用于递送活性剂的可生物降解脂质

摘要

本发明涉及阳离子脂质，该阳离子脂质具有位于该阳离子脂质的脂质部分(例如疏水链)中的一个或多个可生物降解基团。可以将这些阳离子脂质掺入到脂质颗粒中用于递送活性剂，例如核酸。本发明还涉及脂质颗粒，这些脂质颗粒包含中性脂质、能够减少聚集的脂质、本发明的阳离子脂质、以及任选地固醇。该脂质颗粒可以进一步包含治疗剂，例如核酸。

说明书

本申请要求2018年10月1日提交的美国临时申请号62/739,548的权益，将其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及可生物降解脂质并且涉及其用于递送活性剂(例如核酸)的用途。

背景技术

治疗性核酸包括例如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)、反义寡核苷酸、核酶、质粒、免疫刺激核酸、反义、antagomir、antimir、微RNA模拟物、supermir、U1衔接子以及适体。在siRNA或miRNA的情况下，这些核酸可以通过称为RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白质的细胞内水平。RNAi的治疗应用极为广泛，因为siRNA和miRNA构建体可以用针对靶蛋白的任何核苷酸序列进行合成。迄今为止，siRNA构建体在体外和体内模型中均已显示出特异性下调靶蛋白的能力。此外，目前正在临床研究中评估siRNA构建体。

然而，siRNA或miRNA构建体目前面临的两个问题是，第一，它们对血浆中核酸酶消化的敏感性，第二，当作为游离siRNA或miRNA全身性施用时，它们进入细胞内区室(其中它们可以结合蛋白质RISC)的能力有限。由阳离子脂质与其他脂质组分(例如胆固醇和PEG脂质)和寡核苷酸(例如siRNA和miRNA)形成的脂质纳米颗粒已用于促进寡核苷酸的细胞摄取。

仍然需要用于递送寡核苷酸的改进的阳离子脂质和脂质纳米颗粒。优选地，这些脂质纳米颗粒将提供高的药物:脂质比率，避免核酸在血清中降解和清除，适于全身递送，并提供核酸的细胞内递送。另外，这些脂质-核酸颗粒应该是耐受良好的并且提供足够的治疗指数，使得以有效的核酸剂量进行的患者治疗不存在对患者的显著毒性和/或风险。

发明内容

本发明涉及改进的脂质颗粒以及改进的阳离子脂质。

一个实施例是脂质颗粒，该脂质颗粒包含可生物降解阳离子脂质、中性脂质、固醇、和能够减少聚集的脂质(例如PEG修饰的脂质)，其中可生物降解阳离子脂质与固醇的摩尔比率范围从约1.6:1至约2.0:1和/或可生物降解阳离子脂质与中性脂质的摩尔比率范围从约5.5:1至约5.9:1。诸位发明人出人意料地发现，相对于固醇和/或中性脂质的量具有一定较高含量的可生物降解阳离子脂质的脂质颗粒表现出增强的用于递送活性剂(例如siRNA)的功效。在一个实施例中，可生物降解阳离子脂质包含脂质部分，其中该脂质部分具有一个或多个可生物降解基团(例如酯基(-C(O)O-或-OC(O)-))。在一个优选的实施例中，能够减少聚集的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)，例如具有平均聚乙二醇分子量为2000的PEG-DMG。

在另一个实施例中，可生物降解阳离子脂质与固醇的摩尔比率是从约1.7至约1.9:1，例如约1.9:1。在另一个实施例中，可生物降解阳离子脂质与中性脂质的摩尔比率范围从约5.5:1至约5.8:1，例如约5.8:1。

在一个实施例中，该脂质颗粒包含从约55至约60mol％的可生物降解阳离子脂质，例如约58mol％(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。脂质颗粒可以包含从约28至约33mol％的固醇，例如从约28至约32mol％(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在一个实施例中，该脂质颗粒包含从约3至约12mol％，例如从约5至约12mol％、从约8至约12mol％或从约9至约11mol％的中性脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在另一个实施例中，该脂质颗粒包含约10mol％的中性脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含从约0.5至约10mol％，例如从约0.5至约5mol％或从约1至约3mol％的能够减少聚集的脂质(例如PEG修饰的脂质)(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。

另一个实施例是脂质颗粒，该脂质颗粒包含可生物降解阳离子脂质、中性脂质、固醇和能够减少聚集的脂质(例如PEG修饰的脂质)，其中该脂质颗粒包含从约55至约60mol％的可生物降解阳离子脂质和从约33至约28mol％的固醇(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在一个实施例中，该脂质颗粒包含约58mol％的可生物降解阳离子脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在另一个实施例中，该脂质颗粒包含从约3％至约12％的中性脂质、和从约0.5至约10mol％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含约10mol％的中性脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含约2mol％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在一个实施例中，该脂质颗粒包含从约55至约60mol％的阳离子脂质、从约3％至约12％的中性脂质、从约28至约33mol％的固醇、和从约0.5至约10mol％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含约58％的阳离子脂质、约10％的中性脂质、约30％的固醇、和约2％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含约55％的阳离子脂质、约10％的中性脂质、约33％的固醇、和约2％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在一个优选的实施例中，能够减少聚集的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)，例如具有平均聚乙二醇分子量为2000的PEG-DMG。

一个实施例是阳离子脂质，该阳离子脂质具有式(A)：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中

R’不存在、是氢或烷基(例如C

对于R

(i)R

(ii)R

(iii)R

R每次出现时独立地是-(CR

R

R

Q的虚线不存在或是键；

当Q的虚线不存在时，则Q不存在或是-O-、-NH-、-N(R

当Q的虚线是键时，则(i)b是0并且(ii)Q和与其相邻的叔碳(C*)形成取代的或未取代的具有从5至10个环原子(例如杂环基中的杂原子选自O和S，优选地O)的单环或双环杂环基；

R

X是亚烷基或亚烯基(例如C

M

a是1、2、3、4、5或6；

b是0、1、2或3；

Z

Z

R’R

在一个实施例中，R

在另一个实施例中，a是2。在另一个实施例中，b是0。在另一个实施例中，Q不存在。在又另一个实施例中，a是2，b是0并且Q不存在。在又另一个实施例中，a是4，b是0并且Q是-O-。

在另一个实施例中，X是-(CH

在另外的实施例中，M

在另一个实施例中，Z

在另一个实施例中，Z

又另一个实施例是阳离子脂质，该阳离子脂质选自：

以及其盐(例如其药学上可接受的盐)。

又一个实施例是化合物，该化合物具有式(A-I)：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)；

其中

s、t、u、v和q各自独立地是0、1、2、3、4、5、6或7；并且

W是头基(例如可质子化的胺基，其具有在约4至约11之间，例如在约4至约7之间、在约5至约7之间或在约5.5至约6.8之间的pKa)。

合适的头基包括本文所述的那些头基中的任一个(参见例如表1A)。

在某些实施例中，头基是(CH

在一个实施例中，变量s是3至5，例如4。

在一个实施例中，变量t是4至6，例如5。

在一个实施例中，变量q是2至4，例如3。

在一个实施例中，变量u是0至2，例如1。

在一个实施例中，变量v是0至2，例如1。

又另一个实施例是化合物，该化合物具有式(A-II)：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中

b是0、1、2或3；

s是0、1、2、3、4或5；

R

R

在一个实施例中，b是1。

在一个实施例中，s是2、3或4，例如3。

在一个实施例中，R

在一个实施例中，R

在另一个实施例中，R

可以将本文所述的这些阳离子脂质掺入脂质颗粒中。一个实施例是脂质颗粒，该脂质颗粒包含阳离子脂质，例如上文所述的那些(包括具有式(A)、(A-I)和(A-II)的那些)。本文所述的每种阳离子脂质包括一个或多个可生物降解基团。可生物降解基团位于阳离子脂质的脂质部分(例如疏水链)中。可以将这些阳离子脂质掺入脂质颗粒中以递送活性剂，例如核酸(例如siRNA)。一个或多个可生物降解基团掺入脂质中导致在将活性剂递送至靶区域后脂质更快的代谢以及从体内除去。因此，这些脂质具有比没有可生物降解基团的相似脂质更低的毒性。

本文所述的脂质颗粒可以进一步包含活性剂。活性剂的非限制性实例包括核酸，例如质粒、免疫刺激寡核苷酸、siRNA、反义寡核苷酸、微RNA、antagomir、适体和核酶。在一个优选的实施例中，该核酸是siRNA。

可以将本文所述的脂质颗粒掺入药物组合物中。一个实施例是药物组合物，该药物组合物包含本文所述的脂质颗粒和药学上可接受的载体。脂质颗粒优选地包括活性剂，例如核酸。在一个优选的实施例中，该活性剂是siRNA。

又另一个实施例是调节细胞中靶基因的表达的方法，该方法包括向该细胞提供本文所述的脂质颗粒。在一个实施例中，该活性剂是核酸，该核酸是siRNA。

又另一个实施例是在受试者中治疗特征为多肽过表达的疾病或障碍的方法，该方法包括向受试者提供本文所述的药物组合物。在一个实施例中，该活性剂是核酸，该核酸选自由以下组成的组：siRNA、微RNA和反义寡核苷酸，并且其中该siRNA、微RNA或反义寡核苷酸包括与编码多肽的多核苷酸特异性结合的多核苷酸或其补体。

又另一个实施例是在受试者中治疗特征为多肽低表达的疾病或障碍的方法，该方法包括向受试者提供本文所述的药物组合物。在一个优选的实施例中，该活性剂是编码多肽或其功能变体或片段的质粒。

又另一个实施例是在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向受试者提供本文所述的药物组合物。在一个优选的实施例中，该活性剂是免疫刺激寡核苷酸。

附图说明

图1是描绘实例4中描述的施用脂质配制品后相对因子VII蛋白水平的条形图。

图2是描绘实例4中描述的施用脂质配制品后相对因子VII蛋白水平的条形图。

图3是描绘实例4中描述的施用脂质配制品后相对因子VII蛋白水平的条形图。

图4是描绘实例4中描述的施用脂质配制品后相对因子VII蛋白水平的条形图。

图5是描绘实例5中描述的施用脂质配制品后相对因子XII血浆水平的图。

图6A是描绘实例6中描述的施用脂质配制品AF-094(0.03、0.1和0.3mg/kg)和AF-011(0.3mg/kg)后相对因子XII血浆水平的图。

图6B是描绘实例6中描述的施用脂质配制品AF-079(0.3mg/kg)和AF-011(0.3mg/kg)后相对因子XII血浆水平的图。

图7是描绘实例6中描述的施用脂质配制品AF-073(0.03、0.1和0.3mg/kg)和AF-011(0.3mg/kg)后相对因子XII血浆水平的图。

图8是描绘实例6中描述的施用脂质配制品AF-093(0.03、0.1和0.3mg/kg)和AF-011(0.3mg/kg)后相对因子XII血浆水平的图。

图9是描绘实例6中描述的施用脂质配制品AF-083(0.1和0.3mg/kg)和AF-011(0.3mg/kg)后相对因子XII血浆水平的图。

具体实施方式

阳离子脂质可以是本领域已知的任何可生物降解阳离子脂质，例如国际公开号WO2011/153493、WO 2013/086322、WO 2013/086354和WO 2013/086373，美国专利号9,012,498、9,061,063和9,463,247，以及美国专利公开号2014/0308304中所述的那些，将这些文献通过引用以其全文并入本文。这些可生物降解阳离子脂质包括一个或多个可生物降解基团。这导致在将活性剂递送至靶区域后阳离子脂质更快的代谢以及从体内除去。因此，这些阳离子脂质基本上具有比没有可生物降解基团的相似阳离子脂质更低的毒性。在一个实施例中，一个或多个可生物降解基团位于阳离子脂质的脂质部分(例如疏水链)的中部或远侧区段。

在一个实施例中，该可生物降解阳离子脂质具有式(A)：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中

R’不存在、是氢或烷基(例如C

对于R

(i)R

(ii)R

(iii)R

R每次出现时独立地是-(CR

R

R

Q的虚线不存在或是键；

当Q的虚线不存在时，则Q不存在或是-O-、-NH-、-N(R

当Q的虚线是键时，则(i)b是0并且(ii)Q和与其相邻的叔碳(C*)形成取代的或未取代的具有从5至10个环原子(例如杂环基中的杂原子选自O和S，优选地O)的单环或双环杂环基；

R

X是亚烷基或亚烯基(例如C

M

a是1、2、3、4、5或6；

b是0、1、2或3；

Z

Z

R’R

在一个实施例中，R

在另一个实施例中，a是2。在另一个实施例中，b是0。在另一个实施例中，Q不存在。在又另一个实施例中，a是2，b是0并且Q不存在。在又另一个实施例中，a是4，b是0并且Q是-O-。

在另一个实施例中，X是-(CH

在另外的实施例中，M

在另一个实施例中，Z

在另一个实施例中，Z

又另一个实施例是阳离子脂质，该阳离子脂质选自：

以及其盐(例如其药学上可接受的盐)。

在某些实施例中，阳离子脂质中存在的可生物降解基团选自酯(例如-C(O)O-或-OC(O)-)、二硫化物(-S-S-)、肟(例如-C(H)＝N-O-或-O-N＝C(H)-)、-C(O)-O-、-OC(O)-、-C(R

在一个实施例中，阳离子脂质的疏水尾中的一个或两个中的脂肪族基团包括至少一个碳-碳双键。

阳离子脂质(包括具有式(A)、(A-I)和(A-II)的化合物)的合适的胆固醇部分具有下式：

另外的实施例包括阳离子脂质，该阳离子脂质具有头基、一个或多个疏水尾部以及头基与一个或多个尾部之间的接头。头基可以包括胺；例如具有所希望的pK

一个或多个疏水尾部可以包括两个相同或不同的疏水链。尾部可以是脂肪族的，例如，它们可以由碳和氢组成，可以是饱和或不饱和的但没有芳香族环。尾部可以是脂肪酸尾部。一些此类基团包括辛基、壬基、癸基、月桂基、肉豆蔻基、棕榈基、硬脂基、α-亚油基、硬脂酸基、亚油基，γ-亚麻基、花生四烯基和油基。其他疏水尾部也是合适的。

接头可以包括例如甘油酯接头、无环甘油酯类似物接头或环状接头(包括螺接头、双环接头和多环接头)。接头可以包括官能团，例如醚、酯、磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯、磺酸酯、二硫化物、缩醛、缩酮、亚胺、腙或肟。其他接头和官能团也是合适的。

在一个实施例中，阳离子脂质是外消旋混合物。在另一个实施例中，该阳离子脂质富集一种非对映异构体，例如该阳离子脂质具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％非对映异构体过量。在又另一个实施例中，该阳离子脂质富集一种对映异构体，例如该脂质具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％对映异构体过量。在又另一个实施例中，该阳离子脂质是手性纯的，例如单一光学异构体。在又另一个实施例中，该阳离子脂质富集一种光学异构体。

当存在双键(例如，碳-碳双键或碳-氮双键)，则在围绕双键的构型中可能存在异构(即，顺/反或E/Z异构)。当在化学结构中图示了双键的构型时，应理解也可以存在相应的异构体。存在的异构体的量可以变化，这取决于异构体的相对稳定性和在异构体之间转化所需的能量。因此，出于实用目的，一些双键仅以单一构型存在，而其他双键(例如，其中相对稳定性相似并且转化能量低)可以作为构型的不可分离的平衡混合物存在。

在一些情况下，双键不饱和可被环状不饱和取代。环状不饱和基团可以是脂环族不饱和基团，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。在一些情况下，环状基团可以是多环基团，例如双环基团或三环基团。双环基团可以是桥连的、稠合的或具有螺结构。

在一些情况下，双键部分可以被环丙基部分取代，例如

再例如

再例如

再例如

阳离子脂质包括一个或多个可生物降解基团。一个或多个可生物降解基团包括一个或多个键，该键可在生物环境中(例如在生物体、器官、组织、细胞或细胞器中)经历键断裂反应。含有可生物降解键的官能团包括例如酯、二硫醇和肟。当向受试者施用时，生物降解可能是影响化合物从体内清除的因素。可在基于细胞的测定中测量生物降解，其中将包含阳离子脂质的配制品暴露于细胞，并在不同时间点取样。可以从细胞中提取脂质级分，并通过LC-MS进行分离和分析。从LC-MS数据中，可以测量生物降解速率(例如作为t

例如化合物

在每个脂肪族链中包括酯键，其可以在生物环境中经历水解，例如当暴露于例如脂肪酶或酯酶时。当然，化合物的结构影响化合物进行生物降解的速率。因此，相关的化合物例如

预期表现出不同的生物降解速率。预期在水解位点处化合物结构的变化对该速率产生更大的影响。可以影响水解速率，从而影响生物降解速率和从受试者体内清除的一种修饰是使水解反应的离去基团具有伯醇，而不是仲醇。

在一个实施例中，本文所述的任一实施例的阳离子脂质的体内半衰期(t

在另一个实施例中，本文所述的任一实施例的含有一个或多个可生物降解基团的阳离子脂质的体内半衰期(t

一些阳离子脂质可以方便地表示为通过中心部分(例如碳原子)与头基组合的疏水基团。举例而言，化合物：

可以被认为是如下的头基、中心部分和两个疏水基团的组合：

合适的阳离子脂质包括由以下列出的头基和疏水基团的任何组合(与中心部分(例如中心碳原子)组合)组成的化合物。

一些合适的头基包括表1A中所示的那些：

表1A

合适的主要基团包括但不限于作为来自表1A的头基与中心碳原子的组合的那些。其他合适的主要基团包括下表1B中的那些：

一些合适的疏水性尾部基团包括表2中所示的那些：

表2

阳离子脂质包括具有替代脂肪酸基团和其他二烷基氨基的那些，包括其中烷基取代基不同的那些(例如，N-乙基-N-甲基氨基-、N-丙基-N-乙基氨基-等)。对于其中R

在某些实施例中，阳离子脂质具有至少一个可质子化或可去质子化的基团，使得该脂质在等于或低于生理pH(例如pH 7.4)的pH下带正电荷，并且在第二pH(优选地等于或高于生理pH)下为中性。这类脂质也称为阳离子脂质。当然，应理解，作为pH的函数的质子的添加或去除是平衡过程，并且对带电或中性脂质的提及是指主要物质的性质，并且不需要所有脂质以带电或中性形式存在。脂质可以具有多于一个可质子化的或可去质子化的基团，或者可以是两性离子的。

在某些实施例中，可质子化的脂质(即阳离子脂质)的可质子化基团的pK

在具体的实施例中，脂质是带电荷的脂质。如本文所用，术语“带电荷的脂质”意指包括具有一个或两个脂肪酰基或脂肪烷基链和季氨基头基的那些脂质。季胺带有永久性正电荷。头基可以任选地包括可电离基团，例如在生理pH下可质子化的伯胺、仲胺或叔胺。相对于缺少季胺(例如，季胺被叔胺取代)的在结构上相似的化合物中的基团的pKa，季胺的存在可以改变可电离基团的pKa。在一些实施例中，带电荷的脂质被称为“氨基脂质”。参见例如，2009年12月7日提交的临时美国专利申请61/267,419，将其通过引用以其全文并入。

在一个实施例中，阳离子脂质是具有式(I)的化合物，其在与可生物降解基团相邻的α位(在可生物降解基团和叔碳之间)具有支链烷基：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中

R’不存在、是氢或烷基(例如C

对于R

(i)R

(ii)R

(iii)R

R每次出现时独立地是-(CR

R

R

Q的虚线不存在或是键；

当Q的虚线不存在时，则Q不存在或是-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R

当Q的虚线是键时，则(i)b是0并且(ii)Q和与其相邻的叔碳(C*)形成取代的或未取代的具有从5至10个环原子(例如杂环基中的杂原子选自O和S，优选地O)的单环或双环杂环基；

R

X和Y各自独立地是亚烷基或亚烯基(例如C

M

R

a是1、2、3、4、5或6；

b是0、1、2或3；并且

Z

R’R

在一个实施例中，R

在另一个实施例中，a是3。在另一个实施例中，b是0。

在另一个实施例中，a是3，b是0并且R是-CH

在另一个实施例中，X和Y各自独立地是-(CH

在另外的实施例中，M

在一个实施例中，该阳离子脂质是具有式(V)的化合物，其在至少一个尾部上具有烷氧基或硫代烷氧基(即-S-烷基)基团取代：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中

R’、R

X和Y各自独立地是亚烷基(例如C

Z

在一个实施例中，在Z

在另一个实施例中，X和Y各自独立地是-(CH

R’R

在一个实施例中，该阳离子脂质是具有式(VIA)的化合物，其在双键的α位或可生物降解基团的α位在至少一个尾部上具有一个或多个氟取代基：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中

R

Q不存在或是-O-、-NH-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R

R’不存在、是氢或烷基(例如C

R

其中

(i)R

(ii)该化合物不含有以下部分：

其中----是任选的键；并且

(iii)R

在一个优选的实施例中，R

在另一个实施例中，R

在另一个实施例中，该阳离子脂质是具有式(VIB)的化合物，其在双键的α位或可生物降解基团的α位在至少一个尾部上具有一个或多个氟取代基：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中

R’、R

X和Y各自独立地是亚烷基(例如C

Z

其中X、Y、Z

在一个实施例中，Z

例如Z

在一个实施例中，X和Y各自独立地是-(CH

R’R

在一个实施例中，该阳离子脂质是具有式(VII)的化合物，其在至少一个尾部具有作为可生物降解基团的缩醛基团：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中

R’、R

X和Y各自独立地是亚烷基(例如C

M

条件是M

Z

在一个实施例中，M

在另一个实施例中，X和Y各自独立地是-(CH

R’R

在另一个实施例中，该阳离子脂质或其盐具有：

(i)中心碳原子，

(ii)直接结合至中心碳原子的含氮头基，以及

(iii)直接结合至中心碳原子的两个疏水尾部，其中每个疏水尾部具有式-R

在一个实施例中，该阳离子脂质(例如具有式I-VII)具有不对称疏水基团(即两个疏水基团具有不同的化学式)。例如阳离子脂质可以具有下式：

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中

G是支链或非支链C

R

M

R

R

R

在一个实施例中，主要基团包括(i)头基和(ii)与两个疏水尾部直接结合的中心部分(例如中心碳原子)。代表性中心部分包括但不限于中心碳原子、中心氮原子、中心碳环基团、中心芳基、中心杂环基团(例如中心四氢呋喃基或中心吡咯烷基)和中心杂芳基。

代表性

代表性不对称阳离子脂质包括：

其中w是0、1、2或3；并且X和Y各自独立地是1、2、3、4、5、6或7。

在一个实施例中，每个R独立地是-(CR

在另一个实施例中，R

在一个实施例中，Q不存在，是-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R

在一个实施例中，Q的虚线不存在，b是0，并且R’R

其中n是1至4(例如n是2)。

在一个实施例中，Q的虚线不存在，b是0，并且R’R

其中n是1至4(例如n是2)，并且R

在一个实施例中，Q的虚线不存在，b是0，并且R’R

其中n是1至4(例如n是2)，并且R

在一个实施例中，b是0。在另一个实施例中，a是2、3或4并且b是0。例如在一个实施例中，a是3并且b是0。在另一个实施例中，a是3，b是0，并且Q是-C(O)O-。

在某些实施例中，阳离子脂质中存在的可生物降解基团选自酯(例如-C(O)O-或-OC(O)-)、二硫化物(-S-S-)、肟(例如-C(H)＝N-O-或-O-N＝C(H)-)、-C(O)-O-、-OC(O)-、-C(R

在前述可生物降解阳离子脂质的一个优选的实施例中，该可生物降解阳离子脂质的logP值为至少10.1(如通过斯洛伐克共和国Slovensky Grob的MolinspirationCheminformatics的http://www.molinspiration.com/services/logp.html上可获得的软件所计算的)。更优选地，logP值为至少10.2或10.3。

在前述可生物降解阳离子脂质的另一个优选的实施例中，脂质纳米颗粒中的可生物降解阳离子脂质具有至少1.4的HPLC保留时间(相对于脂质纳米颗粒中的胆固醇的保留时间)，在下文中称为t

又另一个实施例是可生物降解阳离子脂质，其具有(i)至少10.1的logP值和/或至少1.4的t

在一个优选的实施例中，该阳离子脂质在其一个或多个可生物降解基团中包括支链烷基或支链烯基。在另一个优选的实施例中，该阳离子脂质的logP为至少10.2或10.3。在又另一个优选的实施例中，该阳离子脂质的t

在一个实施例中，logP值为至少10.1和/或t

(i)pKa为从约4至约7(例如6.0至6.5)；

(ii)在至少一个疏水尾部(并且优选地所有疏水尾部)中，可生物降解基团通过约6至约12个碳原子(例如6至8个碳原子或8至12个碳原子)与疏水尾部的末端分开，

(iii)对于至少一个疏水尾部(并且优选地所有疏水尾部)，从接头基团到疏水尾部的末端的链长为至多21个原子(例如至多20个原子或从约17至约21个原子，从约18至约20个或从约16至约18个原子)(计算链长时，不计算接头基团中的一个或多个原子)；

(iv)对于至少一个疏水尾部(并且优选地所有疏水尾部)，疏水尾部中的碳原子的总数为从约17至约26个(例如从约19至约26个或从约21至约26个)；

(v)对于至少一个疏水尾部(并且优选地所有疏水尾部)，接头基团与可生物降解基团之间的碳原子的数目范围从约5至约10个(例如6至10个或7至9个)；

(vi)对于至少一个疏水尾部(并且优选地所有疏水尾部)，接头基团与疏水尾部的末端之间的碳原子的总数为从约15至约20个(例如从16至20个、16至18个或18至20个)；

(vii)对于至少一个疏水尾部(并且优选地所有疏水尾部)，可生物降解基团与疏水尾部的末端之间的碳原子的总数为从约12至约18个(例如从13至25个)；

(viii)对于至少一个疏水尾部(并且优选地所有疏水尾部)，疏水尾部中的末端疏水链是支链烷基或烯基，例如，其中分支出现在相对于可生物降解基团的疏水链上的α、β、γ或δ位；

(ix)当配制为脂质纳米颗粒(例如在实例1中)时，阳离子脂质在肝中的体内半衰期(t

(x)当配制为脂质纳米颗粒(例如在实例1中)时，在给药后的前24小时内，阳离子脂质从小鼠肝内清除，其中脂质水平相对于C

(xi)当配制为脂质纳米颗粒(例如在实例1中)时，在给药后的前168小时内，阳离子脂质从小鼠脾内清除，其中脂质水平相对于C

(xii)当配制为脂质纳米颗粒(例如在实例1中)时，阳离子脂质从血浆中消除，其中在啮齿类动物和非人灵长类动物中的终末血浆半衰期(t1/2β)为48小时或更短。

合适的阳离子脂质包括具有前述特性的一些或所有的任何组合的化合物。这些特性提供了阳离子脂质，其保持完整直至递送活性剂(例如核酸)，在这之后在体内发生疏水尾部的裂解。例如，化合物可以具有特性(i)至(viii)的所有特性(除了logP或t

对于含有带正电荷的原子(例如氮原子)的阳离子脂质化合物，该化合物还含有带负电荷的抗衡离子。抗衡离子可以是任何阴离子，例如有机或无机阴离子。阴离子的合适实例包括但不限于甲苯磺酸根、甲磺酸根、乙酸根、柠檬酸根、丙二酸根、酒石酸根、琥珀酸根、苯甲酸根、抗坏血酸根、α-酮戊二酸根、α-甘油磷酸根、卤离子(例如氯离子)、硫酸根、硝酸根、碳酸氢根、和碳酸根。在一个实施例中，抗衡离子是卤离子(例如Cl)。

代表性中心部分包括但不限于中心碳原子、中心氮原子、中心碳环基团、中心芳基、中心杂环基团(例如中心四氢呋喃基或中心吡咯烷基)和中心杂芳基。另外，中心部分可以包括例如甘油酯接头、无环甘油酯类似物接头或环状接头(包括螺接头、双环接头和多环接头)中心部分可以包括官能团，例如醚、酯、磷酸酯、膦酸酯、硫代磷酸酯、磺酸酯、二硫化物、缩醛、缩酮、亚胺、腙或肟。其他中心部分和官能团也是合适的。

在一个实施例中，阳离子脂质是外消旋混合物。在另一个实施例中，该阳离子脂质富集一种非对映异构体，例如该阳离子脂质具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％非对映异构体过量。在又另一个实施例中，该阳离子脂质富集一种对映异构体，例如该脂质具有至少95％、至少90％、至少80％或至少70％对映异构体过量。在又另一个实施例中，该阳离子脂质是手性纯的，例如单一光学异构体。在又另一个实施例中，该阳离子脂质富集一种光学异构体。

当存在双键(例如，碳-碳双键或碳-氮双键)，则在围绕双键的构型中可能存在异构(即，顺/反或E/Z异构)。当在化学结构中图示了双键的构型时，应理解也可以存在相应的异构体。存在的异构体的量可以变化，这取决于异构体的相对稳定性和在异构体之间转化所需的能量。因此，出于实用目的，一些双键仅以单一构型存在，而其他双键(例如，其中相对稳定性相似并且转化能量低)可以作为构型的不可分离的平衡混合物存在。

在一些情况下，双键不饱和被环状不饱和取代。环状不饱和基团可以是脂环族不饱和基团，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基或环辛基。在一些情况下，环状基团可以是多环基团，例如双环基团或三环基团。双环基团可以是桥连的、稠合的或具有螺结构。在一些情况下，双键部分可以被环丙基部分取代，例如

其他合适的尾部基团包括具有式-R

在一个优选的实施例中，-R

在一个实施例中，每个尾部(-R

在一个实施例中，尾部具有下式：

其中R

例如，阳离子脂质可以是

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中R

另一个实例是具有下式的尾部

其中R

例如，阳离子脂质可以是

或其盐(例如其药学上可接受的盐)，其中R

R

例如，具有二氢香茅醇(dihydroitronellol)基团的阳离子脂质可以是

或其盐(例如其药学上可接受的盐)。

在另一个实施例中，上述尾部中的R

在另一个实施例中，上述尾部中的R

例如阳离子脂质可以是：

具有下式的阳离子脂质：

也可以被认为是如下的头基、接头部分和疏水链的两个部分的组合：

以下列出了各种头基、接头部分和疏水链I和II。合适的阳离子脂质包括化合物，该化合物由以下列出的头基、接头基团、疏水链I和疏水链II基团的任何组合组成。

表2E-代表性疏水链II和/或IIa及其组合

在一个实施例中，该阳离子脂质是以下化合物以及其盐(包括其药学上可接受的盐)。该阳离子脂质适合于形成核酸-脂质颗粒。

可替代地，对于具有式

阳离子脂质包括具有替代脂肪酸基团和除了所示的那些外其他二烷基氨基的那些，包括其中烷基取代基不同的那些(例如，N-乙基-N-甲基氨基-、和N-丙基-N-乙基氨基-)。

本发明包括本文所述的阳离子脂质的游离形式，及其药学上可接受的盐和立体异构体。阳离子脂质可以是胺阳离子脂质的质子化盐。术语“游离形式”是指非盐形式的胺阳离子脂质。可以通过用合适的稀碱水溶液(例如稀NaOH水溶液、碳酸钾水溶液、氨水溶液和碳酸氢钠水溶液)处理盐来再生游离形式。

可以通过常规化学方法由包含碱性或酸性部分的阳离子脂质来合成阳离子脂质的药学上可接受的盐。通常，通过离子交换色谱或通过使游离碱与化学计算量或与过量的所希望的成盐无机或有机酸在合适的溶剂或各种溶剂组合中反应来制备碱性阳离子脂质的盐。类似地，通过与适当的无机或有机碱反应来形成酸性化合物的盐。

因此，阳离子脂质的药学上可接受的盐包括如通过使碱性本发明阳离子脂质与无机或有机酸反应而形成的阳离子脂质的无毒盐。例如，无毒盐包括衍生自无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等)的那些；以及由有机酸(如乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、羟乙磺酸和三氟乙酸(TFA))制备的盐。

当阳离子脂质为酸性时，合适的“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱(包括无机碱和有机碱)制备的盐。衍生自无机碱的盐包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰、亚锰、钾、钠以及锌。在一个实施例中，碱选自铵、钙、镁、钾和钠。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括以下各项的盐：伯胺、仲胺和叔胺，取代的胺包括天然存在的取代的胺、环状胺和碱性离子交换树脂，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、Ν,Ν

还应注意，阳离子脂质可能是内盐或两性离子，因为在生理条件下，化合物中的去质子化的酸性部分(例如羧基)可能是阴离子的，然后该电荷可在内部与质子化或烷基化的碱性部分(如季氮原子)的阳离子电荷平衡。

除了上文具体描述的那些以外，本文所述的脂质颗粒和组合物中也可以包括在约生理pH下带有净正电荷的一种或多种其他阳离子脂质。此类阳离子脂质包括但不限于N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2,3-二油基氧基)丙基-N,N-N-三乙基氯化铵(“DOTMA”)；N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2,3-二油酰基氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)；1,2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(“DOTAP.Cl”)；3β-(N-(N',N’-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰氨基)乙基)-N,N-二甲基三氟乙酸铵(“DOSPA”)、双十八烷基酰氨基甘氨酰基羧基精胺(“DOGS”)、1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺(“DOPE”)、1,2-二油酰基-3-二甲基丙烷胺(“DODAP”)、N,N-二甲基-2,3-二油氧基)丙胺(“DODMA”)以及N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)。另外，可以使用许多市售的阳离子脂质制剂，例如，LIPOFECTIN(包括可从GIBCO/BRL获得的DOTMA和DOPE)和LIPOFECTAMINE(包括可从GIBCO/BRL获得的DOSPA和DOPE)。

本文所述的脂质颗粒和组合物还可以包括一种或多种中性脂质。中性脂质(当存在时)可以是在生理pH下以不带电或中性两性离子形式存在的许多脂质物质中的任一种。此类脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。在一个实施例中，中性脂质组分是具有两个酰基的脂质(例如，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。在一个实施例中，中性脂质包含碳链长度在C

本文所述的脂质颗粒和组合物还可包含一种或多种能够减少聚集的脂质。在形成过程中减少颗粒聚集的脂质的实例包括聚乙二醇(PEG)修饰的脂质(PEG脂质，例如PEG-DMG和PEG-DMA)、单唾液酸神经节苷脂Gm1和聚酰胺寡聚物(“PAO”)，例如(在美国专利号6,320,017中所述，将其通过引用以其全文并入)。合适的PEG脂质包括但不限于PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)(例如在美国专利号5,820,873中所述的那些，将其通过引用并入本文)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺、PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油、mPEG(mw2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)。

脂质颗粒和组合物可以包含固醇，例如胆固醇。

在另一方面，本发明涉及包含一种或多种本文所述的阳离子脂质的脂质颗粒。

脂质颗粒包括但不限于脂质体。如本文所用，脂质体是具有包封水性内部的含脂质膜的结构。

另一个实施例是核酸-脂质颗粒(例如SNALP)，其包含阳离子脂质、非阳离子脂质(例如中性脂质)、任选地PEG-脂质缀合物(例如本文讨论的用于减少脂质颗粒聚集的脂质)、任选地固醇(例如胆固醇)和核酸。如本文所用，术语“SNALP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。SNALP代表由脂质制成的颗粒，其中核酸(例如干扰RNA)被包封在脂质内。在某些情况下，SNALP可用于全身性施用，因为它们在静脉内(i.v.)注射后可表现出延长的循环寿命，它们可以在远端位点(例如与施用位点物理上分离的位点)积聚，并且它们可以介导这些远端位点的靶基因表达的沉默。核酸可与缩合剂复合并包封在SNALP内，如国际公开号WO 00/03683中所述，将其披露内容通过引用以其全文并入本文。

例如脂质颗粒可以包含阳离子脂质、促融合的脂质(例如DPPC)、中性脂质、胆固醇以及PEG修饰的脂质。在一个实施例中，该脂质颗粒包括以上脂质混合物，其摩尔比率为约20-70％阳离子脂质:0.1-50％促融合的脂质:5-45％中性脂质:20-55％胆固醇:0.5-15％PEG修饰的脂质(基于脂质颗粒中的100％总摩尔的脂质)。

在脂质颗粒的另一个实施例中，阳离子脂质以约20％和约60％的摩尔百分比存在；中性脂质以约5％至约25％的摩尔百分比存在；固醇以约25％至约55％的摩尔百分比存在；并且PEG脂质是PEG-DMA、PEG-DMG或其组合，并且以约0.5％至约15％的摩尔百分比存在(基于脂质颗粒中的100％总摩尔的脂质)。

在具体的实施例中，脂质摩尔比率(就mol％阳离子脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG或PEG-DMA而言)为约40/10/40/10、35/15/40/10或52/13/30/5。该混合物可以进一步以0.1％-50％、0.1％-50％、0.5％-50％、1％-50％、5％-45％、10％-40％或15％-35％的摩尔比率与促融合脂质组合。换句话说，当脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG或PEG-DMA的40/10/40/10混合物以50％的摩尔比率与促融合肽组合时，所得脂质颗粒可以具有20/5/20/5/50(mol％阳离子脂质/DSPC/胆固醇/PEG-DMG或PEG-DMA/促融合肽)的总摩尔比率。在另一个实施例中，这些组合物中的中性脂质DSPC被POPC、DPPC、DOPE或SM取代。

在一个实施例中，该脂质颗粒包含阳离子脂质、中性脂质、固醇和PEG修饰的脂质。在一个实施例中，该脂质颗粒包含按摩尔计从约25％至约75％的阳离子脂质，例如按摩尔计从约35％至约65％、从约45％至约65％、约60％、约57.5％、约57.1％、约50％或约40％。在一个实施例中，该脂质颗粒包含按摩尔计从约0％至约15％的中性脂质，例如按摩尔计从约3％至约12％、从约5％至约10％、约15％、约10％、约7.5％、约7.1％或约0％。在一个实施例中，该中性脂质是DPPC。在一个实施例中，该中性脂质是DSPC。

在一个实施例中，该配制品包含按摩尔计从约5％至约50％的固醇，例如按摩尔计约15％至约45％、约20％至约40％、约48％、约40％、约38.5％、约35％、约34.4％、约31.5％或约31％。在一个实施例中，该固醇是胆固醇。

本文所述的脂质颗粒可以进一步包含一种或多种治疗剂。在一个优选的实施例中，该脂质颗粒包括核酸(例如寡核苷酸)，例如siRNA或miRNA。

在一个实施例中，该脂质颗粒包含按摩尔计从约0.1％至约20％的PEG修饰的脂质，例如按摩尔计约0.5％至约10％、约0.5％至约5％、约10％、约5％、约3.5％、约1.5％、约0.5％或约0.3％。在一个实施例中，PEG修饰的脂质是PEG-DMG。在一个实施例中，PEG修饰的脂质是PEG-c-DMA。在一个实施例中，该脂质颗粒包含按摩尔计25％-75％的阳离子脂质、0.5％-15％的中性脂质、5％-50％的固醇、和0.5％-20％的PEG修饰的脂质。

在一个实施例中，该脂质颗粒包含按摩尔计35％-65％的阳离子脂质、3％-12％的中性脂质、15％-45％的固醇、和0.5％-10％的PEG修饰的脂质。

在一个实施例中，该脂质颗粒包含按摩尔计45％-65％的阳离子脂质、5％-10％的中性脂质、25％-40％的固醇、和0.5％-5％的PEG修饰的脂质。在一个实施例中，PEG修饰的脂质包含平均分子量为2,000Da的PEG分子。在一个实施例中，PEG修饰的脂质是PEG-二苯乙烯基甘油(PEG-DSG)。在一个优选的实施例中，PEG修饰的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)，例如平均聚乙二醇分子量为2000的PEG-DMG。

在一个实施例中，脂质:siRNA(重量[mg]:重量[mg])的比率为至少约0.5:1、至少约1:1、至少约2:1、至少约3:1、至少约4:1、至少约5:1、至少约6:1、至少约7:1、至少约11:1或至少约33:1。在一个实施例中，脂质:siRNA的比率在约1:1至约35:1、约3:1至约15:1、约4:1至约15:1或约5:1至约13:1之间。在一个实施例中，脂质:siRNA的比率在约3:1至约12:1之间。

一个实施例是脂质颗粒，该脂质颗粒包含可生物降解阳离子脂质、中性脂质、固醇、和能够减少聚集的脂质(例如PEG修饰的脂质)，其中可生物降解阳离子脂质与固醇的摩尔比率范围从约1.6:1至约2.0:1和/或可生物降解阳离子脂质与中性脂质的摩尔比率范围从约5.5:1至约5.9:1。诸位发明人出人意料地发现，相对于固醇和/或中性脂质的量具有一定较高含量的可生物降解阳离子脂质的脂质颗粒表现出增强的用于递送活性剂(例如siRNA)的功效。在一个实施例中，可生物降解阳离子脂质包含脂质部分，其中该脂质部分具有一个或多个可生物降解基团(例如酯基(-C(O)O-或-OC(O)-))。在一个优选的实施例中，能够减少聚集的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)，例如具有平均聚乙二醇分子量为2000的PEG-DMG。

在另一个实施例中，可生物降解阳离子脂质与固醇的摩尔比率是从约1.7至约1.9:1，例如约1.9:1。在另一个实施例中，可生物降解阳离子脂质与中性脂质的摩尔比率范围从约5.5:1至约5.8:1，例如约5.8:1。

在一个实施例中，该脂质颗粒包含从约55至约60mol％的可生物降解阳离子脂质，例如约58mol％(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。脂质颗粒可以包含从约28至约33mol％的固醇，例如从约28至约32mol％(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在一个实施例中，该脂质颗粒包含从约3至约12mol％，例如从约5至约12mol％、从约8至约12mol％或从约9至约11mol％的中性脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在另一个实施例中，该脂质颗粒包含约10mol％的中性脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含从约0.5至约10mol％，例如从约0.5至约5mol％或从约1至约3mol％的能够减少聚集的脂质(例如PEG修饰的脂质)(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。

另一个实施例是脂质颗粒，该脂质颗粒包含可生物降解阳离子脂质、中性脂质、固醇和能够减少聚集的脂质(例如PEG修饰的脂质)，其中该脂质颗粒包含从约55至约60mol％的可生物降解阳离子脂质和从约33至约28mol％的固醇(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在一个实施例中，该脂质颗粒包含约58mol％的可生物降解阳离子脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在另一个实施例中，该脂质颗粒包含从约3％至约12％的中性脂质、和从约0.5至约10mol％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含约10mol％的中性脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含约2mol％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在一个实施例中，该脂质颗粒包含从约55至约60mol％的阳离子脂质、从约3％至约12％的中性脂质、从约28至约33mol％的固醇、和从约0.5至约10mol％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含约58％的阳离子脂质、约10％的中性脂质、约30％的固醇、和约2％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在又另一个实施例中，该脂质颗粒包含约55％的阳离子脂质、约10％的中性脂质、约33％的固醇、和约2％的能够减少聚集的脂质(基于脂质颗粒中100mol％的脂质组分)。在一个优选的实施例中，能够减少聚集的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)，例如具有平均聚乙二醇分子量为2000的PEG-DMG。

在一个实施例中，该脂质颗粒是纳米颗粒。在另外的实施例中，该脂质颗粒的平均直径大小为从约50nm至约300nm，例如从约50nm至约250nm，例如从约50nm至约200nm。

在一个实施例中，含有本文所述的任一实施例的阳离子脂质的脂质颗粒的体内半衰期(t

在另一个实施例中，含有本文所述的任一实施例的阳离子脂质的脂质颗粒的体内半衰期(t

本文所述的脂质颗粒和组合物可以进一步包含一种或多种抗氧化剂。抗氧化剂稳定脂质颗粒并防止、减少和/或抑制脂质颗粒中存在的阳离子脂质和/或活性剂的降解。抗氧化剂可以是亲水性抗氧化剂、亲脂性抗氧化剂、金属螯合剂、主抗氧化剂，次抗氧化剂、其盐及其混合物。在某些实施例中，抗氧化剂包含单独的或与一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种另外的抗氧化剂(例如主抗氧化剂、次抗氧化剂、或其他金属螯合剂)组合的金属螯合剂，例如EDTA或其盐。在一个优选的实施例中，抗氧化剂包含与一种或多种主抗氧化剂和/或次抗氧化剂混合的金属螯合剂，例如EDTA或其盐。例如，抗氧化剂可以包含EDTA或其盐、主抗氧化剂例如a-生育酚或其盐、以及次抗氧化剂例如抗坏血酸棕榈酸酯或其盐的混合物。在一个实施例中，抗氧化剂包含至少约100mM柠檬酸盐或其盐。抗氧化剂的实例包括但不限于亲水性抗氧化剂、亲脂性抗氧化剂及其混合物。亲水性抗氧化剂的非限制性实例包括螯合剂(例如金属螯合剂)，例如乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸盐、乙二醇四乙酸(EGTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-Ν,Ν,Ν',Ν'-四乙酸(BAPTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、2,3-二巯基-l-丙磺酸(DMPS)、二巯基丁二酸(DMSA)、cc-硫辛酸、水杨醛异烟酰腙(SIH)、己基硫代乙胺盐酸盐(HTA)、去铁胺、其盐及其混合物。另外的亲水性抗氧化剂包括抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽、二氢硫辛酸、2-巯基乙烷磺酸、2-巯基苯并咪唑磺酸、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸、焦亚硫酸钠、其盐、及其混合物。亲脂性抗氧化剂的非限制性实例包括维生素E异构体例如α-、β-、γ-和δ-生育酚以及α-、β-、γ-和δ-生育三烯酚；聚苯酚例如2-叔-丁基-4-甲基苯酚、2-叔-丁基-5-甲基苯酚和2-叔-丁基-6-甲基苯酚；丁基化羟基茴香醚(BHA)(例如2-叔-丁基-4-羟基茴香醚和3-叔-丁基-4-羟基茴香醚)；丁基羟基甲苯(BHT)；叔丁基氢醌(TBHQ)；抗坏血酸棕榈酸酯；rc-没食子酸丙酯；其盐；以及它们的混合物。合适的抗氧化剂和含有此类抗氧化剂的配制品描述于国际公开号WO2011/066651中，将其通过引用并入本文。

在另一个实施例中，脂质颗粒或组合物含有抗氧化剂EDTA(或其盐)、抗氧化剂柠檬酸盐(或其盐)、或EDTA(或其盐)与一种或多种(例如混合物)主抗氧化剂和/或次抗氧化剂(例如α-生育酚(或其盐)和/或抗坏血酸棕榈酸酯(或其盐))的组合。

在一个实施例中，抗氧化剂以足以防止、抑制或减少脂质颗粒中存在的阳离子脂质的降解的量存在。例如，抗氧化剂可以以至少约或约0.1mM、0.5mM、1mM、10mM、100mM、500mM、1M、2M或5M或从约0.1mM至约1M、从约0.1mM至约500mM、从约0.1mM至约250mM或从约0.1mM至约100mM的浓度存在。

本文所述的脂质颗粒和组合物可以进一步包含载脂蛋白。如本文所用，术语“载脂蛋白”或“脂蛋白”是指本领域技术人员已知的载脂蛋白及其变体和片段，以及指下文所述的载脂蛋白激动剂、其类似物或片段。

在一个优选的实施例中，该活性剂是核酸，例如siRNA。例如，活性剂可以是用目的产物编码的核酸，该核酸包括但不限于RNA、反义寡核苷酸、antagomir、DNA、质粒、核糖体RNA(rRNA)、微RNA(miRNA)(例如，单链且长度为17-25个核苷酸的miRNA)、转移RNA(tRNA)、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、抗原、其片段、蛋白质、肽、疫苗和小分子或其混合物。在一个更优选的实施例中，核酸是寡核苷酸(例如，长度为15-50个核苷酸(或长度为15-30或20-30个核苷酸))。siRNA可以具有例如16-30个核苷酸长的双链体区。在另一个实施例中，核酸是免疫刺激寡核苷酸、诱饵寡核苷酸、supermir、miRNA模拟物或miRNA抑制剂。Supermir是指核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或两者或它们的修饰的单链、双链或部分双链的寡聚物或聚合物，其核苷酸序列与miRNA基本上相同，并且相对于其靶标是反义的。miRNA模拟物代表可用于模拟一种或多种miRNA的基因沉默能力的一类分子。因此，术语“微RNA模拟物”是指能够进入RNAi途径并调节基因表达的合成的非编码RNA(即，miRNA不是通过从内源性miRNA的来源纯化而获得的)。

脂质-核酸颗粒中存在的核酸可以呈任何形式。核酸可以例如是单链DNA或RNA、或双链DNA或RNA、或包括其化学修饰类似物的DNA-RNA杂合体。双链RNA的非限制性实例包括siRNA。单链核酸包括例如反义寡核苷酸、核酶、微RNA和形成三链体的寡核苷酸。脂质颗粒还可以递送与一个或多个配体缀合的核酸。

可以将脂质颗粒(特别是当与治疗剂结合时)配制为药物组合物，例如，其还包含药学上可接受的稀释剂、赋形剂或载体，例如生理盐水或磷酸盐缓冲液。

可以通过常规的熟知的灭菌技术对所得的药物制剂进行灭菌。然后可以将水溶液包装以供使用或在无菌条件下过滤并冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水溶液合并。所述组合物可包含近似生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，例如pH调节剂和缓冲剂和张力调节剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾和氯化钙。另外，脂质悬浮液可以包括脂质保护剂，其在储存时保护脂质免受自由基和脂质过氧化损伤。亲脂性自由基淬灭剂如α-生育酚和水溶性铁特异性螯合剂如铁胺是合适的。

药物配制品中脂质颗粒或脂质核酸颗粒的浓度可以例如按重量计从小于约0.01％变化至等于或至少约0.05％-5％至多达10％至30％。

制造阳离子脂质、含有它们的脂质颗粒以及含有阳离子脂质和/或脂质颗粒的药物组合物的方法描述于例如国际公开号WO 2010/054406、WO 2010/054401、WO 2010/054405、WO 2010/054384、WO 2010/042877、WO 2010/129709、WO 2009/086558和WO 2008/042973以及美国专利公开号2004/0142025、2006/0051405和2007/0042031中，将其各自通过引用以其全文并入。

例如在一个实施例中，制备一种或多种脂质(包括本文所述的任一实施例的阳离子脂质)在有机溶液(例如乙醇)中的溶液。类似地，制备一种或多种活性(治疗)剂(例如，siRNA分子或两种siRNA分子的1:1摩尔混合物)在缓冲水溶液(例如，柠檬酸盐缓冲液)中的溶液。将两种溶液混合并稀释以形成siRNA脂质颗粒的胶态悬浮液。在一个实施例中，siRNA脂质颗粒的平均粒径为约80-90nm。在另外的实施例中，可以通过0.45/2微米过滤器将分散体过滤，浓缩并通过正切流动过滤进行渗滤。

如本文所用，术语“阳离子脂质”包括具有一个或两个脂肪酸或脂肪脂族链以及含有在生理pH下可被质子化以形成阳离子脂质的头基的氨基酸的那些脂质。在一些实施例中，阳离子脂质被称为“氨基酸缀合物阳离子脂质”。

受试者或患者(其中施用复合物是疾病或障碍的有效治疗方案)优选地是人，但在临床试验或筛选或活性实验的情况下可以是任何动物，包括实验动物。因此，如本领域普通技术人员容易理解的，本发明的方法、化合物和组合物特别适合于施用于任何动物，特别是哺乳动物，并且包括但绝不限于人、家畜(例如猫科或犬科受试者)、农场动物(例如但不限于牛、马、山羊、绵羊和猪受试者)、野生动物(无论在野外还是在动物园中)、研究动物(例如小鼠、大鼠、兔子、山羊、绵羊、猪、狗和猫)、禽类(例如鸡、火鸡和鸣禽)，即用于兽医医学用途。

以上通式中列举的许多化学基团都以特定顺序书写(例如-OC(O)-)。除非另有说明，否则旨在将化学基团以所呈现的顺序并入到通式中。例如，形式-(R)

术语“可生物降解阳离子脂质”是指具有位于阳离子脂质的脂质部分(例如疏水链)的中部或远侧区段中的一个或多个可生物降解基团的阳离子脂质。一个或多个可生物降解基团掺入阳离子脂质中导致在将活性药物成分递送至靶区域后阳离子脂质更快的代谢以及从体内除去。

如本文所用，术语“可生物降解基团”是指包括一个或多个键的基团，该键可在生物环境中(例如在生物体、器官、组织、细胞或细胞器中)经历键断裂反应。例如，可生物降解基团可以被哺乳动物(例如人)的身体代谢(例如，通过水解)。含有可生物降解键的一些基团包括，例如但不限于酯、二硫醇和肟。可生物降解基团的非限制性实例是-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(R

如本文所用，“脂族”基团是其中碳原子连接成链并且是饱和或不饱和的非芳香族基团。

术语“烷基”和“亚烷基”是指直链或支链饱和烃部分。在一个实施例中，烷基是直链饱和烃。除非另有说明，否则“烷基”或“亚烷基”含有从1至24个碳原子。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基和正己基。代表性饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基和异戊基。

术语“烯基”是指具有一个或多个碳-碳双键的直链或支链烃部分。在一个实施例中，烯基含有1、2或3个双键并且另外为饱和的。除非另有说明，否则“烯基”含有从2至24个碳原子。烯基包括顺式及反式异构物。代表性直链及支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、和2,3-二甲基-2-丁烯基。

术语“炔基”是指具有一个或多个碳-碳三键的直链或支链烃部分。除非另有说明，否则“炔基”含有2至24个碳原子。代表性直链及支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基和3-甲基-1-丁炔基。

除非另有说明，否则术语“支链烷基”、“支链烯基”和“支链炔基”是指其中基团中的一个碳原子(1)与至少三个其他碳原子结合，并且(2)不是环状基团的环原子的烷基、烯基或炔基。例如，烷基、烯基或炔基中的螺环基团不被认为是分支点。

除非另有说明，否则术语“酰基”是指被氢、烷基、部分饱和或完全饱和的环烷基、部分饱和或完全饱和的杂环、芳基或杂芳基取代的羰基。例如，酰基包括以下基团，例如(C

术语“芳基”是指芳香族单环、双环或三环烃环体系。除非另有说明，否则“芳基”含有6至14个碳原子。芳基部分的实例包括但不限于苯基、萘基、蒽基和芘基。

术语“环烷基”和“亚环烷基”是指饱和的单环或双环烃部分，例如环丙基、环丁基、环戊基和环己基。除非另有说明，否则“环烷基”或“亚环烷基”含有3至10个碳原子。

术语“环烷基烷基”是指与烷基结合的环烷基，其中烷基与分子的其余部分结合。

术语“杂环”(或“杂环基”)是指饱和或不饱和的非芳香族5元至8元单环、或7元至12元双环或11元至14元三环环体系，并且如果是单环则含有1至3个杂原子，如果是双环则包含1-6个杂原子，如果是三环则包含1-9个杂原子，该杂原子独立地选自氮、氧和硫，并且其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化。例如，杂环可以是环烷氧基。杂环可以经由杂环中的任何杂原子或碳原子连接至分子的其余部分。杂环包括但不限于吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基和四氢噻喃基。

术语“杂芳基”是指芳香族5-8元单环、7-12元双环或11-14元三环环体系，其如果是单环则具有1-3个杂原子、如果是双环则具有1-6个杂原子、或如果是三环则具有1-9个杂原子，其中所述杂原子选自O、N或S(例如，如果是单环、双环或三环，分别具有碳原子和1-3个、1-6个或1-9个N、O或S的杂原子)。本文所述的杂芳基还可以含有共享共同碳-碳键的稠合环。

除非另有说明，否则术语“取代的”是指给定结构中的一个或多个氢基团被规定取代基的基团置换，这些规定取代基包括但不限于：卤基、烷基、烯基、炔基、芳基、杂环基、巯基、烷硫基、氧代、硫氧基、芳硫基、烷硫基烷基、芳硫基烷基、烷基磺酰基、烷基磺酰基烷基、芳基磺酰基烷基、烷氧基、芳氧基、芳烷氧基、氨基羰基、烷基氨基羰基、芳基氨基羰基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、卤代烷基、氨基、三氟甲基、氰基、硝基、烷基氨基、芳基氨基、烷基氨基烷基、芳基氨基烷基、氨基烷基氨基、羟基、烷氧基烷基、羧基烷基、烷氧基羰基烷基、氨基羰基烷基、酰基、芳烷氧基羰基、羧酸、磺酸、磺酰基、膦酸、芳基、杂芳基、杂环基以及脂族基团。应理解的是，该取代基可以进一步被取代。示例性取代基包括氨基、烷基氨基、二烷基氨基和环氨基化合物。

术语“卤素”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。

以下缩写可用于本申请：

DSPC：二硬脂酰基磷脂酰胆碱；DPPC：1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱；POPC：1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-磷脂酰胆碱；DOPE：1,2-二油酰基-sn-3-磷酸乙醇胺；PEG-DMG通常是指1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇(例如PEG 2000)；TBDPSCl：叔-丁基氯二苯基硅烷；DMAP：二甲基氨基吡啶；HMPA：六甲基磷酰胺；EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺；DIPEA：二异丙基乙胺；DCM：二氯甲烷；TEA：三乙胺；TBAF：四丁基氟化铵

制备各种有机基团和保护基团的方法是本领域已知的，并且它们的用途和修饰通常在本领域技术人员的能力范围内(参见，例如Green,T.W.等人,

可以通过本文所述的技术或已知的有机合成技术中的至少一种来制备这些化合物。

实例1：醚连接的脂质的合成

10-(4-溴丁氧基)十九碳-1,18-二烯3

向十九碳-1,18-二烯-10-醇(30mmol，8.145g)在甲苯中的溶液添加NaH(90mmol，60％，3.6g)。将反应混合物在80℃搅拌过夜。冷却至室温，向反应中添加纯净的1,4-二溴丁烷(300mmol，64.78g)。然后将反应混合物在90℃加热6小时。TLC显示反应完成。冷却至室温，将反应混合物用冰淬灭，用EtOAc萃取，用盐水洗涤。将有机层分离并且经硫酸钠干燥。将有机层过滤并且在减压下蒸发。将残余物通过ISCO(SiO2：0％-10％EtOAc/己烷)纯化以提供呈无色油状物的产物(12.46g)。

9-(4-溴丁氧基)十七烷二酸4

向1L RBF中添加10-(4-溴丁氧基)十九碳-1,18-二烯(30mmol，12.46g)在400mL(1:1体积)无水DCM和乙腈中的溶液，添加RuCl3(1.5mmol，311mg)并在冰浴中冷却，缓慢添加NaIO4(300mmol，64g)在水中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成。将反应混合物用DCM和水稀释。添加几滴3％亚硫酸钠用于脱色。将有机层分离并经硫酸钠干燥并在真空下蒸发。将残余物通过ISCO(SiO2：0％-10％MeOH/DCM(+0.1％AcOH))纯化以提供呈无色油状物的产物(7.9g)。MS:M+2＝453.1。

9-(4-(二甲基氨基)丁氧基)十七烷二酸5

向150mL耐压瓶中添加9-(4-溴丁氧基)十七烷二酸(10mmol，4.51g)在无水THF(80mL)中的溶液，然后添加碳酸钾(30mmol，4.14g)和2M二甲胺(50mmol，25mL)在无水THF中的溶液。将反应混合物密封并在65℃搅拌过夜。TLC显示反应完成。通过添加1N HCl将反应混合物酸化至约PH 4，将溶液用DCM和水萃取。将有机层分离并且经硫酸钠干燥。将有机溶液过滤并在真空下蒸发。将残余物与3x 20mL甲苯共蒸发，以提供呈浅棕色油状物的产物(3.64g)。

9-(4-(二甲基氨基)丁氧基)十七烷二酸二氯6

在0℃下，向9-(4-(二甲基氨基)丁氧基)十七烷二酸(8.75mmol，3.64g)在无水DCM(50mL)中的溶液添加5滴无水DMF，逐滴添加草酰氯(52.5mmol，4.58mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。当在MeOH中制备样品时，通过检查MS完成反应，质谱显示甲酯质量。将反应混合物在真空下蒸发并提供呈红色油状物的产物，将其按原样用于下一步骤。用MeOH(甲酯)处理后进行MS。MS:M+1＝444.3。

9-(4-(二甲基氨基)丁氧基)十七烷二酸双(3-戊基辛基)酯(ALNY-651)

向9-(4-(二甲基氨基)丁氧基)十七烷二酰二氯(3.29mmol，1.49g)在DCM(30mL)中的溶液添加碳酸钾(16.45mmol，2.27g)，然后添加3-戊基辛烷-1-醇(13.16mmol，2.64g)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成。将反应用水淬灭并用DCM萃取。将有机层分离并经硫酸钠干燥并在真空下蒸发。将残余物通过ISCO(SiO2：30％-100％EtOAc/己烷，含3％TEA)纯化以提供无色油状物(0.538g)。MS:M+1＝780.7。

9-(4-(异丙基(甲基)氨基)丁氧基)十七烷二酸双(3-戊基辛基)酯(ALNY-659)

使用类似的程序合成脂质659。MS:M+1＝809.7。

9-(4-(二甲基氨基)丁氧基)十七烷二酸双(2-异丙基-5-甲基己基)酯(ALNY-652)

MS:M+1＝697.6。

9-(4-(异丙基(甲基)氨基)丁氧基)十七烷二酸双(2-异丙基-5-甲基己基)酯(ALNY-657)

MS:M+1＝725.0。

3-戊基辛-2-烯酸乙酯II

通过加料漏斗向膦酰基乙酸三乙酯(100mmol，22.42g)在无水THF(50mL)中的溶液中并在-10℃下逐滴添加1N NaHMDS(IN THF，100mL)。添加后，将反应混合物在-10℃搅拌1hr，然后在0℃搅拌1hr。向其中添加6-十一烷酮(50mmol，8.52g)，温热至室温并在45℃搅拌过夜。将反应混合物用水淬灭，用二乙醚(2X 100mL)萃取，将合并的醚用盐水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，并过滤。将有机溶液蒸发。将残余物通过ISCO(SiO2：100％己烷)纯化以提供呈无色油状物的产物(11.7g)。

3-戊基辛酸乙酯III

向200mL RBF中添加3-戊基辛-2-烯酸乙酯(48.6mmol，11.7g)在乙酸乙酯(100mL)中的溶液。将溶液用氩气吹扫3次，添加Pd/C(5％wt)，用氩气吹扫并回填，然后通过氢气球充入氢气。将反应混合物用H2气球搅拌过夜。通过硅藻土过滤，用乙酸乙酯彻底洗涤，将合并的有机溶液在减压下蒸发以提供呈无色油状物的产物(11g)。

3-戊基辛烷-1-醇IV

向250mL RBF中添加3-戊基辛酸乙酯(45.4mmol，11g)在无水THF中的溶液。在冰浴中并在氩气下冷却，缓慢添加LAH(2N THF，91mmol，45.4mL)。温热至室温并在室温下搅拌30min，然后在70℃搅拌过夜。将该反应混合物冷却至室温。在0℃下，逐滴添加饱和酒石酸钾钠四水合物溶液直到无鼓泡。将混合物用二乙醚稀释，通过硅藻土过滤，将合并的醚经硫酸钠干燥并过滤。将有机溶液在减压下蒸发。将残余物通过ISCO(SiO2：0％-10％EtOAc/己烷)纯化以提供产物8.26g。

实例2：含酯脂质的合成

(2E,13Z,16Z)-二十二碳-2,13,16-三烯酸乙酯

向1L RBF中添加750mL DCM并在搅拌下添加草酰氯(239.1mmol，20.5mL)。冷却至-78℃，逐滴添加DMSO(296.48mmol，23.16g)，然后在5min内缓慢添加(11Z,14Z)-二十碳-11,14-二烯-1-醇(119.55mmol，35.21g)在DCM(50mL)中的溶液。在-78℃下搅拌30min后，添加三乙胺(717.3mmol，100mL)。将反应混合物温热至室温并再搅拌50min。向反应中添加乙氧基羰基甲基三苯基膦酸酯(135.47mmol，51g)并在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成。将反应混合物用1N HCl淬灭，用DCM萃取，并用盐水洗涤。将有机层分离并经硫酸钠干燥并在真空下蒸发。将残余物通过ISCO(SiO2：0％-30％EtOAc/己烷)纯化以提供呈无色油状物的产物(26.75g)。MS:M+1＝363.3。

(13Z,16Z)-3-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十二碳-13,16-二烯酸乙酯

向预干燥的250mL RBF中添加CuBr(0.76mmol，109mg)和LiCl(1.52mmol，64.4mg)在THF(10mL)中的溶液，并在室温下搅拌10min，在冰浴中冷却，添加(2E,13Z,16Z)-二十二碳-2,13,16-三烯酸乙酯(7.6mmol，2.8g)在DCM(40mL)中的溶液，然后添加TMSCl(8.36mmol，908mg)。将反应混合物在0℃搅拌15min，然后添加(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)溴化镁(11.4mmol，3.3g)在THF(16mL)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌1.5hr，并且然后在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成，将反应用饱和NH4Cl淬灭，用二乙醚(200mL)稀释，萃取并分离，用盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥并且在真空下蒸发。将残余物通过ISCO(SiO2：0％-20％EtOAc和己烷)纯化以提供呈无色油状物的产物(2.16g)。

(13Z,16Z)-3-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十二碳-13,16-二烯-1-醇

在0℃下，向(13Z,16Z)-3-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十二碳-13,16-二烯酸乙酯(10.87mmol，5.97g)在无水THF(60mL)中的溶液中缓慢添加氢化铝锂(1N THF，21.74mmol，22mL)。将反应混合物在0℃搅拌15min，然后在室温下搅拌4hr。在冰浴中冷却，逐滴添加饱和酒石酸钾钠四水合物溶液直到无鼓泡。将反应混合物用EtOAc稀释并萃取。将有机层分离并经硫酸钠干燥并浓缩至无色油状物。将残余物与甲苯共蒸发以去除任何痕量的水。产生产物3.61g。

甲磺酸(13Z,16Z)-3-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十二碳-13,16-二烯-1-基酯

在0℃下，向(13Z,16Z)-3-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十二碳-13,16-二烯-1-醇(7.132mmol，3.61g)在无水DCM(50mL)中的溶液中添加三甲胺(21.396mmol，2.99mL)，然后添加MsCl(14.264mmol，1.1mL)。将反应混合物在室温下搅拌5hr。TLC显示反应完成。用饱和NaHCO3淬灭反应，用DCM稀释并萃取。将有机层分离并且经硫酸钠干燥。将有机溶液过滤并在减压下蒸发以得到产物(1.77g)。

(13Z,16Z)-3-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-1-胺

向150mL耐压瓶中添加甲磺酸(13Z,16Z)-3-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十二碳-13,16-二烯-1-基酯(2.37mmol，1.39g)在THF(20mL)中的溶液，添加二甲胺(2M THF，14.22mmol，7.11mL)。将反应混合物密封并在65℃加热过夜。将反应混合物在0℃冷却并用盐水淬灭，用EtOAc稀释并萃取。将有机层分离并经硫酸钠干燥并在真空下蒸发得到黄色油状物。将残余物通过ISCO(SiO2：30％-100％EtOAc/己烷(添加3％三甲胺))纯化以提供呈浅黄色油状物的产物(1.38g)。

(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯醛

向(13Z,16Z)-3-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)-N,N-二甲基二十二碳-13,16-二烯-1-胺(2.58mmol，1.38g)在丙酮(10mL)中的溶液中添加1N HCl(7mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成，向反应混合物中缓慢添加20％K

(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯-1-醇

在0℃，向(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯醛(0.327mmol，160mg)在无水MeOH(4mL)中的溶液中添加NaBH4(0.653mmol，25mg)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成。将反应混合物用饱和NH4Cl淬灭，用EtOAc稀释并萃取。将有机层经硫酸钠干燥并浓缩得到无色油状物。将残余物通过ISCO(SiO2：30-80％EtOAc/己烷)纯化以提供产物145mg。

2-乙基己酸(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯-1-基酯(ALNY-654)

向100mL RBF中添加(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯-1-醇(0.295mmol，145mg)在无水DCM(3mL)中的溶液，向其中添加K

9-溴壬醛

向200mL RBF中添加氯铬酸吡啶鎓(30mmol，6.47g)和MgSO4(2.5g)在DCM(50mL)中的悬浮液。在冰浴中冷却，缓慢添加9-溴-异壬醇(20mmoL，4.46g)在无水DCM(10mL)中的溶液。在0℃搅拌1hr，然后在室温搅拌1hr。向反应混合物中添加二乙醚(2x 50mL)并剧烈搅拌5min，通过硅藻土过滤。将残余物用3x 50mL的醚洗涤。将合并的醚溶液浓缩得到呈棕色油状物的产物(4.06g)。

2-(8-溴辛基)-1,3-二氧戊环

向250mL RBF中添加9-溴壬醛(18.09mmol，4.0g)在无水甲苯(60mL)中的溶液，添加p-TsOH(0.946mmol，180mg)，然后添加乙二醇(53.97mmol，3.35g)。该反应装备有迪恩-斯塔克(Dean-Stark)和冷凝器并在130℃回流过夜。将反应混合物用饱和NaHCO3淬灭，用EtOAc萃取，用盐水洗涤。将有机溶液经硫酸钠干燥并在减压下蒸发得到无色油状物。将残余物通过ISCO(SiO2：0％-20％EtOAC/己烷)纯化以提供产物3.12g。

(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)溴化镁

向100mL 2颈RBF中添加预活化的Mg屑(12.67mmol，308mg)在THF(16mL)中的溶液，添加2-(8-溴辛基)-1,3-二氧戊环(6.34mmol，1.68g)在THF中的溶液，然后添加1-2个晶体碘。将反应在60℃搅拌35min。将溶液脱色。冷却至室温并照原样使用。

(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯酸

向(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯醛(1.45mmol，711mg)在无水DMF(6mL)中的溶液中添加Oxone(1.45mmol，892.3mg)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成，添加水淬灭反应，用EtOAc稀释并萃取，用盐水洗涤。将有机层分离并且经硫酸钠干燥。将合并的有机层在减压下蒸发。将残余物与甲苯共蒸发以去除任何水。产生产物(733mg)。MS:M+1＝506.5。

(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯酰氯

在0℃，向(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯酸(1.45mmol，733mg)在无水DCM(8mL)中的溶液中添加2滴无水DMF，然后逐滴添加纯净的草酰氯。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成(用MeOH处理反应混合物的小样品)。将反应溶液浓缩得到深红色油状物。

(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯酸3-戊基辛基酯

向(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯酰氯(0.944mmol，495mg)在DCM(10mL)中的溶液中添加K

(20Z,23Z)-10-(2-(二甲基氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯酸2-异丙基-5-甲基己基酯

MS:M+1＝647.6。

(20Z,23Z)-10-(2-(异丙基(甲基)氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯酸3-戊基辛基酯

MS:M+1＝717.8。

(20Z,23Z)-10-(2-(异丙基(甲基)氨基)乙基)二十九碳-20,23-二烯酸2-异丙基-5-甲基己基酯

MS:M+1＝675.7。

(14Z,17Z)-4-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十三碳-14,17-二烯腈

向甲磺酸(13Z,16Z)-3-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十二碳-13,16-二烯-1-基酯(5.13mmol，3g)在EtOH(200标准酒精度)中的溶液中添加KCN(15.39mmol，1.02g)的水溶液，将反应在80℃回流过夜。将冷凝器连接到KOH捕集器，以中和释放的HCN。将反应混合物用饱和NaHCO3淬灭，用醚萃取，用盐水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，并过滤。将有机溶液在减压下蒸发得到无色油状物。将残余物通过ISCO(SiO2：0％-20％EtOAc/己烷)纯化以提供产物(2.08g)。MS:ES

(14Z,17Z)-4-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十三碳-14,17-二烯-1-胺

在0℃，向(14Z,17Z)-4-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十三碳-14,17-二烯腈(4.03mmol，2.08g)在无水THF中的溶液中添加1N水合锂铝在THF(8.06mmol，8.06mL)中的溶液。将反应混合物在0℃搅拌25min，然后在室温下搅拌4小时。在冰浴中冷却，向反应混合物中逐滴添加饱和酒石酸钾钠四水合物溶液直到无鼓泡并形成ppt。将ppt通过硅藻土过滤。将溶液用EtoAC和盐水萃取。将有机层分离并经硫酸钠干燥并过滤。将有机溶液在减压下蒸发得到无色油状物。将残余物在高真空中干燥过夜，产生2g产物。MS:M+1＝520.5。

(14Z,17Z)-4-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-1-胺

向(14Z,17Z)-4-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)二十三碳-14,17-二烯-1-胺(3.85mmol，2g)在无水MeOH(20mL)中的溶液中添加甲醛(30％水溶液，10mL)，然后添加Na(OAC)3BH3(15.39mmol，3.26g)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成。将反应混合物用1N NaOH淬灭，用EtOAc萃取，用盐水洗涤。将合并的有机层经硫酸钠干燥并过滤。将有机溶液在减压下蒸发得到无色油状物。将残余物通过ISCO(SiO2，0-80％EtOAc/己烷)纯化以提供产物(2.3g)。MS:M+1＝548.5。

(20Z,23Z)-10-(3-(二甲基氨基)丙基)二十九碳-20,23-二烯醛

向(14Z,17Z)-4-(8-(1,3-二氧戊环-2-基)辛基)-N,N-二甲基二十三碳-14,17-二烯-1-胺(3.65mmol，2.3g)在丙酮(25mL)中的溶液中添加1N HCl(10mL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物用20％K

(20Z,23Z)-10-(3-(二甲基氨基)丙基)二十九碳-20,23-二烯酸

向(20Z,23Z)-10-(3-(二甲基氨基)丙基)二十九碳-20,23-二烯醛(3.78mmol，1.88g)在无水DMF(15mL)中的溶液中添加Oxone(3.72mmol，2.29g)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成。将反应混合物用盐水淬灭，用EtOAc稀释并萃取。将有机层分离并经硫酸钠干燥并过滤。将有机溶液在减压下蒸发得到无色油状物。将残余物与甲苯2x20 mL共蒸发以去除任何痕量的水。产生1.99g产物。MS:M+1＝520.5

(20Z,23Z)-10-(3-(二甲基氨基)丙基)二十九碳-20,23-二烯酰氯

在0℃，向(20Z,23Z)-10-(3-(二甲基氨基)丙基)二十九碳-20,23-二烯酸(3.82mmol，1.99g)在无水DCM中的溶液中添加2滴无水DMF，然后缓慢添加草酰氯(9.57mmol，833uL)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。TLC显示反应完成。将反应混合物浓缩以提供呈棕红色油状物的产物。

(20Z,23Z)-10-(3-(二甲基氨基)丙基)二十九碳-20,23-二烯酸3-戊基辛基酯

向(20Z,23Z)-10-(3-(二甲基氨基)丙基)二十九碳-20,23-二烯酰氯(2.22mmol，1.2g)在无水DCM(10mL)中的溶液中添加K

(20Z,23Z)-10-(3-(二甲基氨基)丙基)二十九碳-20,23-二烯酸2-异丙基-5-甲基己基酯

MS:M+1＝661.7。

实例3：脂质纳米颗粒的制备

使用如国际公开号WO 2010/088537(将其通过引用以其全文并入)中所述的在线混合方法，将本文所述的阳离子脂质用于配制包含AD-1661双链体的脂质体(如下表所示)。除非另有说明，否则脂质纳米颗粒具有下表中所示的配方。

具有“58/10/30/2”的配方的配制品具有下表所示的配方。

具有“55/10/33/2”的配方的配制品具有下表所示的配方。

具有“50/10/38/2”的配方的配制品含有50mol％阳离子脂质、10mol％DSPC、38mol％胆固醇和2mol％PEG-DMG。

siRNA AD-1661双链体具有以下所示的序列。

小写字母是2'OMe修饰，并且Nf是2'F修饰的核碱基，dT是脱氧胸苷，s是硫代磷酸酯

如下制备脂质纳米颗粒。将以上表所列举的比率的阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-DMG以25mg/mL的总脂质浓度溶解在乙醇中。

通过以0.8mg/mL将siRNA AD-1661溶解在低pH乙酸盐或柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)中来制备siRNA储备溶液。

在与siRNA合并之前，储备溶液应完全澄清，并且脂质应完全溶解。因此，如果确定合适，则将储备溶液加热以完全溶解脂质。

通过将每种溶液泵送至T型接头(即，通过在线混合)来合并各储备溶液。具体地，通过T型接头(PEEK Tee主体，IDEX)将乙醇溶液(5ml/min，通过0.01英寸PEEK管)和缓冲水溶液(15mL/min，通过0.02英寸PEEK管)混合。

在T型接头之后，将单个管放置在合并流将排放的地方。除去乙醇，并通过透析交换为PBS。然后使用离心或渗滤将脂质配制品浓缩至合适的工作浓度。

如以上所述制备含有在实例36的表中列出的阳离子脂质的脂质纳米颗粒。

实例4：脂质纳米颗粒的功效

因子VII(FVII)(凝血级联中的主要蛋白质)在肝(肝细胞)中合成并分泌到血浆中。血浆中的FVII水平可以通过简单的基于板的比色测定来测定。因而，FVII代表方便的模型，可用于测定siRNA介导的肝细胞衍生蛋白的下调。

在雌性7-9周龄15-25g雌性C57Bl/6小鼠中，以0.01mg/kg和0.03mg/kg来评估实例3中制备的脂质纳米颗粒的测试配制品的FVII敲低，每个治疗组具有3只小鼠。所有研究都包括接受磷酸盐缓冲盐水(PBS，对照组)或基准配制品的动物。在测试之前立即将配制品在PBS中稀释至适当的浓度。称重小鼠并计算适当的给药体积(10μl/g体重)。通过侧尾静脉来静脉内施用测试和基准配制品以及PBS(用于对照动物)。24小时后，通过腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪来麻醉动物，并通过心脏穿刺将500-700μl血液收集到血清分离管(BDMicrotainer)中。将血液在15℃以2,000xg离心10分钟，收集血清并将其保存在-70℃直至分析。将血清样品在37℃解冻30分钟，在PBS中稀释，并等分到96孔测定板中。根据制造商的说明，使用生色测定法(Biophen FVII试剂盒，Hyphen BioMed公司)评估因子VII的水平，并在配备有405nm波长滤光片的酶标仪中测量吸光度。

通过以上程序测定含有以下阳离子脂质的脂质纳米颗粒配制品的功效。图1示出了第3天的相对FVII蛋白水平(siRNA浓度为0.01和0.03mg/kg)。配制品AF-011含有称为MC3的阳离子脂质。

通过以上程序测定含有以下阳离子脂质的脂质纳米颗粒配制品的功效。图2示出了第2天的相对FVII蛋白水平(siRNA浓度为0.01和0.03mg/kg)。使用斯洛伐克共和国Slovensky Grob的Molinspiration Cheminformatics的http://www.molinspiration.com/services/logp.html上可获得的软件来计算下表中列出的阳离子脂质的logP值。

*使用PEG-DPG(1,2-二棕榈基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇)代替PEG-DMG。

通过以上程序测定含有以下阳离子脂质的脂质纳米颗粒配制品的功效。图3示出了相对FVII蛋白水平(siRNA浓度为0.01和0.03mg/kg)。N/P是指阳离子脂质的氨基基团与siRNA中磷酸基团的比率。

AD-167990的结构如下所示。

小写字母是2'OMe修饰，并且Nf是2'F修饰的核碱基，dT是脱氧胸苷，s是硫代磷酸酯

通过以上程序测定含有以下阳离子脂质的脂质纳米颗粒配制品的功效。图4示出了48小时后相对FVII蛋白水平(siRNA浓度为0.005、0.01和0.03mg/kg)。

实例5：非人灵长类动物研究

这项研究的目的是向雄性和/或雌性食蟹猴单次静脉内输注剂量后，确定靶向F12蛋白的多个脂质纳米颗粒(LNP)的药效学。在这项研究中，测试了五种含有不同脂质(AF-011、AF-070、AF-079、AF-073和AF-074)和F12 siRNA AD-167990的脂质纳米颗粒配制品。在第1天将这些配制品中的每一种以0.3mg/kg的目标剂量在约60分钟内通过静脉内输注施用给食蟹猴(3只动物/组/配制品)。对于所有组，在第-5、-1、1(服药前)、2、3、5、8、15、22、29、36、43、50、57和64天从每只动物收集血液(约1mL)。使用来自分子创新公司(MolecularInnovations)的人因子XII总抗原测定ELISA试剂盒(HFXIIKT-TOT)，利用F12测定来测定F12血浆蛋白水平。

如实例3中所述用F12siRNA AD-167990制备下表中所述的配制品。

下表提供了用于每种配制品的方案。图5示出了相对F12血浆水平(相对于给药前)。

实例6：非人灵长类动物研究

这是向雄性和/或雌性食蟹猴单次静脉内输注剂量后，靶向因子XII(F12)蛋白的多个脂质纳米颗粒(LNP)的单剂量药效学(PD)/药代动力学(PK)研究。在这项研究中，测试了六种含有不同脂质(AF-079、AF-093、AF-0783、AF-073、AF-094和AF-011)和F12 siRNAAD-167990的脂质纳米颗粒配制品。在第1天将这些配制品中的每一种以0.03、0.1或0.3mg/kg的目标剂量在约60分钟内通过静脉内输注施用给食蟹猴(3只动物/组/配制品)。如早期报告的，使用来自分子创新公司(Molecular Innovations)的人因子XII总抗原测定ELISA试剂盒(HFXIIKT-TOT)，利用F12测定来测定F12血浆蛋白水平。

下表中示出了研究设计。

如实例3中所述用F12siRNA AD-167990制备下表中所述的配制品。

图6A、图6B和图7至图9分别示出了AF-094、单剂量的AF-079、AF-073、AF-093和AF-083的剂量应答。

本文引用的所有参考文献通过引用并入。