用于高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的铁代谢相关蛋白质标记物组合物及其应用

摘要

本发明提供了一种用于高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的铁代谢相关蛋白质标记物组合物及其应用。具体地，本发明提供了一种由血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链组成的生物标记物组合物及其试剂盒，其应用于对待检测对象进行高度近视风险预测以及高度近视的辅助诊断。另外地，本发明还提供了筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物的标记物组合物或方法。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及对高度近视进行风险预测以及高度近视的辅助诊断的标记物组合物及其应用。另外地，本发明还涉及筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物的标记物组合物或方法。

背景技术

近视作为一种全球高发性疾病近年来受到国内外越来越多的关注。同时，近视也是目前影响我国青少年人群视觉健康的主要原因，也是我国正在面临的重大公共卫生问题，据2018年教育部统计，我国青少年儿童总体近视率为53.6％，远高于世界其他国家和地区，其中初中生、高中生群体近视率更是高达71.6％、81.0％；全国15个省份近视率高于全国平均水平，24个省份近视率超过50％。预计到2050年，全球近视人口将达到近50亿，同时高度近视也将影响到近10亿人的生活，且高度近视是引起我国眼盲和低视力的主要原因之一，将给患者及其家庭带来严重的经济负担。

高度近视的发生涉及多因素复杂过程，发病机制仍不清楚，当下的各种光学矫正手段以及手术治疗方法，如屈光手术和巩膜加固手术，不能从根本上阻止及延缓高度近视眼底病变的发展，可以说目前缺乏行之有效的高度近视的治疗措施。由此可见，寻找更有效的方法对高度近视患者和高危人群进行早期检测、风险预测和早期干预具有重要的临床意义。

疾病的分子标记物可以作为疾病早期检测和风险预测的指标，或者作为疾病诊断后的疾病分级、严重程度、进展或疾病减轻的指标。蛋白质组学从整体水平上研究细胞内蛋白质的表达情况，通过比较正常和疾病状态下蛋白表达的差异，揭示参与病理过程的蛋白网络，发现网络中的关键因素，在研究疾病的病理机制、确定有效预防和早期干预方面具有独特的优势。

国际上已有研究表明近视的发生发展与细胞代谢及增殖密切相关，高度近视人眼组织与低度近视人眼组织相比有显著的代谢差异，这种代谢机制已被作为一种近视发生和发展的新学说而被国际热议。目前对高度近视患者的蛋白质组学研究主要集中在考察高度近视患者眼前房水、玻璃体和血液中蛋白质组改变的情况(参见例如，邵珺等，“转甲状腺素蛋白作为高度近视血清潜在分子标记物的研究”中华眼底病杂志，第27卷，第3期，2011年5月，第255-258页；CN102460176B)。但是，目前尚无研究揭示造成不同近视人群角膜细胞代谢及增殖相关的差异性表达蛋白，细胞代谢及增殖将引起何种角膜形态或超微结构改变，从而影响患者的屈光度，最终导致近视，特别是高度近视的发生发展。

因此，探究不同近视程度人群细胞代谢及增殖相关差异的蛋白基础，并将其开发成对高度近视进行风险预测和高度近视的辅助诊断标记物，以及筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物的标记物，对于进一步阐明高度近视的病理机制，在临床上延缓高度近视的进展具有划时代的意义。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明人采用高通量蛋白质组学方法考察了轻度近视、中度近视和高度近视患者角膜基质中的蛋白质表达差异，并首次发现了在不同程度的近视人群中表达具有显著差异的特定血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链的蛋白质标志物组合物，为高度近视风险人群提供了一种新的辅助诊断、风险预测手段，以及高度近视候选药物筛选方法，也为进一步阐明此类疾病的病理机制奠定基础。

具体地，通过以下几个方面的技术方案实现了本发明：

在第一个方面中，本发明提供了一种用于待检测对象高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的蛋白质标记物组合物，其特征在于：所述标记物为血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链的组合，所述标记物用于通过高通量蛋白质组学方法对样品进行检测，所述样品来自角膜组织，进一步地，所述样品来自泪液、房水、玻璃体、血液、血浆或血清。

在第二个方面中，本发明提供了一种用于待检测对象高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的标记物组合物，以及说明书，所述说明书记载了高度近视患者、中度近视患者、低度近视患者和/或健康人群样品的上述标记物水平参考数据集合。

进一步地，对于上述标记物组合物或上述试剂盒而言，所述待检测对象高度近视风险预测以及高度近视辅助诊断的方法包括以下步骤：

(1)提供来源于待测对象的样品，对样品中的标记物水平进行检测，所述标记物为血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链的组合；

(2)将步骤(1)测得的标记物水平与高度近视患者、中度近视患者和/或低度近视患者的相应标记物的水平参考数据集合进行比较，并将健康人群样品的相应标记物的水平作为阴性对照；以及

(3)如果所述待测对象的样品中标记物的水平在高度近视患者样品的相应标记物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度≤-6.00D，或眼轴长度≥26.00mm，则将所述待测对象判定为患有高度近视；

如果所述待测对象的样品中标记物的水平在中度近视或轻度近视患者样品的相应标记物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度＞-6.00D，且眼轴长度<26.00mm，则将所述待测对象判定为未患有高度近视；和

如果所述待测对象的样品中标记物的水平在高度近视患者样品的相应标记物水平参考数据集合范围内，且所述待测对象的屈光度＞-6.00D，且眼轴长度<26.00mm，则将所述待测对象判定为发展成高度近视的风险较高。

在第三个方面中，本发明提供了一种用于筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物的标记物组合物，其特征在于：所述标记物为血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链的组合，所述标记物用于通过高通量蛋白质组学方法对样品进行检测，所述样品来自角膜组织、泪液、房水、玻璃体、血液、血浆或血清。

在第四个方面中，本发明提供了一种筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)在待测组中，向待测对象施用待测化合物，分别检测待测组中来源于所述对象的样品中标记物血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链的水平L

(2)分别对步骤(1)中检测得到的水平L

其中，在步骤(1)和步骤(2)中，所述标记物用于通过高通量蛋白质组学方法对样品进行检测，所述样品来自角膜组织、泪液、房水、玻璃体、血液、血浆或血清，所述待测对象是患有高度近视的动物，优选地，所述动物是哺乳动物，更优选地，所述哺乳动物是人、非人灵长类动物或啮齿类动物。

特别需要指出的是，在本发明中，术语“标记物”也称为“生物学标记物”是指个体的生物学状态的可测量指标。这样的生物学标记物可以是在个体中的任何物质，只要其与被检测个体的特定生物学状态(例如，疾病、病症或障碍)有关即可，例如核酸(如DNA或RNA)标记物、蛋白标记物、细胞因子标记物、趋化因子标记物、糖类标记物、抗原标记物、抗体标记物和功能性标记物等。生物学标记物经过测量和评估，经常用以检查正常生物过程、致病过程，或治疗干预药理响应，而且在许多科学领域都是有用的。

在本发明中，术语“血浆”指全血的液体成分。根据所使用的分离方法不同，血浆可以完全不含细胞成分，也可以含有不同量的血小板和/或少量其他细胞成分。

在本发明中，术语“待测对象”是患有高度近视的动物。优选地，所述动物是哺乳动物。更优选地，所述哺乳动物是人、非人灵长类动物或啮齿类动物。例如，医学研究中常用的高度近视动物模型，如雏鸡、树鼩、豚鼠、恒河猴等。参见例如，WO2018/164113A。

在本发明中，术语“高度近视”又称病理性近视或恶性近视，指等效球镜屈光度≤-6.00D，或眼轴长度≥26.00mm的屈光不正。高度近视眼轴的伸长程度变大，其结果是导致视网膜、脉络膜向后方拉伸，使其负荷增强，从而导致眼底发生各种各样的异常。病理性近视是导致失明的主要原因之一，目前尚没有治疗高度近视的有效防范。

在本发明中，术语“标记物水平参考数据集合”指高度近视患者、中度近视患者、低度近视患者或健康人群样品的参考值或正常值的范围。本领域技术人员知晓，在样品数量足够多的情况下，每个生物标记物在上述患者或健康人群中的绝对值或正常值的范围可以通过检验和计算得到。此外，也可以通过统计学方法计算得到。

本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：

(1)本发明将由血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链组成的标记物组合物用于高度近视的辅助早期筛查和风险预测，这种标记物具有高灵敏度和高特异性的优点，具有重要的科学研究和临床应用价值。

(2)可以将本发明的由血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链组成的标记物用于筛选预防、延缓或治疗高度近视的候选化合物，以便于开发在临床上用于预防、延缓或治疗高度近视的药物。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1：本发明实施例中差异蛋白表达相关热图。其中，A代表低度近视组，B代表中度近视组，C代表高度近视组，热图显示三组的差异表达蛋白。

图2：本发明实施例中差异蛋白表达相关火山图。图中的每个点表示一个蛋白质。其中，(A)火山图显示A-低度近视组与B-中度近视组的差异；(B)火山图显示B-中度近视组与C-高度近视组的差异；(C)火山图显示A-低度近视组与C-高度近视组的差异。

图3：低度近视组、中度近视组和高度近视组患者角膜血清转铁蛋白的蛋白含量差异。图3A为串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)相对定量蛋白组学分析结果，图3B为平行反应监测(Parallel reaction monitoring，PRM)技术靶向验证结果。

图4：低度近视组、中度近视组和高度近视组患者角膜铁蛋白轻链的蛋白含量差异。图4A为TMT相对定量蛋白组学分析结果，图4B为PRM技术靶向验证结果。

图5：低度近视组、中度近视组和高度近视组患者角膜铁蛋白重链的蛋白含量差异。图5A为TMT相对定量蛋白组学分析结果，图5B为PRM技术靶向验证结果。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例

1.实验方法

本实验选取南开大学附属眼科医院(天津市眼科医院)2019年2月-2019年8月行飞秒激光辅助下微小切口基质透镜切除术(small incision lenticule extraction，SMILE)手术患者术中切除的角膜基质组织，共计133人，259只眼，所有患者除确诊不同程度近视外，均不伴有其他眼部及全身系统性疾病，不影响角膜蛋白结果分析。本研究通过南开大学伦理委员会审核批准。

所有患者患眼按照等效球镜度(SE＝球镜+柱镜/2)分为低度近视组(SE＞-3.00D)、中度近视组(-6.00D＜SE≤-3.00D)以及高度近视组(SE≤-6.00D)，并在所有入选患者中从低度、中度、高度近视组分别随机选择各9例眼，共计27例眼进行标本采集。

对上述标本的角膜样品进行串联质谱标签(Tandem Mass Tag,TMT)相对定量蛋白组学分析，对所鉴定的差异表达蛋白进行生物信息学分析,筛选有潜在研究前景的候选蛋白，每组进行三次生物学重复。

随后进行差异蛋白筛选，使用平行反应监测(Parallel reaction monitoring，PRM)技术靶向验证候选蛋白在不同度数近视眼角膜中的表达差异，每组进行三次重复实验。

2.实验结果

本研究采用TMT定量蛋白质组学技术进行分析，在人角膜样品中共鉴定到蛋白质2472个。按照表达倍数变化1.2倍以上(上调大于1.2倍或者下调小于0.83倍)且p值<0.05的标准筛选差异表达蛋白质。结果选择血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链作为潜在的差异蛋白。

(1)如图1所示，热图显示三组的差异表达蛋白。其中，A代表低度近视组，B代表中度近视组，C代表高度近视组。这些差异表达蛋白质的功能主要是结合、催化、分子结构、分子功能调节以及转运，这些差异表达蛋白质主要参与了细胞内调控、生物调控、代谢以及应激反应等重要生物学过程。

(2)如图2所示，图中的每个点表示一个蛋白质。其中，(A)火山图显示A-低度近视组与B-中度近视组的差异，B_vs_A组的上调差异表达蛋白质有19个，下调差异表达蛋白质15个。(B)火山图显示B-中度近视组与C-高度近视组的差异，C_vs_B组的上调差异表达蛋白质有11个，下调差异表达蛋白质25个。(C)火山图显示A-低度近视组与C-高度近视组的差异，C_vs_A组的上调差异表达蛋白质有47个，下调差异表达蛋白质56个。

(3)血清转铁蛋白

TMT蛋白质谱分析显示：高度近视、中度近视和低度近视眼人群角膜的血清转铁蛋白有明显差异。高度近视组的蛋白相对表达量要显著高于低度近视组，并且高度近视组的蛋白相对表达量也要显著高于中度近视组，而中度近视组与低度近视组的蛋白相对表达量之间也存在一定程度的差异。高度近视/低度近视组＝1.1407/0.8841＝1.2902，p＝0.0067，高度近视/中度近视＝1.1407/0.9639＝1.1834，p＝0.0405，中度近视/低度近视＝0.9639/0.8841＝1.0903,p＝0.0764。

使用PRM进一步证实血清转铁蛋白的含量差异。PRM结果显示：血清转铁蛋白低度近视组均值为10.1566，中度近视组为8.1635，高度近视组为12.8561。高度近视/低度近视＝1.2658，p＝0.0470，高度近视/中度近视＝1.5748，p＝0.0491。

通过PRM结果与TMT结果相比，可见PRM验证结果与TMT相对定量结果趋势相一致。高度近视组血清转铁蛋白明显高于中度近视组以及低度近视组，且差异显著。

(4)铁蛋白轻链

TMT蛋白质谱分析显示：高度近视、中度近视和低度近视眼人群角膜的铁蛋白轻链有明显差异。高度近视组的蛋白相对表达量要显著低于低度近视组，并且中度近视组的蛋白相对表达量也要显著低于低度近视组。高度近视/低度近视组＝0.9015/1.1362＝0.7934，p＝0.0236，中度近视/低度近视＝0.9764/1.1362＝0.8594，p＝0.0337。

使用PRM进一步证实铁蛋白轻链的含量差异。PRM结果显示：铁蛋白轻链低度近视组均值为1.1867，中度近视组为0.3893，高度近视组为0.3968。高度近视/低度近视＝0.3344，p＝0.0283，中度近视/低度近视＝0.3281，p＝0.0146。

通过PRM结果与TMT结果相比，可见PRM验证结果与TMT相对定量结果趋势相一致。高度近视组和中度近视组铁蛋白轻链明显低于低度近视组，且差异显著。

(5)铁蛋白重链

TMT蛋白质谱分析显示：高度近视、中度近视和低度近视眼人群角膜的铁蛋白重链有明显差异。高度近视组的蛋白相对表达量要显著低于低度近视组，并且中度近视组的蛋白相对表达量也要显著低于低度近视组。高度近视/低度近视组＝0.8638/1.1606＝0.7443，p＝0.001，中度近视/低度近视＝1.0077/1.1606＝0.8683，p＝0.0455。

使用PRM进一步证实铁蛋白轻链的含量差异。PRM结果显示：铁蛋白重链低度近视组均值为0.7045，中度近视组为0.4305，高度近视组为0.2611。高度近视/低度近视＝0.3706，p＝0.0131。

通过PRM结果与TMT结果相比，可见PRM验证结果与TMT相对定量结果趋势相一致。高度近视组铁蛋白重链明显低于低度近视组，且差异显著。

综上所述，本发明人采用高通量蛋白质组学方法首次发现了在不同程度近视人群的角膜组织中表达具有显著差异的特定蛋白血清转铁蛋白、铁蛋白轻链和铁蛋白重链的标志物组合物。此外，拟于源自患者血液、血浆、血清、泪液和房水的样品中，也能够得到与上述角膜组织样品中一致的结果。此铁代谢相关蛋白质标志物组合物将为高度近视患者提供了一种新的风险预测以及辅助诊断标记物，并提供了以该标记物组合物为基础的候选药物筛选方法，也为进一步阐明此类疾病的病理机制奠定基础。

本发明如有未尽事宜则为公知技术范畴。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。