浓度梯度与细菌检测一体化的微流控芯片及其设计方法

摘要

本发明公开了一种浓度梯度与细菌检测一体化的微流控芯片及其设计方法。其包括浓度梯度分级模块和菌液输送检测模块。所述的浓度梯度分级模块包括依次排列n级混合流道组，n为自然数。混合流道内均设置有多块挡板。各挡板沿着混合流道的长度方向在混合流道两侧壁上交替排列。本发明将传统圣诞树结构浓度梯度芯片的蛇形流道修改为带有交错设置的挡板的直线型流道，可在流道宽度和高度不变的情况下减小流道所占用的面积，并降低加工难度，从而减小微流控芯片的尺寸，并降低加工成本。此外，本发明将浓度梯度药物生成和细菌检测于一体化，可以更加方便快捷的研究多浓度药物对细菌的影响。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学抗菌药物技术领域，具体涉及一种内嵌挡板式树状浓度梯度及细菌检测一体化的微流控芯片。

背景技术

当今社会由于抗生素的普及，人们使用抗生素药物也越来越多，与此同时也产生了许多耐药菌，也就是常说的“超级细菌”，而抗菌药物的滥用正是这种耐药菌产生的主要因素。而这些耐药菌的出现导致了控制疾病的难度不断上升，迫使我们去寻找新的药物。所以合理的使用抗生素尤为重要，而对于抗生素的用法用量就是其中一个关键问题。这就需要精准的使用抗生素浓度梯度对细菌进行试验，从而找到合适的用量。但在目前尚不存在长时间检测药物且能够微量控制抑制剂浓度梯度并与细菌检测一体化的仪器。

微流控制芯片(Microdroplet chip)，又被称为微型生化反应实验室，被广泛应用于生物、化学等领域中。传统的细菌检测方法不仅操作繁琐、试剂药品用量较大，而且耗时长，而用微流控芯片技术则可以在微观的角度进行药物的配比和对细菌的测量，既可以减少药物的用量来降低成本，也可以更加快速的得到结果。在细菌的测量时，经常需要药物的不同浓度梯度，目前已经有很多种基于微流控芯片的浓度梯度生成器，如Y/T形结构浓度梯度生成器、“圣诞树”结构的浓度梯度生成器、级联型浓度梯度生成器等等。“圣诞树”结构的浓度梯度生成器是最为经典的结构之一，因为其结构设计简单、梯度生成快速、梯度稳定等优点被广泛应用。

由于细菌的检测一般会在细菌生长曲线中的对数期，此时的细菌生长速度快，为保证在测得细菌浓度后能更快速稳定的加入梯度浓度的药物，需要更加快速稳定地生成梯度浓度的药物。目前大多数“圣诞树”结构的浓度梯度微流控芯片中为了使药物充分混合，一般是通过蛇形管道来促进药物的混合，并且为了更好的混合，有设计将蛇形管道的弯折处改为圆弧形，有的增加为多层的蛇形管道，这就大大增加了模型的复杂度和梯度的生成时间。当生成较多浓度梯度的时候，即所需层数越多时尤为明显。再者由于弯折流道相较于混合流道来说占用面积更大，所以需要的微流控芯片结构更大，成本也就越高。同时曲折流道相较于混合流道的长度更长，而由于药物的粘性会在壁面上残留药物，更长的流道就会导致有更多药物的残留。因此就需要减小流道的长度并改善流道的混合结构。

发明内容

本发明的目的在于提供一种内嵌挡板式树状浓度梯度及细菌检测一体化的微流控芯片及其设计方法。

本发明浓度梯度与细菌检测一体化的微流控芯片，包括浓度梯度分级模块和菌液输送检测模块。所述的浓度梯度分级模块包括依次排列n级混合流道组，n为自然数。各混合流道均为直型流道。混合流道内均设置有多块挡板。各挡板沿着混合流道的长度方向在混合流道两侧壁上交替排列。所述的菌液输送检测模块包括细菌培养室和菌液输入管道。细菌培养室共有n+2个。n+2个细菌培养室的菌液输入口均与菌液输入管道连通，药物输入口与浓度梯度分级模块上对应的出液口连通。细菌培养室包括腔室主体和检测电极组。检测电极组设置在腔室主体上；且检测电极组与腔室主体的内腔接触。

作为优选，所述的腔室主体设置有相互靠近且互不连通的三条电极安置槽。检测电极组包括叉指三电极。检测电极组贴附在电极安置槽上，或嵌入到电极安置槽中。所述的细菌培养室还包括盖板。盖板固定覆盖在腔室主体开设有腔室主体的侧面上。盖板上设置有三个焊盘；三个焊盘与叉指三电极分别电连接。三个焊盘上均设置有金属插针。

作为优选，所述挡板的长度为混合流道宽度的30％～70％。所述挡板的截面呈矩形或梯形。

作为优选，一条混合流道中的挡板数量为4块。

作为优选，所述挡板的长度为混合流道的宽度的50％。所述挡板的宽度为混合流道宽度的30％～70％。

作为优选，所述挡板截面为等腰梯形；该等腰梯形的上底边长度等于混合流道的宽度的50％，下底边长度等于混合流道的宽度。挡板的下底与混合流道的侧壁接触。

作为优选，第一级混合流道组设置有三条混合流道；后续每一级混合流道组较前一级混合流道均增加一条混合流道。各混合流道组内的混合流道的输入端均通过连接流道连通。任意两条相邻的混合流道之间的连接流道处均设置有该级混合流道组的输入口。使得故第i级混合流道组具有i+1个输入口和i+2个输出口；i＝1,2,...,n。前一级混合流道组内的各输出口与后一级混合流道组的各输入口分别连接；第一级混合流道组的两个输入口作为微流控芯片的两个进液口；最后一级混合流道组的n+2个输出口作为微流控芯片的六个出液口。

作为优选，混合流道组的任意一个输入口均位于该输入口对应的两条混合流道的正中位置。

该浓度梯度与细菌检测一体化的微流控芯片的使用方法如下：

步骤一、通过菌液输入管道向各细菌培养室输送菌液。

步骤二、将各细菌培养室与菌液输入管道连通处均封闭。

步骤三、向浓度梯度分级模块的两个进液口分别输入细菌抑制剂、稀释溶剂。细菌抑制剂和稀释溶剂依次通过n级混合流道组，从浓度梯度分级模块的n+2个出液口分别输出浓度为浓度均匀变化的n+2种梯度细菌抑制剂。n+2种梯度细菌抑制剂分别输入到n+2个细菌培养室中。

步骤四、将浓度梯度分级模块的两个进液口封闭。之后，使得腔室主体与检测电极组接触。检测电极组输出信号到电化学检测仪器，从而获取各细菌培养室中菌液的生长增殖情况。

该浓度梯度与细菌检测一体化的微流控芯片的设计方法，具体步骤如下：

步骤一、设定目标溶液输入的流速v和微流控芯片内的各混合流道长度、宽度、间距以及混合流道中挡板的数量初始值、单块挡板的宽度、长度初始值。

步骤二、对模型进行仿真。

2-1.计算输入的目标溶液的雷诺数

其中，ρ为目标溶液的初始密度；η为目标溶液的初始粘度；a为挡板的宽度；b为挡板的长度。

2-2.在仿真软件中进行微流控芯片的建模。

步骤三、参数优化。

3-1.浓度误差显示：对步骤二中建立的微流控芯片模型进行仿真，在两个进液口分别通入目标溶液和稀释溶剂，并提取n+2个出液口的浓度值。

3-2.误差校正：分别计算出n+2个出液口输出的溶液浓度与对应的期望值之间的百分误差，若百分误差小于或等于误差阈值，则进入步骤3-3；若任意一个出液口输出的溶液浓度的百分误差大于误差阈值，则增大挡板长度或增加挡板的个数。并重新执行步骤二和步骤3-1。所有出液口2输出的溶液浓度的百分误差均小于或等于误差阈值，则以挡板的长度和个数作为最终的参数。

作为优选，步骤三中还计算混样时间，过程如下：根据仿真软件生成的动画得到药物完全混合所需要的动画帧数，再将动画帧数乘以时间步长，得到混样时间。

作为优选，步骤三中，根据仿真得到的浓度云图中各出液后的颜色及不同时间的颜色变化情况来确实是否完全混合。

作为优选，步骤3-3中的误差阈值为5％。

本发明具有的有益效果是：

1、本发明将传统圣诞树结构浓度梯度芯片的蛇形流道修改为带有交错设置的挡板的直线型流道，可在流道宽度和高度不变的情况下减小流道所占用的面积，并降低加工难度，从而减小微流控芯片的尺寸，并降低加工成本。

2、本发明将浓度梯度药物生成和不同浓度药物要对细菌的抑制试验结合为一体，可以更加方便快捷的研究多浓度药物对细菌的影响。

3、本发明在简化微流控芯片结构的情况下，保持了与现有蛇形流道微流控芯片相近的浓度误差，能够将各浓度梯度的溶液误差控制在行业通用阈值(数值为5％)之内。此外，由于本发明中没有曲折的管道，溶液与流道之间的接触面总面积将会减小，则可以减少药物在流道上的残留。

4、由于药物流过的路径减小，本发明可以减少药物梯度生成的时间，使得混样时间控制在480s左右，相比于现有蛇形流道微流控芯片的混样时间缩短了约50％，使后续在得到菌液浓度值后能够快速的进药，使得测得菌液浓度值时和进药时菌液浓度变化不会太大。

附图说明

图1为本发明的整体结构示意图；

图2为验证微流控芯片仿真准确性的实验中实际值与仿真结果对应关系箱型图；

图3为本发明的一条混合流道在仿真中输入端与输出端的灰度值变化数据图(灰度值对应浓度)；

图4为本发明仿真结果的浓度云图；

图5为本发明仿真结果的浓度值散点图；

图6为本发明中细菌培养室的爆炸示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

如图1所示，一种浓度梯度与细菌检测一体化的微流控芯片，包括浓度梯度分级模块和菌液输送检测模块。所述的浓度梯度分级模块采用“圣诞树”结构，包括依次排列n级混合流道组；本实施例中n＝4。第一级混合流道组设置有三条混合流道4；后续每一级混合流道组较前一级混合流道4均增加一条混合流道4。各混合流道4均为直型流道。各混合流道组内的混合流道4的输入端均通过连接流道3连通。任意两条相邻的混合流道4之间的连接流道3部分的正中位置均设置有该级混合流道组的输入口。故第i级混合流道组具有i+1个输入口和i+2个输出口。

第一级混合流道组的两个输入口作为浓度梯度分级模块的两个进液口1，分别定义为目标溶液进液口和稀释溶剂进液口。前一级混合流道组内的各输出口与后一级混合流道组的各输入口分别连接；最后一级混合流道组的六个输出口作为浓度梯度分级模块的六个出液口2，分别输出等分梯度的不同浓度的溶液。混合流道4的两侧边缘均设置有多块挡板5，挡板5数量优选4个。挡板5的截面呈矩形。混合流道4两侧的各挡板5沿着混合流道4的长度方向依次交替排列。挡板5的长度大于或等于混合流道4的宽度的一半，使得液体经过各挡板5时需要不断的调整流动方向。

混合流道4的宽度为1mm；挡板5的宽度为0.3～0.7mm，优选0.7mm。挡板5的长度为0.3～0.7mm，优选0.5mm；挡板5的长度表示挡板5伸入混合流道4内的尺寸。相邻两条混合流道4的间距为10mm；混合流道4的长度为10mm，宽度为1mm，高度为1mm。该微流控芯片整体的长度为70mm，宽度为65mm。整个微流控芯片左右对称。

如图6所示，菌液输送检测模块包括细菌培养室7和菌液输入管道8。菌液输入管道8成L形，输入口靠近浓度梯度分级模块的两个进液口2。细菌培养室7共有六个。六个细菌培养室7分别靠近浓度梯度分级模块的六个出液口2。六个细菌培养室7的菌液输入口7-1与菌液输入管道8连通，药物输入口7-2与浓度梯度分级模块上对应的出液口2连通。

细菌培养室7包括腔室主体7-3、检测电极组7-4和盖板7-5。腔室主体7-3呈方形，腔室主体7-3的外侧壁上设置有相互靠近且互不连通的三条电极安置槽。检测电极组7-4包括叉指三电极，分别为参比电极、工作电极和辅助电极。检测电极组7-4贴附在电极安置槽上，或嵌入到电极安置槽中。当细菌培养室7倒置时，菌液与检测电极组7-4接触，检测电极组7-4能够通过阻抗值的变化来检测出菌液的生长情况。细菌培养室7的菌液输入口7-1、药物输入口7-2分别位于腔室主体7-3顶部的两端。盖板7-5固定覆盖在腔室主体7-3开设有腔室主体7-3的侧面上。盖板7-5上设置有三个焊盘；三个焊盘与叉指三电极分别电连接。三个焊盘上均设置有金属插针，用于将叉指三电极的信号引出到电化学检测仪器。

该浓度梯度与细菌检测一体化的微流控芯片的使用方法如下：

步骤一、通过菌液输入管道8向六个细菌培养室7输送菌液。

步骤二、将六个细菌培养室7与菌液输入管道8连通处均封闭。

步骤三、向浓度梯度分级模块的两个进液口2分别输入细菌抑制剂、蒸馏水。细菌抑制剂和蒸馏水依次通过四级混合流道组，从浓度梯度分级模块的六个出液口2分别输出浓度为0、0.2Q、0.4Q、0.6Q、0.8Q、Q的六梯度细菌抑制剂。Q为步骤二中输入进液口2的初始细菌抑制剂的浓度。

步骤四、当各细菌培养室7内的菌液均达到自身容积的2/3时，将浓度梯度分级模块的两个进液口2封闭。之后，将微流控芯片倒置，使得各细菌培养室7内菌液与叉指三电极接触。叉指三电极向电化学检测仪器输送阻抗信号；电化学检测仪器持续分析各细菌培养室7中菌液的生长增殖情况，从而一次性对被测的细菌抑制剂在不同浓度的培养性能进行测试。

实施例2

本实施例与实施例1区别在于：挡板5的截面呈梯形，具体为上底0.5mm，下底1mm的等腰梯形。挡板5的下底与混合流道4的侧边接触。梯形挡板5的高(对应实施例1中挡板5的宽度)大于或等于混合流道4的宽度的一半，使得液体经过各挡板5时需要不断的调整流动方向。梯形挡板5的高度为0.3～0.7mm，优选0.5mm；挡板5的高度表示挡板5伸入混合流道4内的尺寸。

本实施例中呈等腰梯形的挡板5的两侧斜边能够引导液体的流向平滑的转变，避免流体在挡板5处产生旋流而导致液体无法顺利地向下传递或液体输出速率不稳定的情况发生，从而确保浓度梯度微流控芯片能够稳定、持续地输出不同浓度的溶液。

在以上两个实施例中，本发明均在“圣诞树”结构的浓度梯度微流控芯片基础上进行简化，改变了传统每层级间通过蛇形弯折流道进行混合药物的方式，采用无弯折的混合流道4，并在混合流道4的两边壁面上交错设置矩形或梯形的挡板5对流过的药物溶液进行折流，来促使药物的混合。由于每层没有曲折的管道，可在管道宽度和高度不变的情况下减小管道所占用的面积从而减小微流控芯片的尺寸来降低成本，同时因为接触面总面积的减小也可减少药物在流道上的残留。

“圣诞树”结构的浓度梯度微流控芯片通过两种不同浓度的进液反复的分流后再汇合，经过一层层的溶液分流再混合后生成精确且非连续的浓度梯度。由于数据是通过ansys fluent仿真软件获取，为验证仿真数据与实际数据的误差，这里采用经典圣诞树结构的微流芯片做实物实验，并通过fluent软件仿真其参数，再将实际参数与仿真参数作对比得到误差。

以下结合具体试验说明本发明的技术效果。

首先，验证fluent软件对梯度浓度微流控芯片仿真与实验的近似程度；这里采用四级、六个梯度的现有树形结构的浓度梯度微流控芯片进行验证。首先，称量0.01g甲基紫粉末融于100ml乙醇溶液中，并将其作为目标溶液，乙醇作为稀释溶剂，利用微泵将两种液体以相同的速度分别注入微流控芯片的目标溶液进液口、稀释溶剂进液口。当形成稳定的浓度梯度后，对六个出液口输出的溶液进行拍照，对拍摄的照片进行图像处理，得到各个出液口的灰度值。可通过出口处颜色的深浅来代表药物的浓度。通过将出液口颜色的深浅转为灰度值，然后使用灰度值的线性度来验证生成的浓度梯度。由于第一个出液口未经过混合全为目标溶液，第六个出液口未经过混合全为稀释溶剂，故浓度分别为1和0，然后观察第二个到第五个出液口的灰度值来验证浓度梯度，中间四个出液口的实验所得溶液的颜色与fluent仿真所得颜色的对应关系箱型图如图2所示，可以看出实验结果与fluent仿真结果值具有明显的线性度，可以从fluent中的仿真结果来说明实际中的情况。

由于可以利用灰度值来代表药物的浓度，则可以利用灰度值随时间的变化来代表药物的混合情况。现有树形结构的浓度梯度微流控芯片的一条混合流道作为对象，取该混合流道的输入端作为A点，输出端作为B点，做出A、B两点随着时间变化的灰度值曲线如图3所示。根据图3可知，30s时A点灰度值出现明显变化后趋于稳定时说明混合开始，140s时B点由稳定开始出现明显变化说明药物快到达出口并开始混合，190s时B点渐渐趋于稳定后说明药物混合完成，则A点稳定后与B点稳定后时间的差值就代表着药物经过并混合该混合流道4所需要的时间，可知混合所用了Δt＝160s。fluent进行求解计算，设置时间步长为2s、每时间步长迭代200次，共迭代200次进行计算。可以看出第64帧到148帧分别实际值的30s到190s，即仿真时间为168s。

流体的流动状态可由无量纲数雷诺系数(Re)判断液体的流动状态为层流还是湍流。

式中，v表示流速，单位为m/s；ρ表示密度，单位为kg/m

r

将式带入式得

当Re<2300时，流体为层流状态；当Re＝2300～4000时，流体为过渡状态；当Re>4000时，流体为湍流状态。由公式得，微流控芯片流道高度为400μm，宽度最小处为200μm，液体密度为10

树形结构的浓度梯度微流控芯片是基于对流传质的原理来对药物进行混合。传质的基本方式主要分为分子扩散和湍流扩散，分子扩散发生在静止流体或垂直于浓度梯度方向上作层流运动的流体中的传质，故在微流控芯片中这种微观层面中主要是这种分子扩散的方式。液体的扩散系数不但与液体种类、温度有关，同时也会随着浓度的变化而变化，由威尔基提出的公式：

式中，M

再由描述分子扩散过程中的传质通量与浓度梯度之间关系的菲克定律：

式中，C是扩散物质的体积分数，单位kg/m

首先确定流道内挡板5的形状，在同样的流速、挡板5个数和相似大小的情况下对出液口2的误差进行测试。可以看出混合流道4为无挡板5的混合流道4时无法得到浓度梯度，当挡板5为梯形挡板5或者挡板5时可以得到允许误差范围内的浓度梯度，考虑到制造工艺的条件，挡板5更易制作。

表格1不同挡板5形状时出液口2浓度的百分误差

在确定好使用挡板5后，再在相同流速，挡板5的长度和宽度一致的条件下，设置不同个数的挡板5，可以看出挡板5数量为3、4、5时都可以满足误差条件，在考虑数量最少的条件下，而且挡板5数量为3时两个出液口2在允许误差临界值，所以选取挡板5的最优数目为4。

表格2不同挡板5个数时出液口2浓度的百分误差

确定好挡板5个数后再对其挡板5的大小参数进行进一步的选取，在4个挡板5下，在相同流速下，改变挡板5的长度与宽度(混合流道4的宽度为1mm)。在挡板5长度为0.3mm时药物未充分混合，在0.5mm和0.7mm时浓度梯度在允许误差范围内。而宽度的影响相差不大。考虑制造精度的难易选取长度为0.5mm，宽度为0.7mm。

表格3不同挡板5长度时出液口2浓度的百分误差

表格4不同挡板5宽度时出液口2浓度的百分误差

在fluent进行求解计算，设置时间步长为30s，每时间步长迭代200次，共迭代45次进行计算。

实际时间＝时间步长×迭代次数

以酒精和水作为仿真材料，进液口流速为0.7mm/s的条件下，本发明所得仿真云图如图4所示，图4中颜色越浅表示浓度越低。可以看出从左往右的各出液口浓度依次降低，各出液口的具体浓度值如图5所示，可以看出各出液口的浓度分布十分均匀，能够满足设计要求。

此外，经过计算，在相同的芯片尺寸下和相同的条件下，本发明梯度生成需要动画时长16帧(即迭代次数为16次)，则时间为480s，经典圣诞树模型梯度的生成需要动画时长32帧(即迭代次数为32次)，则时间为960s，本发明所用时间是经典圣诞树模型所用时间的50％。

实施例3

一种内嵌挡板5式树状浓度梯度微流控芯片的设计方法，具体为设计和确定浓度梯度分级模块的具体参数，其具体步骤如下：

步骤一、模型的建立，确定微流控芯片的设计参数。

1-1.设定液体流速v和起始芯片整体尺寸，根据芯片整体的长度L，设定混合流道4的长度则为L/4。模型的整体长度越小混合流道4的长度越小，要求进液口1的流速也就要越小，能否达到预期要求见步骤三。

1-2.根据模型的整体宽度等间距设置混合流道4间距，保持微流控芯片左右对称。

1-3.设计挡板5的长度d

1-4.设计挡板5的宽度，挡板5的宽度对药物混合的影响较小，使其也等于d/2。

1-5.设定挡板5的个数4，并将各挡板5在混合流道4的左右两侧交错放置，根据步骤三中混合效果在对挡板5的个数进行调整，具体见步骤三。

步骤二、对模型进行仿真。

2-1.确定目标溶液的密度、粘度参数带入公式如下。

其中，Re为目标溶液的起始浓度；v为液体为层流时的速度范围，该值是设置仿真速度的依据；ρ为目标溶液的初始密度；η为目标溶液的初始粘度；a为挡板5的宽度；b为挡板5的长度。

2-2.根据步骤一中设计参数，在fluent软件中进行二维建模。

2-3.定义模型的两个进液口1和六个出液口2，同时对模型进行网格的划分，网格划分尺寸为200μm。

2-4.在通用设置中开启瞬态计算，且不考虑重力因素。

2-5.对材料进行设置：选择材料为液体，并根据目标溶液和稀释容积的密度、粘度属性对输入两个进液口1的液体进行参数的设置。

2-6.模型的选择：选择动态计算，模型选择为多相流模型和层流模型，且多相流模型为欧拉模型。将液体主项设置为稀释容积的液体材料，次项为目标溶液的液体材料。

2-7.边界条件的设置：根据步骤一设定的液体流速v对速度进行设置，两个进液口1的速度保持一致，目标溶液进液口的次相为1，稀释溶剂进液口的次相为0。

2-8.初始条件的设置：使用标准初始化，初始速度都为0。

2-9.求解过程的监视：根据精度需要对所需残差值设置为10

2-10.动画设置：先进行初始化，初始化后添加云图动画，设置动画的帧数为每迭代一次做一次保存，并将其储存到一个文件夹中。

2-11.求解计算：设置时间步长为30s，每时间步长迭代45次，每时间步长迭代200次，进行计算。

步骤三、后处理评价分析

3-1.混样过程分析：对步骤二中建立的微流控芯片模型进行仿真，在两个进液口1分别通入目标溶液和稀释溶剂，通过流线图可以看出液体在通过混样流道时的混样情况，并结合浓度云图中rgb的显色观测液体的混样过程与是否混样完成。若目标溶液流出混合流道4处的流线图的rgb颜色不一致，则代表未能完全混样，则回到步骤一调整挡板5长度使d

3-2.浓度误差显示：提取n+2个出液口2的浓度值。

3-3.误差校正：分别计算出n+2个出液口2输出的溶液浓度与对应的期望值之间的百分误差，若百分误差小于或等于误差阈值，则进入步骤3-4；若任意一个出液口2输出的溶液浓度的百分误差大于误差阈值，则增大挡板5长度或增加挡板5的个数。并重新执行步骤二和步骤3-1和3-2。

3-4.混样时间计算：通过动画的显示可以得到药物完全混合所需要的动画帧数，而动画帧数的所对应的实际时间就等于时间步长乘以迭代次数。

根据步骤一到步骤三循环对模型的调参，选取能满足出液口2浓度误差和混合流道4内能完全混合的最低挡板5尺寸。若出液口2浓度值比目标值偏大，可以在层流的条件下增大进液口1流速使出液口2浓度减小，更加接近目标值，反之同理。