检测具有感染性SARS-CoV-2的PCR靶序列、引物和探针及应用

摘要

本发明涉及SARS‑CoV‑2核酸检测领域，更具体地，涉及检测具有感染性SARS‑CoV‑2的PCR靶序列、引物和探针及应用。本发明提供的检测具有感染性SARS‑CoV‑2的PCR靶序列、引物和探针可以很好的区分SARS‑CoV‑2的感染性，同时具有灵敏度高、重复性好的特点。与常规感染性SARS‑CoV‑2检测试验相比，本发明极大缩短了感染性SARS‑CoV‑2检测的试验周期，降低了对科研条件和设备的要求；有效区分了病毒衣壳蛋白损伤导致病毒失活的核酸与和感染性病毒粒子，提高了检测的准确性，减少了实际检测中出现的假阳性现象。

说明书

技术领域

本发明涉及SARS-CoV-2核酸检测领域，更具体地，涉及检测具有感染性SARS-CoV-2的PCR靶序列、引物和探针及应用。

背景技术

严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(severe acute respiratorysyndromecoronavirus 2,SAR S-CoV-2，简称新型冠状病毒)感染的肺炎(Corona VirusDisease 2019，简称COVID-19)，简称新冠肺炎，是经呼吸道传播的一种传染病。

当前，新型冠状病毒核酸检测是确诊新冠肺炎、筛查无症状感染者、调查冷链食品和环境污染的金标准，是疫情防控的关键点。目前对新型冠状病毒的核酸检测手段主要是qRT-PCR法，此方法以其较高的特异性及敏感性在新型冠状病毒检测方面发挥着重大作用。但该方法只能检测样本中是否存在病毒的核酸序列，对于样本中的病毒是否具有衣壳蛋白完整性和感染性等均不能给出有效提示。目前国内外报道了大量在医院门把手、空气、冷链运输等场所中出现新型冠状病毒检测核酸阳性事件。更加细致的研究发现，这些核酸检测阳性大多是由于这些场所已进行高温、消毒剂等灭活措施而产生的“假阳性”。对于新型冠状病毒使用热灭活、消毒剂消杀等灭活措施后样本中的病毒是否仍具有感染性，还需要用经典的病毒培养分离方法确定。由于新型冠状病毒为新发高致病性病原体，常规传统培养及血清学等临床常用方法需在具有生物安全防护条件下的P3级实验室内进行且很难在较短时间内去检测病原体，这使得通过分离培养来进行新型冠状病毒的感染性检测对于基层单位或冷链运输场所不具有可行性，给新型冠状病毒的实际防控，如确定感染途径，医院、冷链运输等场所经过消毒处理后环境中是否还有感染性病毒等，带来了极大的不便。因此，现急需发展一种检测感染性新型冠状病毒快速简便的替代技术。

叠氮溴化丙锭(PMA)是一种对DNA或RNA具有高度亲和力的光敏核酸染料，PMA不能穿透完整的病毒衣壳蛋白，只能选择性地结合病毒衣壳蛋白受损后所暴露出来的核酸。病毒衣壳蛋白的完整性是判断病毒活性的一个标志，日常工业生产、医院、实验室和冷链运输等环境大多使用高温灭活或化学消毒剂灭活等方式进行消毒杀菌，这些灭活方法及化学制剂主要通过破坏病毒衣壳蛋白结构的方式使病毒失活。PMA能够穿透受损的病毒衣壳蛋白与病毒核酸结合，在一定条件下孵育、光解后，PMA会和暴露的核酸稳定交联使核酸无法进行后续的PCR反应，从而去除失活病毒暴露的核酸所引起的干扰(假阳性)，达到检测样本中是否含有感染性病毒的目的。另外，低浓度的非离子表面活性剂Triton X-100可作为PMA预处理的增强剂，通过选择性降低失活病毒受损衣壳蛋白的通透性，使暴露出的核酸与更多的PMA结合，提高PMA检测感染性病毒假阳性的能力。

PMA-qPCR已在检测食品、环境、水等样品中感染性细菌及病毒中得到了良好的应用，但在检测感染性SARS-CoV-2中未见报道。PMA抑制衣壳蛋白受损病毒PCR扩增的效率除与PMA孵育条件、增强剂的选择、孵育温度、光解时间等有关，还与扩增目的片段的长度、靶基因的位置有关。PMA进入衣壳蛋白受损的病毒中时，会以一定的化学计量比与病毒核酸结合，理论上靶基因受到PMA修饰即可抑制目的片段PCR的扩增，因此较长的目的基因扩增片段会提高与PMA结合的概率，从而提高PMA抑制效果，然而较长的扩增片段可能会降低PCR反应的扩增效率以及灵敏度。另外，病毒基因组中不同区域、不同位置由于其GC含量、碱基偏好、构象特征不同，其与PMA结合效率也不同。在大肠杆菌PMA抑制死细菌效果试验中，选择了相同长度但不同位置的目的基因片段，获得了不同的PMA抑制效果。因此，平衡好目的片段长度与PMA抑制效率、筛选出SARS-CoV-2基因组中较为合适的PMA结合区域对于检测感染性SARS-CoV-2技术方法的研发至关重要。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种检测基于PMA-qPCR方法的靶点序列的试剂在制备区分SARS-CoV-2核酸阳性与病毒阳性的检测试剂盒中的应用，所述的靶点序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.61所示。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种检测基于PMA-qPCR方法的靶点序列的试剂在制备区分SARS-CoV-2核酸阳性与病毒阳性的检测试剂盒中的应用，所述的靶点序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.61所示。以上所述的应用中，优选的，所述的检测基于PMA-qPCR方法的靶点序列的试剂为引物和探针，引物具体为：TTCACACAATCGACGGTTCATCC和GTACCTGTCTCTTCCGAAACGAAT，探针为：ACGACGACTACTAGCGTGCCTT，所述的探针携带有本领域的常规荧光基团。

以上所述的应用中，优选的，所述的试剂盒在应用过程中，待测样品的预处理方式是：

(1)将待测样本置于无DNase/RNase酶的EP管中离心，收集上清；

(2)取180μl上清液置于无DNase和RNase酶的EP管中，避光向其中加入10μl PMA和10μl Triton X-100，混匀后，37℃避光漩涡孵育30min；所述PMA终浓度为100μM；所述Triton X-100终浓度为0.5％。

(3)将样品转移至无DNase/RNase酶的lobind EP管中，然后使用PMA-Lite

以上所述的应用中，优选的，所述试剂盒在应用过程中的体系为：

Enzyme Mix 2μl，MP buffer 12μl，引物TTCACACAATCGACGGTTCATCC和GTACCTGTCTCTTCCGAAACGAAT终浓度为800pM，探针ACGACGACTACTAGCGTGCCTT终浓度为400pM，待测样本2μl，灭菌水补足至25μl。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明所提供的检测SARS-CoV-2的PCR引物和探针可以很好的区分SARS-CoV-2的感染性，同时具有灵敏度高、重复性好的特点。将该引物探针及检测方法应用于检测感染性SARS-CoV-2多重qRT-PCR试剂盒，在2-3小时即可完成全部实验。与常规感染性SAR S-CoV-2检测试验相比，本发明极大缩短了感染性SARS-CoV-2检测的试验周期，降低了对科研条件和设备的要求；有效区分了病毒衣壳蛋白损伤导致病毒失活的核酸与和感染性病毒粒子，提高了检测的准确性，减少了实际检测中出现的假阳性现象。可用于公共环境、生产区域、办公场所、食品及食品表面等样本的检测，适用于医院、实验室、基层防控单位、冷链运输场所等，对于SARS-CoV-2的实际防控，如确定感染途径，医院、冷链运输等场所经过消毒处理后环境中是否还有感染性病毒等，具有重要参考意义和良好应用前景。

附图说明

图1检测感染性SARS-CoV-2引物探针组qRT-PCR扩增曲线和标准曲线；

其中A为检测感染性SARS-CoV-2引物探针组的扩增曲线图；

B为检测感染性SARS-CoV-2引物探针组的标准曲线图。

图2中国CDC-N引物探针组qRT-PCR扩增曲线和标准曲线。

其中A为检测感染性SARS-CoV-2的中国CDC-N引物探针组的扩增曲线图；

B为检测感染性SARS-CoV-2的中国CDC-N引物探针组的标准曲线图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。本发明实施例中的试验方法和条件如无特殊说明，均为常规方法。本发明所述的技术方案，如无特殊说明，均为领域的常规方案；所述试剂或材料如无特殊说明，均来源于商业渠道。本发明中所有与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)为SARS-CoV-2毒株(ZY38-1)，活病毒相关的试验均在生物安全三级实验室(ABSL3)完成。以下具体实施例对本发明做进一步阐述：

所述的SARS-CoV-2毒株(ZY38-1)已于2021年01月04日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：SARS-CoV-2/ZY38-1，保藏编号：CCTCC NO:V202107，地址：中国武汉武汉大学。

实施例1：

检测感染性SARS-CoV-2引物、探针的筛选及优化：

1.1感染性SARS-CoV-2引物和探针的设计

根据SARS-CoV-2(ZY38-1)基因组合成1～15(SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.45)引物探针组，参考并合成中国CDC发布的检测SARS-CoV-2引物探针组；中国CDC-ORF1ab和中国CDC-N(SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.51)，参考并合成美国CDC发布的检测SARS-CoV-2引物探针组美国CDC-N1～N3(SEQ ID NO.52～SEQ ID NO.60)。引物和荧光探针其序列如下(上述引物和探针由上海生工生物科技有限公司合成)：

表1.SARS-CoV-2引物、探针序列

1.2qRT-PCR反应体系及反应条件：

反应体系：Enzyme Mix 2μl，MP buffer 12μl，上下游引物终浓度为各400～1000pM，探针终浓度为各200～400pM，模板2μl，灭菌水补足至25μl。

反应条件：50℃反转录10min，之后95℃预变性5min，之后循环45次；每个循环的程序为：95℃变性5sec，58～62℃退火30sec，收集对应探针的荧光通道的信号，循环结束后，结束反应。

其中，阳性对照(标准品)为合成的病毒核酸序列质粒，含1.1中引物扩增片段，阴性对照为不含RNA的无菌水。阳性对照CT值＜40并出现典型的扩增曲线，阴性对照无C T值且无典型扩增曲线表明该次实验结果成立，以下列举出的数据均为实验结果成立数据，阳性对照与阴性对照CT值数据不赘述。

1.3感染性SARS-CoV-2引物和探针的筛选

SARS-CoV-2感染vero细胞病毒收获液稀释后使用世界卫生组织和中国疾控中心推荐的新型冠状病毒灭活条件(56℃热灭活30min)进行灭活，灭活样品经细胞培养7天，空斑试验阴性方可作为灭活完成样品进行下一步试验：

灭活完成样品分别等体积移取两份试验样品，一份加PMA(终浓度100μM)和TritonX(终浓度0.5％)避光于室温漩涡孵育20min，孵育结束后，使用PMA-Lite

表2感染性SARS-CoV-2引物探针的筛选

如表2所示，不同引物探针组的待测预处理样本与待测对照样本相比，CT值均有变大，△CT值(待测预处理样本CT值-待测对照样本CT值)越大，表明该引物探针组扩增片段与PMA结合效率越高，对于区分感染性SARS-CoV-2的效果越强。其中，引物探针组11(SEQ IDNO.31～33)具有最大的△CT值(该引物组扩增的靶序列为SEQ ID NO.61所示)，最适合作为检测SARS-CoV-2病毒阳性(具有感染性)指标。另外，中国CDC-N引物探针组是检测SARS-CoV-2的特异性引物探针，同时，检测待测对照样品CT最低，具有较高的灵敏度，因此选取该引物探针组作为检测感染性SARS-CoV-2方法中核酸阳性指标。

1.4qRT-PCR检测感染性SARS-CoV-2引物、探针浓度和退火温度优化

为了获得引物和探针的最优添加量，利用1.2qRT-PCR反应体系和反应条件对实施例1.3中获得的引物探针组和中国CDC-N引物探针组的使用浓度和退火温度进行优化，每个配比做三个重复，不同引物和探针浓度条件下的Ct值测定结果如表3～4所示。

表3检测感染性SARS-CoV-2引物、探针浓度，退火温度优化

表4中国CDC-N引物、探针浓度，退火温度优化

从上表可以看出，引物终浓度为800pM、探针终浓度400pM，退火温度58℃时，扩增结果的Ct值最低，因此选择该浓度配比(即上下游引物终浓度均为800pM，探针终浓度为400pM)为后续反应的终浓度。

1.5扩增曲线、标准曲线及灵敏度：

将质粒标准品用灭菌水10倍梯度稀释后作为模板，取最终稀释浓度为2.5×10

检测感染性SARS-CoV-2引物探针组和中国CDC-N引物探针组的扩增曲线见图1中A和图2中A，结果呈现出典型的扩增曲线图，且具有良好的线性关系；标准曲线相关系数R

实施例2：

PMA-Triton X-100-qRT-PCR检测感染性SARS-CoV-2方法的优化

2.1PMA使用浓度优化

分别等体积移取灭活完成样本的试验样品，加不同浓度PMA(终浓度为0，5，50，100，150，200，250μM)避光于室温漩涡孵育20min，孵育结束后，使用PMA-Lite

表5最佳PMA使用浓度探索

2.2PMA孵育条件、孵育温度、孵育时间、光解时间优化

分别等体积移取灭活完成样本的试验样品，添加PMA和TritonX-100终浓度分别为(0μMPMA+0％Triton X-100；100μM PMA+0Triton X-100；100μM PMA+0.5％Triton X-100)，避光，分别于4、25和37℃下孵育5、10和30min，之后分别光解2、12和20min。采用天根全自动核酸提取仪提取核酸，并以此为模板进行qRT-PCR。选择ΔCt差异最大或PMA预处理组Ct＞40且无典型扩增曲线的孵育条件，孵育温度、孵育时间和光解时间作为最佳处理条件。结果如表6～9所示，最佳孵育条件为100μM PMA+0.5％Triton X-100；最佳孵育温度为37℃；最佳孵育时间为30min；最佳光解时间为20min。

表6最佳PMA孵育条件探索

表7最佳PMA孵育温度探索

表8最佳PMA孵育时间探索

表9最佳PMA光解时间探索

实施例3：

检测SARS-CoV-2感染性多重qRT-PCR试剂盒的应用

本实施例参考《特定场所消毒技术方案》(国卫办疾控函[2020]156号)和《食品安全国家标准食品冷链物流卫生规范》(GB31605-2020)模拟高温、醇类消毒剂(75％乙醇)、含氯消毒剂(84消毒液)、季铵盐类消毒剂(洁尔灭)处理后的食品包装表面样品(经空斑试验验证阴性，作为灭活完成组)，另外取SARS-CoV-2空斑试验阳性的病毒液作为未灭活组。采用实施例1～2中所得到的最佳检测感染性SARS-CoV-2引物和探针和处理方法，应用于检测感染性SARS-CoV-2多重qRT-PCR试剂盒。

样品采集步骤：

参考《食品及食品包装表面中新冠病毒的采样及检测方法》(T/CAQI 159-2020)中样品采集部分。

检测步骤：

(1)取待检样本等体积分为2份，其中一份样本进行PMA-Triton X与待测样本预处理作为待测预处理样本，另一份添加等量PBS作为待测对照样本；

(2)使用天根全自动核酸提取仪分别提取待测预处理样本和待测对照样本的病毒RN A；

(3)分别以待测预处理样本和待测对照样本RNA为模板进行多重qRT-PCR。

反应体系为：Enzyme Mix 2μl，MP buffer 12μl，检测感染性SARS-CoV-2上下游引物(SEQ ID NO.31～32)和中国CDC-N上下游引物(SEQ ID NO.49～50)，引物的终浓度为800pM，检测感染性SARS-CoV-2探针(SEQ ID NO.33)和中国CDC-N探针(SEQ ID NO.51)终浓度为各400pM，模板2μl，灭菌水补足至25μl。

反应条件为：50℃反转录10min，之后95℃预变性5min，之后循环45次；每个循环的程序为：95℃变性5sec，58℃退火30sec，收集对应探针的荧光通道的信号，循环结束后，结束反应。

其中，阳性对照为合成的含靶标基因片段的病毒核酸序列质粒，阴性对照为不含RNA的无菌水。

(4)以中国CDC-N引物探针组得到的待测对照样本的CT值作为SARS-CoV-2核酸(阳/阴性)指标；以检测感染性SARS-CoV-2引物探针组得到的待测预处理样本和待测对照样本Ct值的差值(ΔCt)作为SARS-CoV-2病毒阳/阴性(感染性)指标：即ΔCt＞6或待测预处理样本Ct值＞40且无明显扩增曲线，即为SARS-CoV-2病毒阴性(不具有感染性)，ΔCt≤6则为SARS-CoV-2病毒阳性(具有感染性)。

进一步地：所述待测样本预处理的具体步骤包括以下：

(1)将待测样本置于无DNase/RNase酶的EP管中离心，收集上清；

(2)取180μl上清液置于无DNase和RNase酶的EP管中，避光向其中加入10μl PM A和10μl Triton X-100，混匀后，37℃避光漩涡孵育30min；所述PMA终浓度为100μM；所述Triton X-100终浓度为0.5％。

(3)将样品转移至无DNase/RNase酶的lobind EP管中，然后使用PMA-Lite

待测对照样本与待测序预处理样本进行相同的条件孵育和光解，但待测对照样本不加PMA和Triton X-100，仅加等体积PBS。

检测感染性SARS-CoV-2多重qRT-PCR试剂盒应用于不同灭活方法处理的食品包装表面样品结果如表10所示。

另外，本实施例以中国CDC-ORF引物探针组(SEQ ID NO.46～48)、中国CDC-N引物探针组(SEQ ID NO.49～51)、美国CDC-N1引物探针组(SEQ ID NO.52～54)、美国CDC-N2引物探针组(SEQ ID NO.55～57)和美国CDC-N3引物探针组(SEQ ID NO.58～60)作为对照SARS-CoV-2病毒阳/阴性(感染性)指标，探讨现有引物探针组对检测感染性SAR S-CoV-2的使用效果。除更换引物探针组，反应体系和条件参考中国和美国CDC公布的引物探针推荐浓度和退火温度外，其余步骤均与实施例3检测SARS-CoV-2感染性多重qRT-PCR试剂盒的应用步骤相同。

中美CDC引物探针组检测不同灭活方法处理的食品包装表面样本结果见表11。

表10检测感染性SARS-CoV-2多重qRT-PCR试剂盒应用于不同灭活方法处理的食品包装表面样品

表11中美CDC引物探针组检测不同灭活方法处理的食品包装表面样本结果

表10数据表明，所有样本核酸指标检测结果均为阳性。其中，经过高温、84、洁尔灭、酒精灭活样本(灭活完全样本)的感染性指标△CT＞6或待测预处理样本CT值＞40且无典型的扩增曲线，表明不具备感染性。而未灭活样本感染性指标△CT＜6，表明具备感染性，该检测感染性SARS-CoV-2引物探针检测结果与空斑试验结果一致，表明本发明的试剂盒可以达到快速检测感染性SARS-CoV-2的目的。

表11数据表明，以中美CDC引物探针组为感染性指标检测不同方法灭活的样本获得的△CT较小，表明常规SARS-CoV-2引物探针组对于检测病毒感染性效果欠佳，无法起到区分感染性SARS-CoV-2的目的。

由于本发明的试剂盒能在2～3h内完成SARS-CoV-2感染性的检测，具有快速、简单、高效等优点，可用于感染性SARS-CoV-2快检的初步筛查。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 检测具有感染性SARS-CoV-2的PCR靶序列、引物和探针及应用

<160> 61

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagtttagct gccacagtac gtc 23

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagcaaaagc acagaaagat aatacagt 28

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aattggcagg cacttctgtt gcat 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aatacctaca acttgtgcta atgacc 26

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctgcacttac accgcaaacc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caactccgcg aacccatgct 20

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgtgctgact ctatcattat tggt 24

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gataatttct tttggggctt ttagagg 27

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttctgtacaa tccctttgag tgcgtgac 28

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgacataga agttactggc gat 23

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgcattaata tgacgcgcac t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacatgaca ccccgtgacc t 21

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gttttatgag gctatgtaca caccg 25

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttatgtgat gttgatatga catggtcgt 29

<210> 15

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<212> DNA

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<400> 15

agccccaaca gcctgtaaga ct 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttatcctaaa tgtgatagag ccatgcc 27

<210> 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cacctggttt aacatatagt gaaccg 26

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<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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acgtgttgta gcttgtcaca ccgt 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tactgttttg ccacctttgc tc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gcaccaaagg tccaaccag 19

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctgcactgtt agcgggtaca atcact 26

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<212> DNA

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ttcatcaaac aatatggtga ttgcct 26

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<212> DNA

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gcaccaaagg tccaaccag 19

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tctgcactgt tagcgggtac aatcact 27

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<212> DNA

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cgcgctactg caacgat 17

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gttgcaaaca aagtgaacac cc 22

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgatacaagc ctcactccct ttcggat 27

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<212> DNA

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ccgatacaag cctcactccc 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gttgcaaaca aagtgaacac cc 22

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<212> DNA

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tgcaacgcca acaataagcc atccg 25

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ttcacacaat cgacggttca tcc 23

<210> 32

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtacctgtct cttccgaaac gaat 24

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

acgacgacta ctagcgtgcc tt 22

<210> 34

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cgtggacatc ttcgtattgc tg 22

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gccaatcctg tagcgact 18

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cactgttgct acatcacgaa cgctt 25

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tgctggacac catctaggac 20

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

ccaatttgta ataagaaagc gttcgt 26

<210> 39

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

acatcaagga cctgcctaaa gaaatcact 29

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cctttaattg aattgtgcgt ggat 24

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gatgaaatct aaaacaacac gaacgtc 27

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

aacgaacaac gcactacaag actaccc 27

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tgctggacac catctaggac 20

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

aaaacctgag tcacctgcta c 21

<210> 45

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

acatcaagga cctgcctaaa gaaatcact 29

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ccctgtgggt tttacactta a 21

<210> 47

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

acgattgtgc atcagctga 19

<210> 48

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ccgtctgcgg tatgtggaaa ggttatg 27

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ttgctgctgc ttgacagatt 20

<210> 52

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gaccccaaaa tcagcgaaat 20

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

tctggttact gccagttgaa tctg 24

<210> 54

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

accccgcatt acgtttggtg gacc 24

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

ttacaaacat tggccgcaaa 20

<210> 56

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gcgcgacatt ccgaagaa 18

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

acaatttgcc cccagcgctt cag 23

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

gggagccttg aatacaccaa aa 22

<210> 59

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

tgtagcacga ttgcagcatt g 21

<210> 60

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

aycacattgg cacccgcaat cctg 24

<210> 61

<211> 148

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

ttcacacaat cgacggttca tccggagttg ttaatccagt aatggaacca atttatgatg 60

aaccgacgac gactactagc gtgcctttgt aagcacaagc tgatgagtac gaacttatgt 120

actcattcgt ttcggaagag acaggtac 148