一种针对CD19的PDL1的新型双靶点CAR T细胞结构EM2设计

摘要

本发明提供一种新型的CAR‑T结构能特异性的杀伤表达CD19的肿瘤细胞，同时还可反转PD1‑PDL1的免疫抑制信号，但又能对只表达PDL1的细胞不产生杀伤效应。其结构如附图1所示，其中1为CD19scFv(a single‑chain variable fragment单链可变区)、2为连接段(linker)、3为PD1‑EM(extramembrane胞外段)、4为4‑1‑BB(T细胞共刺激分子)、5为CD3ζ。

说明书

技术领域

本发明属于一种新型的嵌合型抗原受体免疫(chimeric antigen receptor) T细胞的结构设计，不仅可以特异性的杀伤表达CD19的肿瘤细胞，而且还可以反转PD1-PDL1免疫抑制信号，且不引起对仅表达PD-L1细胞的特异性杀伤的脱靶效应(on target offtumor effect)。

背景技术

肿瘤的免疫抑制微环境免疫抑制肿瘤微环境(TIME)已被认为是影响嵌合抗原受体CAR T细胞(尤其是实体肿瘤)疗效的主要问题。程序性死亡-1(PD- 1；CD279)是一种位于细胞表面的I型跨膜受体，是T细胞、B细胞、NK细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞甚至活化的血管内皮细胞上表达最广泛的T细胞抑制受体。PD-1通路在时间上似乎是一个“主开关”，因为在某些情况下，单一剂量的抗PD治疗可以将肿瘤部位的高度抑制环境逆转。许多癌症类型过度表达PD-L1，通过PD-1/PD-L1相互作用损害T细胞的抗肿瘤反应和逃避免疫系统。近年来，使用抗PD-1和/或抗PD-L1单克隆抗体(monoclonal antibody- mAbs)的免疫治疗在许多癌症类型中取得了显著的临床成功，包括黑色素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。然而，这些治疗费用相当昂贵，而且其益处依赖于特异性抗肿瘤T细胞的存在。此外，表面抑制受体如PD-1、LAG-3、TIM-3和CTLA-4的表达上调是由于CAR T细胞功能减退所致在一些临床研究中观察到PD-1对CAR T细胞的上调作用，并结合PD-1阻断可提高CAR T细胞的临床疗效。综上所述，这些结果支持将 CAR T细胞与PD-1阻断相结合的策略。许多使CAR T细胞逆转或阻断免疫抑制PD-1/PD-L1信号的策略，如PD1CD28开关受体、PD-1/PDL1抗体单链可变片段(scFv)分泌、PD-1基因敲除和敲除等，在临床前研究中取得了显著进展。然而，研究表明，PD-1基因敲除或敲除降低了T细胞的增殖活性，促进了 T细胞的耗竭，这表明在不破坏T细胞内在PD-1的情况下，将CAR T细胞和PD-1疗法结合起来是一种更好的方法。

PD-L1在癌症中的过度表达为以PD-L1为靶点的CAR T治疗开辟了可能，但其在正常组织中的广泛表达迄今为止一直使科学家们感到沮丧。据报道，检查站封锁导致免疫相关的不良事件。例如，结肠炎和垂体炎显然更常见于抗CTLA- 4治疗，而肺炎和甲状腺炎似乎更常见于抗PD-1治疗。确切的病理生理学基础尚不清楚，但其与免疫检查点在维持免疫内环境稳定中的作用的关系已被假设。因此，由T细胞直接靶向PD-L1可能在理论上杀死PD-L1

同时，细胞因子释放综合征(CRS)是最显著和严重的T细胞治疗诱导的毒性，这是由活化的T细胞释放大量细胞因子和激活其他免疫细胞引起的，最重要的是巨噬细胞。含有CD28共刺激结构域的CARs明显比4-1BB具有更高的 CRS风险和更短的持续时间，这可能是由于CD28诱导的更强烈的CAR免疫反应、更快的T细胞活化、增殖和细胞溶解。此外，严重的CRS与高肿瘤负荷和高剂量的CAR T细胞相关。综上所述，一种分泌较少细胞因子并诱导较轻全身免疫反应的新型CAR T细胞可能更安全。

基于上述考虑，我们在CD19靶向CAR区的跨膜区(TMD)旁加入PD-1胞外区，构建了一种新的靶向CD19和PD-L1的双特异性CAR-T细胞，我们称之为EM

发明内容

本发明提供一种新型的CAR-T结构能特异性的杀伤表达CD19的肿瘤细胞，同时还可反转PD1-PDL1的免疫抑制信号，但又能对只表达PDL1的细胞不产生杀伤效应。其结构如附图1所示，其中1为CD19scFv(a single-chain variable fragment单链可变区)、2为连接段(linker)、3为PD1-EM (extramembrane胞外段)、4为4-1-BB(T细胞共刺激分子)、5为CD3ζ。

CD19单链抗体包含SEQ 1序列。连接段包含SEQ 2序列。PD1-EM包含 SEQ 3序列。4-1-BB包含SEQ 5序列。CD3ζ包含SEQ 6序列。PD1-EM与4- 1-BB之间为包含SEQ 4的CD8跨膜序列。

附图说明

附图1 不同CAR T的结构示意图；

附图2 CAR T制备的流程图；

附图3 不同结构的CAR T细胞CAR的表达效率；

附图4 同结构的CAR T细胞对于CD19

附图5 不同结构的CAR T细胞和肿瘤细胞孵育后细胞因子的释放；

附图6 2nd和EM2

附图7 不同结构的CAR T细胞和肿瘤细胞孵育后细胞因子的释放；

附图8 不同CAR T细胞对于CD19蛋白的亲和力；

附图9 不同的CAR T细胞培养至7天的表型变化；

附图10 不同效应细胞和NALM-6细胞孵育之后免疫抑制marker的表达；

附图11 NSG负瘤NALM-6-PDL1小鼠的动物实验步骤；

附图12 不同效应细胞和NALM-6细胞孵育之后免疫抑制marker的表达；

附图13 NSG负瘤NALM-6-PDL1小鼠的动物肿瘤负荷的荧光成像图，肿瘤负 荷，生存曲线和细胞因子释放图。

具体实施方式

本发明的EM2结构，从5’起顺次连接：SEQ 7信号肽序列、SEQ 1的CD19scfv 序列、SEQ 2连接序列、SEQ 3的PD1-EM序列，SEQ 4的CD8跨膜区序列、SEQ 5的4-1BB序列、SEQ 6的CD3ζ序列。

一、材料

1.标本采集：实验所用的人外周单个核淋巴细胞来源于307医院健康供者，报经医院伦理委员会批准(伦理编号：Ky-2018-5-37)并征得供者同意。

2.实验用试剂：CD3，CD28分选并活化T细胞磁珠(美国，Gibco公司)，IL-2 (中国，双鹭)，X-VIVO-15(美国，公司lonza)，胎牛血清(FBS，美国Gibco 公司)，Ficoll淋巴细胞分离液(美国GE医疗集团),FITC-CD 19(20-291)(中国，Acro)；CD3-precp,TIM-3-APC，BCL-2-PE，CTLA-4-APC，CD19-APC(美国， biolegend)；PDL1-PE，CD45RA-FITC，PD1-APC，CD62L-PECD4-FITC/CD8- PE/CD3-Precp(美国，BD公司)

二、方法

(一)所有CAR T细胞的结构如附图1所示：

实验分组：

实验组，其CAR T结构为——

CD19scfv-linker-PD1 EM-CD8TM-4-1BB-CD3ζ(以下简称EM1组)

对照组，其CAR T结构分别为——

1.未进行修饰的T细胞，

2.CD19scfv-CD8hinge+TM-4-1BB-CD3ζ(简称2nd)

3.CD19scfv-CD8hinge+TM-4-1BB-CD3z-T2A-PD1EM-CD28TM+IM(简称switch

4.CD19scfv-linker-PD1 EM-CD8hinge+TM-4-1BB-CD3ζ组(简称OR- gate

(二)其中所有结构的详细序列见-细胞制备其流程图，如附图2所示：

(三)在第5-6天检测不同结构CAR T细胞的CAR的表达效率：(检测荧光耦合蛋白：CD19-FITC可以特异性的和CD19scfv进行结合)

采用BD C6流式检测仪，取培养前及培养后细胞悬液50ul均分为1管，每管各加入CD19-FITC(1ug)流式蛋白，各管涡旋震荡后室温下避光孵育60min，加入适量PBS(1％BSA)，400×g室温水平离心3min，弃上清液——进行两遍，加入PBS 100μl上机测定。结果见附图3所示：

三、CAR T细胞和表达不同抗原的细胞孵育进行杀伤实验以验证其安全性和有效性：

实验方法：

具体实验流程如下所示：

1)用CSFE荧光染料将靶细胞进行染色

2)将靶细胞和效应细胞在EP管中进行混合，进行共孵育12-16小时

3)离心。倒出上清，并加入1ml PBS，然后继续离心，到处上清；

4)在每管中加入结合缓冲液Binding buffer 200ul,7AAD 5ul,Annexin-V- APC5ul，充分混匀后，避光室温孵育15分钟

5)一个小时内将所有样本上流式细胞仪检测完毕，我们认为FITC

细胞染色的具体方法如下：

a.将靶细胞取出用PBS进行洗涤一遍，然后计数；

b.按照1ul细胞染料：10

c.然后避光孵育15min,之后加入适量的培养基(带血清)将细胞密度调整到需要的密度即可使用。

有效性和安全性的验证结果：

在CD19

小结：EM2

四、不同的CAR T细胞和相应的效应细胞进行共孵育其IFN-γ，IL-21，TNF-α， IL-10，IL-2，IL-6分泌的情况：

(一)实验方法：

将不同的CAR T细胞和相应的靶细胞按照1:1至2×10

(二)检测结果见附图5：

结论：表达EM2

五、不同结构的CAR T细胞在培养过程中的增殖情况以及和相应的靶细胞共孵育之后的特异性增殖情况；

(一)不同结构的CAR T细胞在培养过程中的增殖情况见附图6：

培养条件：

培养基为X-VIVO-15，IL-2-100u/ml,CD3，CD28磁珠活化；在培养过程中一直让其细胞密度处于5×10

(二)特异性增殖情况

采用培养第九天的CAR T细胞，然后和不同的靶细胞进行孵育，过48小时后检测不同CAR T细胞的细胞数来确定CAR T细胞的特异性增殖情况，如附图7) 所示：

结果显示EM2

六、检测不同结构的CAR T细胞和CD19蛋白亲和力的检测：

实验目的：我们通过检测不同CAR-T细胞对于不同浓度下的CD19蛋白的结合强度，从而确定出他们对CD19蛋白的亲和力。

试剂信息：

实验仪器

实验方法：

细胞中加入洗液(PBS+1％BSA)，离心洗两次；加入CD19-FC蛋白(11880- H02H)至终浓度依次为180μg/mL、72μg/mL、28.8μg/mL、11.52μg/mL、 4.61μg/mL、1.84μg/mL、0.74μg/mL、0.29μg/mL、0.12μg/mL、0.05μg/mL， 4℃避光孵育45min，加入洗液离心洗细胞2次；加入10μL Goat Anti-Human- IgG(Fc)/FITC，4℃避光孵育20min，加入洗液离心洗细胞2次，上机检测。

实验结果，如附图8所示：

结果表明：EM2

我们采用：

TSCM：CD45RA+，CD45RO+，CCR7+，

CM：CD45RA-，CD45RO+，CCR7+，

EM：CD45RA-，CD45RO+，CCR7-。

其中简称：CM,central memory-中枢记忆型细胞；EM,effector memory-效应记忆型细胞；TSCM,stem memory T cell-干性记忆型T细胞，

八.不同CAR T细胞和表达CD19的肿瘤细胞NALM-6孵育完毕之后，其免疫抑制marker的表达情况，如下附图10所示：

实验方法：

我们将培养至9天的效应细胞分别按照1:1(5×10

小结：我们通过比较Mock-T细胞,2nd和EM2

九.研究不同的CAR T细胞对于NSG小鼠负瘤(NALM-6-PDL1)的控制情况：实验目的：研究表达不同结构的CAR的效应细胞，对于NSG小鼠负瘤(NALM- 6-PDL1)的控制情况；

实验步骤，见附图11：

1.建立肿瘤模型：取6-8周的雌性NSG小鼠，然后在第0天接种10

2.在第3天，对所有小鼠进行活体成像，根据肿瘤负荷将小鼠随机分成3组，每组六只；

2.在第4天：T细胞，2nd，Switch

3.分贝在第5,9,16,20天尾静脉采血，检测小鼠体内的细胞因子；

4.第7,14,21天，对小鼠再次进行活体成像，检测小鼠体内的肿瘤负荷。

实验结果，其结果见附图12：

1. EM2

2. 2nd CAR T细胞并不能有效控制高表达免疫抑制分子PDL1的肿瘤细胞；

十.在1:1的E:T条件下，用NALM-6-PDL1细胞刺激第2代v.s.EM2PD-1CAR T细胞48小时后，所选富含基因的途径的热图显著上调或下调。对于每个路径，计算单个样本富集分数，并取每个响应组的平均值。从深蓝到深红的颜色梯度表明了富含诱导(红色)或抑制(蓝色)基因的途径的平均标准化富集分数(从-2到+2)。

其结果如附图13所示：

结果表明：EM2

参考文献

1 Hombach,A.,Hombach,A.A.&Abken,H.Adoptive immunotherapy withgenetically engineered T cells:modification of the IgG1 Fc'spacer'domain inthe extracellular moiety of chimeric antigen receptors avoids'off-target'activation and unintended initiation of an innate immune response.Genetherapy17,1206-1213,doi:10.1038/gt.2010.91(2010).

2 Zah,E.,Lin,M.Y.,Silva-Benedict,A.,Jensen,M.C.&Chen,Y.Y.T CellsExpressing CD19/CD20 Bispecific Chimeric Antigen Receptors Prevent AntigenEscape by Malignant B Cells.Cancer immunology research 4,498-508,doi:10.1158/2326-6066.CIR-15-0231 (2016).

3 Victor D.Fedorov,2Maria Themeli,1Michel Sadelain1,3*.PD-1-and CTLA-4-Based Inhibitory Chimeric Antigen Receptors(iCARs)Divert Off-TargetImmunotherapy Responses.ScienceTranslationalMedicine Vol 5 Issue 215 215ra172(2013).

4 Stephan,M.T.et al.T cell-encoded CD80 and 4-1BBL induce auto-andtranscostimulation,resulting in potent tumor rejection.Nature medicine 13,1440-1449, doi:10.1038/nm1676(2007)。

序列表

<110> 中国人民解放军总医院第五医学中心

<120> 一种针对CD19的PDL1的新型双靶点CAR T细胞结构EM2设计

<130> 2020.1.22

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

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<210> 7

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

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ccg 63