一种评价榨菜小孢子发育时期与花器相关性的方法

摘要

本发明公开了一种评价榨菜小孢子发育时期与花器相关性的方法，具体包括以下步骤，对榨菜花蕾外部形态特征进行分析，计算纵横比，同时观察记录颜色；利用DNA染液对花粉染色，并在紫外灯激发的显微镜下拍照观察；对花药进行包埋处理，获得包埋好的样品；对包埋好的样品进行半薄切片，获得半薄树脂切片，然后在普通光学显微镜下观察拍照；对第一树脂切片继续进行切片，获得超薄树脂切片。本发明中，对榨菜小孢子发育时期进行划分，获得不同发育时期的细胞学特征，并对榨菜小孢子发育时期与花器形态进行分析和研究，获得花蕾大小、花蕾形态和花药形态与小孢子发育时期的对应关系，进而简便的实现根据花器形态判断榨菜小孢子的发育时期。

说明书

技术领域

本发明涉及榨菜小孢子与花器形态研究技术领域，特别涉及一种评价榨菜小孢子发育时期与花器相关性的方法。

背景技术

榨菜，十字花科植物体常被单毛、分叉毛、星状毛或腺毛。花两性，通常成总状花序；萼片4，分离，两轮；花瓣4，具爪，排成十字形花冠，少数无花瓣(如独行菜，无瓣蔊菜)；雄蕊6枚，2轮，外轮2枚较短，内轮4枚较长，称四强雄蕊；心皮2，合生、子房1室，具侧膜胎座，中央具假隔膜，分成2室，每室通常具多枚胚珠。果为角果，长宽近相等的称短角果，长为宽数倍的称长角果。

腌制榨菜的是优良茎用芥菜，也称为鲜菜头，鲜菜头也可做小菜，配肉炒或做汤，但更多用于腌制。它质地脆嫩，风味鲜美，营养丰富，具有一种特殊的风味，具有特殊酸味和咸鲜味，脆嫩爽口，含丰富的人体所必需的蛋白质、胡萝卜素、膳食纤维、矿物质等，以及谷氨酸、天门冬氨酸、丙迄酸等17种游离氨基酸。榨菜可以用于佐餐、炒菜和做汤，在食品领域得到广泛的应用。

单倍体培养能够大幅度缩短育种周期，加快育种进程，游离小孢子培养技术是单倍体培养最常用的一种方式，其中小孢子培养的取材，也就是选择适宜的发育时期的小孢子，是决定能否成功诱导小孢子形成胚的关键因素。前人在青花菜、小白菜等其它植物上研究表明，小孢子发育时期与花器形态密切相关，但不同作物之间其形态指标等差异显著。而现有缺少榨菜小孢子发育时期与花器形态相关性的研究，无法根据花器形态便捷的判断小孢子发育时期，给榨菜游离小孢子培养的具体实施带来难度。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明可以解决现有榨菜培育缺少小孢子发育时期与花器形态的研究，无法根据花蕾大小、花药颜色和花器形态直观的判断小孢子发育时期，难以快速、便捷地找到适宜时期的小孢子，榨菜游离小孢子培养技术在实际取材中耗时耗力较大的难题。

(二)技术方案

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案，一种评价榨菜小孢子发育时期与花器相关性的方法，具体包括以下步骤：

S1：对各种榨菜花蕾外部形态特征进行分析，计算纵横比，同时观察记录颜色，对榨菜小孢子发育时期进行划分；

S2：利用DNA染液对各发育时期的榨菜花粉染色，并在紫外灯激发的显微镜下拍照观察；

S3：对榨菜花药进行包埋处理，获得包埋好的样品；

S4：对包埋好的样品进行半薄切片，获得半薄树脂切片，然后在普通光学显微镜下观察拍照；

S5：对第一树脂切片继续进行切片，获得超薄树脂切片，然后对花粉形态进行超薄透射电镜观察拍照，获得不同发育时期的细胞学特征；

S6：对榨菜小孢子发育时期与S1-S5中获得的花器形态数据进行分析，获得花蕾大小、花蕾形态和花药形态与小孢子发育时期的对应关系。

作为本发明的一种优选技术方案，所述S1中，对榨菜花蕾外部形态特征进行分析的具体步骤为：

S101：取大小不同的新鲜花蕾，观察其外部形态特征及颜色，再用游标卡尺测量花蕾纵茎和横茎的长度，计算花蕾纵横比，并记录数据；

S102：将花萼去除，剥开花瓣，取出花药，用游标卡尺在解剖镜下测量花药纵径和横茎，计算花药纵横比，同时观察记录花药颜色，并记录数据；

S103：对S101和S102获得数据分别用EXCEL表进行记录和分析；

S104：对榨菜小孢子发育时期进行划分。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤102中，花萼去除的方式为，在解剖镜用镊子和解剖针去除花萼，每朵花瓣取出的花药数量相同，且数量范围为3-5个。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤S2中，染色和观察的具体步骤为：

S201：在载玻片上滴一滴DNA染液，取大小不同的新鲜花蕾，挤出花粉，使花粉散落在染色液中；

S202：盖上盖玻片，赶走气泡，室温黑暗放置25min-35min；

S203：在紫外灯激发的显微镜下观察拍照。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤S201中，DNA染液设置为浓度为0.8μg/L-1.2μg/L的DAPI染液。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤S3中，包埋处理的具体步骤为：

S301：按花蕾大小对榨菜雄蕊进行分级取样，并将样本置于浓度2.3％-2.8％的戊二醛溶液中并抽真空处理，至样品完全沉于试管底部，控制温度在3.8℃-4.2℃下固定过夜；

S302：去除固定液，用浓度0.1摩尔pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样本3-5次，每次清洗时间为15min-18min；

S303：采用浓度1％-1.1％的锇酸固定清洗后的样本1h-2h，然后重复步骤S302：

S304：用浓度为50％、70％、80％、90％、95％的乙醇溶液依次对样品进行梯度脱水处理，每次持续15min-18min；

S305：用浓度100％的乙醇处理20min-22min；

S306：用纯丙酮处理20min-25min；

S307：用体积比v/v＝1/1的包埋剂和丙酮的混合液处理样品1h-1.2h；

S308：用体积比v/v＝3/1的包埋剂和丙酮的混合液处理样品3h-3.2h；

S309：将样品换入新的离心管中，用纯包埋剂处理过夜。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤307至所述步骤S309中，包埋剂为环氧树脂。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤S4中，半薄切片和观察拍照的具体步骤为：

S401：将包埋好的样品用半薄切片机切片，获得厚度为100nm的半薄树脂切片；

S402：在载玻片上滴一滴蒸馏水，将半薄树脂切片放入水滴中，于85℃下在展片机上展片；

S403：将展片后的半薄树脂切片切片用1％亚甲基兰染色后，在普通光学显微镜下观察拍照。

作为本发明的一种优选技术方案，所述步骤S5中，超薄切片和观察拍照的具体步骤为：

S501：将半薄树脂切片中包埋好的花粉样品在超薄切片机中切片，获得厚度为50nm的超薄树脂切片；

S502：用铜镍载网捞片，用醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液和柠檬酸铅溶液各染色15min；

S503：干燥后于透射电镜下观察拍照。

(三)有益效果

1.本发明提供的榨菜小孢子发育时期与花器形态相关性的研究方法，通过榨菜花蕾外部形态特征进行分析，简便的获得花蕾和花药的纵横比，以及花蕾和花药的颜色，为后续的研究提供基础数据；

2.本发明提供的榨菜小孢子发育时期与花器形态相关性的研究方法，利用DNA染液对花粉染色，进而便于后续的观察，且能够获得不同发育期的花粉染色图片；

3.本发明提供的榨菜小孢子发育时期与花器形态相关性的研究方法，其花药进行包埋处理，获得包埋好的样品，便于后续进行切片处理；

4.本发明提供的榨菜小孢子发育时期与花器形态相关性的研究方法，对包埋好的样品进行半薄切片，获得半薄树脂切片，然后在普通光学显微镜下观察拍照，获得不同发育时期的花药半薄切片的图片；

5.本发明提供的榨菜小孢子发育时期与花器形态相关性的研究方法，对第一树脂切片继续进行切片，获得超薄树脂切片，然后对花粉形态进行超薄透射电镜观察拍照，获得不同发育期的花药超薄切片的图片。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明的流程示意框图；

图2是本发明的对榨菜花蕾外部形态特征进行分析的流程示意框图；

图3是本发明的染色和观察的流程示意框图；

图4是本发明的包埋处理的流程示意框图；

图5是本发明的半薄切片和观察拍照的流程示意框图；

图6是本发明的具体测量时不同长度的花蕾示意图；

图7是本发明的不同发育时期的花药半薄切片示意图；

图8是本发明的不同发育时期的花粉超薄切片示意图。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步定义和解释。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“上”、“下”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的设备或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

实施例1

如图1至图5所示，一种评价榨菜小孢子发育时期与花器相关性的方法，具体包括以下步骤：

S1：对各种榨菜花蕾外部形态特征进行分析，计算纵横比，同时观察记录颜色，对榨菜小孢子发育时期进行划分，分成母细胞时期、四分体时期、单核时期、双核时期和三核时期；

S2：利用DNA染液对各发育时期的榨菜花粉染色，并在紫外灯激发的显微镜下拍照观察；

S3：对榨菜花药进行包埋处理，获得包埋好的样品；

S4：对包埋好的样品进行半薄切片，获得半薄树脂切片，然后在普通光学显微镜下观察拍照；

S5：对第一树脂切片继续进行切片，获得超薄树脂切片，然后对花粉形态进行超薄透射电镜观察拍照，获得不同发育时期的细胞学特征；

S6：对榨菜小孢子发育时期与S1-S5中获得的花器形态数据进行分析，获得花蕾大小、花蕾形态和花药形态与小孢子发育时期的对应关系。

具体地，所述S1中，对榨菜花蕾外部形态特征进行分析的具体步骤为：

S101：取大小不同的新鲜花蕾，观察其外部形态特征及颜色，再用游标卡尺测量花蕾纵茎和横茎的长度，计算花蕾纵横比，并记录数据；

S102：将花萼去除，剥开花瓣，取出花药，用游标卡尺在解剖镜下测量花药纵径和横茎，计算花药纵横比，同时观察记录花药颜色，并记录数据；

S103：对S101和S102获得数据分别用EXCEL表进行记录和分析；

S104：对榨菜小孢子发育时期进行划分，将榨菜小孢子发育分为。

具体地，所述步骤102中，花萼去除的方式为，在解剖镜用镊子和解剖针去除花萼，每朵花瓣取出的花药数量相同，且数量范围为3-5个。

具体地，所述步骤S2中，染色和观察的具体步骤为：

S201：在载玻片上滴一滴DNA染液，取大小不同的新鲜花蕾，挤出花粉，使花粉散落在染色液中；

S202：盖上盖玻片，赶走气泡，室温黑暗放置25min-35min；

S203：在紫外灯激发的显微镜下观察拍照。

具体地，所述步骤S201中，DNA染液设置为浓度为0.8μg/L-1.2μg/L的DAPI染液。

具体地，所述步骤S3中，包埋处理的具体步骤为：

S301：按花蕾大小对榨菜雄蕊进行分级取样，并将样本置于浓度2.3％-2.8％的戊二醛溶液中并抽真空处理，至样品完全沉于试管底部，控制温度在3.8℃-4.2℃下固定过夜；

S302：去除固定液，用浓度0.1摩尔pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样本3-5次，每次清洗时间为15min-18min；

S303：采用浓度1％-1.1％的锇酸固定清洗后的样本1h-2h，然后重复步骤S302：

S304：用浓度为50％、70％、80％、90％、95％的乙醇溶液依次对样品进行梯度脱水处理，每次持续15min-18min；

S305：用浓度100％的乙醇处理20min-22min；

S306：用纯丙酮处理20min-25min；

S307：用体积比v/v＝1/1的包埋剂和丙酮的混合液处理样品1h-1.2h；

S308：用体积比v/v＝3/1的包埋剂和丙酮的混合液处理样品3h-3.2h；

S309：将样品换入新的离心管中，用纯包埋剂处理过夜。

具体地，所述步骤307至所述步骤S309中，包埋剂为环氧树脂。

具体地，所述步骤S4中，半薄切片和观察拍照的具体步骤为：

S401：将包埋好的样品用半薄切片机切片，获得厚度为100nm的半薄树脂切片；

S402：在载玻片上滴一滴蒸馏水，将半薄树脂切片放入水滴中，于85℃下在展片机上展片；

S403：将展片后的半薄树脂切片切片用1％亚甲基兰染色后，在普通光学显微镜下观察拍照。

具体地，所述步骤S5中，超薄切片和观察拍照的具体步骤为：

S501：将半薄树脂切片中包埋好的花粉样品在超薄切片机中切片，获得厚度为50nm的超薄树脂切片；

S502：用铜镍载网捞片，用醋酸双氧铀50％乙醇饱和溶液和柠檬酸铅溶液各染色15min；

S503：干燥后于透射电镜下观察拍照。

综上所述，本发明中，简便的实现对榨菜小孢子发育时期与花器形态进行分析和研究，获得榨菜花蕾大小与小孢子发育时期的对应关系，进而方便根据榨菜花蕾大小等花器形态判断小孢子发育时期，便于选择适宜发育时期的小孢子进行榨菜游离小孢子培养，缩短育种周期，加快育种进程。

请参阅图6-8，且经过上述步骤获得如下数据：

表1小孢子发育时期的花器官外部形态特征

通过表1中的数据，可以有效的确定小孢子在五个发育时期，花蕾形态、花瓣颜色和花药颜色的基础数据。

表2小孢子发育时期的花器官外部形态指标

通过表2中的数据，可以有效的确定小孢子在五个发育时期，花蕾纵经、花蕾横经、花蕾纵横比、花药长、花药宽和花药长宽比，的具体数据，便于后续的分析。

表3小孢子发育时期的细胞学形态特征

通过表3中的数据，可以有效的确定小孢子在五个发育时期中的细胞学特性。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。