手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法

摘要

本发明公开了手工克隆程序中供‑受体细胞粘合方式的改进方法，先用植物凝集素(PHA)把去核半卵和供体细胞粘合，形成半卵‑供体细胞配对体；然后再用另一个去核半卵与配对体粘合，形成卵‑供体‑卵式的粘合体(形成三角状)，移入电融合液中待融合，以卵‑供体‑卵的粘合方式进行融合，其融合效率显著高于以卵‑卵‑供体的粘合方式的融合率。

说明书

【技术领域】

本发明涉及克隆技术领域，具体涉及手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法。

【背景技术】

动物克隆是指动物不经过有性生殖的方式而直接获得与亲本具有相同遗传性状后代的过程，包括孤雌生殖、卵裂球分离与培养、胚胎分割以及细胞核移植等。目前，广为人知的动物克隆技术实际上就是指细胞核移植技术。传统的细胞核移植技术通常是指通过显微操作的方法，将供体细胞的细胞核注入预先去核的成熟卵母细胞或早期合子内，形成一个新的重构胚，重构胚经过融合激活后发生发育程序重编，经细胞分裂、分化并在代孕母体内发育成一个新的个体，包括卵母细胞去核、注供体细胞、融合供体细胞并激活、体外培养、胚胎移植等一系列操作的复杂过程，每一个操作步骤都会影响到核移植的最终效率。自1997年"Dolly"羊出生以来，研究者就不断对核移植过程中的每个技术环节进行改进。

手工克隆(handmade cloning，HMC)技术改进去核操作步骤，在体视显微镜下用特制的切割刀直接切割去核，然后将两个不含有细胞核的半卵与一个供体细胞靠近并施以直流电脉冲使其融合，最后将重构胚单个培养。整个过程不需要显微操作仪，Vajta等(Vajtaet al，2001)将其称之为手工克隆。杜玉涛(2011)研究表明与传统的体细胞核移植相比，手工克隆技术能大幅度提高体细胞核移植的囊胚率。

手工克隆基本程序包括：卵母细胞的成熟培养；胎儿成纤维细胞的培养；卵母细胞的手工去核；供-受体细胞的粘合/融合/激活；重构胚的微穴培养。将卵母细胞质中的核去除掉，这个过程称之为去核。卵母细胞的去核是体细胞核移植技术的关键技术环节，在去除尽量少胞质的情况下同时保证去核干净。若胞质去除过多，会使卵母细胞内累积的蛋白质，mRNA流失过多，影响供体细胞的重编程。若去核不完全会导致重构胚染色体非整倍性，造成多倍体，卵裂异常，发育受阻，胚胎早期死亡等，去核效率的高低直接关系到所构建克隆胚胎体外发育和受体移植妊娠率及产犊率的高低。

传统细胞核移植技术的去核方法有盲吸去核法，染色去核法和spindle-view法，但是每种方法都存在一定的缺点，人们一直在寻求更好的方法。比如(刘东，2004)的挤压去核法，用玻璃针在极体附近透明带刺穿一个切口，推挤卵母细胞，使第一极体连同其附近的1/4-1/3胞质溢出透明带。(郭继彤，2002)用蔗糖高渗溶液对牛卵母细胞进行短时培养，大部分卵母细胞的纺锤体部位突出于卵膜表面，指示去核操作。这些都是在尝试对卵母细胞的去核操作方法进行改进。后来发展起来的手工克隆技术(Vajta 2007)直接用刀切除一半卵，以达到去核干净的目的。

盲吸去核法是根据成熟卵母细胞的特点，去除极体附近的约1/3胞质，达到去核目的，操作简洁迅速，但是去核过程中会使卵母细胞第一极体的位置发生改变，影响去核效果，去核效率相对较低，一般在70％。染色法去核利用DNA特异性染料Hoechest33342将整个卵母细胞染色后，借助荧光显微镜显示染色体去核的方法，可以去除少量胞质和保证100％去干净，但是紫外线的照射会损伤胚胎活力(Tsunda，1988)。

后来发展的spindle-view法，是利用偏振光折射直接获取纺锤体镜像，不需要染色就能观察到卵母细胞内的纺锤体，去核率可以达到95％以上，但是价格昂贵，不利于推广应用。手工去核直接用刀切，相对去除的胞质更多，然后再将2枚半卵融合弥补去除胞质过多的损失。

传统核移植程序中的供-受体细胞融合，是把供体胞质通过显微操作仪注入去核的卵母细胞中，随后通过电激活/化学激活的方式把供-受体细胞融合。

【发明内容】

现有技术的手工克隆程序中，卵母细胞是去除透明带的，要把供体细胞融合进去只能先把供-受体细胞粘合在一起，再通过电激活/化学激活的方式把供-受体细胞融合，本发明提供了手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，采用了植物凝集素(PHA)这种新型试剂，提高了供-受体细胞的融合效率。

本发明所述的手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，包括如下步骤：

1)将去核干净的卵母细胞和供体细胞粘合：

①供体细胞用胰酶消化后，待其变圆立即终止，之后每次消化50-60个供体细胞，待其变圆后置于培养皿中，培养皿内液体为含有0.3-0.5mg/mL的植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液，让其稀疏散开排列，等待粘合；

②把去核干净的卵母细胞，每次转移20-40个到步骤①的培养皿中，用尖头玻璃管拨动去核干净的卵母细胞与步骤①得到的供体细胞粘合，形成半卵-供体细胞配对体；

2)把另一个去核干净的卵母细胞与供-受体细胞配对体粘合：

③将另一个去核干净的卵母细胞，沿着步骤②得到的半卵-供体细胞配对体的缝隙，用尖头玻璃管拨动，与半卵-供体细胞配对体粘合，形成一个供体细胞位于中间，去核卵母细胞位于两侧的平面三角形状的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体(简称：卵-供体-卵)；

④把步骤③得到的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体移入卵母细胞培养液中，每次粘合15-25个卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体，再移入电融合液中待融合，使得供体细胞和受体细胞完全融为一体，便于后续的核质重编程程序的启动。

本发明中：

步骤1)所述的供体细胞，为猪胎儿成纤维细胞。

步骤1)所述的用胰酶消化，胰酶浓度为0.25％，消化时间为3-5min。

步骤1)所述的培养皿，选自60mm培养皿。

步骤1)和步骤2)所述的卵母细胞培养液，包含80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/LNaHCO

步骤1)所述的卵母细胞培养液，含有0.4mg/mL的植物凝集素(PHA)。

步骤2)所述的半卵-供体细胞配对体的缝隙，是指去核卵母细胞与供体细胞粘合处。

步骤2)所述的移入电融合液中待融合，是将粘合后的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体移到融合槽中进行融合-电激活，施加交流电场(1-3V/mm的交流电脉冲)，让卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体自动靠向电极，其中一极的去核卵胞质紧贴电极一端，另一极的卵胞质悬空于融合槽，体细胞夹于两个去核卵母细胞中间，使得卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体与电极磁场垂直，电融合参数AC：6V/cm；DC：1.2kV/cm，30μs，2DC，电激活后的重构胚移入胚胎培养液中洗3遍后，在38.5℃的培养箱中恢复30min，然后检查其融合情况。

和现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、猪卵母细胞去核后的胞质能否成功与供体细胞相融合是这是影响克隆效率的关键步骤，在手工克隆过程中，由于切割去核损失了一部分胞质，故与供体细胞融合的过程中，需要再取一个去核的卵母细胞与供体细胞融合，以提高核移植重编程的效率。本发明所述的手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，是一种提高供-受体细胞融合效率的粘合方式，通过比较实验，本发明的手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，卵-供体-卵的粘合方式进行融合其融合，效率高达88.03％±0.58，而以卵-供体-卵的粘合方式进行融合，效率为79.95％±0.82。前者的融合效率显著高于后者。

2、去核后半卵胞质与供体的粘合方式对供-受体的融合起关键作用，本发明所述的手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，采用现有技术的的卵-卵-供体式的粘合方法，简便利于操作，但相对比较耗时且融合效率低；采用本发明方法的卵-供体-卵式的粘合方法，耗时少，融合效率高，相比粘合成一个配对体的时间而言，卵-供体-卵式的粘合方法只需23s，而卵-卵-供体式的粘合方法则需要30s。本发明所述的手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法中，卵-供体-卵式的融合率显著高于对比例1的卵-卵-供体式88.03％vs 79.95％，故本发明手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，卵-供体-卵式的粘合方式是可行的，值得推广应用。

【附图说明】

图1是本发明实施例1的卵-供体-卵的粘合方式的图。

图2是本发明实施例1中用到的尖头玻璃管(头部呈钝圆形状)的图。

图3是本发明对比例1的卵-卵-供体的粘合方式的图。

【具体实施方式】

以下结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步说明。

实施例1：

手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，包括如下步骤：

1)将去核干净的卵母细胞和供体细胞(猪胎儿成纤维细胞)粘合：

①把供体细胞用胰酶消化，胰酶浓度为0.25％，消化4min，待其变圆后立刻终止，之后每次消化60个供体细胞，待其变圆后置于60mm培养皿中(以下以培养皿代替)，培养皿内液体为含有0.4mg/mL的植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液，让其稀疏散开排列，等待粘合；

②把去核干净的卵母细胞，每次转移30个到步骤①的培养皿中，用尖头玻璃管拨动去核干净的卵母细胞与步骤①得到的供体细胞粘合，形成半卵-供体细胞配对体；

2)把另一个去核干净的卵母细胞与供-受体细胞配对体粘合：

③将另一个去核干净的卵母细胞，沿着步骤②得到的半卵-供体细胞配对体的缝隙(去核卵母细胞与供体细胞粘合处)，用尖头玻璃管拨动，与半卵-供体细胞配对体粘合，形成一个供体细胞位于中间，去核卵母细胞位于两侧的平面三角形状的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体(简称：卵-供体-卵)；

④把步骤③得到的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体移入卵母细胞培养液中，每次粘合15-25个卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体，再移入电融合液中待融合，使得供体细胞和受体细胞完全融为一体，便于后续的核质重编程程序的启动；

步骤1)和步骤2)所述的卵母细胞培养液，包含80％体积的TCM199、10％体积的猪卵泡液、10％体积的胎牛血清、0.1g/L半胱氨酸、0.075g/L青霉素、0.05g/L链霉素、10ng/mL胰岛素样生长因子、50ng/mL表皮生长因子、2.2g/LNaHCO

步骤2)所述的再移入电融合液中待融合，是将粘合后的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体移到融合槽中进行融合-电激活，施加交流电场(1-3V/mm的交流电脉冲)，让卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体自动靠向电极，其中一极的去核卵胞质紧贴电极一端，另一极的卵母细胞悬空于融合槽，体细胞夹于两个去核卵母细胞中间，使得卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体与电极磁场垂直，电融合参数AC：6V/cm；DC：1.2kV/cm，30μs，2DC，电激活后的重构胚移入胚胎培养液中洗3遍后，在38.5℃的培养箱中恢复30min，然后检查其融合情况。

实施例2：

手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，包括如下步骤：

1)将去核干净的卵母细胞和供体细胞(猪胎儿成纤维细胞)粘合：

①把供体细胞用胰酶消化，胰酶浓度为0.25％，消化3min，待其变圆后立刻终止，之后每次消化50个供体细胞，待其变圆后置于60mm培养皿中(以下以培养皿代替)，培养皿内液体为含有0.3mg/mL的植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液，让其稀疏散开排列，等待粘合；

②把去核干净的卵母细胞，每次转移25个到步骤①的培养皿中，用尖头玻璃管拨动去核干净的卵母细胞与步骤①得到的供体细胞粘合，形成半卵-供体细胞配对体；

2)把另一个去核干净的卵母细胞与供-受体细胞配对体粘合：

③将另一个去核干净的卵母细胞，沿着步骤②得到的半卵-供体细胞配对体的缝隙(去核卵母细胞与供体细胞粘合处)，用尖头玻璃管拨动，与半卵-供体细胞配对体粘合，形成一个供体细胞位于中间，去核卵母细胞位于两侧的平面三角形状的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体(简称：卵-供体-卵)；

④把步骤③得到的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体移入卵母细胞培养液中，每次粘合15-25个卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体，再移入电融合液中待融合，使得供体细胞和受体细胞完全融为一体，便于后续的核质重编程程序的启动；

步骤1)和步骤2)所述的卵母细胞培养液同实施例1；

步骤2)所述的再移入电融合液中待融合同实施例1。

实施例3：

手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，包括如下步骤：

1)将去核干净的卵母细胞和供体细胞(猪胎儿成纤维细胞)粘合：

①把供体细胞用胰酶消化，胰酶浓度为0.25％，消化5min，待其变圆后立刻终止，之后每次消化50个供体细胞，待其变圆后置于60mm培养皿中(以下以培养皿代替)，培养皿内液体为含有0.5mg/mL的植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液，让其稀疏散开排列，等待粘合；

②把去核干净的卵母细胞，每次转移25个到步骤①的培养皿中，用尖头玻璃管拨动去核干净的卵母细胞与步骤①得到的供体细胞粘合，形成半卵-供体细胞配对体；

2)把另一个去核干净的卵母细胞与供-受体细胞配对体粘合：

③将另一个去核干净的卵母细胞，沿着步骤②得到的半卵-供体细胞配对体的缝隙(去核卵母细胞与供体细胞粘合处)，用尖头玻璃管拨动，与半卵-供体细胞配对体粘合，形成一个供体细胞位于中间，去核卵母细胞位于两侧的平面三角形状的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体(简称：卵-供体-卵)；

④把步骤③得到的卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体移入卵母细胞培养液中，每次粘合15-25个卵母细胞-体细胞-卵母细胞配对体，再移入电融合液中待融合，使得供体细胞和受体细胞完全融为一体，便于后续的核质重编程程序的启动；

步骤1)和步骤2)所述的卵母细胞培养液同实施例1；

步骤2)所述的再移入电融合液中待融合同实施例1。

对比例1：

和实施例1相比，步骤1)的培养皿内液体为没有加入植物凝集素(PHA)(即0mg/mL植物凝集素PHA)的卵母细胞培养液，和实施例1相比，步骤2)将去核干净的卵母细胞放入操作液滴中静置，然后移放到含有供体细胞的操作液滴中，先把一枚卵母细胞与一枚供体细胞粘合，然后再与另一枚卵母细胞粘合在一起，其排列顺序为卵母细胞一卵母细胞一体细胞(简称：卵-卵-供体)，其他同实施例1。

对比例2：

和实施例1相比，步骤1)的培养皿内液体为0.4mg/mL植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液。和实施例1相比，步骤2)将去核干净的卵母细胞放入操作液滴中静置，然后移放到含有供体细胞的操作液滴中，先用0.4mg/mL植物凝集素PHA把一枚卵母细胞与一枚供体细胞粘合，然后再与另一枚卵母细胞粘合在一起，其排列顺序为卵母细胞一卵母细胞一体细胞(简称：卵-卵-供体)，其他同实施例1。

对比例3：

和实施例1相比，步骤1)的培养皿内液体为含有0.2mg/mL的植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液，其他同实施例1。

对比例4：

和实施例1相比，步骤1)的培养皿内液体为含有0.6mg/mL的植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液，其他同实施例1。

实验结果：

比较实施例和对比例两种粘合方式的对供-受体细胞融合效率的影响：

表1不同粘合方法对融合效率的影响

表2不同粘合方法的效率

结果分析：

1、本发明实施例1-3的手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法和对比例1相比，实施例1-3采用卵-供体-卵的粘合方式，对比例1采用卵-卵-供体的粘合方式，实施例1-3加入植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液，以卵-供体-卵的粘合方式进行融合，其融合效率高达88.03％±0.58，显著高于对比例1的融合率0，说明在供-受体细胞粘合过程中PHA是必不可少的。

2、采用本发明实施例1-3的手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法和对比例1-2相比，实施例1-3采用卵-供体-卵的粘合方式，对比例1-2采用卵-卵-供体的粘合方式，供-受体细胞的粘合方式对去核卵胞质及供体核的融合起关键作用。本发明所述的手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，采用对比例1-2的卵-卵-供体式的粘合方法，简便利于操作，但相对比较耗时且融合效率低；采用实施例1-3的卵-供体-卵式的粘合方法，耗时少，融合效率高，相比粘合成一个配对体的时间而言，卵-供体-卵式的粘合方法只需23s，而卵-卵-供体式的粘合方法则需要30s。

3、本发明实施例1-3的手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法和对比例3-4相比，含有不同浓度植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液，会影响到卵-供体-卵的粘合方式的融合率，实施例1-3的融合效率高达86.24-88.03％，显著高于对比例3-4其他浓度的植物凝集素(PHA)的卵母细胞培养液的融合率81.77-82.69％。原因是适宜浓度的PHA(0.4mg/mL)把供体细胞牢固地夹在两个去核胞质的中间，增加了供体细胞与胞质及胞质与胞质之间细胞膜的黏附能力，这样使整个细胞串的结构变得更稳定，由于它们紧密的接触也使融合率提高。然而在供-受体的粘合过程中，没有添加PHA的组中(对比例1)，其融合效率为0，说明PHA在供-受体的粘合过程是必不可少的，而且其添加的最佳浓度为0.4mg/mL。

结果表明：

实施例1的卵-供体-卵式的融合率显著高于对比例1的卵-卵-供体式88.03％vs79.95％，故本发明手工克隆程序中供-受体细胞粘合方式的改进方法，卵-供体-卵式的粘合方式是可行的，值得推广应用。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。