本申请是分案申请，原申请的申请日为2015年3月30日，申请号为201580017376.6，发明名称为“用于治疗和预防肺部炎症的包含环糊精和布地奈德衍生物的组合物”。
技术领域
本申请案之有关专利案有：美国临时申请号61/972209案，申请日为2014年3月28日，名称为“具有布地奈德衍生物的环糊精的组合物和方法”，其整体被并入本文中作为参考，如同完全在此之所述，且本申请案也有关专利案：欧洲申请号EP14132158BE 28.032014，名称为“用于治疗和预防肺部炎症性疾病的具有布地奈德衍生物的环糊精的组合物”，由列日大学(Universitéde Liège)所交付且被分配给公开号EP14162158.1。
本发明涉及新颖的和有用的药物组合物，其以环糊精化合物和布地奈德衍生物来配制，用于治疗和/或预防肺部炎症性疾病。本发明还涉及一种新颖的和有用的分析技术，用来检测和定量HP-β-CD在溶液中的量。更具体地，本发明涉及验证的1H NMR分析的使用，其用于直接在药物制剂中检测和定量环糊精的量，而不需任何用于液体制剂的萃取或分离的步骤。
背景技术
肺部炎性疾病(PID)的疾病状态特征是不完全可逆的气流限制。气流限制与肺部的异常的炎症反应有关，例如，有害粒子(细粒子，如在烟雾和霾中之所见，其直径为2.5微米或更小)。
肺部炎性疾病包括炎症性哮喘，即严重阶段的哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、如慢性支气管炎、阻塞性细支气管炎、肺气肿、肺纤维化、囊性纤维化等。
PID患者的支气管壁有显著的嗜中性粒细胞炎症，其系因蛋白酶和氧化剂(氧反应性物质)的重复产生而导致气道结构产生进行性的破坏。迄今为止，市售的治疗剂不能适当减少或防止PID患者的这种嗜中性粒细胞炎症。尤其是，众所周知，吸入或口服类固醇显示出对嗜中性粒细胞炎症并没有效率。例如，S.Culpitt等人对COPD患者所进行的研究：Am JRespir Crit Care Med.160:1635-1639(1999)，其显示出高剂量的吸入类固醇对于COPD相关的嗜中性粒细胞炎症及对嗜中性粒细胞的趋化剂(主要为人类的IL-8)并没有效率。
鉴于PID患者当前的类固醇治疗的无效性，故可以适当减少或防止PID患者的嗜中性粒细胞炎症的有效的类固醇治疗剂是有必要的。
发明内容
简言之，本发明利用新颖的和有用的药物组合物来克服上述的与目前的PID患者使用类固醇治疗的有关的不足与缺点，本发明可以有效地治疗性地治疗和/或预防对于需要这种治疗的哺乳动物宿主的肺部炎症性疾病。
一般而言，本发明涉及新颖的和有用的药物组合物，其以环糊精化合物和布地奈德衍生物来配制，用于治疗和/或预防肺部炎症性疾病。本发明还涉及一种新颍的和有用的分析技术，用来检测和定量HP-β-CD在溶液中的量。更具体地，本发明涉及验证的1H NMR分析的使用，用于直接在药物制剂中检测和定量环糊精的量，而不需任何用于液体制剂的萃取或分离的步骤。本发明还涉及一种新颖的和有用的分析技术来检测和定量溶液中的HP-β-CD。
本发明的新颖的组合物和方法，其包括以环糊精化合物和式(I)的布地奈德衍生物来配制的组合物，并使用它们来治疗和/或预防需要这种治疗的哺乳动物宿主的PID：
其中，R1和R2各自独立地表示氢原子，卤素、C
“C
“C
“C
“C
“C
“C
“C
“呋喃”，如本文所使用的，系指：
“呋喃呋喃羰基氧基”，如本文所使用的，系指：
“卤素”，如本文所使用的，系指氟、氯、溴或碘。
“R4”和“R5”，它们可选择性地一起形成3至5个原子的烃环，其中两个碳原子可选择性地被氧原子所取代，且环可选择性地被C
根据本发明的较佳的布地奈德衍生物是由通式(Ⅰ)所表示的糠酸莫米松或糠酸氟替卡松，其分别在R3或R4具有呋喃羰基氧基，如下图之所示：
糠酸莫米松可购自辉瑞和默克(Pfizer and Merck)，而糠酸氟替卡松可购自GSK。
根据本发明的其他较佳的布地奈德衍生物是由通式(Ⅰ)所表示的丙酸氟替卡松或二丙酸倍氯米松，其在R4中具有至少丙羰氧基或丙酸基，如下图之所示：
丙酸氟替卡松可购自GSK，其商品名为辅舒酮(Flixotide)，而二丙酸倍氯米松可购自UCB，SANDOZ，TEVA和CHIESI，其商品名为QVAR，Ecobec和Beclophar。
依据本发明，最佳的布地奈德衍生物是布地奈德。布地奈德是皮质类固醇，由通式(Ⅰ)所表示：
布地奈德，也称为(R，S)-11(3,16a，17,21-四羟基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮环16,17-乙缩醛丁醛或16,17-(亚丁基双(氧))-11,21-二羟基-，(11-β3，16-a)-孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮，布地奈德的化学式，分子量和CAS编号分别是C
布地奈德是消旋物，包括两个非对映体22R和22S的混合物，且商业上以两种异构体(22R和22S)的混合物被提供。
布地奈德溶液的商业制剂由AstraZeneca LP(Wilmington,Del.)提供。其商标为Pulmicort
倍他米松也被本发明所构想。如布地奈德，倍他米松也是皮质类固醇，由下面通式所表示：
倍他米松的IUPAC名称是(8S,9R,10S,11S,13S,14S,16S,17R)-9-氟代-11,17-二羟基-17-(2-羟乙酰基)-10,13,16-三甲基-6,7,8,11,12,14,15,16-8氢环戊[a]菲-3-酮。布地奈德的化学式，分子量和CAS ID编号分别为C
倍他米松的不同的名称包括Celestone，Rinderon Betadexamethasone及Flubenisolone。
氟替卡松是本发明所设想的另一种皮质类固醇，由下面通式所表示：
氟替卡松的IUPAC名称是(6α，11β，16α，17α)-6,9-二氟-17-{[(氟甲基)硫代]羰基}-11-羟基-16-甲基-3-氧代雄甾-1,4-二烯-17-基-2-呋喃羧基。氟替卡松的化学式，分子量和CAS ID编号分别为C
环糊精已知是淀粉被细菌降解而产生的环状寡糖。环糊精包括6个、7个或8个α-D-吡喃葡萄糖苷单位，并相应地被命名为α、β或γ环糊精。
根据本发明的环糊精化合物包括环糊精本身，烷基-环糊精(R-CD)，其中“R”是甲基、乙基、丙基或丁基；羧烷基-环糊精(CR-CD)、醚化-环糊精(RO-CD)、羟基烷基-环糊精(HR-CD)、葡糖基-环糊精、二和三甘油酯-环糊精或它们的组合和它们的药学上可接受的盐，约25℃时其在水中溶解的量至少约0.5克/100毫升。
本发明所使用的较佳的水溶性环糊精化合物，其水溶解度至少是β-环糊精的水溶解度(约1.85克/100毫升)。这种水溶性环糊精化合物的例子包括羟丙基环糊精，麦芽糖环糊精及其盐。特别是，羟丙基-β-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精，和它们的衍生物是较佳的。
根据本发明的其它的较佳的环糊精化合物包括甲基环糊精(环糊精甲基化的产品)，如2-O-甲基β环糊精；二甲基环糊精(DIMEB)(较佳地在2和6中被取代)、三甲基环糊精(较佳地在2、3和6中被取代)、“随机甲基化的”环糊精(RAMEB或RM)(较佳地在2，3和6中随机地被取代，但每单位的吡喃葡萄糖具有1.7～1.9的甲基)，羟丙基环糊精(HPCD)，较佳地在2，和3位置随机地被取代的羟丙基化环糊精(HP-βCD,HP-γCD)，羟乙基-环糊精，羧甲基乙基环糊精，乙基环糊精，其利用在羟基的氢碳化链接枝所得到的两性环糊精且能够形成纳米颗粒，利用单胺化环糊精(具有间隔臂)接枝所得到的胆固醇环糊精和甘油三酯环糊精，如治疗药物载体系统中的述评，Stephen D.Bruck Ed,环糊精-启用辅料；它们目前和将来的药物的用途，D.Thomson,Volume 14,Issue 1p1-114(1997)中之所述，其全部被引入本文中作为参考。
根据本发明最佳的环糊精化合物包括具有选择性地接枝在吡喃葡萄糖单位的化学功能的β环糊精，如羟丙基β环糊精(HPβCD)、-β-环糊精(SBEβCD)、随机甲基化-β-环糊精(RMβCD)、二甲基-β环糊精(DIMEβCD)、三甲基-β-环糊精(TRIMEβCD)、羟丁基-β-环糊精(HBβCD)、葡糖基-β-环糊精、麦芽糖基-β-环糊精、2-O-甲基-β-环糊精(Crysmeb)和它们的药学上可接受的盐，以及它们的任意组合。
根据本发明的最佳的环糊精化合物是羟丙基-β-环糊精(上文或下文也称为HP-β-CD或HP-β-CD)。
根据本发明的环糊精化合物是经由公知的淀粉的酶降解，如J Szejtli，Kluwer学术出版社1998年，第1-78页的环糊精技术之所述，其全部被引入本文中作为参考，随后经由适当的化学基的接枝所产生。它们可购自Roquette(法国)。
最佳的药物组合物包含约1-1至约1-100摩尔比，较佳地约1:75，且最佳地约1:50的布地奈德衍生物及环糊精化合物。布地奈德/羟丙基β环糊精的比较佳地为约1:50的摩尔比。
根据本发明的包含环糊精化合物和布地奈德衍生物的药物组合物，可以经由将粉末形式的过量的布地奈德衍生物加入到足够量的环糊精的液体溶液中来制备。液体环糊精溶液是水基或水-醇基或例如乙醇的醇溶液。布地奈德衍生物和环糊精化合物于室温下连续搅拌混合。过量的布地奈德衍生物可经由过滤除去。
两种成分被秤重，以得到介于约1：1500至约1:2的重量浓度比，较佳为约1:60的重量浓度比的布地奈德衍生物和环糊精混合物。
随后，液体混合物以本领域的适当的公知技术在雾化期间被干燥，以产生微粒化干燥粉末。在此情况，药物组合物还可以包括药学上可接受的赋形剂，例如，如乳糖、硬脂酸镁、甘露糖醇、多元醇、亮氨酸衍生物等的载体。
液体混合物也可以如混合步骤的液体溶液中的环糊精的相同的浓度，被加入等渗缓冲剂中的环糊精中，以产生液体溶液的药物组合物。
在液体溶液中的药物组合物也可以含有公知的药学上可接受的赋形剂，如等渗缓冲剂，防腐剂，溶剂或粘度调节剂和辅助物质。合适的等渗缓冲系统系基于磷酸钠(PBS)，醋酸钠或硼酸钠，如下面资料之所述：
防腐剂可以被加入，以防止药物组合物在使用过程中的微生物污染。合适的防腐剂是，例如，苯扎氯铵、氯丁醇，对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、山梨酸。此类防腐剂通常以从约0.01至约1％重量/体积的量被使用。
合适的辅助物质和药学上可接受的盐被描述于Remington的医药科学，第16版，1980，Mack出版公司，由Oslo等人编辑，其全部被引入本文以作为参考。
一般，合适量的药学上可接受的盐被用于本发明的药物组合物中，以使组合物具有等渗性。药学上可接受的物质的例子包括生理盐水、林格氏液(Ringer's solution)和葡萄糖溶液。
依据本发明，溶液的pH值较佳地为由约5至约8，而更佳地为由约7至约7.5。
根据本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防需要这种治疗的哺乳动物宿主的肺部炎症性疾病，较佳地是对于慢性阻塞性肺疾病，如慢性支气管炎、阻塞性细支气管炎、肺气肿、肺纤维化、囊性纤维化，而最佳地是对于烟草诱导的慢性阻塞性肺疾病和囊性纤维化疾病。
本发明的药物组合物可以被配制成口服，胃肠道用或局部用的剂型，特别是气雾或经鼻吸入给药的剂型，给药的局部用形式。本发明的药物组合物之递送可经由溶液，悬浮液，如微粉化的粉末混合物等。另外，本发明的药物组合物之施用可以经由例如，喷雾器，计量剂量吸入器或干粉吸入器，或设计用于这类局部施用的任何其他设备。
根据本发明的药物组合物其可以施用的剂量范围为由每天约0.05至约1000微克，较佳地是由每天约0.1至约500微克，尤其是在由每天约50至约200微克的范围。
本发明所设想的较佳的药物组合物是包含在液体溶液中的布地奈德和环糊精，最佳地是布地奈德和HP-β-环糊精。
本发明所设想的最佳的药物组合物是包含在液体溶液中的布地奈德和环糊精，其中布地奈德的浓度大约为100微克/毫升而在等渗缓冲液中的HP-β-环糊精约20毫莫耳/升。
根据本发明的药物组合物是环糊精化合物与布地奈德衍生物的组合，最佳地是化学计量比为约1：1或约2：1的布地奈德衍生物-环糊精化合物的复合物。尤其是化学计量比为约1：1的布地奈德与HP-β-环糊精的复合物。
本发明进一步针对以下的内容：
(1)一种药物组合物，其包含环糊精化合物和式(Ⅰ)的布地奈德衍生物：
其中，“R1”和“R2”各自独立地表示氢原子、卤素、C
“R3”，“R4”，“R5”和“R6”分别独立地表示氢、羟基、C
“R4”和“R5”选择性地一起形成3至5个原子的烃环，2个碳原子选择性地被氧原子替换，且该环选择性地被C
(2)依据项目1的药物组合物，其中，布地奈德衍生物/环糊精化合物的重量浓度比为约1：1500至约1：2。
(3)依据项目1的药物组合物，其中所述的布地奈德衍生物/环糊精化合物的重量浓度比为约1:60。
(4)依据项目1-3任一项的药物组合物，其中，布地奈德衍生物选自下列化合物组成之群组：糠酸莫米松、氟替卡松、糠酸氟替卡松、丙酸氟替卡松、倍他米松、丙酸倍他米松、倍氯米松、布地奈德或它们的组合和它们的药学上可接受的盐或酯。
(5)依据项目1-4任一项的包括布地奈德衍生物的药物组合物，其中，R1，R2，R6是氢；R3是羟基乙酮基而R4与R5形成1,3-二氧戊环-2-基)丙基或
(6)依据项目1-4任一项的包括布地奈德衍生物的药物组合物，其中，R1是氢，R2是Cl，R3是呋喃羧基，R4是氯甲基羰基而R5和R6是氢(糠酸莫米松)。
(7)依据项目1-4任一项的包括布地奈德衍生物的药物组合物，其中，R1和R2是氟，R3是氟甲基硫羰基，R4是呋喃羧基而R5和R6是氢(糠酸氟替卡松)。
(8)依据项目1-4任一项的包括布地奈德衍生物的药物组合物，其中，R1和R2是氟，R3是氟甲基硫羰基，R4是丙基羧基而R5和R6是氢(丙酸氟替卡松)。
(9)依据项目1-4任一项的包括布地奈德衍生物的药物组合物，其中，R2是氯，R1，R5和R6是氢，R3是丙酰基氧甲基羰基而R4是丙基羰氧基
(10)依据项目1-9任一项的药物组合物，其中，布地奈德衍生物与环糊精化合物以约1：1的化学计量比形成复合物。
(11)依据项目1-10任一项的药物组合物，其中，环糊精化合物具有至少约1.85克/100毫升的水溶解度。
(12)依据项目1-11任一项的药物组合物，其中，环糊精化合物选自下列化合物组成的群组：
β-环糊精、羟丙基-β环糊精、无规甲基化-β环糊精、二甲基-β环糊精、三甲基-β环糊精、羟丙基-β环糊精、羟丁基-β环糊精、葡糖基-β环糊精、麦芽糖基-β环糊精、2-O-甲基-β环糊精或它们的组合，及它们的药学上可接受的盐。
(13)依据项目1-12任一项的药物组合物，其中，环糊精化合物是羟丙基-β环糊精。
(14)依据项目1-13任一项的药物组合物，其中，肺炎性疾病是慢性阻塞性疾病。
(15)用于预防性治疗肺部炎性疾病的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效剂量的依据项目1-14任一项的药物组合物。
(16)用于治疗性治疗肺部炎性疾病的方法，其包括给予需要这种治疗的患者有效剂量的依据项目1-14任一项的药物组合物。
(17)依据项目15或16的治疗方法，其中，环糊精化合物和布地奈德衍生物分
别以约0.1毫克及约25毫克/剂量的标称剂量被施用。
(18)用于治疗肺部炎性疾病的患者需要的吸入系统，其包括依据项目1-14任一项的药物组合物。
(19)一种药物组合物，其包含约250微克/毫升的布地奈德和约20毫莫耳/升的HP-β-CD。
(20)一种药物组合物，其包含约100微克/毫升的布地奈德和约20毫莫耳/升的HP-β-CD。
(21)一种药物组合物，其包含约250微克/毫升的布地奈德和约10毫莫耳/升的HP-β-CD。
(22)一种药物组合物，其包含约100微克/毫升的布地奈德和约10毫莫耳/升的HP-β-CD。
(23)一种药物组合物，其包含约100微克/毫升的氟替卡松和约10毫莫耳/升的HP-β-CD。
(24)一种药物组合物，其包含约40微克/毫升的氟替卡松和约10毫莫耳/升的HP-β-CD。
(25)一种药物组合物，其包含约40微克/毫升的倍氯米松和约10毫莫耳/升的HP-β-CD。
(26)依据项目19-25任一项的药物组合物，其中，药物组合物是溶液。
(27)依据项目26的药物组合物，其中，溶液具有由约5至约8的pH值。
(28)依据项目26的药物组合物，其中，溶液具有由约7至约7.5的pH值。
(29)依据项目26的药物组合物，其中，药物组合物是溶液且溶液被进行喷雾干燥以生成粉末。
(30)依据项目29的药物组合物，其中，粉末包含约3微米的颗粒。
(31)一种药物组合物，其包含布地奈德衍生物和输送布地奈德衍生物的环糊精，其分子剂量的范围由约0.05至约1000微克。
(32)一种药物组合物，其包含布地奈德衍生物和输送布地奈德衍生物的环糊精，其分子剂量的范围由约0.1至约500微克。
(33)一种药物组合物，其包含布地奈德衍生物和输送布地奈德衍生物的环糊精，其分子剂量的范围每日由约50至约200微克。
(34)依据项目31-33任一项的药物组合物，其中，布地奈德衍生物是布地奈德而环糊精化合物是HP-β-CD。
(35)依据项目31-33任一项的药物组合物，其中，布地奈德衍生物是倍他米松而环糊精化合物是HP-β-CD。
(36)依据项目31-33任一项的药物组合物，其中，布地奈德衍生物是氟替卡松而环糊精化合物是HP-β-CD。
(37)依据项目31-33任一项的药物组合物，其中，布地奈德衍生物是倍氯米松而环糊精化合物是HP-β-CD。
(38)一种药物组合物，其包含化学计量比为约1：1至约2：1的布地奈德衍生物和环
糊精化合物的复合物。
(39)一种药物组合物，其包含化学计量比为约1：1的布地奈德衍生物和环糊精化合物的复合物。
(40)依据项目38-39任一项的药物组合物，其中，布地奈德衍生物是布地奈德而环糊精化合物是HP-β-CD。
(41)依据项目38-39任一项的药物组合物，其中，布地奈德衍生物是氟替卡松而环糊精化合物是HP-β-CD。
(42)依据项目38-39任一项的药物组合物，其中，布地奈德衍生物是倍氯米松而环糊精化合物是HP-β-CD。
(43)用于治疗需要这种治疗的哺乳动物宿主的肺部炎性疾病的方法，该方法包括
将依据项目1-14、19-42和58任一项的药物组合物给予该哺乳动物宿主。
(44)用于减少需要这种治疗的哺乳动物宿主的肺组织中的炎性细胞的方法，该方法包括
将依据项目1-14、19-42和58任一项的药物组合物给予该哺乳动物宿主。
(45)用于减少需要这种治疗的哺乳动物宿主的肺组织中的臭氧诱导的KC的产生的方法，该方法包括
将依据项目1-14、19-42和58任一项的药物组合物给予该哺乳动物宿主。
(46)用于减少需要这种治疗的哺乳动物宿主的肺组织中的IL-13的方法，该方法包括
将依据项目1-14、19-42和58任一项的药物组合物给予该哺乳动物宿主。
(47)用于减少需要这种治疗的哺乳动物宿主的支气管高反应性的方法，该方法包括
将依据项目1-14、19-42和58任一项的药物组合物给予该哺乳动物宿主。
(48)用于减少需要这种治疗的哺乳动物宿主的IL-17水平的方法，该方法包括
将依据项目1-14、19-42和58任一项的药物组合物给予该哺乳动物宿主。
(49)用于减少需要这种治疗的哺乳动物宿主的CXCL-1水平的方法，该方法包括
将依据项目1-14、19-42和58任一项的药物组合物给予该哺乳动物宿主。
(50)用于减少哺乳动物宿主的肺组织中嗜中性粒细胞的方法，该哺乳动物宿主在暴露香
烟烟雾后需要这种治疗，该方法包括
将依据项目1-14、19-42和58任一项的药物组合物给予该哺乳动物宿主。
(51)用于检测和定量含有活性成分和HP-β-CD的组合物中的HP-β-CD，而组合物不
需任何的分离或萃取的步骤，其中，HP-β-CD包含在其上的羟基基团，该方法包括：
使用HP-β-CD上的羟基基团的1H NMR的分析，来检测和量化组合物中的HP-β-CD。
(52)依据项目51的方法，其中，组合物是溶液。
(53)依据项目51或52的方法，其中，活性成分是布地奈德。
(54)依据项目51或52的方法，其中，布地奈德衍生物是布地奈德。
(55)依据项目51或52的方法，其中，布地奈德衍生物是氟替卡松。
(56)依据项目51或52的方法，其中，布地奈德衍生物是倍氯米松。
(57)依据项目51或52的方法，其中，布地奈德衍生物是倍他米松。
(58)如权利要求38-39中任一项所述的药物组合物，其中，该布地奈德衍生物是倍他米松且该环糊精化合物为HP-β-CD。
下列例子，参考文献，和图式被提供以帮助本发明的理解。可以理解到，所述之程序可以被修改而不背离本发明。
附图说明
本发明的上述和其它目的，优点和特征，及完成这些的方式，考虑以下附图和例子将变得更加明显，其中：
图1显示布地奈德在HP-β-环糊精(HP-β-CD)的浓度增加的水溶液中的溶解度；
图2显示气道阻塞和炎症的模型：组织学检查所测的支气管周围炎症的评分；
图3显示在肺的蛋白萃取物中所测定的IL-13的水平；
图4显示COPD模型：组织学检查所测的支气管周围炎症的评分；
图5显示气道反应性的测量：对接受安慰剂或治疗后的小鼠所测量的增强暂停(Penh)；
图6显示暴露臭氧的小鼠的肺蛋白萃取物中利用ELISA(酶联免疫吸附)所测定的IL-17；
图7显示暴露臭氧的小鼠的肺蛋白萃取物中利用ELISA(酶联免疫吸附)所测定的IL-13；
图8显示暴露臭氧的小鼠的肺蛋白萃取物中利用ELISA(酶联免疫吸附)所测定的KC(CXL1)；
图9显示布地奈德-环糊精对BALF的嗜中性粒细胞百分比的影响；
图10显示含有布地奈德衍生物和环糊精的复合物中的布地奈德-羟丙基-β-环糊精复合物的
图11显示含有布地奈德衍生物和环糊精的复合物中的布地奈德-羟丙基-β-环糊精复合物的1D-COSY-NMR谱。
图12显示HP-β-CD中的化学结构；
图13显示水中的HP-β-CD(δ0.6-1.5)的
图14显示考虑加权(1/X)的二次回归所得到的精确度曲线；
图15显示暴露于LPS的动物的在BALF中的嗜中性粒细胞的计数，该动物经安慰剂，布地奈德悬浮液和羟丙基-β-环糊精-布地奈德复合物的处理；
图16显示暴露于LPS的小鼠的炎症评分；；
图17显示暴露于LPS的小鼠的炎症评分；
图18显示暴露于LPS的动物的在BALF中的嗜中性粒细胞的计数的％，该动物经安慰剂，Crysmeb-二丙酸倍他米松复合物和100微克/毫升的倍他米松悬浮液的处理；
图19显示暴露于LPS的动物的在BALF中的嗜中性粒细胞的计数，该动物经安慰剂，Crysmeb-二丙酸倍他米松复合物和100微克/毫升的倍他米松悬浮液的处理；
图20显示暴露于LPS的小鼠的炎症评分，该小鼠经安慰剂，2倍浓度的二丙酸倍他米松或二丙酸倍他米松-Crysmeb复合物的处理；及
图21显示暴露于LPS的动物的在BALF中的嗜中性粒细胞的计数，该动物经安慰剂，
丙酸氟替卡松悬浮液和羟丙基-β-环糊精-丙酸氟替卡松复合物的处理。
具体实施方式
现在将提供本发明各种实施例的例子来说明本发明，但它们并非用来限制本发明。其中的份数和百分比均以重量计，除非另有规定。
例1
布地奈德与HP-β-环糊精的溶液的药物组合物
布地奈德购自Indis(比利时)而羟丙基-β-环糊精购自Roquette(法国)。约250微克/毫升
图1中，溶液的药物组合物的制备系将过量的粉末状的布地奈德加入至约5、约10、约25、约50、及约100毫莫耳/升(mM)的环糊精水溶液(使用Karl-Fischer滴定仪将水加入所计算的，准确称取适量的环糊精以得到所要的体积莫耳浓度)。混合过程需要在室温下以约350rpm(转/分)的转速连续搅拌约24小时来完成。利用0.22μm(微米)的过滤器过滤所得混合物以除去过量的布地奈德。溶液中的布地奈德的浓度以验证过的高效液相色谱法(HPLC)来证实，然后混合物用PBS-环糊精溶液(约5、约10、约25、约50及约100毫莫耳/升(mM)的以前相同的精确浓度)来稀释，以达到体内测试所要求的布地奈德的浓度。在这样的浓度，例如，约100微克/毫升或约250微克/毫升，布地奈德可溶于水/PBS中，药物组合物是呈现澄清且透明的吸入性溶液。
例1a：具有约100微克/毫升(μg/ml)的布地奈德和约10毫莫耳/升(mM)的HP-β-CD
较佳的吸入性溶液的药物制剂包含约100微克/毫升的布地奈德和约10毫莫耳/升的羟丙基β-环糊精。溶液的制备系将约0.6979克的5％水(校正的含水量)的HP-β-CD溶解在约50毫升的纯化的，无热原的水(或无菌PBS)中，加入过量的布地奈德且在室温下以约350rpm(转/分)的转速搅拌约24小时。利用0.22μm(微米)的过滤器除去过量的布地奈德。利用验证过的高效液相色谱法(HPLC)来证实所得的溶液。然后以约10mM的HP-β-CD溶液(在PBS或水中)来稀释所得的溶液，以达到约100微克/毫升的浓度的布地奈德。添加氯化钠以达到等渗性。较佳地，最终的溶液利用0.22微米的聚丙烯膜或蒸汽灭菌过程来过滤灭菌。
例1b：具有约100微克/毫升(μg/ml)的布地奈德和约20毫莫耳/升(mM)的HP-β-CD
第二个较佳的吸入性溶液的药物制剂包含约100微克/毫升的布地奈德和约20毫莫耳/升的羟丙基β-环糊精。溶液的制备系将约1.3958克的5％水(校正的含水量)的HP-β-CD溶解在约50毫升的纯化的，无热原的水(或无菌PBS)中，加入过量的布地奈德且以约350rpm(转/分)的转速搅拌约24小时。利用0.22μm(微米)的过滤器除去过量的布地奈德。利用验证过的高效液相色谱法(HPLC)来证实所得的溶液。然后以约20mM的HP-β-CD溶液(在PBS或水中)来稀释所得的溶液，以达到约100微克/毫升的浓度的布地奈德。添加氯化钠以达到等渗性。较佳地，最终的溶液利用0.22微米的聚丙烯膜或蒸汽灭菌过程来过滤灭菌。
例1c：具有约250微克/毫升(μg/ml)的布地奈德和约20毫莫耳/升(mM)的HP-β-CD
第三个较佳的吸入性溶液的药物制剂包含约250微克/毫升的布地奈德和约20毫莫耳/升的羟丙基β-环糊精。溶液的制备系将约1.3958克的5％水(校正的含水量)的HP-β-CD溶解在约50毫升的纯化的，无热原的水(或无菌PBS)中，加入过量的布地奈德且以约350rpm(转/分)的转速搅拌约24小时。利用0.22μm(微米)的过滤器除去过量的布地奈德。利用验证过的高效液相色谱法(HPLC)来证实所得的溶液。然后以约20mM的HP-β-CD溶液(在PBS或水中)来稀释所得的溶液，以达到约250微克/毫升的浓度的布地奈德。添加氯化钠以达到等渗性。较佳地，最终的溶液利用0.22微米的聚丙烯膜或蒸汽灭菌过程来过滤灭菌。
例1d：具有约100微克/毫升(μg/ml)的氟替卡松和约10毫莫耳/升(mM)的HP-β-CD
第四个较佳的吸入性溶液的药物制剂包含约100微克/毫升的氟替卡松和约10毫莫耳/升的羟丙基β-环糊精。溶液的制备系将约0.6979克的5％水(校正的含水量)的HP-β-CD溶解在约50毫升的纯化的，无热原的水(或无菌PBS)中，加入过量的氟替卡松且在室温下以约350rpm(转/分)的转速搅拌约24小时。利用0.22μm(微米)的过滤器除去过量的氟替卡松。利用验证过的高效液相色谱法(HPLC)来证实所得的溶液。然后以约10mM的HP-β-CD溶液(在PBS或水中)来稀释所得的溶液，以达到约100微克/毫升的浓度的氟替卡松。添加氯化钠以达到等渗性。较佳地，最终的溶液利用0.22微米的聚丙烯膜或蒸汽灭菌过程来过滤灭菌。
例1e：具有约40微克/毫升(μg/ml)的氟替卡松和约10毫莫耳/升(mM)的HP-β-CD
第五个较佳的吸入性溶液的药物制剂包含约40微克/毫升的氟替卡松和约10毫莫耳/升的羟丙基β-环糊精。溶液的制备系将约0.6979克的5％水(校正的含水量)的HP-β-CD溶解在约50毫升的纯化的，无热原的水(或无菌PBS)中，加入过量的布地奈德且在室温下以约350rpm(转/分)的转速搅拌约24小时。利用0.22μm(微米)的过滤器除去过量的氟替卡松。利用验证过的高效液相色谱法(HPLC)来剂量所得的溶液。然后以约10mM的HP-β-CD溶液(在PBS或水中)来稀释所得的溶液，以达到约40微克/毫升的浓度的氟替卡松。添加氯化钠以达到等渗性。较佳地，最终的溶液利用0.22微米的聚丙烯膜或蒸汽灭菌过程来过滤灭菌。
例1f：具有约40微克/毫升(μg/ml)的倍氯米松和约10毫莫耳/升(mM)的HP-β-CD
第六个较佳的吸入性溶液的药物制剂包含约40微克/毫升的倍氯米松和约10毫莫耳/升的羟丙基β-环糊精。溶液的制备系将约0.6979克的5％水(校正的含水量)的HP-β-CD溶解在约50毫升的纯化的，无热原的水(或无菌PBS)中，加入过量的倍氯米松且在室温下以约350rpm(转/分)的转速搅拌约24小时。利用0.22μm(微米)的过滤器除去过量的倍氯米松。利用验证过的高效液相色谱法(HPLC)来剂量所得的溶液。然后以约10mM的HP-β-CD溶液(在PBS或水中)来稀释所得的溶液，以达到约40微克/毫升的浓度的倍氯米松。添加氯化钠以达到等渗性。较佳地，最终的溶液利用0.22微米的聚丙烯膜或蒸汽灭菌过程来过滤灭菌。
例2
氟替卡松与HP-β-环糊精的粉末状的药物组合物
较佳的吸入性溶液的药物组合物包含约40微克/毫升(μg/ml)的来自ECIC的氟替卡松和约10毫莫耳/升(mM)的羟丙基β-环糊精。溶液的制备系将约0.6979克的5％水(校正的含水量)的HP-β-CD溶解在约50毫升的纯化的，无热原的水中，加入过量的氟替卡松且以约350rpm(转/分)的转速搅拌约24小时。利用0.22μm(微米)的过滤器除去过量的氟替卡松。利用验证过的高效液相色谱法(HPLC)来剂量所得的溶液。然后以约10mM的HP-β-CD溶液(在PBS或水中)来稀释所得的溶液，以达到约40微克/毫升的浓度的氟替卡松。最终的溶液在最佳条件下以ProCept喷雾干燥器-冷却器进行喷雾干燥，以获得合理的粉末产率(约>90％)，其颗
粒约3微米的大小。喷雾干燥的工艺系本领域技术人员所熟知。喷雾干燥器-冷却器和其干燥过程述于Procept数据表或下面数据源：
(http://www.procept.be/spray-dryer-chiller)，其全部被并入本文以作为参考。
例3
例1的药物组合物在气道阻塞和炎症的模型中的评估
3a：致敏性，过敏原的暴露和治疗方案。
其中，IP系指腹腔内注射而BHR系指支气管高反应性。
为了研究气道炎症的调节，约6至约8周龄的BALB/c小鼠在第0天(D0)和第7天(D7)经腹膜内注射约10微克的乳化在氢氧化铝(Alumlnject；Perbio，Erembodegem，比利时)的卵白蛋白(OVA)(Sigma Aldrich，Schnelldorf，德国)。随后，小鼠从第21天至第25天被暴露于过敏原，其系每日吸入超声雾化器(Devilbiss 2000)所产生约1％的卵白蛋白(OVA)气溶胶约30分钟。从第18天至第24天小鼠接受约50微升的鼻内滴注，并于第26天被处死，如先前Cataldo等人所报导的：Am.J.Pathol.161(2)：491-498(2002)，其全部被并入本文作为参考。安慰剂组的小鼠被鼻内注射PBS。
材料和方法
6到8周龄的雄性小鼠C57BL/6购自Charles River(Koln，德国)并饲养在我们的设施。所有的动物实验过程都经列日大学(University of Liège)的伦理委员会批准过。食物和水随意供给。
材料
磷酸盐缓冲盐水(PBS)购自Lonza(Verviers，比利时)，羟丙基-β-环糊精(羟丙基基团的取代度：0.62)购自Roquette(法国)，布地奈德购自Indis(比利时)而250微克/毫升的商用布地奈德悬浮液
支气管肺泡灌洗液(BALF)
在评估气道反应性之后即刻，并在最后的过敏原暴露后约24小时，处死小鼠并进行支气管肺泡灌洗，其系使用4次约1毫升的约0.05毫莫耳/升的PBS-EDTA(Calbiochem，Darmstadt，德国)，如先前CataldoDD，Tournoy KG，VermaelenK等人所描述的：Am JPathol.161(2)：491-498(2002)，其全部被并入本文作为参考。
BALF的上清液被收集用于蛋白质的评估，而细胞被用来计数不同的细胞。离心制备的细胞用苏木精-伊红((Diff-Quick，Dade，比利时)染色后依形态学标准来进行不同细胞的计数。用温和的人工抽吸来收集细胞。支气管肺泡灌洗液(BALF)经离心(在约4℃下以约1200转/分的转速进行离心约10分钟)后，上清液备冷冻在约-80℃下，用来作蛋白质的评估，而细胞沉淀物则重新悬浮于约1毫升的约0.05毫莫耳/升的PBS–EDTA中。离心制备(细胞离心涂片器)的细胞用Diff-Quick(Dade，比利时)染色，之后进行不同细胞的计数。
肺组织学检查和组织的处理
在BAL之后，胸腔被打开且左主支气管被夹紧，左肺被切下并立即被冷冻在约-80℃下以进行蛋白提取。右肺被输入4毫升的约4％的多聚甲醛，并包埋在石蜡中而用于组织的检查。从石蜡切取约5微米厚的切片，并用苏木精–依红染色。支气管周围炎症的程度以分数来评估，其系以支气管周围炎症细胞的量化来计算，如先前CataldoDD，Tournoy KG，VermaelenK等人所描述的：Am J Pathol.161(2)：491-498(2002)。当检测不到炎症细胞时，其值为0，当偶然有炎症细胞时，其值为1，当大部分支气管被薄层的炎症细胞包围(约1至约5个细胞)时，其值为2，而当大部分支气管被厚层的炎症细胞包围(>约5个细胞)时，其值为3。因每只小鼠有6-8片的随机选择的组织切片被评分，炎症分数可被表示为其平均值，且可以在群组之间进行比较。
如上所述，左肺被切下且立即被冷冻在约-80℃下，然后在液氮中使用Mikro-Dismembrator(Braun Biotech International，Gmbh Melsungen，德国)将其破碎，以形成一均质的粉末。此粉碎的肺组织于约4℃下在含有约2莫耳/升的尿素，约1莫耳/升的NaCl，和约50毫莫耳/升的Tris(pH值约7.5)的溶液中培育过夜，随后在约16 000×g下离心约15分钟以得到蛋白提取。
利用ELISA(duoset kit，R&D Systems，Abingdon，英国)并依制造商的说明来测定非汇集的肺蛋白样品的IL-13的水平。
支气管反应性的测定
小鼠经由腹膜内注射氯胺酮(约10毫克/毫升，Merial，Brussels，比利时)和甲苯噻嗪(约1毫克/毫升，VMD，Arendonk，比利时)的混合物(约200微升)而被麻醉。气管切开术之进行系将20规格的聚乙烯导管插入气管并围绕其周围将其绑扎，以避免泄漏和断开。使用
统计分析
肺组织学检查的水平的结果被表示为平均值+/-SEM，且利用变异的单向分析进行组与组之间的比较，其后进行Tukey后测。测试之执行系使用GraphPad Prism 5.显著性水平：α＝约0.05(95％信赖区间)。
药理结果
图2显示组织学测定的支气管周围炎症的评分，其系以安慰剂，约100微克/毫升的布地奈德，根据例1a的药物组合物，和约250微克/毫升的布地奈德做检查。
暴露于卵清蛋白的小鼠(安慰剂组)显示其肺组织的炎性细胞数目有显著的增加。相比于安慰剂组，暴露于约100微克/毫升的布地奈德和约10毫莫耳/升的HP-β-CD的复合物的小鼠显示，其炎性细胞数目显著减少。布地奈德(约100微克/毫升)-HP-β-CD(约10毫莫耳/升)复合物诱导出相同的炎症，其低于较高浓度(约250微克/毫升)的单独的布地奈德诱导出的炎症，并且比相同浓度(100微克/毫升)的单独的布地奈德更有显著的效果。
图3说明：在肺蛋白萃取物中所测的IL-13的水平。
使用Mikro-Dismembrator(Braun Biotech International，Gmbh Melsungen，德国)将肺粉碎。粉碎的肺组织于约4℃下在含约1莫耳/升的尿素溶液中培育过夜，用于蛋白萃取。上清液被贮存在约-80℃下，用于ELISA之检测。
比起经约250微克/毫升的布地奈德-约10莫耳/升的环糊精处理过的小鼠，经约250微克/毫升的布地奈德处理过的小鼠，显示其肺组织中有更高水平的IL-13。依类似方式，比起经约100微克/毫升的布地奈德-约10莫耳/升的环糊精处理过的小鼠，经约100微克/毫升的布地奈德处理过的小鼠，显示有更高水平的IL-13。
例4
例1a、例1b和例1c的药物组合物在COPD模型中的评估
两种不同的小鼠模型被用来仿真慢性阻塞性肺疾病(COPD)。在第一个模型中，C57BL/6的小鼠暴露于高浓度的臭氧(O
4.A臭氧模式
暴露于臭氧和治疗方案
暴露于臭氧的经历的示意性的说明报导如下：
在示意性的说明中，C57BL/6的小鼠在高浓度的臭氧(约2ppm)中暴露约3小时之前，首先接受约50毫升的鼻内注射作为前处理(第0天与第1天之间)，(第2天和第4天之间)再接受约50毫升的鼻内注射，约3小时。小鼠在第5天被处死。安慰剂组的小鼠被注射PBS。
支气管肺泡灌洗液(BALF)的分析，肺组织学的分析，支气管反应性的测量，和统计的分析如先前例1(气道炎症和高反应性)之所述。非汇集的肺蛋白样品的IL-17和KC(CXCL1)的水平，利用ELISA(duoset kit，R&D Systems，Abingdon，英国)并依照制造商的说明来测量。
药理结果
图4显示经安慰剂，依据例1a的组合物和约250微克/毫升的布地奈德的组织学所测定的支气管周围炎症的评分。相比其它组群，暴露于臭氧的小鼠(安慰剂组)显示在其肺组织中的炎性细胞数目显著增加。暴露于含有约100微克/毫升的布地奈德和约10毫莫耳/升的HP-β-CD的复合物所诱导出的相同炎性的细胞数目，少于暴露于只有较高浓度(约250微克/毫升)的布地奈德。
图5显示气道反应性的测量：小鼠接受安慰剂或根据例1a制备的药物组合物治疗后，测量其增强暂停(Penh)。
相比于其它群组，接受乙酰甲胆碱挑战的小鼠，其暴露于臭氧所诱导出的支气管高反应性预期地显著增加。相比于安慰剂组，含约100微克/毫升的布地奈德-约10毫莫耳/升的HP-β-CD的复合物诱导出的48克/升的乙酰甲胆碱的支气管高反应性显著减少。布地奈德(约100微克/毫升)-HP-β-CD(10毫莫耳/升)的复合物诱导出的相同的支气管高反应性少于单独使用较高浓度(约250微克/毫升)的布地奈德。
图6显示暴露于臭氧的小鼠的肺蛋白提取物经ELISA所测量的IL-17。
比较经HP-β-CD和单独或组合的地奈德的不同的治疗。药物组合物系依照例1a来制备，其或是组合混合物(布地奈德–HP-β-CD)或是单独的各活性化合物(约250微克/毫升的布地奈德或约10毫莫耳/升的HP-β-CD)在相同的PBS缓冲液溶液中。
相比于布地奈德(约250微克/毫升)治疗的群组，含有约250微克/毫升或约100微克/毫升或约10微克/毫升的布地奈德和10毫莫耳/升的HP-β-CD的复合物诱导出的IL-17的水平有显著下降。
IL-17的水平在暴露于臭氧后增加，且其可能参与臭氧引起的嗜中性粒细胞炎症的发病机理。这是首次证明了经由吸入布地奈德-环糊精的复合物能够减少臭氧诱导的IL-17的水平。
图7显示暴露于臭氧的小鼠的肺蛋白提取物的经由ELISA所测量的IL-13。
比较经HP-β-CD和单独或组合的地奈德的不同的治疗。药物组合物系按照例1a来制备，其或是组合混合物(布地奈德–HP-β-CD)或是单独的各活性化合物(约250微克/毫升的布地奈德或约10毫莫耳/升的HP-β-CD)在相同的PBS缓冲液溶液中。
相比于布地奈德治疗的群组(约250微克/毫升)，含有约250微克/毫升或约100微克/毫升或约10微克/毫升的布地奈德和10毫莫耳/升的HP-β-CD的复合物诱导出的IL-13的水平有显著下降
先前已显示IL-13可以经臭氧的暴露来调节，且其可以参与暴露于臭氧后的气道功能障碍。请参见，例如，Williams S.,Nath P,Leung S,等人：Eur Respir J.32(3)：571-8(2008年9月)，其全部内容被并入本文作为参考。这是第一次显示经由吸入含有布地奈德的化合物可以显著降低臭氧诱导的IL-13的水平。相比于布地奈德治疗的群组(约250微克/毫升)，含有约250微克/毫升或约100微克/毫升或约10微克/毫升的布地奈德和10毫莫耳/升的HP-β-CD的复合物诱导出的IL-13的水平有显著下降。因此，相比于吸入约250微克/毫升的布地奈德，吸入布地奈德-环糊精的复合物可以降低IL-13的水平。
图8显示暴露于臭氧的小鼠的肺蛋白提取物的经由ELISA所测量的KC(CXCL1)。
比较经HPβCD和单独或组合的地奈德的不同的治疗。药物组合物系依照例1a来制备，其或是组合混合物(布地奈德–HP-β-CD)或是单独的各活性化合物(约250微克/毫升的布地奈德或约10毫莫耳/升的HP-β-CD)在相同的PBS缓冲液溶液中。比较经HPβCD和单独或组合的地奈德的不同的治疗。药物组合物系依照例1a来制备，其或是组合混合物(布地奈德–HP-β-CD)或是单独的各活性化合物(约250微克/毫升的布地奈德或约10毫莫耳/升的HP-B-CD)在相同的PBS缓冲液溶液中。
相比于布地奈德的治疗的群组(约250微克/毫升)，含有约250微克/毫升或约100微克/毫升或约10微克/毫升的布地奈德和10毫莫耳/升的HP-β-CD的复合物诱导出的KC的水平有下降。
这是首次证明了CXCL-1可以经由吸入布地奈德的衍生物来减少，CXCL-1是细胞因子，其在暴露于刺激物或氧化剂后嗜中性粒细胞在支气管壁起着关键性作用。减少臭氧诱导的KC的产生的仅是布地奈德-环糊精的复合物。
4.B香烟烟雾暴露的模型
暴露于香烟和治疗方案
使用
支气管肺泡灌洗液(BALF)的分析如先前例3(气道阻塞和炎症模型)之所述。
统计分析
支气管肺泡灌洗液中的炎症细胞的数目的结果被表示为平均值+/-SEM，且使用Mann-Whitney检验来执行组间的比较。使用GraphPad Prism 5.来执行测试。P值<0.05被认为是显著的。
药理结果
在本实验中，依照例1b和1c的药物组合物被用作特定的吸入溶液，其包括：
·约100微克/毫升的布地奈德和约20毫莫耳/升的羟丙基-β-环糊精(例1b)
·约250微克/毫升的布地奈德和约20毫莫耳/升的羟丙基-β-环糊精(例1c)
将它们用来与单独的约500微克/毫升的布地奈德的溶液做比较。
图9显示布地奈德-环糊精的混合物对于在BALF中的嗜中性粒细胞百分比的影响。
表1：在肺泡灌洗液中的嗜中性粒细胞百分比(+/-SEM)
相比于假暴露的小鼠，暴露于香烟烟雾的小鼠显示在他们的支气管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜中性粒细胞数目有显著的增加。相比于暴露于香烟烟雾的小鼠，暴露于所有测试浓度的布地奈德-HP-β-CD(约20毫莫耳/升)的复合物的小鼠所诱导的嗜中性粒细胞的数目有显著的减少。相比于单独使用较高浓度(约500微克/毫升)的布地奈德，所有的布地奈德-HP-β-CD(约20毫莫耳/升)的复合物所诱导出的减少更多。只有布地奈德明显无效降低治疗的小鼠的肺泡灌洗液中的炎症的水平。
例5
复合的布地奈德衍生物-环糊精
因为HP-β-CD碳水化合物不含发色团，故UV检测是不可行的。到现在为止，没有技术被描述用于水溶液药物中的HP-β-CD的定量。因为NMR谱仪被广泛用来了解CD和药物之间的相互作用，并评估取代的吡喃葡萄糖单元的数目(摩尔取代度)，1H核磁共振光谱法被应用于水溶液中的HP-β-CD的检测和定量。
材料
HP-β-CD(摩尔取代度＝0.64)是由Roquette(法国)善意捐赠。
三甲基硅烷基-3-丙酸-d4(TMSP)和氧化氘(约99.96％D)购自Eurisotop(Gif-sur-Yvette，法国)。
马来酸得自Sigma-Aldrich。
样品的制备
在验证过程中，HP-β-CD的标准溶液被稀释在
较佳的布地奈德-HP-β-CD的药物组合物系根据例1a来制备，但其等渗缓冲液以D
NMR的测量
利用运作于约298°K下约500.13兆赫的Bruker Avance光谱仪，D
为了特别检测HP-β-CD，其重点在于羟丙基基团。因此，来自甲基的双峰的峰面积于约1.1ppm被测量，其是羟丙基基团(图10b)的一部分。当HP-β-CD与布地奈德共存时，此特定峰值也可以被定量。在约1.1ppm的高峰仍然可以被量化，并保持没有布地奈德时的相同的面积(图10a)。其他峰也可被用于HP-β-CD的量化，包括在约5.2ppm的峰。
方法的验证
方法的验证以三个系列的实验进行。以下的标准被测试：选择性、特异性(相比于β-环糊精)、响应函数(校正曲线)、线性、精确度(重复性和中间精密度)、正确度、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、基质效应及精度。总误差被用作验证过程的决定标准。可接受的限度被设定为约+/-7.5％，而获得在这些限制范围内的未来的结果的最低的概率被设定于β＝约95％(β-期望限制)。因此，该技术在上述范围内是有效的。
图11显示HP-β-CD-布地奈德的复合物的1D-COSY谱。
依据K.A.Connors：Chem.Rev.97：1325-1357(1997)，其全部被并入本文作为参考，众所周知，HP-β-CD的H-3和H-5质子位于环糊精空腔内部，与这些质子相关的论文均建议布地奈德或布地奈德的一部分被包含在HP-β-CD的内部。
事实上，两个相关点(约7.4-7.5ppm及约5.8-6.1ppm)表示布地奈德芳环之间的相互作用，其H-5HP-β-CD质子建议导致水溶性复合物的包容。
例6
使用作为质量控制的工具的1H NMR光谱仪来检测和量化溶液中的2-羟丙基-β-环糊精
环糊精(CDs)是由连接-1,4-吡喃葡萄糖单元所形成的环状寡聚糖，其形成包括疏水空腔的截头的圆锥状的结构。最常用的天然环糊精由6个、7个或8个吡喃葡萄糖单元所构成，通常分别被命名为α-、β-和γ-环糊精。为了降低毒性，并提高水溶解度，一些衍生物被开发。其中，2-羟基丙基-β-环糊精(HP-β-CD)(图12)被广泛地应用于药物制剂中，经由水溶性包合复合物的形成，以提高疏水性药物的水溶解性，稳定性和生物利用度。
根据USP和EP准则，药物赋形剂的特性和量化方法应加以界定。由于HP-β-CD的碳水化合物不含发色团，UV检测是不可行的。因此，虽然用于CDs的量化的一些技术已被说明，但其中没有一个被开发用于药物水溶液中的HP-β-CD的量化。
因为NMR光谱仪被广泛用来了解CD和药物之间的相互作用，并评估取代的吡喃葡萄糖单元的数目(摩尔取代度)，1H核磁共振光谱法被应用于在本研究中，以执行水溶液中HP-β-CD的检测和定量。
实验方法
材料
HP-β-CD(摩尔取代度＝0.64)由Roquette(法国)善意捐赠。
三甲基硅烷基-3-丙酸-d4(TMSP)和氧化氘(约99.96％D)购自Eurisotop(Gif-sur-Yvette，法国)。
统计分析以e-新软件(Arlenda，Liege，比利时)进行。
样品的制备
为验证过程，HP-β-CD的标准溶液被稀释在
NMR的测量
利用运作于约298°K下约500.13兆赫的Bruker Avance光谱仪，所有样品被记录用来作为质子信号的采集。该仪器配备具有Z梯度的5毫米的TCI冷冻探针。1D NOESY-presat序列(64次扫描)被用来尽量减少水的信号。马来酸被用来作为量化的内部标准和零点校准的TMSP。
结果与讨论
水中HP-β-CD的检测和定量(1H-NMR)
特别为了检测HP-β-CD，其关键点在于羟丙基基团。因此，来自甲基的双峰的峰面积于约1.1ppm被测量，其是羟丙基基团(图13)的一部分。当HP-β-CD不是单独在水中时，此特定峰值也可以被定量。实际上，包含HP-β-CD和皮质类固醇的溶液可以被实现，其被包含于环糊精，并于约1.1ppm的峰仍然可被量化且一直保持与没有皮质类固醇时相同的面积。
方法的验证
方法的验证以三个系列的实验进行。以下的标准被测试：选择性、特异性(相对于β-环糊精)、响应函数(校正曲线)、线性、精确度(重复性和中间精密度)、正确度、检出限(LOD)、定量限(LOQ)、基质效应及精度(图3)。总误差被用作验证过程的决定标准。可接受的限度被设定为约+/-7.5％，而获得在这些限制范围内的未来的结果的最低的概率被设定于β＝约95％(β-期望限制)。
如图14之所示，由绿色点表示的逆算浓度的相对误差散布于相对偏差(红线)的周围，且被包含在由虚线表示的β-期望公差极限之间。因此，该技术在上述范围内是有效的。
在本研究中，首次发展出新颖且有用的分析技术，用来检测和量化溶液中的HP-β-CD。此技术可用于如肠胃溶液的药物溶液的剂量。此方法显示至少有两个主要的优点：快速和便利。事实上，NMR测定只需约8分钟，而样品的制备只需要简单添加可抑制水的信号和量化羟丙基的峰面积的分子即可。因此，测量可以直接地被实现于药物溶液(含活性成分)，而不需任何的分离或萃取的步骤。
例7
布地奈德对LPS/COPD动物模型的影响
材料与方法
小鼠
6至8周龄的雄性的C57BL/6的小鼠购自Charles River(Koln，德国)，并饲养在我们的设施。所有的动物实验和程序都经列日大学的伦理委员会的批准。食物和水随意供给。
材料
磷酸盐缓冲盐水(PBS)，如下面数据源之报告：
http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_Phosphate_Buffered_Saline_PBS.pdf，其购自Lonza(Verviers，比利时)，羟基丙基-β-环糊精购自Roquette(法国)，布地奈德购自Indis(比利时)而约250微克/毫升的商用的布地奈德的悬浮液
暴露于脂多醣(LPS)的测定和环糊精-布地奈德的治疗
小鼠(n＝7/组)在每日滴注之前用约2.5％的异氟烷/氧混合物来麻醉。小鼠在第0，1，2，3天被滴注约50微升的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(安慰剂组)或约50微升的羟丙基-β-环糊精-布地奈德的复合物，或约50微升的约250微克/毫升的商业布地奈德的悬浮液
肺的细胞学和组织学
在实验方案结束时，动物被处死，且执行支气管肺泡灌洗液(BALF)的步骤，其系经由4X1毫升的约0.05毫莫耳/升的PBS-EDTA溶液(Calbiochem，Darmstadt，德国)的气管内滴注。BALF的上清液被收集，用于蛋白质的评估，而细胞被用于不同细胞的计数。经苏木精-伊红(Diff-Quick，Dade，比利时)染色后，细胞计数基于形态学标准执行于细胞离心的样品。
执行支气管肺泡灌洗液的步骤后，左主支气管被夹住且左肺被切除，并保持于约80℃下。右肺在约25厘米的压力下输注约4％的多聚甲醛，并被包埋在石蜡中。6个约5微米的切片被随机采集，并用苏木精和伊红(HE)染色。每个后续的切片与前一个相隔开约50微米。载玻片用Hamamatsu nanozoomer(奈米伸缩镜头)HT 2.0扫描，并利用前面所述的炎症评分系统在数字化载玻片上将炎症量化。请参见，例如Cataldo等人：Am J Pathol(2002)，其全部被并入本文作为参考。
结果
支气管-肺泡灌洗的细胞学检查
相比于安慰剂处理的动物，经布地奈德的悬浮液和羟丙基-β-环糊精-布地奈德的复合物处理的实验动物，在其BALF中所测得的中性粒细胞的数目有显著降低。请参见图15。
肺薄壁的炎症的测量
令人惊奇地，比起用安慰剂和布地奈德的悬浮液处理的动物，经暴露于LPS且经羟丙基-β-环糊精-布地奈德的复合物处理过的动物，显示出LPS诱导的发炎有显著降低。请参见图16。
例8
二丙酸倍他米松(微粉化的起始材料)
溶液被制备于PBS缓冲液的约20毫莫耳/升的Crysmeb溶液中。约5.08克的Crysmeb被溶解在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的缓冲液中。PBS购自Lonza(Verviers,，比利时)，如下面资料源之报告：
http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_Phosphate_Buffered_Saline_PBS.pdf，其全部被并入本文作为参考。
将约25至约30毫克的二丙酸倍他米松(过量)添加入饱和的溶液中，并在约25℃下轻轻混合约48小时。
饱和溶液通过0.22微米的过滤，并利用验证过的高效液相色谱法(HPLC)测定在滤液中的二丙酸倍他米松的含量。
制备的二丙酸倍他米松的溶液的浓度为约147克/毫升。
例8a：100微克/毫升的二丙酸倍他米松溶液
用约20毫莫耳/升的Crysmeb PBS溶液将约34毫升的147微克/毫升的溶液，如上述制备，稀释至约50毫升(高效液相色谱(HPLC)检测＝约99.00微克/毫升)。
在层流条件下使溶液通过0.22微米加以过滤，以使稀释溶液灭菌。无菌的二丙酸倍他米松的溶液的浓度为约100微克/毫升。
例8b：50微克/毫升的二丙酸倍他米松溶液
用约20毫莫耳/升的Crysmeb PBS溶液将约17毫升的147微克/毫升的溶液，如上述制备，稀释至约50毫升(高效液相色谱(HPLC)检测＝约49.64微克/毫升)。
在层流条件下使溶液通过0.22微米加以过滤，以使稀释溶液灭菌。无菌的二丙酸倍他米松的溶液的浓度为约50微克/毫升。
例8C：参考悬浮液
因为没有商业用二丙酸倍他米松的溶液；因此，参考二丙酸倍他米松的溶液需根据以下配方来制备：
二丙酸倍他米松 10.0毫克
Tween 80(聚山梨醇酯80) 00.1毫克
PBS缓冲液q.s.ad 100.0毫升
在层流条件下制备悬浮液
注：在反应釜中，二丙酸倍他米松会劣化；因此，其应在使用前才制备。
例9
丙酸氟替卡松(微粉化的起始材料)
根据以下的制备方法，HPβCD和Crysmeb二者都能够溶解丙酸氟替卡松(FP)。
例9a：共蒸发的中间产物
将约1.5克的HPβCD溶解于100毫克的纯乙醇中。随后将约25毫克的丙酸氟替卡松溶解于50毫克的纯乙醇中。一旦溶解了，将溶液合并，并在真空下蒸发至干。
例9b：250微克/毫升的丙酸氟替卡松的溶液
将共蒸发物，如上面例8a的制备，分散于约100毫升的PBS缓冲液中，以制得悬浮液。悬浮液经高压釜灭菌，以产生具有约250微克/毫升的FP和约10毫莫耳/升的HPβCD的浓度的FP溶液(以HPLC测定FP，其约238微克/毫升)。
例9c：100微克/毫升的丙酸氟替卡松的溶液
用约10毫莫耳/升的HPβCD溶液来稀释250微克/毫升的溶液，如上面例8b之制备，(约8.4毫升的238微克/毫升+约11.6毫升的PBS中的HPβCD)。悬浮液经由高压釜灭菌，以产生具有约100微克/毫升的FP和约10毫莫耳/升的HPβCD的浓度的FP溶液。
例9d：50微克/毫升的丙酸氟替卡松的溶液
用约10毫莫耳/升的HPβCD溶液稀释250微克/毫升的溶液，如上面例8b之制备，(约4.2毫升的约238微克/毫升+约15.6毫升的PBS中的HPβCD)。悬浮液经由高压釜灭菌，以产生具有约50微克/毫升的FP和约10毫莫耳/升的HPβCD的浓度的FP溶液。
例9的参考产品是辅舒酮的悬浮液。
例10
二丙酸倍他米松对LPS/COPD动物模型的影响
材料与方法
小鼠
6至8周龄的雄性的C57BL/6小鼠购自Charles River(Koln，德国)，并饲养在我们的设施。所有的动物实验和程序都经列日大学伦理委员会的批准。食物和水随意供给。
材料
磷酸盐缓冲盐水(PBS)，如下面数据源之报告：
http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_Phosphate_Buffered_Saline_PBS.pdf，其购自Lonza(Verviers，比利时)，crysmeb购自Roquette(法国)，二丙酸倍他米松购自ACIC(加拿大)而tween80经由SigmaAldrich购自ICI。对于小鼠的给药，例8所生产的产品被测试。
暴露于脂多醣(LPS)的测定和环糊精-二丙酸倍他米松之治疗
小鼠(n＝10/组)在每日滴注之前用约2.5％的异氟烷/氧混合物来麻醉。在第0，1，2，3天，小鼠被输注约50微升的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(安慰剂组)，或约50微升的Crysmeb-二丙酸倍他米松的复合物，或约50微升的倍他米松的悬浮液，如根据例8所制备的。在第4天，小鼠被处死。在治疗给药后6小时，小鼠气管内被滴注LPS(约1微克/100微升的PBS，来自E.Coli，InvivoGen，San Diego，CA，美国的超纯的脂多醣)，在第1和3天为2次。
肺细胞学和组织学
在实验方案结束时，动物被处死且进行支气管肺泡灌洗液(BALF)的步骤，其系经由4X1毫升的PBS-EDTA 0.05毫莫耳/升的溶液(Calbiochem，Darmstadt，德国)的气管内滴注。收集BALF的上清液用于蛋白质的评估，而细胞用于不同细胞的计数。经苏木精-伊红(Diff-Quick，Dade，比利时)染色后，细胞离心制备的样品依据形态学标准进行不同细胞的计数。
在支气管肺泡灌洗液的步骤进行之后，左主支气管被夹住且左肺被切除，并保存在-80℃下。右肺在约25厘米的压力下被输注约4％的多聚甲醛，并包埋在石蜡中。6片约5微米的切片被随机采集，并用苏木精和伊红(H.E)染色。每个后续的切片与前一个相隔开约50微米。载玻片用Hamamatsu nanozoomer(奈米伸缩镜头)HT 2.0扫描，且利用前面所述的炎症评分系统对数字化载玻片进行炎症的定量。请参见，例如，Cataldo等人：Am J Pathol(2002)，其全部被并入本文作为参考。
结果
支气管肺泡冲洗液的细胞学检查
相比于安慰剂处理的动物，经二丙酸倍他米松悬浮液和Crysmeb-二丙酸倍他米松的复合物治疗后的实验动物，其在BALF中的嗜中性粒细胞的数目被降低并不显著。请参见图18和图19。
肺薄壁炎症的测量
令人惊奇地，比起用安慰剂和布地奈德(约100微克/毫米)的悬浮液处理的动物，经暴露于LPS且经约100微克/毫升的Crysmeb-二丙酸倍他米松的复合物处理过的动物，显示出LPS诱导的发炎有显著降低。请参见图17。
并且，比起用安慰剂处理过的动物，暴露于LPS且经约50与约100微克/毫升的Crysmeb-二丙酸倍他米松的复合物及约50微克/毫升的倍他米松的悬浮液处理过的动物，显示出LPS诱导的发炎有显著降低。比起安慰剂组，约100微克/毫升的氟替卡松参考组也显示有降低的效果但不显著。
此外，比起约100微克/毫升的氟替卡松参考组，约100微克/毫升的Crysmeb-二丙酸倍他米松的复合物也显著降低炎症。请参见图20。
例11
丙酸氟替卡松对LPS/COPD动物模型的影响
材料与方法
小鼠
6至8周龄的雄性的C57BL/6小鼠，购自Charles River(Koln，德国)，并饲养在我们的设施。所有的动物实验和程序都经列日大学的伦理委员会的批准。食物和水随意供给。
材料
磷酸盐缓冲盐水(PBS)，如下面来源之报告：
http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_Phosphate_Buffered_Saline_PBS.pdf，其购自Lonza(Verviers，比利时)，羟基丙基-β-环糊精购自Roquette(法国)，丙酸氟替卡松购自ACIC(加拿大)而约250微克/毫升的商业的丙酸氟替卡松悬浮液
暴露于脂多醣(LPS)的测定和环糊精-丙酸氟替卡松的治疗
小鼠(n＝10/组)在每日滴注之前用约2.5％的异氟烷/氧混合物来麻醉。在第0、1、2、3天，小鼠被灌输约50微升的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(安慰剂组)，或约50微升的羟丙基-β-环糊精-丙酸氟替卡松的复合物，或约50微升的市售的约250微克/毫升的丙酸氟替卡松的悬浮液
肺细胞学和组织学
在实验方案结束时，动物被处死且进行支气管肺泡灌洗液(BALF)的步骤，其系经由4X1毫升的0.05毫莫耳/升的PBS-EDTA溶液(Calbiochem，Darmstadt，德国)的气管内滴注。收集BALF的上清液用于蛋白质的评估，而细胞用于不同细胞的计数。经苏木精-伊红(Diff-Quick，Dade，比利时)染色后，细胞离心制备的样品依据形态学标准进行不同细胞的计数。
在支气管肺泡灌洗液的步骤进行之后，左主支气管被夹住，左肺被切除，并保存在-80℃下。右肺在约25厘米的压力下被输注约4％的多聚甲醛，并包埋在石蜡中。6片约5微米的切片被随机采集，并用苏木精和伊红(H.E)染色。每个后续的切片与前一个相隔开约50微米。载玻片用Hamamatsu nanozoomer(奈米伸缩镜头)HT 2.0扫描，且利用前面所述的炎症评分系统对数字化载玻片进行炎症的定量。请参见，例如，Cataldo等人：Am J Pathol(2002)，其全部被并入本文作为参考。
结果
支气管-肺泡冲洗液细胞学检查
相比于安慰剂治疗的动物，用约250微克/毫升的羟丙基-β-环糊精-丙酸氟替卡松的复合物治疗的动物，其BALF中测得的嗜中性粒细胞的数量有令人惊讶的降低。相比于安慰剂，约250微克/毫升的丙酸氟替卡松悬浮液，其嗜中性粒细胞的数量有降低，但并不显著。请参见图21。
刊物
Frederick G.Vogt及Mark Strohmeier:“药物-环糊精复合物的夹杂物的二维固态核磁共振的分析”,Molecular Pharmaceutics.9:3357-3374(2012).
Agüeros,M.,Campanero,M.A.,Irache,J.M.:“以高效液相色谱-蒸发光散射检测对不同的环糊精和Gantrez的同时定量”,J.Pharm.Biomed.Anal.39:495-502(2005).
Thorsteinn Loftsson and Marcus E.Brewster:“环糊精的制药应用：基础科学和产品开发”,J.Pharm.Pharmacol.62:1607-1621(2010).
Szeman,J.,Gerloczy,A.,Csabai,K.,Szejtli,J.,Kis,G.L.,Su,P.,Chau,R.Y.,Jacober,A.:“基于环糊精增强荧光对不同生物体液中的2-羟丙基-γ-环糊精的高效液相色谱法的测定”.J.Chromatogr.B.774:157-164(2002).
此处所引用的所有刊物的完整的公开内容全部被并入本文作为参考，如同各单独地整个被阐述并被并入在本说明书。
对于本领域的技术人员而言，本发明的各种修改和变更将变得明显而不脱离本发明的范围和精神。说明性的实施例和例子仅是被提供用作示例性，并非用来限制本发明的范围。本发明的范围仅由阐述如下的权利要求所限定。
机译： 包含环糊精和布地奈德衍生物的组合物，用于治疗和预防肺部炎症
机译： 包含环糊精和布地奈德衍生物的组合物，用于治疗和预防肺部炎症
机译： 包含环糊精和布地奈德衍生物的组合物，用于治疗和预防肺部炎症
