转录的基因产物的核酸序列的载体。然后在一些情况下，RNA分子被翻译为蛋白质、多肽或肽。表达载体可以含有各种控制序列。除了控制转录和翻译的调控序列外，载体和表达载体还可以含有具有其他功能的核酸序列。

如本文所使用的，术语“宿主细胞”是指能够复制载体或表达由载体编码的基因的任何转基因生物体。合适的生物体包括真核生物和原核生物。宿主细胞可以被载体转染或转化。转染或转化是指用于将外源核酸分子转移或引入宿主细胞的过程。

根据本发明优选的实施方案，宿主细胞是细菌细胞。更优选地，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。该细胞适合用于实施本发明，因为它在内膜和外膜之间具有周质区。优选的宿主细胞的实例包括但不限于大肠杆菌(E.coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、百日咳杆菌(Bordotellapertussi)、梨火疫病菌(Erwinia amylovora)和根瘤菌(Rhizobium sp.)。

大多数目前可商购获得的治疗蛋白是通过动物细胞培养产生的。这些蛋白质在其生产过程中被各种糖变体修饰。得到的聚糖异质性导致治疗蛋白的功效和稳定性发生变化，并且在抗体制备过程中需要高成本的纯化、分析和质量控制(QC)。

当与需要昂贵的动物细胞培养系统的糖基化蛋白比较时，糖基化蛋白质可以在细菌中大规模生产，并且在速度和成本方面是优异的。

本发明的另一个方面提供了野生型程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)之间的结合抑制剂，包含作为活性成分的PD-L1变体、核酸分子或载体。

本发明的另一个方面提供包含作为活性成分的PD-L1变体、核酸分子或载体的组合物。

该组合物优选为药物组合物，更优选为用于预防或治疗癌症或传染病的药物组合物。

本发明的另一个方面提供了用于抑制野生型程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)之间的结合的方法，包括向对象施用药学有效量的PD-L1变体、核酸分子或载体。

本发明的另一个方面提供了用于增强免疫应答的方法，包括向对象施用药学有效量的PD-L1变体、核酸分子或载体。

本发明的另一个方面提供了用于治疗癌症或传染病的方法，包括向对象施用药学有效量的PD-L1变体、核酸分子或载体。

本发明的药物组合物可以包含(a)PD-L1变体、核酸分子或载体，和(b)一种或多于一种药学上可接受的载剂。

通过本发明的药物组合物预防或治疗的癌症的类型不受限制。可施用本发明的药物组合物以治疗各种癌症，包括白血病；淋巴瘤，例如急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤和多发性骨髓瘤；儿童时期的实体瘤，例如脑瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤、骨肿瘤和软组织肉瘤；和成年人的常见实体瘤，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、泌尿癌、子宫癌、口腔癌、胰腺癌、黑素瘤和其他皮肤癌、胃癌、卵巢癌、脑瘤、肝癌、喉癌、甲状腺癌、食道癌和睾丸癌。

通过本发明的药物组合物预防或治疗的传染病的类型不受限制，并且其实例包括由病毒(包括流感病毒)、细菌和真菌引起的感染。

药学上可接受的载剂是通常用于制剂的那些。药学上可接受的载剂的实例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。本发明的药物组合物还可以包含选自润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂的一种或多于一种添加剂。合适的药学上可接受的载剂和制剂的详细信息可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences(第19版，1995年)中找到。

可以向对象口服施用或肠胃外施用本发明的药物组合物，优选肠胃外施用。合适的肠胃外施用途径的实例包括静脉注射、局部注射和腹膜内注射。

如本文所使用的，“对象”是指需要通过抑制PD-1和PD-L1之间的结合来预防或治疗疾病的对象。该术语优选旨在包括人和动物。

如本文所使用的，术语“药学有效量”表示由研究人员、兽医、医生或其他临床医生确定的在组织系统、动物或人中诱导生物或医学响应的活性成分或药物组合物的量。该术语旨在包含诱导所讨论的疾病或障碍的症状缓解的量。对于本领域技术人员明显的是，活性成分的有效量和施用频率将根据所需效果而变化。

根据本发明的药物组合物的合适剂量可以根据因素而变化，所述因素例如剂型、施用方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况和饮食、施用时间、施用途径、排泄速率和响应性。熟练的医生可以容易地确定和开出根据对所需治疗和预防有效的本发明的药物组合物的剂量。根据优选的实施方案，本发明的药物组合物以0.0001mg/kg至100mg/kg的日剂量施用。

根据本领域技术人员可以容易地执行的方法，本发明的药物组合物可以利用一种或多于一种药学上可接受的载剂和/或赋形剂配制。该药物组合物可以以单位剂型提供或在多剂量包装物中分配。制剂可以是溶液剂、混悬剂或在油或水介质中的乳状液的形式，或可以是提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂的形式。该制剂还可以包括分散剂或稳定剂。

本发明的药物组合物还可以单独使用或与一种或多于一种其他常规生物疗法、化学疗法和/或放射疗法组合使用。该组合疗法在治疗癌症或传染病上更有效。一种或多于一种化学治疗剂可以与本发明的组合物组合使用。化学治疗剂的实例包括顺铂、卡铂、甲基苄肼、氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、亚硝基脲、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和氨甲蝶呤。放射疗法可以与本发明的组合物组合使用。例如，放射疗法可以是X射线辐照或γ射线辐照。

本发明的另一方面提供了用于制备PD-L1变体的方法，其包括a)培养包含载体的宿主细胞，所述载体包含编码PD-L1变体的核酸分子，和b)回收由宿主细胞表达的PD-L1变体。

本发明的另一方面提供了用于筛选PD-L1变体的方法，其包括a)将点突变随机引入PD-L1变体或编码PD-L1变体的核酸分子中，并构建经点突变的PD-L1变体或编码经突变的PD-L1变体的核酸分子的文库，和b)从所述文库中选择抑制野生型程序性死亡配体1(PD-L1)和程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)之间的结合的PD-L1变体。

本发明的筛选方法可以使用荧光激活细胞分选(FACS)或自动流式细胞术。流式细胞术的仪器对本领域技术人员来说是已知的，并且所述仪器的实例包括FACSAria、FACSStar Plus、FACScan和FACSort(加利福尼亚州福斯特城的Becton Dickinson)、Epics C(佛罗里达州海厄利亚的Coulter Epics分部)，MOFLO(科罗拉多州科罗拉多斯普林斯的Cytomation)和MOFLO-XDP(印第安纳州印第安纳波利斯的Beckman Coulter)。通常，流式细胞术涉及液体样品中细胞或其他颗粒的分离。流式细胞术的典型目的是分析分离的颗粒的一种或多于一种性质(例如标记配体或其他分子的存在)。颗粒一个接一个地通过传感器，并根据大小、折射、光散射、不透明度、照度、形状、荧光等进行分类。

本发明的效果

本发明的特征和优点总结如下：

(i)本发明提供了对PD-1具有增强的结合亲和力的PD-L1变体。

(ii)本发明还提供了用于制备PD-L1变体的方法和用于筛选PD-L1变体的方法。

(iii)本发明的PD-L1变体通过用其他最佳氨基酸取代野生型PD-L1序列中的一些氨基酸来制备，从而实现对PD-1的亲和力的极大改善。另外，可以通过突变位点的最小可能数量来降低免疫原性的可能性。

附图说明

图1显示了使用抗FLAG-FITC的在大肠杆菌中PD-L1的表达谱。

图2显示了二聚体PD-1的制备和荧光标记以及二聚体PD-1的活性测试结果。

图3显示了大肠杆菌内膜展示和探针浓度选择的结果。

图4显示了初始文库DNA测序的结果。

图5显示了显示高水平结合PD-1的PD-L1变体的富集的直方图。

图6显示了用于结合PD-1的PD-L1变体的分析结果。

图7显示了用于结合PD-1的结合热点残基中含有定点突变的PD-L1变体的分析结果。

图8显示了用于结合PD-1的包含位于第169、195和198位的三重突变的PD-L1变体的分析结果。

具体实施方式

将参考以下实施例更详细地解释本发明。对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不受根据本发明的主旨的这些实施例的限制。

实施例

实施例1：用于细菌内膜展示的人PD-L1的克隆(野生型PD-L1)

对于使用细菌展示的PD-L1工程改造，克隆了人PD-L1胞外域(SEQ ID NO:123)。首先，人PD-L1基因cDNA购自Sino Biotech(目录号:HG10084-M)，并且使用用于基因扩增的引物(JY#1，JY#2)利用Vent聚合酶(New England Biolab)对对应于PD-L1胞外域的DNA(氨基酸序列F19-R238)进行PCR。用限制酶SfiI消化扩增的基因，然后与用SfiI消化的载体(pMopac12-NlpA-FLAG)连接，以构建质粒(pMopac12-NlpA-PDL1_WT-FLAG)。信号肽NlpA允许PD-L1蛋白在固定在内细胞膜上时分泌到大肠杆菌的周质区。将连接的质粒转化到大肠杆菌Jude1((F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)Φ80lacZΔM15ΔlacX74 recA1 endA1araD139Δ(ara,leu)7697galU galKλ-rpsL nupG)。通过测序分析单个菌落。

实施例2：用于糖基化的PD-1工程改造的克隆的四聚体人PD-L1(PD-L1-链霉抗生物素蛋白)的克隆

将克隆质粒pMopac12-NlpA-PDL1-FLAG、在大肠杆菌中很好地表达的pMopac12-NlpA-Fc-FLAG(阳性对照)和没有FLAG标签的pMopac12-NlpA-PDL1(阴性对照)中的每一种转化到Jude1细胞。在37℃和250rpm下，将每个样品在添加了40μg/ml氯霉素的4ml TB 2％葡萄糖培养基中培养16h。然后，将经培养的细胞以1:100的比例接种到添加了40μg/ml氯霉素的7ml的TB培养基中。在37℃和250rpm下培养直到OD

实施例3：用于工程改造PD-L1的二聚体人PD-1(PD-1-GST)的克隆

克隆PD-1并将其用作针对工程改造PD-L1筛选的荧光探针。为了基于通过PD-1二聚化的亲和力作用的更有效筛选，PD-1的C端区域的GST表达以诱导二聚化。对于每种蛋白的流动性，将由Gly和Ser组成的接头插入PD-1和GST之间。首先，PD-1基因cDNA购自SinoBiotech(目录号：HG10377-M)，并且使用用于基因扩增的引物(CKJ#1，CKJ#2)利用Vent聚合酶对对应于PD-L1胞外域的DNA(氨基酸序列L25-Q167)进行PCR。还使用用于基因扩增的引物(CKJ#3，CKJ#4)利用Vent聚合酶对GST进行PCR。利用Vent聚合酶对扩增的PD-1和GST DNA进行组装PCR(assembly PCR)以制备PD-1-GST。用限制酶BssHII和XbaI(New EnglandBiolab)消化PD-1-GST，然后与用相同的限制酶消化的哺乳动物细胞表达的载体(pMAZ)连接。将连接的质粒转化到大肠杆菌Jude1。通过测序分析单个菌落。

实施例4：二聚体PD-1-GST在哺乳动物细胞中的表达和荧光标记的二聚体PD-1-GST的制备

将二聚体PD-1表达载体转染至哺乳动物细胞(HEK293F)，然后培养6天。将细胞培养物以6000×g离心15分钟。取上清液并通过0.22μm的过滤器进行过滤。将滤液与1mL Ni-NTA树脂(Qiagen)混合并在4℃下使其与树脂结合保持16h。使结合的溶液流入柱中，用含有10mM咪唑(SIGMA)的10CV(柱体积)PBS溶液洗涤，并用含有20mM咪唑的10CV的PBS溶液再次洗涤。最后，用含有250mM咪唑的PBS溶液回收洗出液。用Alexa-488标记试剂盒对纯化的PD-1引物进行荧光标记。通过ELISA分析荧光标记的二聚体PD-1的活性。结果，证实了二聚体PD-1具有针对PD-L1的高结合亲和力(图2)

实施例5：用于大肠杆菌内膜展示的PD-L1的克隆

对于有效筛选，必须确定大肠杆菌内细胞膜的锚定基序。所以，将锚定蛋白质的N端区域的NlpA系统(pMopac12-NlpA-PDL1_WT-FLAG)与锚定蛋白质的C端区域的geneIII系统(pAK200-PelB-PDL1_WT-geneIII)进行比较。只进一步克隆了pAK200-PelB-PDL1_WT-geneIII，这是因为已经构建了质粒pMopac12-NlpA-PDL1_WT-FLAG。首先，使用用于基因扩增的引物(JY#3，JY#2)利用Vent聚合酶对对应于PD-L1胞外域的DNA(氨基酸序列F19-R238)进行PCR。用限制酶SfiI消化扩增的基因，然后与用SfiI消化的载体(pAK200-PelB-geneIII)连接，以完成质粒(pAK200-PelB-PDL1_WT-geneIII)。信号肽PelB允许蛋白质分泌到大肠杆菌的周质区，并使PD-L1的C端被固定在内细胞膜上的geneIII蛋白锚定。将连接的质粒转化到大肠杆菌Jude1。通过测序分析单个菌落。

实施例6：通过流式细胞术验证大肠杆菌内膜中表达的PD-L1与探针PD-1-GST之间的结合亲和力，来进行展示和探针浓度选择

将完整的pMopac12-NlpA-PDL1-FLAG和pAK200-PelB-PDL1-geneIII质粒分别转化到Jude1细胞中。在37℃和250rpm下，将每个样品在添加了40μg/ml氯霉素的4ml TB2％葡萄糖培养基中培养16h。然后，将经培养的细胞以1:100的比例接种到添加了40μg/ml氯霉素的7ml TB培养基中。在37℃和250rpm下培养直到OD

实施例7：用于高通量筛选的PD-L1易错PCR文库的构建

对于对PD-1具有高结合亲和力的PD-L1变体的高通量筛选，基于pAK200-PelB-PDL1-geneIII设计了包括SfiI位点的引物(JY#4，JY#5)，使得将突变随机引入PD-L1的所有位点。使用设计的引物Taq聚合酶(TAKARA)、dNTP(Invitrogen)、MgCl

实施例8：使用流体细胞术进行PD-L1变体的筛选

将1ml的初始文库接种到添加了40μg/ml氯霉素的25ml TB 2％葡萄糖培养基，并在37℃和250rpm下培养4h。将在添加了40μg/ml氯霉素的100ml TB2％葡萄糖培养基中培养的大肠杆菌以1:100的比例接种到TB葡萄糖培养基。在37℃和250rpm下培养直到OD

实施例9：培养大肠杆菌以测定对PD-1具有提高的结合亲和力的PD-L1变体的富集

将1ml初始、第1轮、第2轮、第3轮、第4轮、第5轮和第6轮文库分别接种到添加了40μg/ml氯霉素的25ml TB 2％葡萄糖培养基中，并在37℃和250rpm下培养4h。然后，将培养的大肠杆菌以1∶100的比例接种到添加了40μg/ml氯霉素的100mL TB培养基中。在37℃和250rpm下培养直到OD

实施例10：通过流式细胞术测定对PD-1具有增加的结合亲和力的PD-L1变体的富集

将1ml的10mM Tris-HCl(pH 8.0)添加到含有收集到的细胞的e-管中，以使细胞悬浮并进行离心(14000rpm，1分钟)以收集细胞。将这样的悬浮-离心过程重复两次以去除残余培养基。洗涤细胞，将细胞重悬于1ml的STE溶液[0.5M蔗糖，10mM Tris-HCl，10mM EDTA(pH8.0)]中，并在37℃下旋转30分钟以除去外细胞膜。通过离心(14000rpm，1分钟)再次收集细胞并去除上清液。在重悬于1ml溶液A[0.5M蔗糖，20mM MgCl

实施例11：用于与分离的PD-L1变体进行比较的对照PD-L1(PD-L1_L3B3)的克隆

使用14种引物(JY#7、JY#8、JY#9、JY#10、JY#11、JY#12、JY#13、JY#14、JY#15、JY#16、JY#17、JY#18、JY#19、JY#20)通过装配PCR制备对照变体(PD-L1_L3B3)。用限制酶SfiI消化扩增的基因，然后与用SfiI消化的载体(pAK200-PelB-geneIII)连接，以构建质粒(pAK200-PelB-PDL1_L3B3-geneIII)。将连接的质粒转化到大肠杆菌Jude1。通过测序分析单个菌落。

实施例12：用流式细胞术分离对PD-1具有增加的结合亲和力的PD-L1变体

在37℃和250rpm下，将6轮的单个菌落、野生型PDL1和对照PDL1_L3B3中的每一个在添加了40μg/ml氯霉素的4ml TB 2％葡萄糖培养基中培养16h。然后，将经培养的细胞以1:100的比例接种到添加了40μg/ml氯霉素的7ml TB培养基中。在37℃和250rpm下培养直到OD

实施例13：结合热点残基中含有突变的变体的克隆

分离的变体的测序显示有可能发现被认为对增加结合亲和力具有很大的影响的氨基酸位置和针对该位置的共有氨基酸性质。基于该发现，通过用被认为是结合热点的氨基酸进行取代，总共制备了16种变体并进行克隆。使用简并密码子引物(JY#21、JY#22、JY#23、JY#24、JY#25、JY#26、JY#27、JY#28、JY#29、JY#30)进行组装PCR。用限制酶SfiI消化扩增的基因，然后与用SfiI消化的载体(pAK200-PelB-geneIII)连接，以构建质粒(pAK200-PelB-PDL1_L3B3-geneIII)。将连接的质粒转化到大肠杆菌Jude1。通过测序分析单个菌落。对于未鉴别的变体，使用另外的引物(JY#31、JY#32、JY#33、JY#34、JY#35、JY#36、JY#37、JY#38、JY#39、JY#40、JY#41、JY#42)进行QuikChange PCR。

实施例14：结合热点残基中含有突变的变体的克隆

在37℃和250rpm下，将野生型PD-L1、变体JY-73和JY-74以及16种另外的变体中的每一种在添加了40μg/ml氯霉素的4ml TB 2％葡萄糖培养基中培养16h。然后，将经培养的细胞以1:100的比例接种到添加了40μg/ml氯霉素的7ml TB培养基中。在37℃和250rpm下培养直到OD

[表1]

实验中使用的引物

[表2]

实验中发现的PD-L1变体和经取代的氨基酸的位置

由于已经在上面详细描述了本发明的特定部分，显然这些特定技术方案仅是优选实施例，并且本领域技术人员不将本发明的范围限制于此。因此，可以说，本发明的实际保护范围由所附的权利要求书及其等同物限定。

(支持本发明的韩国国家R&D项目)

(授权号码)1711072940

(部门名称)韩国科学与信息通信技术部

(研究管理专业组织)韩国国家研究基金会

(研究项目名称)生物医学技术开发(R&D)

(研究标题)长效血清持久的基于Fc的下一代抗内皮素GPCR抗体的鉴别

(贡献率)1/1

(组织)国民大学产产学合作基金会

(研究期)2018年3月30日至2019年1月29日