肺结核病变活动性标志物、试剂盒、方法及模型构建方法

摘要

本发明涉及肺结核病变活动性标志物、试剂盒、方法及模型构建方法，其特征在于，肺结核病变活动性标志物为血液样本中的血浆蛋白生物标志物，血浆蛋白生物标志物为包括C1QB蛋白质和CCL19(MIP3B)蛋白质的一种或多种的联合标志物；发明首次采用C1QB和CCL19(MIP3B)这一组合联合标志物作为肺结核病变活动性检测的生物标记物，构建了肺结核病变活动性检测的快速诊断模型，为结核病的临床诊断提供了新的方向，作为肺结核病变活动性诊断的一种技术构思，为活动性肺结核的诊断提供新的靶点；因此，本发明克服了现有活动性肺结核的诊断检出率低、耗时长等缺点，具有特异性好、灵敏度高的特点，对肺结核病变活动性的辅助诊断有良好的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，更具体地，涉及C1QB和CCL19(MIP3B)作为肺结核病变活动性诊断标志物、试剂盒、检测方法以及模型构建方法。

背景技术

在全球，结核病是十大死亡原因之一，也是单一传染源的主要死因。肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染性疾病。2019年，全世界估计有1000万人患有结核病。结核病的诊断试验包括痰涂片显微镜检查(100多年前开发)、快速分子试验(2010年WHO首次批准)和基于培养的方法，痰涂片检查只在约50-60％的肺结核患者中发现抗酸杆菌，而培养则需要长达8周才能提供结果，但二者仍是参考金标准。如果诊断不明确，未能进行及时有效的抗结核治疗，结核病的死亡率会很高。

WHO，2020年全球结核病报告显示，菌阴性肺结核患者与菌阳性肺结核患者的相对传播率为22％，而中国至少有30％的结核病病例是由痰涂片阴性结核病传播的。据日本的研究显示，术前培养阴性的患者中有73％在其病灶中检测不到活的结核分枝杆菌。部分结核患者包括菌阴性结核病抗结核治疗结束后，肺部仍有持续性炎症。这些炎性反应不仅对肺结核感染控制无效，反而会加剧疾病，引起结核病复发和传染。18-氟代脱氧葡萄糖(fluorine-18fluorodeoxyglucose，18F-FDG)摄取反映细胞内糖酵解，在结核、其他肉芽肿炎症、肿瘤细胞中均增高。18F-FDG高摄取与疾病活动程度有较高的相关性。目前可用18F-FDG PET/CT评价菌阴性肺结核的病变活动性。然而，18F-FDG-PET/CT成本高并且涉及辐射暴露，而且对于定性病变诊断常常缺乏特异性，常常不能可靠地区分结核病变与恶性肿瘤。因此，寻找一种可替代PET-CT的生物标志物来评估肺结核病灶活动性非常重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的肺结核病变活动性诊断标志物特异性不好，灵敏度不高，且检测耗时的问题，提供C1QB和CCL19(MIP3B)这一组合作为肺结核病变活动性诊断的一种技术构思，为活动性肺结核的诊断提供新的靶点，并且对活动性肺结核诊断有良好的临床应用价值。

具体地，本发明一方面提供了选择性地检测一种C1QB和CCL19(MIP3B)的试剂组合标志物在制备快速诊断肺结核病变活动性的试剂盒中的用途，所述试剂用于测定得自所述受试者的血浆中C1QB和CCL19(MIP3B)的水平，其中所述C1QB的水平相对于正常人受试者的水平的升高，CCL19(MIP3B)的水平相对于正常人受试者的水平的降低指示所述受试者中存在活动性肺结核。

一种肺结核病变活动性标志物，其特征在于，为血液样本中的血浆蛋白生物标志物，所述血浆蛋白生物标志物为包括C1QB蛋白质、CCL19蛋白质或MIP3B蛋白质的一种或多种的联合标志物。

进一步地，所述联合标志物中CCL19蛋白质或MIP3B蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步地，所述联合标志物中C1QB蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

一种基于肺结核病变活动性标志物的结核病变活动性检测试剂盒，其特征在于，包括全血样品中血浆提取分离相关试剂、血浆样本的蛋白质组学定量分析相关试剂、血浆样本中C1QB蛋白质、CCL19蛋白质或MIP3B蛋白质的蛋白表达水平测定相关试剂；还包括标准品，所述标准品为C1QB蛋白质、CCL19蛋白质或MIP3B蛋白质的一种或多种。

一种基于肺结核病变活动性标志物的结核病变活动性检测试剂盒的检测方法，其特征在于，试剂盒中的检测试剂用于测定得自受试者的血浆样品中的标志物蛋白表达水平，包括以下步骤：

a.测定得自所述受试者血浆中C1QB蛋白质、CCL19蛋白质或MIP3B蛋白质表达水平；

b.将受试者血浆中标志物蛋白表达水平与正常受试者中血浆中标志物蛋白表达水平进行对比；

c.基于步骤b做出的对比结果，其中所述受试者的血浆样品中C1QB蛋白质的表达水平相对于正常人受试者的水平的升高，CCL19或MIP3B蛋白质的表达水平相对于正常人受试者的水平的降低指示所述受试者中存在活动性肺结核；所述C1QB蛋白质和CCL19或MIP3B蛋白质的表达水平相对于肺结核好转或治愈受试者的水平的升高，指示所述受试者中存在活动性肺结核。

进一步地，测定生物样品中的血浆蛋白生物标志物的水平的方法包括：蛋白定量方法、蛋白浓度测定方法和模型构建算法。

进一步地，包括不限于串联质谱-液相色谱/质谱(TMT-LC/MS)、液相色谱-平行反应监测/质谱(LC-PRM/MS)等)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹法(WB)、蛋白芯片等和逻辑回归算法、决策树、神经网络算法等、聚合酶链式反应(PCR)、实时聚合酶链式反应(RT-PCR)。

测定得自所述受试者的血浆中C1QB和CCL19(MIP3B)的水平，其中所述C1QB和CCL19(MIP3B)的水平相对于肺结核好转或治愈受试者的水平的升高，指示所述受试者中存在活动性肺结核。

建立模型，根据指数预测肺结核病变活动性。一种基于肺结核病变活动性标志物的结核病变活动性检测模型的构建方法，其特征在于，使用检测算法构建C1QB蛋白质、CCL19蛋白质或MIP3B蛋白质的活动性结核病快速诊断模型；其检测算法包括以下步骤：

(1)血浆样本的收集与处理，从全血中分离血浆样本，数据采集模块用于样本数据采集，获取样本数据集；

(2)测定血浆样本，数据处理模块从样本中测定血浆蛋白生物标志物的指标，所述血浆蛋白生物标志物具体包括C1QB蛋白质、CCL19蛋白质或MIP3B蛋白质；

(3)数据模型构建模块使用神经网络的方法拟合训练集进行模型的构建，以70％的样本量作为训练集，30％的样本量作为测试集，对血浆蛋白标志物的表达进行整合分析，记录最优模型参数；同时阈值计算模块根据ROC曲线使用验证集计算模型分类的阈值，构建得到活动性结核病检测模型，

(4)其中所述受试者的血浆样品中C1QB蛋白质的表达水平相对于正常人受试者的水平的升高，CCL19或MIP3B蛋白质的表达水平相对于正常人受试者的水平的降低指示所述受试者中存在活动性肺结核；

(5)或所述C1QB蛋白质和CCL19或MIP3B蛋白质的表达水平相对于肺结核好转或治愈受试者的水平的升高，指示所述受试者中存在活动性肺结核。

本发明的有益效果是：

发明首次采用血浆蛋白来源的C1QB和CCL19(MIP3B)这一组合联合标志物作为肺结核病变活动性检测的生物标记物，构建了结核病变活动性检测的快速诊断模型，为结核病的临床诊断提供了新的方向，作为结核病病变活动性诊断的一种技术构思，为肺结核病变活动性的诊断提供新的靶点，并且对肺结核病变活动性诊断有良好的临床应用价值；因此，本发明克服了现有肺结核病变活动性诊断检出率低、耗时长等缺点，具有特异性好、灵敏度高的特点，对肺结核病变活动性的辅助诊断有良好的临床应用价值。

附图说明

图1为活动性肺结核患者、健康志愿者和非结核肺部呼吸性疾病血浆中C1QB和CCL19(MIP3B)水平(n＝88)。

活动性肺结核患者(TB)、健康志愿者(HC)和非结核肺部呼吸性疾病(ORD)血浆各取88例。数据取两次次平行试验均值，*表示具有统计学差异，**表示具有显著性差异。

图2为菌阴性肺结核血浆标志物与PET-CT相关指标(SUVmax、SUVmin、SUVmean、MTV、TLGq)相关性分析。

图2为菌阴性肺结核血浆标志物与PET-CT相关指标(SUVmax、SUVmin、SUVmean、MTV、TLGq)相关性分析。

菌阴性肺结核取18例，相关性的强弱大致可以按照如下分布来进行判定：0.8-1.0极强相关；0.6-0.8强相关；0.4-0.6中等程度相关；0.2-0.4弱相关；0.0-0.2极弱相关或无相关。

图3为菌阴性活动性肺结核患者和肺结核好转或治愈结核病患者血浆中C1QB和CCL19(MIP3B)水平。

图3为菌阴性活动性肺结核患者和肺结核好转或治愈结核病患者血浆中C1QB和CCL19(MIP3B)水平。

菌阴性活动性肺结核患者(TB)取40例和肺结核好转或治愈(Improvement)取40例。数据取两次次平行试验均值，*表示具有统计学差异，**表示具有显著性差异。

图4为C1QB和CCL19(MIP3B)结核(TB)和肺结核好转或治愈(Improvement)血浆中相对水平的ROC分析。

C1QB的曲线下面积(AUC)为0.731，CCL19(MIP3B)的曲线下面积为0.621。C1QB的最佳截断点为3.117。此时，特异性为72.5％，敏感性为75％。CCL19(MIP3B)的最佳截断点为30.435。此时，特异性为85％，灵敏度为42.5％。

图5为肺结核病变活动性预测模型。

(A)活动性预测Nomogram图。(B)Nomogram列线图的校准曲线。注：x轴代表预测的非经常性风险。y轴代表实际诊断的非复发。对角线虚线代表理想模型的完美预测。实线表示列线图的性能，其中更接近对角线虚线表示更好的预测。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

C1QB基因编码血清补体亚成分的b链多肽，是血清补体系统的组成部分。有研究表明C1QB与红斑狼疮和肾小球肾炎有关。在结核病研究领域，发现C1QB可区分活动性结核和潜伏性结核感染。这种血清补体系统是宿主免疫应答的一个组成部分，在宿主抵抗病原体入侵中发挥重要作用。CCL19(MIP3B)是一种趋化因子，也可以指示炎症反应的程度。目前，尚无研究揭示CCL19(MIP3B)与结核病的关系。

1.简介

本发明提供了血浆生物标志物C1QB和CCL19(MIP3B)，其指示活动性肺结核，且其可以用于准确地诊断受试者中的活动性肺结核。另外，提供了用于诊断肺结核病变活动性的试剂盒。在某些实施方案中，所述方法需要检测合适的样品中的C1QB和CCL19(MIP3B)。

2.定义

在详细阐述本发明之前，提供要在本文中使用的某些术语的定义。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。

术语“受试者”意图包括，能够直接地或间接地涉及活动性肺结核的任意障碍。受试者的例子包括哺乳动物，例如，人类、非人灵长类动物、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人动物。在某些实施方案中，所述受试者是人，例如，遭受活动性肺结核的人，处于遭受活动性肺结核及其相关的风险中的人，或者潜在地能够遭受活动性肺结核相关的痴呆的人。

术语“治疗”在本文中用于表示解除、减轻或缓解受试者中的疾病的至少一种征状。例如，关于活动性肺结核，术语“治疗”包括：解除、减轻或缓解认知损害(诸如记忆和/或定向的病损)或总体功能(所有功能，包括日常生活活动)的病损，和/或减慢或逆转总体或认知损害的进行性衰退。因此，术语“治疗”也包括：在疾病的临床表现或疾病的征状之前延迟或阻止发作，和/或减少疾病征状的发展或恶化的风险。

术语“约”或“大约”通常是指在给定的值或范围的5％内，或更优选1％内。

3.结核病的血浆蛋白生物标志物

本发明涉及血浆蛋白生物标志物：：与“正常”受试者相比，其被发现在得自患有活动性肺结核的受试者的生物样品中差别地存在。如果在样品中的一种血浆蛋白生物标志物的表达水平之间的差异被确定为统计上显著的，那么该血浆蛋白生物标志物在样品之间差别地存在。统计显著性的常见试验包括、但不限于：t-检验、ANOVA、Kniskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney和比值比。单独的或组合的血浆蛋白生物标志物可以用于提供受试者患有或没患活动性肺结核的相对风险的量度。

4.测定样品中的血浆蛋白生物标志物的表达水平

通过任意合适的方法，可以测定生物样品中的血浆蛋白生物标志物的水平。可以使用任意可靠的用于测量样品中的血浆蛋白的水平或量的方法。通常，可以从生物样品检测和定量血浆蛋白，所述样品是采集受试者全血而分离得到的血浆样品，所述方法包括：蛋白定量方法(例如，串联质谱-液相色谱/质谱(TMT-LC/MS)、液相色谱-平行反应监测/质谱(LC-PRM/MS)等)、蛋白浓度测定方法(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫印迹法(WB)、蛋白芯片等)和模型构建算法(例如，逻辑回归算法、决策树、神经网络算法等)。其它示例性的技术包括聚合酶链式反应(PCR)、实时聚合酶链式反应(RT-PCR)等。

5.血浆蛋白生物标志物确定肺结核的活动性

本文描述的血浆蛋白生物标志物可以用于诊断试验中以评估受试者的活动性肺结核状态。疾病状态包括活动性肺结核的存在或不存在。疾病状态还可以包括监测活动性肺结核的进程，例如，监测疾病进展。基于受试者的活动性肺结核状态，可以指示其它操作，包括、例如，其它诊断试验或治疗操作。

通常以测定的准确度、测定的灵敏度、测定的特异性或“曲线下面积”(AUC)(例如，在受试者操作特征(ROC)曲线下的面积)的方式，测量诊断试验的正确预测疾病状态的能力。本文中使用的准确度是错误分类的样品的比例的量度。可以将准确度计算为，正确分类的样品的总数除以样品的总数(例如在试验群体中)。灵敏度是通过试验预测为阳性的“真阳性”的量度，且可以计算为正确鉴别的活动性肺结核样品的数目除以活动性肺结核样品的总数。特异性是通过试验预测为阴性的“真阴性”的量度，且可以计算为正确鉴别的正常样品的数目除以正常样品的总数。AUC是受试者操作特征曲线下的面积的量度，所述曲线是灵敏度相对于假阳性率的图(1-特异性)。AUC越大，试验的预测值越有效。试验的实用性的其它有用的量度包括“阳性预测值”(它是试验为阳性的实际阳性的百分比)和“阴性预测值”(它是试验为阴性的实际阴性的百分比)。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均于市购。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1

从全血中分离血浆样本

用EDTA抗凝管采集活动性肺结核患者晨起空腹外周血全血，3000rcf离心15min,6小时内分离血浆至新的1.5mL离心管中。血浆样品保存于-80低温冰箱中。

实施例2

ELISA方法测定血浆样本中蛋白表达水平

血浆样本收集：活动性结核患者88例，健康对照88例，非结核肺部呼吸性疾病88例。

按标准操作使用人C1QB和CCL19(MIP3B)试剂盒(CLOUD-CLONE CORP.Whan.CN)检测血浆蛋白标志物的表达水平。采用GraphPad Prism 8软件中的t test or one-wayANOVA进行统计分析(P<0.05时，具有显著性差异，P<0.01时，具有极显著差异)。差异表达的血浆蛋白数据处理时以mean±SEM表示，绘制包含误差线的散点图。结果发现，C1QB和CCL19(MIP3B)可以有效区分活动性结核患者、健康对照和非结核肺部呼吸性疾病，具有统计学意义。如图1所示。

实施例3

肺结核血浆标志物与PET-CT相关指标(SUVmax、SUVmin、SUVmean、MTV、TLGq)相关性分析。

血浆样本收集：菌阴性肺结核患者18例，PET-CT的SUVmax≥3。

按标准操作使用人C1QB、CCL19(MIP3B)、RANTES、MHCDMb的ELISA试剂盒(CLOUD-CLONE CORP.Whan.CN)检测血浆蛋白标志物的表达水平。采用18例患者详细的PET-CT资料进行相关性分析。通过相关性分析可以发现PET-CT相关指标(SUVmax、SUVmin、SUVmean、MTV、TLGq)与血液中生物标志物浓度的关系。根据相关性分析结果，我们发现CCL19(MIP3B)与MTV之间存在相关性，如图2所示。

实施例4

ELISA方法测定血浆样本中蛋白表达水平

血浆样本收集：菌阴性肺结核患者(TB)和肺结核好转或治愈(Improvement)血浆各40例。

按标准操作使用人C1QB和CCL19(MIP3B)的ELISA试剂盒(CLOUD-CLONECORP.Whan.CN)检测血浆蛋白标志物的表达水平。采用GraphPad Prism 8软件中的t testor one-way ANOVA进行统计分析(P<0.05时，具有显著性差异，P<0.01时，具有极显著差异)。差异表达的血浆蛋白数据处理时以mean±SEM表示，绘制包含误差线的柱状图。结果发现，C1QB的血浆浓度有统计学意义[3.549(3.211-3.886)vs 2.745(2.540-2.950)，P<0.01]，如图3所示。

实施例5

建立肺结核活动性预测模型。

所有统计分析均采用R软件(3.6.2版，https://www.r-project.org/)。用Kolmogorov-Smirnov检验评价连续变量的正态分布。对正态分布变量用Student t检验或偏态变量用非参数检验(Mann-Whitney U检验)比较复发组和无复发组候选生物标志物的浓度，偏态变量用中位数和范围表示。P<0.05视为具有显著性。计算候选生物标志物的受试者工作特征(ROC)曲线和各自的曲线下面积(AUC)。如图4所示，C1QB和CCL19(MIP3B)有统计学意义，C1QB的曲线下面积(AUC)为0.731，CCL19(MIP3B)的曲线下面积为0.621。C1QB的最佳截断点为3.117。此时，特异性为72.5％，敏感性为75％。CCL19(MIP3B)的最佳截断点为30.435。此时，特异性为85％，灵敏度为42.5％。同时，使用R包rms绘制列线图，结合两种或两种以上生物标志物更准确预测患者的疾病活动风险。C指数用于评价列线图的预测准确性，校准曲线用于评价列线图的效率，如图5所示，C指数为0.773，表明列线图预测结核患者复发的准确性更高。同时校正曲线显示列线图虚线偏离对角线不远，说明列线图预测效率较高。

以上实施例以痰菌阴性结核病进行举例说明，但本发明并不仅限于痰菌阴性结核病，同样适用于痰菌阳性结核病，特此说明。

以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。