包含葡萄提取物和蓝莓提取物的特别混合物的组合物的单次剂量用途

摘要

本发明涉及一种组合物的用途，所述组合物包含至少一种由酿酒葡萄和狭叶越橘获得的分子混合物，所述混合物包含：‑至少1％的儿茶素和/或表儿茶素，所述百分比相对于所述混合物的总重量以重量计给出；‑至少5ppm(所述混合物中的百万分率)的阿魏酸；和‑至少200ppm的白藜芦醇，所述组合物在人类或动物中用作单次剂量以改善或维持认知功能。

说明书

本发明涉及特定分子混合物的单次剂量用途，以对人类和动物的认知功能产生快速和即时作用。

越来越多的健康成人，并且尤其是大学生正在寻找改善其认知表现的解决方案。这一追求正导致不当和有时危险地使用药物兴奋剂的情况增加。另外，在持续数周的长期剂量的情形下使用的现有商购营养解决方案可证明是限制性和昂贵的。

因此，从公共健康的利益出发，需要一种安全、非药物性、天然和非限制性解决方案来改善认知表现，尤其是以在单次剂量服用后有效的食品补充剂形式。同样重要的是，剂量要符合少量天然活性成分的要求，并且是在达到所需作用前，例如在考试类型的测试前不久服用的单次剂量。

本发明的目标是满足这些需要。

为此目的，其涉及包含由酿酒葡萄(Vitis vinifera)及狭叶越橘(Vacciniumangustifolium)获得的分子混合物的组合物的用途。

由酿酒葡萄和狭叶越橘获得的分子混合物(尤其是富含类黄酮的分子混合物)是已知的，尤其根据申请FR1560263，所述申请描述了所述混合物在长期摄入期间对人类的认知功能的影响。同样，当在小鼠、犬中长期施用数周以及在人类中长期施用数月时，富含类黄酮的葡萄和蓝莓/覆盆子提取物的作用已显示出对记忆有功效。

然而，尽管类黄酮在长期服用时可对认知产生有益作用，但当以单次剂量服用时，其不一定具有效果且其活性取决于所考虑的类黄酮的类型以及剂量(其通常极大)和相关人的年龄而高度可变。因此，在急性服用(单次剂量)可可饮料下进行的两次临床研究显示出高剂量可可黄烷醇(520、773和994mg)的有益作用，而提供有46mg黄烷醇的对照组则没有效果(Field DT,Williams CM,Butler LT.可可黄烷醇的摄取使得视觉和认知功能急剧改善。《生理学与行为(Physiol Behav)》2011年6月1日；103(3-4)：255-60；Scholey AB,French SJ,Morris PJ,Kennedy DO,Milne AL,Haskell CF.可可黄烷醇的摄取使得情绪和认知表现在持续的心智努力过程中急剧改善。《精神药理学杂志(J Psychopharmacol.)》2010年10月；24(10)：1505-14)。

同样与可可类黄酮的急性摄取有关的Pase等人的另一研究(Pase MP,ScholeyAB,Pipingas A,Kras M,Nolidin K,Gibbs A,Wesnes K,Stough C.“可可多酚增强积极情绪状态而非认知表现：随机化、安慰剂对照试验(Cocoa polyphenols enhance positivemood states but not cognitive performance:a randomized,placebo-controlledtrial.)”《精神药理学杂志》2013年5月；27(5)：451-8)未显示出认知功能的改善。同样，Wightman等人在2012年(Wightman EL,Haskell CF,Forster JS,Veasey RC,Kennedy DO.“表没食子儿茶素没食子酸酯、健康人类的脑血流量参数、认知表现和情绪：一项双盲、安慰剂对照的交叉研究(Epigallocatechin gallate,cerebral blood flow parameters,cognitive performance and mood in healthy humans:adouble-blind,placebo-controlled,crossover investigation.)”《人类精神药理学(Hum Psychopharmacol.)》2012年3月；27(2):177-86)研究了在135mg和270mg类黄酮剂量下急性摄取绿茶提取物对认知的影响，但未报告任何显著结果。最后，两项随机化、对照(安慰剂)、双盲研究，Henrickson和Mattes(Hendrickson SJ,Mattes RD.葡萄汁对食欲、内隐记忆和情绪没有急性影响(No acute effects of grape juice on appetite,implicit memory and mood.)《食品和营养研究(Food Nutr Res.)》2008；52)和Haskell Ramsay等人(Haskell-RamsayCF,Stuart RC,Okello EJ,Watson AW.“健康的年轻成人在急性补充紫葡萄汁之后认知和情绪的改善(Cognitive and mood improvements following acute supplementationwith purple grape juice in healthy young adults.)”《欧洲营养学杂志(Eur JNutr.)》。2017年12月；56(8)：2621-2631)分别在平均21岁和26岁的年轻成人中研究了摄取葡萄汁(美洲葡萄(Vitis Labrusca))对认知(情景记忆、工作记忆、注意力)的急性影响。在第一项研究中，每个志愿者摄取了提供有138mg花青素苷和1504mg多酚的230ml的葡萄汁，而在第二项研究中，向每个志愿者供应了含有580mg花青素苷和2100mg多酚的600ml的葡萄汁。这两项研究都未显示出对记忆有任何影响。

此外，相当出人意料的是，在长期摄入下对认知展现出影响的组合物在单次剂量下同样对认知表现展现出影响。这是本发明的目标，本发明目标尤其为包含至少一种由酿酒葡萄和狭叶越橘获得的分子混合物的组合物的用途，所述混合物包含：

-至少1％的儿茶素和/或表儿茶素，所述百分比相对于所述混合物的总重量以重量计给出，

-至少5ppm(混合物中的百万分率)的阿魏酸(ferulic acid)，和

-至少200ppm的白藜芦醇，

所述组合物在健康人类或健康动物中用作改善或维持认知功能的单次剂量。

有利的是，此类组合物的单次剂量使得可在小于5小时内利用低剂量和天然产物，快速获得认知表现的维持或改善。

参考附图，其它特征和优点将从下文的本发明的详细描述中显现：

-图1示出了为评估根据本发明的效果而进行的临床研究的计划。

-图2按处理(P：安慰剂，V：Verum)分组，示出了说明在评估组重复(B2-B6)期间与评估组B1相比的表现变化的曲线。在A中示出了负三减法测试上的“净”得分(正确-错误)的变化。对于此相同测试，显示了正确响应的％变化(B)以及每批的响应数的变化(C)。D中示出了快速视觉信息处理测试的正确结果。p值是配对t-检验的值。垂直条表示标准差。

-图3按处理(安慰剂、本发明)分组，示出了说明STS+SSS+RVIP测试正确答案的综合Z-得分的曲线，即表示了与B1相比累积正确答案数目的百分比变化的数据。用配对t-检验进行评估组分析。垂直条表示标准差。通过多次比较评估处理(安慰剂、本发明)内的演进并且结果见于表B。

-图4示出了处理对由血流介导的肱动脉的扩张峰的影响的结果(局部缺血后60秒)。配对t-检验安慰剂相对于本发明，无差别。

在本发明的含义内，“动物”意指可以接受根据本发明的组合物的任何动物，例如但不限于宠物、禽类、猪、反刍动物、山羊或甚至小鼠。

在本发明的含义内，“花色素”意指具有糖苷配基或糖基化形式(也就是说，携带糖)的所有花青素或花青素苷或花色苷。因此，在本申请中并在本发明的含义内，术语“花色素”、“花青素”、“花青素苷”和“花色苷”是等效的。

在本发明的含义内，“至少X％的儿茶素和/或表儿茶素”意指：在混合物中不存在表儿茶素的情况下至少X％的儿茶素、或者在混合物中不存在儿茶素的情况下至少X％的表儿茶素、或者在混合物中儿茶素和表儿茶素都存在的情况下至少X％的儿茶素和表儿茶素的混合物。优选地，其意指至少X％的儿茶素和表儿茶素的混合物。

在本发明的含义内，“狭叶越橘的提取物”意指由狭叶越橘获得的至少一种分子，优选一组分子。原料可以是叶子和/或果实；优选地，原料是植物的所有叶子和果实。

在本发明的含义内，“酿酒葡萄提取物”意指由酿酒葡萄获得的至少一种分子，优选一组分子。原料可以是叶子和/或果实和/或种子和/或外皮、木质部；优选地，原料是植物的地上部分，也就是说，所有的叶子、果实、外皮(也就是说，皮)、种子和木质部，甚至更优选地是外皮(皮)和种子。可能富含白藜芦醇的外皮与可能富含黄烷醇单体、原花青定寡聚物和原花色素的种子的组合对于本发明可为特别有利的。

在本发明的含义内，“由酿酒葡萄和狭叶越橘混合物获得的提取物”意指由酿酒葡萄和狭叶越橘混合物获得的一组分子。酿酒葡萄的原料可以是叶子和/或果实和/或种子和/木质部；优选地，酿酒葡萄的原料是植物的地上部分，也就是说，所有的叶子、果实、外皮(皮)、种子和木质部，更优选地是外皮(皮)和种子。狭叶越橘的原料可以是叶子和/或果实；优选地，狭叶越橘的原料是植物的所有叶子和果实。

在本发明的含义内，术语“黄烷醇聚合物”意指展现出大于10的聚合度的黄烷醇。

在本发明的含义内，术语“ppm”意指混合物中的百万分率(mg/kg)。除非另外指明，否则ppm是指相对于混合物总重量的重量。

在本发明的含义内，“单次剂量”意指一次服用的一个或多个摄取单元的摄取。

在本发明的含义内，“健康”意指不受病变(尤其是神经病变)影响的人类或动物，但其可能是疲倦和/或有压力的，但其为非病理状态。

具体实施方式

本发明因而涉及一种组合物的用途，所述组合物包含至少一种由酿酒葡萄和狭叶越橘获得的分子混合物，所述混合物包含：

-至少1％的儿茶素和/或表儿茶素，所述百分比相对于所述混合物的总重量以重量计给出，优选地至少5％，甚至更优选地在5％与50％之间，尤其在7％与35％之间，

-至少5ppm(混合物中的百万分率)的阿魏酸，优选地至少10ppm，甚至更优选地在5ppm与300ppm之间，尤其在10ppm与100ppm之间，以及

-至少200ppm白藜芦醇，优选地至少300ppm，甚至更优选地至少400ppm，甚至更优选地在300ppm与6000ppm之间，尤其在400ppm与6000ppm之间

所述组合物在健康人类或健康动物中用作改善或维持认知功能的单次剂量。

还可以单次剂量的形式使用所述组合物，以用于患病的人类或动物的急性治疗并获得快速作用，尤其是患有可能影响认知表现的疾病(例如感冒)。因此，本发明还涉及一种组合物，所述组合物包含至少一种由酿酒葡萄和狭叶越橘获得的分子混合物，所述混合物包含：

-至少1％的儿茶素和/或表儿茶素，所述百分比相对于所述混合物的总重量以重量计给出，优选地至少5％，甚至更优选地在5％与50％之间，尤其在7％与35％之间，

-至少5ppm(混合物中的百万分率)的阿魏酸，优选地至少10ppm，甚至更优选地在5ppm与300ppm之间，尤其在10ppm与100ppm之间，以及

-至少200ppm白藜芦醇，优选地至少300ppm，甚至更优选地至少400ppm，甚至更优选地在300ppm与6000ppm之间，尤其在400ppm与6000ppm之间

在单次不重复的基础上服用以供用作单次剂量，以改善或维持患病人类或动物的认知功能。在所需作用之前5小时进行这一单次剂量的使用。

除了至少1％的儿茶素和/或表儿茶素、至少5ppm的阿魏酸和至少200ppm的白藜芦醇之外，根据本发明的所述有用组合物的分子混合物还优选地包含：

-至少50ppm的槲皮素和/或槲皮素糖苷，优选地至少70ppm的槲皮素和/或糖苷，尤其是在50ppm与10,000ppm之间，和/或

-至少500ppm的花色素，优选地至少600ppm，甚至更优选地至少700ppm，甚至更优选地在600ppm与5000ppm之间。

优选地，锦葵色素3葡糖苷(malvidin 3glucoside)为主要花色素。优选地，其以至少300ppm的浓度存在于混合物中。

根据第一实施例，所述分子混合物为由酿酒葡萄提取物和狭叶越橘提取物组成的混合物。

根据第二实施例，所述分子混合物为由由酿酒葡萄和狭叶越橘混合物获得的提取物组成的混合物。

根据第三实施例，所述分子混合物为由以下组成的混合物：

-酿酒葡萄的提取物和/或狭叶越橘的提取物，以及

-由酿酒葡萄和狭叶越橘混合物获得的提取物。

优选地，根据本发明的有用组合物中的所述酿酒葡萄提取物为黄烷醇聚合物的含量按重量计小于提取物中多酚总重量的0.5％，甚至更优选地其含量小于0.1％的提取物。根据本发明，黄烷醇聚合物的生物利用度不是很高，不同于黄烷醇单体，其在小肠中吸收极快并接着代谢成甲基化、硫酸化和葡糖苷酸化衍生物。聚合物的这种较少量存在是尤其出于功效和生物可用性使用的葡萄提取物的质量准则。

根据本发明的所述提取物可通过任何方法获得，使得可获得包含以下的混合物：

-相对于所述混合物的总重量以重量计，至少1％的儿茶素和/或表儿茶素，优选地至少5％，甚至更优选地在5％与50％之间，尤其是在7％与35％之间，

-至少5ppm的阿魏酸，优选地至少10ppm，甚至更优选地在5ppm与300ppm之间，尤其在10ppm与100ppm之间，

-至少200ppm的白藜芦醇，优选地至少300ppm，甚至更优选地至少400ppm，甚至更优选地在300ppm与6000ppm之间，尤其在400ppm与6000ppm之间，

-任选地，至少50ppm的槲皮素和/或槲皮素糖苷，优选地至少70ppm的槲皮素和/或糖苷，尤其是在50ppm与10,000ppm之间，

-任选地，至少500ppm的花色素，优选地至少600ppm，甚至更优选地至少700ppm，甚至更优选地在600ppm与5000ppm之间。

优选地，锦葵色素3葡糖苷是浓度为至少300ppm的主要花色素。优选地，所述花色素包含至少20％，更优选地至少25％的锦葵色素3葡糖苷(重量百分比)。

一种尤其适合的方法为包含以下步骤的方法：

-获得酿酒葡萄提取物：

*进行酿酒葡萄(优选地为酿酒葡萄的所有叶子、果实、外皮、种子和木质部)的水和/或乙醇提取；所使用的溶剂的量(30％v/v到96％V/V)为所使用的材料质量的2倍至10倍。提取的持续时间可在30分钟与24小时之间，且提取温度在20℃与80℃之间。所使用的原材料可以是干燥的、新鲜的或冷冻的、完整的或碾碎的；

*例如通过离心倾析或通过按压和过滤，从所述固体材料分离所述水和/或乙醇溶液；

*在优选地低于60℃的温度下并且在低于100mbar的压力下通过真空蒸发来蒸发乙醇；

*进行先前去溶剂化提取物的膜分离，以便优先选择原花青素单体和寡聚物(聚合度在2和10之间，包括2和10)并且消除黄烷醇聚合物(>十聚物)，以获得特征在于黄烷醇聚合物含量相对于提取物中多酚总重量按重量计小于0.5％并且更优选地小于0.1％的提取物。此步骤可使用截止阈值小于15,000道尔顿且更优选地小于3000道尔顿的滤膜来进行；

-获得狭叶越橘提取物：

*进行狭叶越橘(优选地为狭叶越橘的所有叶子和果实)的水和/或乙醇提取；所使用的溶剂的量(30％v/v到96％V/V)为所使用的材料质量的2倍至10倍。提取的持续时间可在30分钟与24小时之间，且提取温度在20℃与80℃之间。所使用的原材料可以是干燥的、新鲜的或冷冻的；

*通过离心倾析或通过按压和过滤，从所述固体材料分离所述水和/或乙醇溶液；

*在优选地低于60℃的温度下并且在低于100mbar的压力下通过真空蒸发来蒸发乙醇；

*在有或无载体(如麦芽糊精)下通过雾化、真空烘箱或冻干干燥所述提取物；

-在所述干燥步骤之前或之后，混合酿酒葡萄和狭叶越橘的提取物。

根据一个变型，所述方法在于实施以下步骤：

-混合酿酒葡萄和狭叶越橘，进行狭叶越橘(优选地为狭叶越橘的所有叶子和果实)的水和/或乙醇提取；所使用的溶剂的量(30％v/v到96％V/V)为所使用的材料质量的2倍至10倍。提取的持续时间可在30分钟与24小时之间，且提取温度在20℃与80℃之间。所使用的原材料可以是干燥的、新鲜的或冷冻的；

-通过离心倾析或通过按压和过滤，从所述固体果渣分离所述水和/或乙醇溶液；

-在优选地低于60℃的温度下并且在低于100mbar的压力下通过真空蒸发来蒸发乙醇；

-在有或无载体(如麦芽糊精)下通过喷雾或升华来干燥所述提取物。

无论所述方法的变型如何，在所述干燥步骤之前，所述方法可包含以下步骤：

-将混合或未混合的提取物的溶液装载到树脂上，

-用水冲洗所述树脂，

-将水/乙醇洗脱溶液施用到所述树脂上，

-回收纯化的洗脱液，

-从所述洗脱液蒸发所述乙醇，

-浓缩所述洗脱液

-干燥纯化的水性提取物。

根据本发明的组合物可仅仅由所述分子混合物(也就是说，提取物)组成，或包含其它组分。优选地，除所述分子混合物以外，根据本发明的组合物还含有其它成分，尤其是赋形剂或包衣剂，如麦芽糊精、微晶纤维素、环糊精、淀粉、可溶或不可溶的纤维。

所述组合物可以呈适合于营养应用的任何形式，优选地呈粉末形式。

所述组合物可整合到另一组合物中，尤其是以选自以下的形式提供的营养组合物中：片剂、胶囊、明胶胶囊、粉末、溶液、微胶囊、悬浮液、乳液、食品补充剂、用于人类或动物的饮料和食品。

其优选地为旨在用于人类的非治疗性营养组合物，例如食品补充剂、条形物、乳制品、待吞咽或复水的粉末、凝胶、果酱、糖果、碳酸化或非碳酸化饮料、待复水的无水饮料、蜜饯。

其还可以是旨在用于动物的营养组合物。

其还可以是旨在用于动物的非治疗性营养组合物，例如干式食品，如(挤压、共挤压或冻干的)粗磨食物、零食、点心、湿或半湿式食品(如酱汁、果冻、饮料或甚至食品补充剂)。优选地，根据本发明的组合物整合到干式食品(如粗磨食物)中。

有利的是，如果旨在用于动物，那么根据本发明的组合物可作为包含物整合到一种组合物(尤其是营养组合物)中，也就是说，通过将前者添加至后者(例如通过浸渍或混合)，或通过包衣，也就是说，通过喷雾或通过粉化将前者施用到后者的表面，例如通过将其与一种或多种成分(例如至少一种适口性增强剂)预先混合。

其可为一种药物组合物、药剂或兽用产品。

对根据本发明的组合物中的混合物具有特异性的酿酒葡萄分子和狭叶越橘分子的存在对认知功能的维持或改善产生了协同作用。

本发明的特定目标因此为如上文所描述的组合物(与其变型无关)，其供在健康人类或动物中以单次剂量使用以改善或维持认知功能。

所述单次剂量在所需作用之前5小时内服用，优选地在所需作用之前3小时内服用。此单次剂量可以在单次、不重复的基础上服用一次。

优选地，本发明涉及以改善或维持认知功能的单次剂量的用途，即，尤其是改善或维持记忆和/或执行功能和/或注意力和/或专注度和/或学习力和/或灵活性和/或规划和/或警觉性。

具体来说，根据本发明的组合物可用于人类以改善或维持其对于考试或需要持续认知能力的测试的表现。

在人类中以单次剂量服用的根据本发明的组合物对于维持或改善优选地超过10岁、甚至更优选地超过15岁并且再更优选地超过18岁的人的认知功能尤其适用且有效。这些可以包括大学生和活跃成人。

根据本发明的组合物在动物中以单次剂量服用，其对于维持或改善犬、猫或马的认知功能尤其适用且有效。

优选地，根据本发明的组合物的使用量使得其可为人类或动物提供：

-每kg体重至少100μg的儿茶素和/或表儿茶素，优选地500μg/kg并且甚至更优选地1mg/kg，和

-优选地，每kg体重至少0.05μg的阿魏酸，优选地0.25μg/kg并且甚至更优选地0.5μg/kg，和

-每kg体重至少10μg的白藜芦醇，优选地50μg/kg并且甚至更优选地100μg/kg，和

-任选地，每kg体重至少0.2μg的槲皮素和/或槲皮素糖苷，优选地1μg/kg并且甚至更优选地2μg/kg，和

-任选地，每kg体重至少1μg的花色素，并且优选地5μg/kg并且甚至更优选地10μg/kg。

现通过实例和测试结果说明本发明，所述实例和测试结果表明了作为本申请的主题的组合物的单次和快速剂量对认知功能的协同作用。

根据本发明的混合物的此第一实例通过实施如下文所描述的方法获得。

所使用的原材料为：

-酿酒葡萄的果实的外皮和种子(籽)，酒行业的副产物，

-狭叶越橘的冷冻浆果。

将400g狭叶越橘的冷冻浆果碾碎且与2000ml含0.1重量％HCl的80％(V/V)乙醇的溶液混合。将混合物在室温(20℃)下保持24小时。随后通过过滤将乙醇溶液与果肉分离，并在真空下用旋转蒸发器浓缩至20％干物质。保存此提取物的一部分以待测试；保存另一部分以待与酿酒葡萄的提取物混合。

将500g酿酒葡萄的外皮和种子与2500ml含0.1重量％HCl的80％(V/V)乙醇在40℃下混合5小时。随后通过过滤将乙醇溶液与果肉分离。随后在真空下用旋转蒸发器在50℃的温度及60mbar的压力下去除乙醇。接着将水溶液稀释到干物质呈5％且通过5000道尔顿膜过滤。然后将所获得的渗透物以1BV/小时装载到树脂柱(C18)上。接着用3BV的蒸馏水以2BV/小时第一次冲洗树脂，并接着用5BV的80％(V/V)乙醇溶液以1BV/小时洗脱所述树脂。

保存所提取的溶液的一部以待测试并加以表征(表1a)。

此表中的多酚通过具有荧光检测器的超高效液相色谱测量。

然后将另一部分与狭叶越橘提取物混合以形成根据本发明的混合物，且将麦芽糊精添加到所述混合物中直到获得固体含量为30％的溶液。

然后将溶液在入口温度为160℃的条件下进行喷雾干燥。

所得到的产物为含有表1b中所呈现的多酚的淡紫色粉末。此表中的多酚通过质谱/质谱超高效液相色谱(UPLC-MS/MS)测量。

根据本发明的混合物的此第二实例通过实施如下文所描述的方法获得。

所使用的原材料为：

-酿酒葡萄的种子和外皮，

-狭叶越橘的浆果。

将1000g冷冻的狭叶越橘果渣粉碎且与5000ml含0.1重量％HCl的60％(V/V)乙醇的溶液混合。将混合物在室温(20℃)下保持24小时。随后通过过滤将乙醇溶液与果肉分离，并在真空下用旋转蒸发器浓缩至20％干物质。

在60℃下将400g所选择的酿酒葡萄外皮和种子与1500ml 80％(V/V)乙醇混合5小时。随后通过过滤将乙醇溶液与果肉分离。随后在真空下用旋转蒸发器在50℃的温度及60mbar的压力下去除乙醇。接着将水溶液稀释到干物质呈5％且通过5000道尔顿膜过滤。然后将所获得的渗透物以1BV/小时装载到树脂柱(C18)上。接着用3BV的蒸馏水以2BV/小时第一次冲洗树脂，并接着用5BV的80％(V/V)乙醇溶液以1BV/小时洗脱所述树脂。

保存所提取的溶液的一部以待测试并加以表征(表2a)。

所得到的产物为含有表2b中所呈现的多酚的淡紫色粉末。此表中的多酚通过超高效液相色谱(UPLC-MS/MS)测量。

将19.980kg实例1的组合物与0.020kg胶态二氧化硅混合。在所属领域的技术人员已知的常规条件下通过混合组分获得组合物。将组合物包装在PET袋中，所述PET袋自身包装在纸板盒中。

所使用的原材料为：

-用于制酒的新鲜酿酒葡萄，

-狭叶越橘的冷冻浆果。

将7.2g狭叶越橘的冷冻浆果碾碎并接着按压。将果汁与固体部分(1.8g)分离。将所述固体部分与35ml含0.1重量％HCl的80％(V/V)乙醇的溶液混合。将混合物在室温(20℃)下保持24小时。随后通过过滤将乙醇溶液与果肉分离，并在真空下用旋转蒸发器浓缩至20％干物质。随后在真空下在麦芽糊精载体上干燥提取物。接着收集180mg呈粉末形式的提取物以待与酿酒葡萄的提取物混合。

按压300g的新鲜葡萄，将果汁与由酿酒葡萄的外皮和种子组成的固体物质(71g)分离。在40℃下将固体物质与1000ml含0.1重量％HCl的80％乙醇(V/V)混合5小时。随后通过过滤将乙醇溶液与果肉分离。随后在真空下用旋转蒸发器在50℃的温度及60mbar的压力下去除乙醇。接着将水溶液稀释到干物质呈5％且通过5000道尔顿膜过滤。然后将所获得的渗透物以1BV/小时装载到树脂柱(C18)上。接着用3BV的蒸馏水以2BV/小时第一次冲洗树脂，并接着用5BV的80％(V/V)乙醇溶液以1BV/小时洗脱所述树脂。随后在50℃的温度及60mbar的压力下用旋转蒸发器蒸发水醇溶液，且随后在真空下干燥所获得的提取物。接着回收420mg无水酿酒葡萄提取物，随后与180mg狭叶越橘提取物混合以构成600mg根据本发明的产品。

根据本发明的产品以明胶胶囊的形式施用。每一明胶胶囊含有总共450mg粉末，其包含300mg根据本发明的产品及150mg玉米麦芽糊精。

产品的建议日服用量为600mg或2粒明胶胶囊。

实例5为400mg明胶胶囊，其由以下组成：

-实例1的组合物：300m

-维生素C：80mg

-麦芽糊精：20mg

通过在所属领域的技术人员已知的常规条件下混合组分来获得组合物，并且同样在常规条件下将组合物置于明胶胶囊中。

建议服用量为每天1到2粒明胶胶囊。

将实例2的根据本发明的组合物添加到挤压式干燥狗粮中，所述狗粮符合AFCO标准并且包含动物粉、脂肪、纤维、谷类以及防腐剂和抗氧化剂。

根据若干实施例，尤其是通过包衣和掺杂将组合物添加到粗磨食物中。

通过将根据本发明的组合物添加到液体D'Tech禽类适口性增强剂(SPF，法国埃尔旺(Elven))中来进行包衣测试。将第一层禽类脂肪(相对于粗磨食物的重量6％)作为粗磨食物上的包衣添加，随后在适口性增强剂(1％、2％或3％，相对于粗磨食物的重量％)与根据本发明的组合物(0.02％、0.04％或0.1％，相对于粗磨食物的重量％)之间添加混合物层。

在挤压之前通过在原料(也被称为预混合物)中添加根据本发明的组合物(0.02％、0.04％或0.1％，相对于粗磨食物的重量％)进行掺杂测试。

对30名18岁至25岁的健康学生志愿者进行单中心、交叉、双盲、安慰剂对照临床研究。

研究的产品组合物为实例4的组合物。

本研究的目标聚焦于根据本发明的产品的单次剂量作用，一方面是通过使用验证的计算机组进行的测试(COMPASS)测量的对于认知功能(工作记忆和注意力)的作用，另一方面是通过测量血流介导的扩张(FMD)评估的对于内皮功能的作用。

实际上，众所周知，组合物对认知功能的功效的主要已知作用机制与内皮功能的改善有关，更确切地说，一氧化氮(NO)的可用性的增加。无论是通过增加内皮细胞的合成还是通过限制其降解(酶、反应性氧化物质)。NO在增加脑血流并且因此在神经元活化期间的局部血管扩张中起主要作用。一种评估内皮功能的简单无创方法在于响应于瞬时局部缺血测量血流介导的肱动脉直径扩张(FMD)。

实例4的组合物以单次口服2粒明胶胶囊(300mg/胶囊，即600mg/剂量)施用。安慰剂是仅含有麦芽糊精(无多酚)的外观相似的胶囊。研究计划示于图1中。

受试者必须遵循以下指令：

-在整个研究期间：不改变其习惯，尤其是关于进食、睡眠、体力和脑力活动；不摄取食品补充剂；不吸烟或摄取麻醉剂；完成每日睡眠时间记录。

-在每次评估访视(V1和V2)之前24小时期间：遵循饮食限制，使得可在测试之前24小时中调节多酚的摄取，完成饮食追踪记录。

-在评估访视之前当天，不进行超过2个小时的剧烈体力活动。

-在评估访视前禁食12小时。

-携带饮食追踪和睡眠时间记录以进行评估访视。

在核对入选和排除标准之后，受试者进入研究并且经历关于计算机认知评估组的培训课程，此计算机认知评估组是使用COMPASS软件(纽卡斯尔的诺桑比亚大学(Nothumbria University,Newcasttle))模块为此次研究设置的。此组的目标是对学校/大学测验的条件进行建模。为了做到这一点，使用了一系列较长并对认知要求较高的计算机化测试。这由一系列六个评估组组成，每个评估组包含：2分钟连续减三法(STS)、2分钟连续七减法(SSS)、5分钟快速视觉信息处理(RVIP)和2分钟利用视觉类比量表(表现，焦虑；表现，疲劳)的主观评价。目标和工作流程的细节在下文中列出：

连续减三法(STS)

此任务测试受试者的注意力和工作记忆。这在于要求参与者尽可能快且精确地执行以-3为单位减法，使用计算机键盘写入答案。在屏幕上显示最初在800与999之间随机抽出的数字。一旦参与者键入第一条目，此数字便消失。如果给出不正确答案，那么将基于参与者给出的最后一个答案自动确定下一个正确答案。此任务持续2分钟。

连续减七法(SSS)

此任务同样评估了受试者的注意力和工作记忆。此任务的操作与STS相同，不同之处在于要求参与者执行以7为单位的减法。此任务同样持续2分钟。

快速视觉信息处理(RVIP)任务：

此任务旨在测量参与者的注意力跨度。在整个测试中，在屏幕上逐个呈现数字(100个/分钟)。要求参与者检测3个连续偶数或奇数数字的出现，且当检测到所述数字序列时尽可能快速地按下其键盘上的空格条。此任务持续5分钟。

具有较高认知要求的此评估组的总持续时间为66分钟：在此66分钟期间，受试者将包括STS、SSS、RVIP和主观评价的评估组的执行一连重复六次。每一评估组持续11分钟。

受试者的准备

研究参与者已禁食12小时且声明他们已经遵循所述指令。对于每一参与者，在两次访视的同一时间进行FMD测量。

设备：

由指定房间中的相同操作员进行记录，其中超声波机(VINNO TM E10)和线性探针(VINNO TM F4-42L)在10MHz下工作。

图像获取：

临床研究技术员将受试者送至FMD检查室，然后将其安置在医疗检查床上并且使其舒适地仰卧休息至少15分钟。在测量血压之后，固定右臂。血压袖带放置在手腕上方的前臂处。放置记录探针并通过受试者手臂刚好高于肘窝处的固持系统固定记录探针，以便在不改变探针方位的情况下获得肱动脉的清晰图像(最大直径)。

血流介导的扩张：FMD

记录动脉的纵向图像2分钟(由于超音波机的可能记录时间的限制，划分成4个连续的30秒时序)。然后，为了诱导短暂局部缺血阶段，操作员将血压袖带充气到前收缩压为230mmHg，持续6分钟。紧接着在解除袖带压缩之后，将动脉图像再记录2分钟(划分成4个连续的30秒时序)。

在第1次访视(V1)的第1次超声波检查结束时，使用厘米尺测量探头位置和肘窝之间的距离，使得对于同一受试者，可以在后续测量期间在同一位置进行肱动脉记录，以获得更好的再现性。

使用配备有半自动血管壁检测系统的“血管研究工具(Vascular ResearchTools)”软件、“肱分析器(Brachial Analyzer)”模块分析记录。所有分析都由对所取得的产品不知情的相同操作员进行。

根据以下公式，FMD计算为动脉的直径从其基线值增加的百分比：FMD＝(最大直径-基础直径)/基础直径×100。基础动脉直径的值计算为在压缩之前2分钟期间获得的各值的平均值。最大直径的值计算为在解除压缩之后测量的4个值(平均30秒)的最高平均值。

通过对B1的每一测试执行重复测量ANOVA(rANOVA)来测定得分的同质性和任何处理/顺序相互作用。

对于每种类型的测试，通过对得分变化(与B1相比正确响应的次数的总变化)执行rANOVA来估计评估组的六次重复的表现变化。

考虑到在评估注意力和工作记忆的各种测试(STS、SSS、RVIP)中所获得的所有正确得分，使用综合得分或“Z

通过计算个体的内访和互访变化来评估超声波再现性。通过计算平均值和标准差来描述定量变量。通过进行学生t检验(配对和未配对，取决于条件)评估处理的作用。

使用R(Jupyter.org支持)进行关于认知测试的所有统计检验。使用Prism6软件(格拉夫帕德(GraphPad))进行对FMD数据的测试。在本研究中进行的所有统计检验都是双侧的，置信区间设置为5％。

ITT群体的26名受试者的初始特征呈现于以下表5中：

F：女性；M：男性；BMI：身体质量指数；POP：仅含孕激素的丸剂；SBP：收缩血压；

DBP：舒张血压；HR：心率；V0：入选访视。

在此ITT群体内，4名受试者的FMD分析的值在所有点都不可解释。因此，为了FMD统计从ITT群体去除这4名受试者，因此使具有类似于总ITT群体的特征的受试者数目变为26(表6)。

F：女性；M：男性；BMI：身体质量指数；POP：仅含孕激素的丸剂；SBP：收缩血压；

DPB：舒张血压；HR：心率；V0：入选访视。

随时间推移得分(STS、SSS、RVIP)的演进

通过与B

随时间推移“整体性能”的演进

为了获得对所执行的注意力和工作记忆测试(STS、SSS、RVIP)的正确得分的总体得分，使用Z

个别内访变化：通过取得与相同受试者的访视的第二基础直径相比的第一基础直径来计算。随后对个体值进行平均以获得在1.21±5.2％(52个值)下观察到的个体平均值内访变化。

个体互访变化：与相同受试者的V2的相同测量相比，通过取得V1的第一基础直径来计算。随后对个体值进行平均以获得在0.51±4.14％(26个值)下观察到的平均互访变化。

未观测到FMD峰(在局部缺血后60秒时)上的处理之间存在统计学显著差异(在本发明下为平均5.93％，以及在安慰剂下为平均5.73％，p＝0.45)。后局部缺血扩张的整体量值并非显著不同，这取决于处理(图4)。

在健康学生(年轻成人)中进行的这一研究使得可评估根据本发明的组合物的单次剂量补充物在长期和有认知要求的一组测试期间对维持认知表现的影响。出人意料地，存在于根据本发明的组合物中的多酚的组合和特定量使得可获得对认知的急性作用。

这一研究的结果显示，通过本发明经由“质量上”(更多正确的答案)和“数量上”(更多尝试)的改善，工作记忆测试的结果得到改善。相比之下，随着所述评估组测试的重复，服用安慰剂的相同受试者显现出工作记忆和注意力表现降低。因此，根据本发明的组合物的单次剂量服用使得在长期认知挑战(考试模拟)期间的整体表现得到改善。有趣的是，在B4评估组下对认知功能的影响在服用产品约2小时后达到其最大值。

然而，在这些相同条件下，未观察到内皮功能的伴随显著变化。因此，所述作用与参与执行这些测试任务的大脑结构灌注的改善无关。

因此，这一于单次剂量对认知功能的作用和所述组合物对认知功能的快速作用的研究结果似乎不可预测，并且所属领域的技术人员可预期与安慰剂相比，还将观察到本产品对FMD的作用。

实际上：

-类黄酮的测试剂量(≥174mg)低于最小剂量(520mg可可类黄酮)，对于所述最小剂量在现有技术中已证实其对认知功能的急性作用。

-与安慰剂相比，根据本发明的组合物不会引起对FMD的显著作用；

-对这一产品的先前工作并不支持单次剂量服用后产生显著抗氧化作用的假设；

-此产品的其它潜在作用机制(对神经形成和神经可塑性的作用)涉及长期过程，其在仅数个小时之后不可能产生显著生理作用；

对由蓝莓或葡萄制备的产品进行的数次临床研究未显示出这些产品在单次剂量服用之后对认知功能有任何作用。