包含修饰的MHCII类DRα1结构域的重组多肽及其应用方法

摘要

本发明提供了包含修饰的DRα1结构域的重组多肽。在一些实施方案中，所述多肽包括修饰的DRα1结构域、抗原性肽和任选包括接头序列。本发明还提供了包含所述重组多肽的药物组合物，使用所述重组多肽或药物组合物治疗炎性疾病的方法，以及包含编码所述重组多肽的核酸的表达构建体。

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2019年10月5日提交的美国临时申请号62/741,941的权益，所述专利申请以其全部内容并入本文作参考。

发明领域

本发明揭示涉及重组治疗蛋白，特别是修饰的部分MHC分子，及其在炎性疾病治疗中的应用。

致谢政府支持

本发明是在国立卫生研究院授予的基金号R42AI122574和退伍军人事务部授予的基金号5I01 BX000226-10和1IK6BX004209的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

发明背景

多发性硬化症(MS)是最普遍的中枢神经系统白质和灰质的慢性炎性疾病，在全球范围内影响超过200万人，在美国影响至少40万人(GBD 2015Neurological DisordersCollaborator Group,Lancet Neurol.16:877-897,2017)。MS的炎症过程是由自身免疫驱动的脱髓鞘作用介导的，通常伴随神经退行性损伤。目前尚无法治愈MS。因此，MS患者必须依靠疾病修饰治疗来改善某些疾病征象(Wingerchuk et al.,Mayo Clin.Proc.89:225-240,2014)。有大约15种疾病缓解药物可用于复发缓解型MS(Reich et al.,N.Engl.J.Med.378:169-180,2018)。然而，持续需要改良的MS疗法。

发明概述

本发明揭示了修饰的主要组织相容性(MHC)II类DRα1多肽。这些修饰的DRα1多肽表现出对CD74的改变的亲和性并与巨噬细胞移动抑制因子(MIF)竞争结合CD74的能力，而对分子的结构没有明显影响。

在一些实施方案中，揭示了重组多肽，其包括在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处包含谷氨酰胺残基的MHC II类DRα1结构域(在某些情况下称为L14Q突变，或者在DRα1-MOG-35-55构建体语境中称作L50Q)。谷氨酰胺残基置换在这个位置的天然亮氨酸残基(图1)。在一些实例中，DRα1结构域是人DRα1结构域。在一些实例中，重组DRα1结构域的序列包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。

在其它实施方案中，揭示了重组多肽，其包括在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处包含谷氨酰胺残基的DRα1结构域、抗原性肽和任选包括接头序列。在一个实例中，所述接头序列包括第一甘氨酸-丝氨酸间隔子、凝血酶切割位点和第二甘氨酸-丝氨酸间隔子。抗原性肽可以是髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)多肽，例如人或小鼠MOG-35-55。在一些实施方案中，所述重组多肽的序列包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。

本发明还提供了编码本文揭示的重组多肽的核酸分子。示例的核酸分子包括SEQID NO:4-6。在一些实施方案中，所述核酸包括在表达构建体和/或载体中。本发明还揭示了包括所述表达构建体或载体的细胞或细胞系。

在一些实施方案中，本发明揭示的重组多肽或编码所述重组多肽的核酸例如与药学上可接受的载体一起包括在药物组合物中。在一些实例中，所述组合物包括至少5mg/kg的所述重组多肽。

本发明进一步揭示了治疗炎性病症的方法，包括给患有所述炎性病症的对象施用本发明揭示的重组多肽或药物组合物(如包括SEQ ID NO:1-3任一多肽的组合物)。在一些实例中，所述对象患有多发性硬化症(或其小鼠模型，EAE)。

本发明的前述和其它特征通过以下详细描述及参考附图将可以变得更加明显。

附图简述

图1是氨基酸序列比对，示出在HLAII类α1结构域(SEQ ID NO:7-19)位置18处的残基(Q18，箭头)。这个残基在大多数人类和小鼠II类α1结构域中是保守的，包括来自非抗原呈递DM和DO调节分子的结构域。但是，DRα1在此位置具有亮氨酸(L)。在这个比对中，这个残基显示为位置18；但是在晶体结构中，这个残基位于位置14。

图2A和2B示出DRα1-hMOG-35-55、人MHC II类DR衍生的RTL302(来自DRβ1501的人β1结构域，随后是人DRα1结构域；这个RTL不含抗原性肽和间隔子)、人II类DR衍生的RTL312(人MOG-35-55肽，随后是甘氨酸-丝氨酸间隔子，凝血酶切割位点，甘氨酸-丝氨酸间隔子，来自DRβ1501的DRβ1结构域和DRα1结构域)、人II类衍生的DP2构建体(RTL600；抗原性肽，甘氨酸-丝氨酸间隔子，凝血酶切割位点，甘氨酸-丝氨酸间隔子，DPβ1结构域和DPα1结构域)和DP4构建体(RTL600；抗原性肽，甘氨酸-丝氨酸间隔子，凝血酶切割位点，甘氨酸-丝氨酸间隔子，DP4β1结构域和DPα1结构域)与CD74的结合。此外，测试小鼠MHC II类衍生的RTL551(小鼠MOG-35-55，甘氨酸-丝氨酸间隔子，凝血酶切割位点，甘氨酸-丝氨酸间隔子，IAbβ1结构域和IAbα1结构域)与包被的rhCD74(C27S)的结合。使用等摩尔浓度(250nm)的每种蛋白质配体进行结合实验(图2A)。图2B是示出与野生型形式相比的DRα1突变体的部分氨基酸序列的比对。除了DRα1-hMOG-35-55(具有人MOG-35-55肽的DRα1；SEQ ID NO:20)和DRhQ(具有谷氨酰胺取代的DRα1-hMOG-35-55；SEQ ID NO:21)之外，合成DRα1-mMOG-35-55(具有小鼠MOG-35-55肽的DRα1；SEQ ID NO:22)和DRmQ(具有谷氨酰胺取代的DRα1-mMOG-35-55；SEQID NO:23)。箭头指示诱变的位置。DRα1-hMOG和DRα1-mMOG在位置9也不同(P取代S)。

图3A和3B是显示用Fab G4探查DRα1衍生的构建体DRα1-hMOG-35-55、DRα1-mMOG-35-55和DRhQ以评估DRα1-hMOG-35-55、DRhQ和DRα1-mMOG-35-55之间的免疫学差异的图(图3A)。圆二色性用于评估二级结构内容的差异(图3B)。

图4A-4C示出设计用于定位CD74的DRα1结合位点的策略。图4A是示出用于缩小与CD74结合的区域的重叠肽(全长(SEQ ID NO:24)和SEQ ID NO:25-31分别表示的P1-P7)的示意图。将小鼠CD74(图4B)或小鼠H2M(图4C)用吸附于蛋白A/G珠的特异性单克隆抗体进行免疫沉淀，然后加入重叠的肽的集合(全部)或各个肽。将免疫复合物充分洗涤并用含有1％SDS的电泳样品缓冲液洗脱结合的肽。将洗脱的材料在Tris-Tricine中通过SDS-肽凝胶电泳分析。然后在BioRad Molecular Imager FX中扫描凝胶的荧光团。

图5A-5C是示出P2或P7肽与CD74或Fab G5结合的一系列图。各自测试肽P2和P7结合分别吸附于蛋白A/G珠和蛋白L珠的免疫沉淀的小鼠CD74或FabG4的能力(图5A)。只有P2能结合CD74和Fab G4。P7不能结合任何靶。P2肽在DRα1-hMOG-35-55多肽中的位置在图5B示出。竞争实验表明DRα1-hMOG-35-55以750nM的相对亲和性(K

图6A和6B是示出构建体与rhCD74结合的图。通过在结合期间使用或不使用G4Fab的直接结合测定法，评估构建体DRα1-hMOG-35-55和DRhQ在ELISA板上与rhCD74的直接结合(图6A)。计算的多肽K

图7A和7B是显示构建体在EAE小鼠中的作用的图。如材料和方法章节所述，对8-12周龄的C57BL/6WT雄性小鼠进行免疫。每日皮下注射DRhQ或DRα1-hMOG-35-55蛋白(图7A)或者DRα1-mMOG-35-55或DRmQ(图7B)(100μg于0.1ml中)，注射5天，在EAE评分≥2.0开始，对小鼠的EAE临床体征评分(上图)。从免疫后第8天至第27天每天计算小鼠组的平均EAE得分和SD，并对每只小鼠通过对整个实验的EAE得分曲线进行数值积分求和(CDI，代表总疾病负荷；下图)。

图8是示出ERK1/2磷酸化测定的图。使用运载体、DRhQ或DRα1-hMOG-35-55对来自EAE小鼠的200万个脾细胞处理30分钟，然后在存在蛋白酶和磷酸酶抑制剂的情况下裂解细胞。通过电泳和Western印迹分析上清液以评估P-ERK1/2和总ERK1/2(T-ERK1/2)。DRα1-hMOG(未显示)和DRhQ能在体外下调ERK1/2磷酸化。

图9A是DRhQ的卡通效果绘制的结构模型，示出DRα1-hMOG-35-55构建体中相关氨基酸残基的位置，并且通过对接模型与CD74接触示出。Q残基侧链在位置14突出显示。抗原性MOG肽以浅灰色显示，并示出MOG肽中W3的侧链。图9B示出在图1中描述的分子的几个α1结构域(来自蛋白质数据库)及使用PyMOL(Schrodinger,Portland OR)比对其β1-链-环-β-链区域。位置14以棍棒突出显示。注意，图1的氨基酸残基编号与晶体结构中的编号不同：图1中Q18对应于大多数晶体结构中的氨基酸残基14，位于结构域的β链末端。

序列列表

本文中或所附序列表中列出的任何核酸和氨基酸序列是以如37C.F.R.§1.822所定义的核苷酸碱基和氨基酸的标准单字母缩写示出。在至少一些情况下，仅示出每个核酸序列的一条链，但应理解包括所示链的任何互补链。

SEQ ID NO:1是示例的具有L14Q取代(下划线)的人DRα1多肽的氨基酸序列：

IKEEHVIIQAEFY

SEQ ID NO:2是示例的DRhQ多肽的氨基酸序列。DRhQ包括抗原性肽人MOG-35-55(下划线)、间隔子(粗体)、两个间隔子之间的凝血酶切割位点(大写斜体)和修饰的DRα1结构域(黑色大写字母)。下划线标出了DRα1部分中的L14Q(L50Q)突变：

SEQ ID NO:3是示例的DRmQ多肽的氨基酸序列。DRmQ包括抗原性肽小鼠MOG-35-55(下划线)、间隔子(粗体)、两个间隔子之间的凝血酶切割位点(大写斜体)和修饰的DRα1结构域(黑色大写字母)。下划线标出了DRα1部分中的L14Q(L50Q)突变：

SEQ ID NO:4是示例的编码人L14Q DRα1的核酸。编码突变的密码子以下划线标示：

ATCAAAGAAGAACATGTGATCATCCAGGCCGAGTTCTAT

SEQ ID NO:5是示例的编码DRhQ的核酸。编码DRα1部分中的L14Q(L50Q)突变的密码子以下划线标示：

ATGGAAGTTGGTTGGTACCGTCCGCCGTTCTCCCGTGTTGTTCACCTGTACCGTAACGGTAAAGGAGGTGGAGGCTCACTAGTGCCCCGAGGCTCTGGAGGTGGAGGCATCAAAGAAGAACATGTGATCATCCAGGCCGAGTTCTAT

SEQ ID NO:6是示例的编码DRmQ的核酸。编码DRα1部分中的L14Q(L50Q)突变的密码子以下划线标示：

ATGGAAGTTGGTTGGTACCGTTCCCCGTTCTCCCGTGTTGTTCACCTGTACCGTAACGGTAAAGGAGGTGGAGGCTCACTAGTGCCCCGAGGCTCTGGAGGTGGAGGCATCAAAGAAGAACATGTGATCATCCAGGCCGAGTTCTAT

SEQ ID NO:7-19是人和小鼠II类α1结构域。

SEQ ID NO:20-23是人和小鼠DRα1-MOG-35-55构建体。

SEQ ID NO:24-31是DRα1的全长和P1-P7肽。

SEQ ID NO:32-64是示例的抗原性肽。

发明详述

在MS、实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的动物模型及MS对象中，多条证据支持自身反应性、髓鞘特异性CD4

先前已经开发了一种有效的生物疗法，称为RTL1000和第二代衍生物DRα1-人(h)MOG-35-55，其紧密结合MIF/D-DT受体CD74并竞争性抑制MIF/D-DT结合和通过磷酸化的细胞外信号相关激酶(p)ERK1/2的下游信号传导(Vandenbark et al.,J.Immunol.171:127-133,2003；Benedek et al.,J.Neuroinflammation 12:123,2015)。RTL1000和DRα1-hMOG-3-55可以治疗发生临床症状后的EAE小鼠，抑制T细胞和巨噬细胞活化及迁移至中枢神经系统内以及降低疾病严重程度(Vandenbark et al.,J.Immunol.171:127-133,2003；Benedeket al.,Eur.J.Immunol.43:1309-1321,2013；Meza-Romero et al.,J.Immunol.192:4164-4173,2014)。还发现RTL治疗可增强抗炎巨噬细胞/小胶质细胞数量，促进髓鞘再生及降低急性和慢性EAE的严重程度(Meza-Romero et al.,J.Immunol.192:4164-4173,2014)。

在本公开中，发明人已经鉴别在DRα1-hMOG-35-55构建体(称为DRhQ)的位置50的谷氨酰胺取代亮氨酸的氨基酸取代(L50Q)，其改变了所述构建体对CD74的亲和性，结合能力提高8-10倍。如通过圆二色性和抗体探查所评估的，这种取代不影响分子的结构，增加的结合亲和性转化为DRhQ竞争性抑制MIF与其同源CD74受体结合的相应能力。用DRhQ治疗WTC57BL/6小鼠在体外可将脾细胞中的pERK1/2磷酸化降至背景水平。最后，L50Q取代显著增强所述构建体治疗严重EAE的正在发生的临床症状的能力。

I.术语

除非另有说明，否则技术术语是根据常规用法使用的。常用术语在分子生物学中的定义可见于Benjamin Lewin,Genes V,Oxford University Press出版,1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrew等(编),The Encyclopedia of Molecular Biology,BlackwellScience Ltd.出版,1994(ISBN 0-632-02182-9)；及Robert A.Meyers(编),MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.出版,1995(ISBN 1-56081-569-8)。

除非另有解释，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。除非上下文另外明确指出，否则单数术语“a”、“an”、“the”包括复数对象。类似地，除非上下文另外明确指出，否则单词“或”旨在包括“和”。因此，“包含A或B”是指包括A、或B、或A和B。进一步应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子量值均是近似值，仅供说明。尽管与本文描述的那些类似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但是在下面描述了合适的方法和材料。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均以其全部内容并入本文参考。本文提及的所有GenBank登记号均以在2018年10月5日在GenBank中呈递的全部内容并入本文参考。在发生冲突的情况下，以本说明书、包括术语解释为准。另外，材料、方法和实例仅是举例说明本发明，无限制之意。

为了便于回顾本发明的各个实施方案，下文提供了对特定术语的解释：

抗原：可以刺激动物抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括注射或吸收到动物中的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物包括由异源免疫原诱导的产物发生反应。术语“抗原”包括所有相关的抗原性表位。“表位”或“抗原决定簇”或“抗原性肽”是指抗原上的B和/或T细胞对其应答的位点。在一个实施方案中，当表位与MHC分子结合呈递时，T细胞对表位作出应答。表位可以由连续氨基酸形成，或者通过蛋白质的三级折叠而并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常保留，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丧失。表位在独特的空间构象中通常包括至少3个、更通常至少8个氨基酸(如约8-50或8-23个氨基酸)。确定表位的空间构象的方法包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。

抗原可以是组织特异性抗原或疾病特异性抗原。这些术语不是排他的，因为组织特异性抗原也可以是疾病特异性抗原。组织特异性抗原在有限数目的组织例如单个组织中表达。组织特异性抗原可以由一个以上的组织表达，例如但不限于在中枢或周围神经系统中表达的抗原。

CD74：也称为CD74分子、主要组织相容性复合物、II类恒定链或Ii。CD74是一种伴侣蛋白，调节抗原呈递。其也是巨噬细胞移动抑制因子(MIF)的细胞表面受体。CD74的核酸和蛋白质序列可公开获得。例如GenBank登记号NM_001025158、NM_004355和NM_001025159公开了人CD74核酸序列，GenBank登记号NP_001020329、NP_004346和NP_001020330公开了示例的人CD74氨基酸序列。相似地，GenBank登记号NM_001042605和NM_010545公开了示例的小鼠CD74核酸序列，GenBank登记号NP_001036070和NP_034675公开了示例的小鼠CD74氨基酸序列。这些序列均以在2018年10月5日呈递GenBank的序列并入本文作参考。

对照：“对照”是指用于与实验样品进行比较的样品或标准。在一些实施方案中，对照是获自健康对象或健康对象群体的样品。在其它实施方案中，对照是历史对照或标准参考值或值范围(如先前测试的对照样品，如代表基线或正常值的一组样品，如健康对象中CD74表达或活性水平)。在另外的实例中，对照来自治疗之前的对象(如用MHC II类β1α1多肽或MHC II类α1结构域多肽治疗之前的CD74表达或活性水平)。

结构域：可以等同于特定功能的多肽或蛋白质氨基酸序列的分立部分。例如，构成MHC II类分子的α和β多肽分别被认为具有两个结构域α1、α2和β1、β2。各个结构域通常通过连接氨基酸序列连接。在一个实施方案中，通过扩展序列以包括全部或部分接头或相邻结构域，将整个结构域序列包括在重组分子中。例如，当选择MHC II类分子的α1结构域时，所选择的序列可从α链的氨基酸残基位置1经过整个α1结构域延伸至α1结构域羧基末端的氨基酸84。在各种MHC分子结构域中氨基酸的精确数目根据哺乳动物的物种以及在物种内不同基因类别之间有差异。用于重组分子的序列的选择需要维持结构域功能，而不是基于氨基酸数目的精确结构定义。本领域技术人员将理解，即使利用了少于选择的结构域的整个氨基酸序列，也可以保持结构域功能。例如，在不影响结构域功能的情况下，可以省略α1结构域的氨基或羧基末端的一些氨基酸。在本发明提供的MHC II类多肽(例如α1多肽)的背景下，可以评估特定选择的结构域的功能活性，例如T细胞增殖和/或CD74结合测定。

有效量：足以抑制疾病或病症进展或者使疾病或病症消退、或能缓解疾病或病症引起的症状的特定化合物的剂量或数量。例如，这可以是所述MHC分子治疗或抑制病症例如炎性和/或自身免疫疾病所需要的量或剂量。在一个实施方案中，有效量是单独或与一或多种其它治疗剂一起在对象中诱导希望的应答如治疗或抑制炎性或自身免疫性病症或其它疾病或病症的量。

炎症：由于损伤组织而引起的局部保护性反应，可以隔离致炎因子。炎症是由于血管组织对有害刺激如病原体、受损的细胞或刺激物的复杂生物反应而引起的。这是生物体的保护性反应以去除有害刺激并启动组织的愈合过程。炎症反应的特征在于全身或在炎症部位局部的白细胞积聚。可以通过许多方法测量炎症反应，如白细胞的数量、多形核中性粒细胞(PMN)的数量、PMN激活程度测量如Luminal增强化学发光或细胞因子存在量的测量。

原发性炎性病症是由炎症本身引起的病症。继发性炎症病症是另一病症引起的炎症。炎症可导致多种炎性疾病，包括但不限于风湿性关节炎、骨关节炎、炎症性肺病(包括慢性阻塞性肺病)、炎症性肠病(包括溃疡性结肠炎和克罗恩病)、牙周病、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、干燥综合征、哮喘、过敏性鼻炎和皮肤病症(包括皮肌炎和银屑病)等。包括炎性成分的自身免疫病症(包括但不限于多发性硬化症)也被认为是炎性病症。

抑制或治疗疾病：“抑制”疾病是指例如在已知具有某种疾病例如炎性病症或自身免疫性病症倾向的人中抑制疾病的全面进展。疾病的抑制可以涵盖例如在患有疾病或病症或处于患疾病或病症的风险的对象中从部分抑制到基本上完全抑制疾病的范围。在一些实例中，术语“抑制”是指降低或延缓疾病的发作或进展。“治疗”疾病是指改善疾病或病理状况的征兆或症状例如炎性或自身免疫性病症的征兆或症状的治疗干预。要施用有效量的所述药物化合物以抑制或治疗疾病或病症的对象可以通过这种病症的标准诊断技术鉴别，例如通过症状、家族病史基础或发生所述疾病或病症的风险因素等。

接头：共价连接两个分子(如两个多肽)的分子。接头(如肽接头或化学接头)可以包含在本发明的重组MHC多肽中，例如在α1结构域与抗原性肽之间。长度通常在2-25个氨基酸之间(如5-10、10-15、15-20或20-25个氨基酸)的肽接头序列包括但不限于由Chaudharyet al.(Nature 339:394-397,1989)描述的甘氨酸(4)-丝氨酸间隔子。类似地，也可以使用化学接头(例如硫醇键或交联剂)。

MHC II类：MHC II类分子由两个非共价结合的蛋白质形成，即α链和β链。α链包含α1和α2结构域，β链包含β1和β2结构域。适合抗原的裂口由α1和β1结构域的相互作用形成。α2和β2结构域是跨膜Ig折叠样结构域，可将α和β链锚定在APC的细胞膜中。MHC II类复合物当与抗原结合时(及存在适当的共刺激信号)刺激CD4 T细胞。CD4 T细胞的主要功能是引发炎症反应，调节免疫系统中的其它细胞，以及为B细胞的抗体合成提供帮助。

药学上可接受的载体：Remington:The Science and Practice of Pharmacy,TheUniversity of the Sciences in Philadelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21st 30Edition(2005)描述了适用于本文公开的蛋白质的药物输送的组合物和制剂。

重组：重组核酸或多肽是具有非天然存在的序列或具有通过人工组合两或更多个另外分离的序列节段制成的序列的核酸或多肽。通常通过化学合成或通过人工操作分离的核酸节段例如通过遗传工程技术实现这种人工组合。

序列相同性：两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相似性以序列之间的相似性表示，另外称为序列相同性。序列相同性通常用相同性(或相似性或同源性)百分比测量；所述百分比越高，则两个序列越相似。具有明显序列相同性及彼此具有相同或相似功能的多肽或其结构域-例如不同物种中的相同蛋白质-可以称为“同源物”。

本领域已知用于比较的序列比对方法。各种程序和比对算法描述在：Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482,1981；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444,1988；Higgins&Sharp,Gene,73:237-244,1988；Higgins&Sharp,Comput.Appl.Biosci.5:151-153,1989；Corpet et al.,Nucl.Acids Res.16,10881-90,1988；Huang et al.,Comput.Appl.Biosci.8,155-65,1992；及Pearson,Methods Mol.Biol.24:307-331,1994。Altschul et al.(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)提出了序列比对方法和同源性计算的详细描述。NCBIBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)可得自一些来源，包括National Centerfor Biotechnology Information(NCBI,Bethesda,MD)及因特网，用于与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx联合使用。

由于遗传密码的简并性，未显示高度序列相同性的核酸序列仍可编码相似的氨基酸序列。应当理解，可以使用这种简并产生核酸序列中的改变，以产生全部编码基本上相同的蛋白质的多个核酸分子。

对象：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的类别。

II.DRα结构域

本发明揭示了分离的重组多肽，其包括MHC II类DRα1结构域或其片段且不包括MHC II类α2、β1或β2结构域，以及在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸14的氨基酸位置包括谷氨酰胺(Q)取代亮氨酸(L)。哺乳动物MHC II类DRα链蛋白质的氨基酸序列以及编码这些蛋白质的核酸为本领域熟知，且可得自包括GenBank的许多来源。示例的序列在并入本文作参考的Das et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3543-3547,1983)(人HLADRα)中提供。示例的人DRα多肽是GenBank登记号NP_061984(2018年10月5日呈递GenBank，并入本文作参考)。其它MHC II类DRα多肽可以由本领域技术人员从公开数据库如IMGT/HLA数据库(可在万维网ebi.ac.uk/imgt/hla/获得)中鉴别。

在特定的实施方案中，MHC II类α1结构域是人HLA-DRA多肽。α1结构域在哺乳动物MHC II类α链蛋白质中明确定义。在一些实例中，MHC II类α链包括参与运输多肽的前导序列，其被蛋白酶解去除以产生成熟α多肽。

α1结构域可包括成熟α链的大约氨基酸残基1-90，但是本领域技术人员将认识到这个结构域的C末端截止不必须是精确定义的，例如可以在成熟α链的氨基酸残基70-100之间的任何点发生。在一些实例中，α1结构域包括成熟MHC II类DRα结构域的氨基酸残基1-70、1-71、1-72、1-73、1-74、1-75、1-76、1-77、1-78、1-79、1-80、1-81、1-82、1-83、1-84、1-85、1-86、1-87、1-88、1-89、1-90、1-91、1-92、1-93、1-94、1-95、1-96、1-97、1-98、1-99或1-100。在其它实例中，α1结构域包括全长DRα1多肽的大约残基20-120(如大约残基20-110、24-110、24-109、25-100、25-109、26-110、26-109、30-120、32-120、32-115、26-90、26-85、26-84，或者其它重叠区域)。在一些实例中，DRα1结构域不包括N末端甲硫氨酸；然而，N-末端甲硫氨酸可以是存在的，例如由于在细菌、酵母或哺乳动物系统中表达。

在其它实例中，DRα1结构域可包括在5'-和/或3'-末端缺失或添加一些氨基酸，如添加或缺失约1-25个氨基酸，如在5'-或3'-末端添加或缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸，或其组合(如在一端缺失而在另一端添加)。α1结构域的组成根据哺乳动物物种和所讨论的特定α链也可以在这些参数之外变化。本领域技术人员将理解，氨基酸序列的精确数值参数不如维持结构域功能(例如CD74结合或下调)重要。

在一些实施方案中，揭示了包括DRα1结构域的重组多肽，所述结构域在对应于SEQID NO:1的氨基酸位置14的位置处包括谷氨酰胺残基。所述重组多肽不包括MHC II类α2、β1或β2结构域。在一些实例中，所述重组DRα1多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成或由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。在另外的实施方案中，所述重组多肽具有与SEQ ID NO:1或其片段具有至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。例如，所述DRα1多肽可以是SEQ ID NO:1的同源物或直系同源物，其具有与SEQ ID NO:1或其片段具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的氨基酸序列。示例的序列可以使用在万维网上容易获得的计算机程序以及本文列出的氨基酸序列获得。在一些实例中，所述同源物保留SEQ ID NO:1多肽的功能，如改变的二级结构、结合CD74和/或在小鼠中抑制EAE。

在其它实施方案中，揭示了包括DRα1结构域或其片段和抗原性肽的重组多肽，所述结构域在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处包含谷氨酰胺残基。所述重组多肽不包括MHC II类α2、β1或β2结构域。在一些实例中，所述重组多肽还包括接头(例如在DRα1多肽与抗原性肽之间的接头)。所述接头可以是肽接头或化学接头(如化学交联剂)。

在一些实施方案中，抗原性肽是人或小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)35-55。因此，在一些实施方案中，所述重组多肽包括SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列、基本上由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成、或由SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的氨基酸序列组成。在另外的实施方案中，所述重组多肽具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3或其片段具有至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。例如，所述多肽的DRα1部分可以是SEQ ID NO:1的同源物或直系同源物，其氨基酸序列与SEQ IDNO:1或其片段具有至少85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性。示例的序列可以是使用在万维网上容易获得的计算机程序和本文列出的氨基酸序列获得。在一些实例中，所述多肽保留SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的多肽的功能，如改变的二级结构、结合CD74和/或在小鼠中抑制EAE。下文讨论了可以包含在所述多肽中的其它抗原性肽。

所述重组多肽(例如SEQ ID NO:1-3)的微小修饰可以产生具有基本上等价活性的多肽(例如与SEQ ID NO:1-3相比)。这样的修饰可以是有意的，例如通过定点诱变，或者可以是自发的。通过这些修饰产生的所有多肽均包括在本文中。因此，MHC II类DRα1多肽的特定的非限制性实例是SEQ ID NO:1-3任一序列的保守变体(如保守氨基酸取代，例如一或多个保守氨基酸取代，例如1-10个保守取代，2-5个保守取代，4-9个保守取代，如1、2、5或10个保守取代)。

编码本发明揭示的重组DRα1多肽(例如编码SEQ ID NO:1-3任一序列)和/或其任何同源物或变体的核酸分子可以通过标准方法产生，如通过聚合酶链反应(PCR)扩增。在一些实例中，所述重组多肽由包括SEQ ID NO:4-6任一的核酸序列或由SEQ ID NO:4-6任一的核酸序列组成的核酸编码。在另外的实施方案中，所述核酸具有与SEQ ID NO:4-6任一序列或其片段具有至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同性的序列。

在一些实施方案中，所述重组多肽(例如SEQ ID NO:1-3)可以在原核细胞或真核细胞中从编码所述重组多肽的核酸构建体(如包括SEQ ID NO:4-6任一序列的核酸构建体)表达。编码所述重组多肽的核酸构建体(如表达构建体)也可以包括调节元件，如启动子、增强子和/或3'调节区，根据其中要表达蛋白质的细胞类型确定。将构建体导入适合在选择的细胞类型中表达所述重组多肽的载体中。

已知许多用于表达和纯化多肽的原核和真核系统。例如，可通过将强力的调节的启动子和有效的核糖体结合位点置于编码多肽的构建体的上游以在原核细胞中产生异源多肽。合适的启动子序列包括β-内酰胺酶、色氨酸(trp)、噬菌体T7和λP

用于表达大量蛋白质的合适的原核细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。通常，在不溶性包涵体中发现高水平表达的蛋白质，从这些聚集物中提取蛋白质的方法例如由Sambrook et al.(2001，见第15章)描述。重组多肽在原核细胞中的重组表达另外可以使用设计用于最佳表达和纯化融合蛋白的商业系统方便地获得。这种融合蛋白通常包括便于纯化的标签。这种系统的实例包括：pMAL蛋白质融合和纯化系统(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)；GST基因融合系统(AmershamPharmacia Biotech,Inc.,Piscataway,NJ)；和pTrcHis表达载体系统(Invitrogen,Carlsbad,CA)。其它系统包括His6-tag(例如Roche Applied Science,Mannheim,Germany)或链霉亲和素结合肽(例如Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。例如，pMAL表达系统利用将麦芽糖结合蛋白加入表达的蛋白质的载体。融合蛋白在大肠杆菌中表达，使用直链淀粉柱从粗制细胞提取物中纯化融合蛋白。如果需要，可以通过用合适的蛋白酶例如因子Xa处理，从融合蛋白上切下麦芽糖结合蛋白结构域。然后可以经由第二个直链淀粉柱而将麦芽糖结合片段从制备物中除去。

重组多肽还可以在真核表达系统中表达，包括Invitrogen(Carlsbad，CA)生产的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、果蝇、杆状病毒和/或Sindbis表达系统。如中国仓鼠卵巢(CHO)、猴肾(COS)、HeLa、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等真核细胞也可以用于表达重组多肽。适用于这些细胞中的调节区，对于哺乳动物细胞而言包括病毒启动子如来自CMV、腺病毒或SV40的启动子，对于酵母细胞而言包括3-磷酸甘油酸激酶或醇脱氢酶的启动子。

可以通过例如用磷酸钙或磷酸锶沉淀、电穿孔、脂染、DEAE葡聚糖、显微注射、原生质体融合或微粒枪将载体作为纯DNA(转染)导入受体细胞(例如真核细胞)中。或者，核酸分子可以通过用病毒载体感染而导入。开发了使用例如逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒的系统。

在哺乳动物细胞中产生的DRα1多肽(如本文所述的那些)可以在蛋白质释放入上清液中之后被提取，及可以使用抗MHC或其它抗体制备的免疫亲和柱纯化。或者，所述多肽可以与例如β-珠蛋白一起表达为嵌合蛋白。此后，针对β-珠蛋白的抗体用于纯化嵌合蛋白。然后将在β-珠蛋白基因与编码重组多肽的核酸序列之间工程化的相应蛋白酶切割位点用于在翻译后将两个多肽片段彼此分离。可用于产生β-珠蛋白嵌合蛋白的表达载体是pSG5(Stratagene,La Jolla,CA)。

重组多肽在原核细胞中的表达产生未糖基化的多肽。多肽在天然存在的糖基化靶位点的糖基化可以通过在合适的真核表达系统如哺乳动物细胞中表达多肽而实现。在其它实例中，重组多肽可以被修饰(例如通过定点诱变)以包括希望的翻译后修饰位点，如用于N-连接的糖基化、磷酸化或其它修饰的一或多个位点。

表达的蛋白质通常在含有6M尿素的碱性溶液(通常约为pH10)中纯化。然后，通过对中性pH的缓冲溶液(通常是大约pH7.4的磷酸盐缓冲盐水)进行透析实现纯化的蛋白质的折叠。也已知其它蛋白质纯化方法，可以与本文揭示的重组多肽一起使用。

III.抗原性肽

在一些实施方案中，本文揭示的重组多肽包含直接或经由肽或化学接头与DRα1结构域共价连接的抗原性肽。MHC复合物在APC表面上的抗原呈递通常不涉及完整抗原性肽(参见例如美国专利号5,468,481)。而是，在MHC II的情况下位于β1和α1结构域之间的沟中及在MHC I的情况下位于α1和α2结构域之间的沟中的肽通常是完整多肽抗原的小线性片段。如Janeway&Travers(Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,1997)所述，位于MHC I类分子的肽沟中的肽受结合袋大小的限制，通常为8-15个氨基酸长(如8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)，更通常长度是8-10个氨基酸(但参见Collins etal.,Nature 371:626-629,1994关于可能的例外)。相反，位于MHC II类分子的肽沟中的肽并不受此限制，通常更大，通常长度为至少3-50个氨基酸(如长度为8-30、10-25或15-23个氨基酸)。在一些实例中，位于MHC II类分子的肽沟中的肽的长度为约15-23个氨基酸。肽片段可以通过标准方法制备如使用合成肽合成仪或者其可以表达为重组多肽的部分。

在一些实例中，抗原性肽包括来自神经元或中枢神经系统蛋白质的肽，如髓鞘蛋白(例如髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)，髓鞘碱性蛋白(MBP)或蛋白脂蛋白(PLP))。在特定的实例中，抗原性肽包括人或小鼠MOG-35-55肽，分别由SEQ ID NO:2的氨基酸1-21或SEQID NO:3的氨基酸1-21示例。在其它实例中，抗原性肽是来自视黄醛蛋白的肽，如感光细胞间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoid binding protein，IRBP)，抑制蛋白，磷转导素或恢复蛋白。另外的抗原性肽包括来自II型胶原蛋白(胶原蛋白II)、纤维蛋白原-α、波形蛋白、α-烯醇酶、人软骨糖蛋白-39、α2麦醇溶蛋白或胰岛素的肽。在一些实例中，抗原性肽包括翻译后修饰，如磷酸化、糖基化或瓜氨酸化。示例的抗原性肽的序列在表1和国际专利公开号WO 2012/103365和美国专利公开号2012/0276127中提供，其全部内容并入本文作参考。本领域技术人员可以鉴别与特定疾病或病症有关的其它抗原性肽。

表1：示例的抗原性肽

在一些实例中，通过将编码选择的抗原性肽的核酸序列可操纵地连接于编码DRα1多肽的构建体的5'末端，使抗原性肽共价连接于MHC II类DRα1多肽，由此在表达的肽中，所述抗原性肽与DRα1结构域的氨基末端连接。在其它实例中，通过将编码选择的抗原的核酸序列可操纵地连接于编码DRα1多肽的构建体的3'末端，使抗原性肽与DRα1多肽共价连接，由此在表达的肽中，所述抗原性肽与DRα1结构域的羧基末端连接。获得这个结果的一种便利方式是将编码抗原性肽的序列掺入用于扩增DRα1结构域编码区的PCR引物中。在一些实例中，在抗原性肽和DRα1多肽之间包括编码接头肽序列的序列。但是，不必将抗原性肽精确地连接在MHC II类α1结构域编码区的5'末端(或3'末端)。例如，可以将抗原性肽编码区插入在DRα1结构域编码序列的5'或3'末端的前几个(通常在前10个)密码子内的α1结构域中。

在一些实施方案中，在要产生许多具有不同抗原性肽的DRα1结构域的情况下，特别有用的是连接抗原性肽与DRα1结构域的遗传系统。所述系统允许构建表达载体，其中在DRα1结构域中(例如在α1结构域的5'或3'末端)包括独特的限制位点。连同这种构建体一起制备了抗原性肽编码序列的文库，每个抗原编码区的侧翼是选择的限制性酶的位点。然后，简单地通过(a)用选择的限制酶释放抗原编码区，(b)用相同的限制酶切割DRα1结构域构建体及(c)将抗原编码区连接进DRα1结构域构建体中将特定抗原包括在DRα1结构域中。以这种方式，可以在短时间内制备和表达大量DRα1结构域-肽抗原构建体。

在一些实例中，将抗原通过肽接头与DRα1结构域多肽共价连接。在一些实例中，所述接头包括一或多个(例如1、2、3、4或更多个)甘氨酸-丝氨酸间隔子，例如GGGGS(SEQ IDNO:52)。在一些实例中，所述接头包括两个甘氨酸-丝氨酸间隔子。在非限制性实例中，所述重组多肽在抗原性肽与DRα1多肽之间可包括第一甘氨酸-丝氨酸间隔子、凝血酶切割位点和第二甘氨酸-丝氨酸间隔子。

在一些实例中，将抗原通过二硫键与DRα1结构域多肽共价连接。在一些实例中，二硫键是利用DRα1结构域多肽中的天然存在的半胱氨酸残基(如DRα1结构域中的半胱氨酸残基)。本领域技术人员可以鉴别DRα1结构域多肽中合适的半胱氨酸残基。在其它实例中，利用DRα1结构域多肽中的非天然存在的半胱氨酸残基形成二硫键，如通过诱变引入DRα1结构域多肽中的半胱氨酸残基。在进一步的实例中，利用肽抗原中的天然存在的半胱氨酸残基形成二硫键。在进一步的实例中，利用肽抗原中的非天然存在的半胱氨酸残基形成二硫键，如通过诱变引入肽抗原中的半胱氨酸残基。

IV.治疗或抑制病症的方法

本发明揭示了治疗或抑制对象病症的方法，所述病症包括但不限于炎性和/或自身免疫性病症。所揭示的方法包括给对象施用重组多肽，所述重组多肽包含在对应于SEQID NO:1的氨基酸位置14的位置处具有谷氨酰胺残基的MHC II类DRα1结构域多肽(以SEQID NO:1示例)，或者所述重组多肽包含与抗原性肽共价连接的在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处具有谷氨酰胺残基的MHC II类DRα1结构域多肽(以SEQ ID NO:2和3示例)，或者给对象施用编码所述重组多肽的核酸。在一个非限制性实例中，所述对象患有多发性硬化症，给对象施用与MOG-35-55肽连接的在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处具有谷氨酰胺残基的MHC II类DRα1结构域多肽(如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)。

在一些实施方案中，所述方法包括选择患有待治疗病症的对象，并且给对象施用有效量的本发明所述重组多肽、编码本发明所述重组多肽的核酸或者包含本发明揭示的重组多肽或核酸的药物组合物。

在一些实施方案中，所述对象患有炎性和/或自身免疫性疾病或病症，包括但不限于系统性红斑狼疮，干燥综合征，风湿性关节炎，I型糖尿病，Wegener’s肉芽肿病，炎性肠病，多肌炎，皮肌炎，多发性内分泌衰竭，Schmidt’s综合征，自身免疫性葡萄膜炎，乳糜泻，Addison’s病，肾上腺炎，Graves’病，甲状腺炎，桥本氏甲状腺炎，自身免疫性甲状腺疾病，恶性贫血，胃萎缩，慢性肝炎，类狼疮状肝炎，动脉粥样硬化，早老性痴呆，脱髓鞘病，多发性硬化症，亚急性皮肤红斑狼疮，甲状旁腺功能低下，Dressler’s综合征，重症肌无力，自身免疫性血小板减少症，特发性血小板减少性紫癜，溶血性贫血，寻常型天疱疮，天疱疮，疱疹样皮炎，斑秃，类天疱疮，硬皮病，进行性系统性硬化症，CREST综合征(钙质沉着，雷诺现象，食管运动不良，指端硬化和毛细管扩张)，成年型糖尿病(II型糖尿病)，男性和女性自身免疫性不孕不育，强直性脊柱炎，溃疡性结肠炎，克罗恩病，混合性结缔组织病，结节性多动脉炎，系统性坏死性血管炎，青少年型风湿性关节炎，肾小球肾炎，特应性皮炎，特应性鼻炎，Goodpasture’s综合征，Chagas’病，结节病，风湿热，哮喘，反复流产，抗磷脂综合征，农民肺，多形性红斑，心切开术后综合征，Cushing’s综合征，自身免疫性慢性活动性肝炎，饲鸟者肺，过敏性疾病，过敏性脑脊髓炎，中毒性表皮坏死，脱发，Alport’s综合征，肺泡炎，过敏性肺泡炎，纤维化肺泡炎，间质性肺病，结节性红斑，坏疽性脓皮病，输血反应，麻风病，疟疾，利什曼病，锥虫病，Takayasu动脉炎，风湿性多肌痛，颞动脉炎，血吸虫病，巨细胞动脉炎，蛔虫病，曲霉菌病，Sampter综合征，湿疹，淋巴瘤样肉芽肿，Behcet病，Caplan综合征，川崎病，登革热，脑脊髓炎，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑，银屑病，胎儿成红细胞增多症，嗜酸性筋膜炎，Shulman’s综合征，Felty’s综合征，丝虫病，睫状体炎，慢性睫状体炎，异时性睫状体炎，Fuch’s睫状体炎，IgA肾病，Henoch-Schonlein紫癜，肾小球肾炎，移植物抗宿主病，移植排斥，人免疫缺陷病毒感染，埃可病毒感染，心肌病，阿尔茨海默氏病，细小病毒感染，风疹病毒感染，疫苗接种后综合征，先天性风疹感染，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，肾细胞癌，多发性骨髓瘤，Eaton-Lambert综合征，复发性多软骨炎，恶性黑色素瘤，冷球蛋白血症，Waldenstrom巨球蛋白血症，EB病毒感染，腮腺炎病毒，及Evan’s综合征。

其它炎性疾病包括骨关节炎、炎症性肺病(包括慢性阻塞性肺病)、牙周疾病、风湿性多肌痛、动脉粥样硬化、系统性硬化症、变应性鼻炎和皮肤病症(包括皮肌炎和银屑病)等。

在其它实施方案中，所述对象患有视网膜病症，例如视网膜变性，如色素性视网膜炎、视锥视杆营养不良、Leber先天性黑朦、或黄斑病(例如年龄相关性黄斑变性、Stargardt样黄斑变性、卵黄状黄斑营养不良(Best病)、Malattia Leventinese(Doyne’s蜂窝状视网膜营养不良)、糖尿病黄斑病变、隐匿性黄斑营养不良和玻璃纸性黄斑病变。在其它实例中，视网膜病症包括视网膜病，例如自身免疫性视网膜病、糖尿病性视网膜病或血管性视网膜病。在另外的实施例中，视网膜病症包括视网膜脱离或青光眼。视网膜病症可以是进行性的(例如视网膜变性或青光眼)或急性的(例如视网膜脱离)。在另外的实例中，所述对象是患有葡萄膜炎或视神经炎的对象。在其它实施方案中，所述对象患有卒中(例如缺血性卒中或出血性卒中)。在另外的实例中，所述对象是药物成瘾的对象，例如由包括甲基苯丙胺和酒精滥用的药物成瘾引起的认知或神经精神损害的对象。

在一些实施方案中，给对象施用有效量的包括DRα1结构域或其部分(例如能够结合CD74或降低CD74的表达和/或活性的α1结构域的部分)的组合物，所述结构域在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸位置14的位置处包括谷氨酰胺取代亮氨酸。在一个实例中，所述组合物包括修饰的DRα1-MOG-35-55(例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3)。

取决于所选择的特定施用方式，可以用合适的固体或液体载体配制药物组合物，所述药物组合物包括本文揭示的重组多肽或核酸(例如有效量的所述重组多肽或核酸)。可用于本发明的药学上可接受的载体和赋形剂包括本领域技术人员已知的那些。见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,The University of the Sciencesin Philadelphia,Editor,Lippincott,Williams,&Wilkins,Philadelphia,PA,21stEdition(2005)。例如，肠胃外制剂通常包括作为药学和生理学可接受的液体运载体的注射液体，如水、生理盐水、其它平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规无毒固体载体可包括例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。

除生物学中性载体外，待施用的药物组合物可包含少量无毒辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂、pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。可以包括的赋形剂是例如其它蛋白质，如人血清白蛋白或血浆制品。所述药物组合物的剂型根据选择的施用方式确定。例如，除了注射液体外，还可以使用表面、吸入、口服和栓剂制剂。表面制剂可包括滴眼剂、软膏剂、喷雾剂、贴剂等。吸入制剂可以是液体(例如溶液或悬浮液)及包括薄雾、喷雾等。口服制剂可以是液体(例如糖浆、溶液或悬浮液)或固体(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊)。栓剂制剂也可以是固体、凝胶或悬浮液形式。对于固体组合物，常规无毒固体载体可以包括药用级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。制备这种剂型的实际方法为本领域技术人员已知或显而易见。

在一些实例中，药物组合物可以通过实现其预期目的的任何方式施用。施用所述重组多肽或其部分(或编码这种多肽的核酸)的量和方案可以由主治医生确定。用于治疗应用的有效剂量根据要治疗的病症的性质和严重程度、特定DRα1结构域或其部分和/或选择的抗原性肽、患者的年龄和状况以及其它临床因素而变化。通常，剂量范围为约0.1μg/kg体重-100mg/kg体重。其它合适的范围包括约100μg/kg-50mg/kg体重，约500μg/kg-10mg/kg体重或约1mg/kg-5mg/kg体重的剂量，例如约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg或约5mg/kg。给药时间表可能从每月一次至每天一次，具体取决于多种临床因素，如对象对蛋白质的敏感性。给药时间表的实例是施用大约1mg/kg每月一次、每两周一次、每周一次、每周两次、每周三次或每天一次；施用剂量大约2.5mg/kg每周一次、每周两次、每周三次或每天一次；施用剂量大约5mg/kg每周一次、每周两次、每周三次或每天一次；施用剂量大约10mg/kg每周一次、每周两次、每周三次或每天一次；或施用剂量大约30mg/kg每周一次、每周两次、每周三次或每天一次。

可以将包括一或多种所述重组多肽的药物组合物配制成单位剂型，适于精确剂量的个体施用。在一个具体的非限制性实例中，单位剂量可含有约1ng-约5g的所述重组多肽(如约10μg-1g，约100mg-500mg或约10mg-100mg)。施用的活性化合物的量将取决于所治疗的对象、患病的严重程度以及施用方式。在这些范围内，待施用的制剂含有一定量的活性成分，其量在所治疗的对象中有效地实现期望的效果。

重组多肽可以以各种方式例如表面、口服、静脉内、肌内、腹膜内、鼻内、皮内、鞘内、皮下、眼内、通过吸入或通过栓剂等方式施用给人或其它动物的其有效作用的组织。在一个实例中，经皮下将所述化合物施用给对象。在另一个实例中，经静脉内将所述化合物施用给对象。

在一些实施方案中，所述重组多肽可以被包含在惰性基质中以表面或局部应用。在一些实例中，可以将所述制剂注射进眼睛，例如玻璃体内注射。作为惰性基质的一个实例，可以从二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)例如卵磷脂酰胆碱(PC)制备脂质体。脂质体，包括阳离子和阴离子脂质体，可以使用本领域技术人员已知的标准方法制备。包含一或多种重组多肽的脂质体可以滴剂或水基乳膏的形式表面施用，或者可以眼内注射。在表面应用的制剂中，脂质体胶囊由于磨损和眼表面的泪液而降解，所述重组多肽随时间缓慢释放。在眼内注射的制剂中，脂质体胶囊由于细胞消化而降解。这两种制剂均提供了缓释药物递送系统的优点，使得对象可以随时间暴露于基本上恒定浓度的所述重组多肽。在一个实例中，所述DRα1多肽可溶于有机溶剂如DMSO或醇中，及含有聚酐、聚(乙醇)酸、聚(乳)酸或聚己酸内酯聚合物。所述重组多肽可包含在递送系统中，该系统可根据植入体的大小、形状和配方以及移植方法的类型植入眼睛的不同部位。合适的部位包括但不限于前房、前段、后房、后段、玻璃体腔、脉络膜周隙、结膜下、巩膜外、角膜内、角膜上和巩膜。

在一些实例中，公开的重组多肽的有效量(例如治疗有效量)可以是治疗或抑制对象的病症(例如炎性和/或自身免疫性病症)所需的重组多肽的量。在其它实例中，公开的重组多肽的治疗有效量可以是治疗或抑制视网膜病症、卒中、脑外伤或与药物成瘾相关病症(例如由药物成瘾所致认知或神经精神损害)所需的重组多肽的量。

本发明还包括一或多种公开的重组多肽与一或多种其它可用于治疗病症的药剂的组合。在一些实例中，所述重组多肽可以与有效剂量的一或多种用于炎性或自身免疫性病症的治疗一起施用，所述治疗包括但不限于非甾体抗炎药、皮质类固醇、甲氨蝶呤、抗TNF化合物、霉酚酸酯、氨基水杨酸盐、抗生素、干扰素、醋酸格拉替雷、抗体治疗(例如利妥昔单抗或米拉妥珠单抗(milatuzumab))或免疫抑制剂或免疫调节剂化合物。在另一个实例中，所述重组多肽可以与有效剂量的一或多种视网膜病症治疗组合施用，包括但不限于基因治疗、维生素或矿物质补充剂(例如维生素A、C和/或E，或锌和/或铜)、抗血管生成治疗(如兰尼单抗(ranibizumab)或贝伐单抗)、光凝术、光动力疗法、叶黄素或玉米黄质、皮质类固醇或免疫抑制剂。本领域技术人员可以选择针对特定疾病的合适联合疗法。术语“组合施用”或“共施用”是指同时和相继施用所述活性药剂。

实施例

提供以下实施例以举例说明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为限定本公开为所述特定特征或实施方案。

实施例1

材料和方法

Fab、抗体及其它试剂。G4是与源自人IgG文库的DRα1结构域反应的人Fab，由Technion Israel的Yoram Reiter博士惠赠。抗人MOG抗体购自Santa CruzBiotechnology。CHAPS、T20和牛血清白蛋白购自Sigma-Aldrich。抗CD74抗体购自EverestBiotech。UltraPure

DRα1构建体克隆、表达和纯化。已经报道了DRα1构建体的纯化(Vandenbark etal.,J.Immunol.171:127-133,2003)。简而言之，将含编码人MOG-35-55肽、柔性接头和来自氨基酸残基15-97的MHC II类DRα1结构域的序列的合成的DNA片段以及在DRα1结构域中包含突变L50Q突变的相似的合成的DNA片段克隆进高水平表达载体pET21d(+)(Novagen)中。将这些克隆转化进大肠杆菌BL21菌株(DE3)(New England Biolabs)，在含有50μg/ml抗生素羧苄青霉素的LB琼脂平板上铺板，并在37℃温育过夜。第二天，从每个克隆中选择三个单独的菌落，在补充有抗生素的LB肉汤中生长，以测试IPTG诱导的感兴趣蛋白的产生。确认后，制备100ml过夜培养物并用于在4X 1L烧瓶中接种补充抗生素的LB。在对数生长点加入IPTG至终浓度2mM诱导靶蛋白合成。将培养物在37℃再温育4小时，通过离心收获，并将细菌糊状物在-80℃冷冻至使用。

将沉淀重悬于超声缓冲液(50mM Tris，300mM NaCl，2mM EDTA，pH8.0)中，超声以破坏细胞并释放包涵体。将这些包涵体中含有的蛋白质在4℃温和搅拌于20mM乙醇胺、6M尿素pH10缓冲液中溶解过夜。通过使溶解的蛋白质通过阴离子交换柱并在溶解缓冲液中用NaCl梯度洗脱蛋白质以实现纯化。收集级分并通过SDS-PAGE分析。将含有感兴趣蛋白的那些级分集合在一起，对20mM Tris pH8.5透析，浓缩至5mg/ml，急速冷冻，然后在-80℃以1ml等分保存至使用。

氨基酸序列比对。从NCBI检索感兴趣的所有不同的II类α1结构域序列，使用BLAST网站(NIH)的BLAST两个或更多个序列进行比对，然后手动优化以显示相关区域。

通过圆二色性对蛋白质的结构分析。解冻蛋白并通过SDS-PAGE分析(数据未显示)，然后使用AVIV分光仪通过远UV光(180-260nm)的吸光度测试其二级结构含量。蛋白质的纯度大于95％。在20mM Tris缓冲液pH8.5中以1mg/ml的浓度制备100微升的每种多肽，并将其置于CD比色杯中。通过0.1mm光程，扫描蛋白质在180nm至260nm的远UV光谱中的吸光度，每隔0.5nm进行测量。还扫描仅包含20mM Tris缓冲液的样品，并从蛋白质读数中减去信号。对每种蛋白质，对至少扫描三次取平均值，绘制为摩尔椭圆率。

DRα1构建体与CD74的结合和竞争测定。这些实验如下所述使用Maxisorp平板(Nunc)通过ELISA进行。在结合和竞争实验之前，将蛋白质用靶向赖氨酸侧链伯胺的AlexaFluor 488(Invitrogen)或生物素(Pierce Biotechnology)标记。使用Superdex75 10/300柱(GE Healthcare)通过大小排阻色谱法去除未缀合的Alexa Fluor 488或生物素。对于结合实验，产生重组人CD74(rhCD74)构建体(数据未显示)，关于设计、生产和纯化已有阐述(Benedek et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 114:E8421-E8429,2017)。将平板用在TBS中0.1μg/ml浓度的rhCD74(C27S)在室温包被2小时或者在4℃包被过夜。在用于TBS中的5％BSA和0.0125％的Tween 20(T20)封闭后，将在具有0.0125％的T20的封闭缓冲液中制备的DRα1-MOG构建体在室温捕获3小时，随后用与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的链霉亲和素检测。将数据加载到Prism软件上并拟合一个或两个结合位点等式以确定相对亲和性。

对于竞争实验，将ELISA平板在室温用在TBS中0.5μg/ml浓度的MIF包被。然后将平板用在TBS中的5％BSA和0.0125％T20封闭过夜，然后加入竞争性混合物(所述混合物含有rhCD74与在5％BSA/TBS加上0.0125％T20中制备的连续稀释的DRα1构建体)，在25℃放置1.5小时。用特异性识别远离推定的MIF/D-DT结合位点的区域的人CD74的单克隆抗体检测结合的rhCD74。测定在450nm的吸光度，并用Prism分析数据，使用软件中包含的竞争等式计算参数。对于DRα1-hMOG-35-55与P2肽之间的竞争(见下节)，从DR*1501Tg小鼠脾细胞免疫沉淀小鼠CD74及设置竞争实验。使用2.5μl的P2肽和增加浓度的DRα1-hMOG-35-55蛋白。用2％SDS从免疫沉淀中洗脱结合的肽并在16.5％PAG Tris/Tricine中分析。扫描凝胶的FITC，通过光密度测定法定量荧光。绘制P2荧光相对于DRα1竞争物作图，使用Prism分析数据。将相对密度值拟合单结合位点等式。

DRα1-hMOG-35-55上CD74结合表位作图。先前描述了能以高亲和性结合DRa1-MOG蛋白及其亲本分子RTL1000的Fab(Meza-Romero et al.,J.Immunol.192:4164-4173,2014)。然而，尚未确定其在DRα1结构域上的结合区域。为了作图G4 Fab的表位，合成覆盖DRα1结构域全长的一系列7个重叠N末端-FITC标记的肽。测试这些肽结合来自脾细胞的In1免疫沉淀的小鼠CD74以及免疫吸附于蛋白L珠的G4的能力。

免疫沉淀和western印迹实验。免疫沉淀后，将各个肽在结合实验中在0.1％CHAPS/TEN缓冲液(50mM Tris，2mM EDTA，150mM NaCl，pH7.4)中分析14-16小时。将免疫复合物用50μl的2％SDS/ESB(电泳样品缓冲液)洗脱20分钟，然后在非还原条件下在10-20％SDS-PAGE中通过电泳分析。电泳后，扫描凝胶的FITC标记的肽。在平行实验中，使用免疫沉淀的小鼠H2M测试一组肽的结合。H2M分子结合II类α1结构域，但在不同区域结合，因此其应示出在结合期间对α1结构域合成肽的不同选择性。我们还测试了G4和CD74识别相同一组肽的可能性，因为G4阻断DRα1构建体与rhCD74的结合。在这方面，将G4 Fab结合于蛋白L珠，然后将P2或P7肽应用于所述免疫复合物。如上所述洗脱结合的材料，通过电泳分析，并扫描凝胶的FITC标记的材料。使用标准技术将蛋白质移至PVDF(孔径0.1μm)及随后用在TBS中的5％BSA和0.05％T20封闭进行Western印迹实验。

ERK1/2磷酸化封闭。将来自EAE小鼠的200万个脾细胞在37℃用20mM Tris pH8.5、25μg的DRhQ或DRa1-hMOG-35-55在体外处理30分钟。然后离心细胞并用补充有蛋白酶和磷酸盐抑制剂的RIPA缓冲液裂解。将细胞裂解在冰上进行30分钟并通过在4℃以14,000rpm离心10分钟除去含有细胞核和细胞器的碎片。收集上清液，在还原条件下在10-20％梯度凝胶中进行SDS-PAGE。电泳后，将蛋白质移至PVDF，首先对膜进行p-ERK1/2探查，剥离，然后用抗总ERK1/2抗体探查。

EAE诱导。8-12周龄的C57BL/6WT雄性小鼠购自JacksonLaboratory。所有程序均已根据联邦、州和机构指南批准和执行。在小鼠侧面的四个部位对小鼠进行皮下免疫接种，以分布0.2ml的200μg小鼠MOG-35-55肽和含有400μg热灭活的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)H37RA(Difco)的完全弗氏佐剂(Meza-Romero et al.,J.Immunol.192:4164-4183,2014)的乳液。此外，在免疫后第0天和第2天，为小鼠经腹膜内注射来自ListBiological Laboratories的百日咳毒素(Ptx)(每只小鼠分别接种75ng和200ng)。从EAE评分>2.0开始，每天经皮下注射DRα1-hMOG-35-55、DRhQ、DRα1-mMOG-35-55和DRmQ蛋白(100μg于0.1ml中)，共5天，如前所述对小鼠进行EAE的临床体征评分，评分标准为组合后肢和前肢麻痹评分的六点量表(Meza-Romero et al.,J.Immunol.192:4164-4183,2014)。从免疫后第8天至第27天每天计算小鼠组的平均EAE得分和SD，并通过在整个实验中对EAE得分曲线进行数值积分来对每只小鼠求和(CDI，代表总疾病负荷)。

数据分析。使用Prism软件包(GraphPad)计算比较EAE严重性数据和拟合结合和竞争结果的数据的等式的统计分析。

实施例2

修饰的DRα1多肽的产生和分析

DRα1-hMOG-35-55、DRα1-mMOG-35-55、DRhQ和DRmQ蛋白质的产生具有可比性，表明L50Q取代不影响转录和表达率。蛋白质产量一致地约为90-100mg/升LB肉汤。Fab G4用于检测纯化的蛋白质。在先前研究中，显示Fab G4在不同情况下检测到DRα1结构域，包括作为独立结构域、作为较大构建体的部分(如本文所述)或作为两个结构域重组蛋白的部分(如RTL1000)。

一些人II类α1结构域的比对的分析(图1)揭示了DRα1结构域不与其它人或小鼠II类共享的独特特征。这种独特特征示出在用于比对的大多数序列中在位置18处是谷氨酰胺(Q)残基(Q18，图1中的箭头；SEQ ID NO:1中的氨基酸位置14)。然而，DRα1结构域在位置18具有亮氨酸(L)。与其它肽呈递II类结构域一样，这个Q18残基在非抗原呈递蛋白质DMα1和DOα1中也是保守的。在所有分析的II类α1结构域一级序列和蛋白质数据库(PDB)中储存的晶体结构中，这个区域位于多肽N末端指向分子主体外的β链1和β链2之间的环中。

为探索L18与Q18的功能作用，在ELISA实验中使用了几种先前构建的源自小鼠和人的RTL进行结合测定。图2A示出具有Q18的那些多肽(DP2、DP4和小鼠衍生的RTL551(IAb))在ELISA测定中显示出比具有L18的构建体更大的与rhCD74的结合活性。产生突变体多肽(序列在图2B中示出)以研究L18相对Q18(DRα1-MOG-35-55构建体中的位置50)是否对CD74受体具有不同的结合亲和性。

人Fab G4(识别DRα1结构域)用作确定L50Q取代是否影响DRα1构建体的免疫学识别的工具。Fab G4以与其与DRα1-hMOG-35-55以及DRα1-mMOG-35-55相同的方式与DRhQ突变体交叉反应(图3A)。为并排比较DRhQ和DRα1-MOG-35-55蛋白质的二级结构含量，在圆二色性光谱仪中对蛋白质进行了远UV扫描(图3B)。在先前研究中显示，DRα1-hMOG-35-55含大量α-螺旋和β折叠二级结构(Meza-Romero et al.,J.Immunol.192:4164-4183,2014)。所有分子在190nm均显示高正吸光度，这是指示α-螺旋元件的主要特征，而在215nm的负吸光度表明存在β-折叠二级结构。总的来说，这些结果表明这三种蛋白质在结构上相似，提示在所述构建体的β-折叠平台中亮氨酸(L)置换为谷氨酰胺(Q)只能最小程度地改变α-螺旋含量，但不会改变分子底部的β-折叠结构的量。

设计了跨越DRα1蛋白全长的七个重叠肽(图4A)。这些肽在氨基酸序列的N末端含有FITC部分，以便通过荧光扫描检测。其中，由于全长肽的溶解性问题，必须对P1进行修饰，并且无法合成第二肽(P6)。这些肽单独和合并用于结合来自小鼠脾细胞的免疫沉淀的CD74。作为第一种方法，将所有肽的混合物同时加入到含有ln1免疫沉淀CD74的蛋白A/G珠中。如图4B所示，只有两个肽P2和P5在较小程度上与免疫沉淀的小鼠CD74结合。为证实这一点，在相同条件下将各个肽加入蛋白A/G-ln1-CD74复合物。如图4B所示，只有P2和P5肽明显结合小鼠CD74。P2呈现出较强的结合，而P5具有较低的亲和性。

为测试这种策略的有效性，还使用免疫沉淀的H2M进行了实验。假设不同的肽(或肽组)将与H2M结合。如图4C所示，一组不同的重叠肽与这个蛋白结合，证实了先前实验的结果。这个在后实验显示P7肽强力结合免疫沉淀的H2M，P4程度较低(图4C)。这个结果与DR/DM复合物的已公开晶体结构一致(Pos et al.,Cell 151:1557-1568,2012)。这两个分子的界面以DM和DR的α链为主。DM结合DRα1结构域的外侧面，远离DRα1区的N末端及接近肽结合沟，而没有接触DRβ1结构域。

在先前公开中，已证明G4 Fab有效阻断DRα1构建体与CD74的结合(Meza-Romeroet al.,J.Immunol.192:4164-4173,2014)。因此，进行旨在确定P2是否也与蛋白L结合的G4Fab相互作用及比较与免疫沉淀的CD74的结合的实验。P7肽可能不结合G4或CD74。如所预期的，仅P2肽能结合G4，表明G4和CD74在DRα1多肽上具有相同的结合位点(图5A)。图5B示出具有P2肽位置的DRα1结构域的示意图。为确认P2肽与结合CD74的界面相关，进行竞争实验以确定DRα1-hMOG-35-55和P2肽是否彼此竞争结合mCD74。结果表明，DRα1-hMOG-35-55能以750nM的相对亲和性(K

评估包括DRα1-hMOG-35-55、DRhQ、DRα1-mMOG-35-55和DRmQ的DRα1-MOG与其受体的结合。将重组人CD74(C27S)包被于ELISA平板上，然后在封闭后，将DRα1构建体在室温捕获1-1.5小时，并用抗MOG抗体检测。将结果输入Prism软件，将曲线拟合单位点特异结合等式计算K

表2：与CD74的结合亲和性

当与构建体的对应野生型形式相比时，DRhQ突变体以高8-10倍的亲和性与受体结合(见表2中K

如图7A所示，与含天然L50的DRα1-hMOG-35-55构建体相比，用DRhQ构建体治疗C57BL/6雄性小鼠显著降低进行中的EAE的严重性。相反，与使用含L50的DRα1-mMOG-35-55构建体相比，用在封闭MIF结合CD74的能力方面没有差异(见上文)的DRmQ构建体进行治疗，其对EAE的治疗效果也没有差异(图7B)。

研究表明，MIF是通过与细胞表面CD74/CD44相互作用而驱动ERK1/2磷酸化的主要促炎细胞因子(Leng et al.,J.Exp.Med.197:1467-1476,2003)。从EAE小鼠收获的脾细胞显示出p-ERK1/2水平上调，表明与炎症过程相关的正在进行的活跃信号传导级联。用DRα1-MOG构建体治疗后，在温育30分钟后这种磷酸化在体外被下调。这提示用所述构建体处理正在进行炎症反应的动物的脾细胞导致ERK1/2磷酸化下调(图8)。

在蛋白质数据库中保藏的一些人和小鼠II类分子的晶体结构中，Q氨基酸残基位于在结构域N末端的β链1和β链2之间的环中的β链1的末端(图9A和9B)。实际上，这个环涉及TSST-1毒素与II类的a1结构域的结合(Karp et al.,Nature 346:474-476,1990；Kim etal.,Science 266:1870-1874,1994)及II类与不变链(Ii，CD74)之间的结合阻止TSST与II类结合(Karp et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:9657-9661,1992)，提示潜在的共享或重叠表位。使用蛋白质-蛋白质对接算法，我们预测在CD74与DRα1-hMOG-35-55之间存在界面(Meza-Romero et al.,Metab.Brain Dis.31:249-255,2016；Wingerchuk et al.,MayoClin.Proc.89:225-240,2014)并确定构建体中的氨基酸残基F48、L50、P52、D53和S55(图9A中的F12、L14、P16、D17和S19)是这个界面的重要组分。因此，我们将Q突变引入DRα1-hMOG-35-55和DRα1-mMOG-35-55中以分别产生DRhQ和DRmQ变体。从免疫学和生物物理学观点，这些新突变体与其亲本分子没有区别。这两种蛋白质显示出与Fab G4相同水平和性质的交叉反应，提示表位在结构上未被修饰(图3A)。同样，这两种构建体通过圆二色性光谱分析显示出相同谱，表明二级结构保留在突变体DRhQ(图3B)和DRmQ(未显示)中。

早期实验研究表明，除了DRα1-MOG-35-55(Benedek et al.,Eur.J.Immunol.43:1309-1321,2013)外，RTL1000也能结合CD74并阻断MIF结合CD74(Benedek et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 114:E8421-E8429,2017)。如通过对接算法所预测(Meza-Romeroet al.,Cytokine 88:62-70,2016；Meza-Romero et al.,Metab.Brain Dis.31:249-255,2016)，通过使用跨越DRα1结构域氨基酸序列的一组重叠肽，主要结合位点缩小至DRα1结构域的N末端(图4A和4B)。所有这些氨基酸残基构成P2肽的核心，示出其结合免疫沉淀的小鼠CD74及Fab G4(图5A)。另外，DRα1-hMOG-35-55胜过P2肽，结合免疫纯化的小鼠CD74(图5C)，表明两种配体在同一区域结合受体。对几种小鼠和人MHC II类分子的晶体结构的仔细检查表明，这些残基位于α1结构域N末端的β1和β2链之间的环中。根据我们的对接模型，这个环内的残基与CD74上的残基紧密接触(图9A)。

我们还检测了这种新变体与重组形式人CD74的结合及其防止或竞争MIF与其受体结合的活性。我们的结果表明，与亲本分子形成鲜明对比的是，在直接结合ELISA测定中，携带Q的变体示出对CD74的K

鉴于可以将本发明揭示的原理应用于其的众多可能的实施方案，应当认识到，示例的实施方案仅是示例，不应被视为限制本发明的范围。本发明的范围由所附权利要求书限定。因此，我们要求保护在这些权利要求的范围和精神内的所有内容作为我们的发明。

序列表

<110> 俄勒冈健康科学大学

美国政府退伍军人事务部

<120> 包含修饰的MHC II类DRα1结构域的重组多肽及其应用方法

<130> 899-101380-02

<150> US 62/741,941

<151> 2018-10-05

<160> 64

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 84

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的DRalpha1多肽

<400> 1

Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Gln Asn Pro

1 5 10 15

Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe

20 25 30

His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe

35 40 45

Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala

50 55 60

Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn Tyr Thr

65 70 75 80

Pro Ile Thr Asn

<210> 2

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DRhQ多肽

<400> 2

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe

35 40 45

Tyr Gln Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly

50 55 60

Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg

65 70 75 80

Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu

85 90 95

Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg

100 105 110

Ser Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn

115 120

<210> 3

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DRmQ多肽

<400> 3

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe

35 40 45

Tyr Gln Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly

50 55 60

Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg

65 70 75 80

Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu

85 90 95

Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg

100 105 110

Ser Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn

115 120

<210> 4

<211> 242

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码修饰的DRalpha1多肽的核酸

<400> 4

atcaaagaag aacatgtgat catccaggcc gagttctatc agaatcctga ccaatcaggc 60

gagtttatgt ttgactttga tggtgatgag attttccatg tggatatggc aaagaaggag 120

acggtctggc ggcttgaaga atttggacga tttgccagct ttgaggctca aggtgcattg 180

gccaacatag ctgtggacaa agccaacttg gaaatcatga caaagcgctc caactatact 240

cc 242

<210> 5

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码DRhQ的核酸

<400> 5

atggaagttg gttggtaccg tccgccgttc tcccgtgttg ttcacctgta ccgtaacggt 60

aaaggaggtg gaggctcact agtgccccga ggctctggag gtggaggcat caaagaagaa 120

catgtgatca tccaggccga gttctatcag aatcctgacc aatcaggcga gtttatgttt 180

gactttgatg gtgatgagat tttccatgtg gatatggcaa agaaggagac ggtctggcgg 240

cttgaagaat ttggacgatt tgccagcttt gaggctcaag gtgcattggc caacatagct 300

gtggacaaag ccaacttgga aatcatgaca aagcgctcca actatactcc gatcaccaat 360

taa 363

<210> 6

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码DRmQ的核酸

<400> 6

atggaagttg gttggtaccg ttccccgttc tcccgtgttg ttcacctgta ccgtaacggt 60

aaaggaggtg gaggctcact agtgccccga ggctctggag gtggaggcat caaagaagaa 120

catgtgatca tccaggccga gttctatcaa aatcctgacc aatcaggcga gtttatgttt 180

gactttgatg gtgatgagat tttccatgtg gatatggcaa agaaggagac ggtctggcgg 240

cttgaagaat ttggacgatt tgccagcttt gaggctcaag gtgcattggc caacatagct 300

gtggacaaag ccaacttgga aatcatgaca aagcgctcca actatactcc gatcaccaat 360

taa 363

<210> 7

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人DM1 alpha 1结构域

<400> 7

Trp Pro Asp Asp Leu Gln Asn His Thr Phe Leu His Thr Val Tyr Cys

1 5 10 15

Gln Asp Gly Ser Pro Ser Val Gly Leu Ser Glu Ala Tyr Asp Glu Asp

20 25 30

Gln Leu Phe Phe Phe Asp Phe Ser Gln Asn Thr Arg Val Pro Arg Leu

35 40 45

Pro Glu Phe Ala Asp Trp Ala Gln Glu Gln Gly

50 55

<210> 8

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人DO1 alpha1结构域

<400> 8

Ala Gly Ala Thr Lys Ala Asp His Met Gly Ser Tyr Gly Pro Ala Phe

1 5 10 15

Tyr Gln Ser Tyr Gly Ala Ser Gly Gln Phe Thr His Glu Phe Asp Glu

20 25 30

Glu Gln Leu Phe Ser Val Asp Leu Lys Lys Ser Glu Ala Val Trp Arg

35 40 45

Leu Pro Glu Phe Gly Asp Phe Ala Arg Phe Asp Pro

50 55 60

<210> 9

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人DQ1 alpha1结构域

<400> 9

Gly Glu Asp Ile Val Ala Asp His Val Ala Ser Cys Gly Val Asn Leu

1 5 10 15

Tyr Gln Phe Tyr Gly Pro Ser Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly

20 25 30

Asp Glu Gln Phe Tyr Val Asp Leu Glu Arg Lys Glu Thr Ala Trp Arg

35 40 45

Trp Pro Glu Phe Ser Lys Phe Gly Gly Phe Asp Pro

50 55 60

<210> 10

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人DQ2 alpha1结构域

<400> 10

Gly Glu Asp Ile Val Ala Asp His Val Ala Ser Tyr Gly Val Asn Phe

1 5 10 15

Tyr Gln Ser His Gly Pro Ser Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly

20 25 30

Asp Glu Glu Phe Tyr Val Asp Leu Glu Thr Lys Glu Thr Val Trp Gln

35 40 45

Leu Pro Met Phe Ser Lys Phe Ile Ser Phe Asp Pro

50 55 60

<210> 11

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人DP4 alpha1结构域

<400> 11

Arg Arg Val Ile Lys Ala Asp His Val Ser Thr Tyr Ala Ala Phe Val

1 5 10 15

Gln Thr His Arg Pro Thr Gly Glu Phe Met Phe Glu Phe Asp Glu Asp

20 25 30

Glu Met Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val Trp His Leu

35 40 45

Glu Glu Phe Gly Gln Ala Phe Ser Phe Glu Ala

50 55

<210> 12

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人DP2 alpha1结构域

<400> 12

Ala Gly Ala Ile Lys Ala Asp His Val Ser Thr Tyr Ala Ala Phe Val

1 5 10 15

Gln Thr His Arg Pro Thr Gly Glu Phe Met Phe Glu Phe Asp Glu Asp

20 25 30

Glu Met Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val Trp His Leu

35 40 45

Glu Glu Phe Gly Gln Ala Phe Ser Phe Glu Ala

50 55

<210> 13

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人DR1 alpha1结构域

<400> 13

Ala Gly Ala Ile Lys Ala Asp His Val Ser Thr Tyr Ala Ala Phe Val

1 5 10 15

Gln Thr His Arg Pro Thr Gly Glu Phe Met Phe Glu Phe Asp Glu Asp

20 25 30

Glu Met Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val Trp His Leu

35 40 45

Glu Glu Phe Gly Gln Ala Phe Ser Phe Glu Ala

50 55

<210> 14

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IAk alpha 1结构域

<400> 14

Glu Asp Asp Ile Glu Ala Asp His Val Gly Ser Tyr Gly Ile Thr Val

1 5 10 15

Tyr Gln Ser Pro Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr Phe Glu Phe Asp Gly

20 25 30

Asp Glu Leu Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val Trp Met

35 40 45

Leu Pro Glu Phe Ala Gln Leu Arg Arg Phe Glu Pro

50 55 60

<210> 15

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IAd alpha1结构域

<400> 15

Glu Asp Asp Ile Glu Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Thr Thr Val

1 5 10 15

Tyr Gln Ser Pro Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly

20 25 30

Asp Glu Leu Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Lys Thr Val Trp Arg

35 40 45

Leu Pro Glu Phe Gly Gln Leu Ile Leu Phe Glu Pro

50 55 60

<210> 16

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IAb alpha1结构域

<400> 16

Glu Asp Asp Ile Glu Ala Asp His Val Gly Thr Tyr Gly Thr Ser Val

1 5 10 15

Tyr Gln Ser Pro Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr Phe Glu Phe Asp Gly

20 25 30

Asp Glu Leu Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Lys Thr Val Trp Arg

35 40 45

Leu Pro Glu Phe Gly Gln Leu Ala Ser Phe Asp Pro

50 55 60

<210> 17

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IAf alpha1结构域

<400> 17

Glu Asp Asp Ile Glu Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Ile Ser Val

1 5 10 15

Tyr Gln Ser Pro Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr Phe Glu Phe Asp Gly

20 25 30

Asp Glu Trp Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg

35 40 45

Leu Pro Glu Phe Gly Gln Leu Thr Ser Phe Asp Pro

50 55 60

<210> 18

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IAu alpha1结构域

<400> 18

Glu Asp Asp Ile Glu Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Ile Ser Val

1 5 10 15

Tyr Gln Ser Pro Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr Phe Glu Phe Asp Gly

20 25 30

Asp Glu Trp Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg

35 40 45

Leu Pro Glu Phe Gly Gln Leu Thr Ser Phe Asp Pro

50 55 60

<210> 19

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠IA1 alpha1结构域

<400> 19

Glu Asp Asp Ile Glu Ala Asp His Val Gly Ser Tyr Gly Ile Val Val

1 5 10 15

Tyr Gln Ser Pro Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly

20 25 30

Asp Glu Trp Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Glu Thr Val Trp Met

35 40 45

Leu Pro Glu Phe Gly Gln Leu Thr Ser Phe Asp Pro

50 55 60

<210> 20

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 部分DRalpha1-hMOG-35-55序列

<400> 20

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe

35 40 45

Tyr Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met

50 55

<210> 21

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 部分DRhQ序列

<400> 21

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe

35 40 45

Tyr Gln Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met

50 55

<210> 22

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 部分DRalpha1-mMOG-35-55序列

<400> 22

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe

35 40 45

Tyr Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met

50 55

<210> 23

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 部分DRmQ序列

<400> 23

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Ser Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Gly Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe

35 40 45

Tyr Gln Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met

50 55

<210> 24

<211> 86

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的DRalpha1

<400> 24

Met Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Gln

1 5 10 15

Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu

20 25 30

Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu

35 40 45

Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn

50 55 60

Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn

65 70 75 80

Tyr Thr Pro Ile Thr Asn

85

<210> 25

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽P1

<400> 25

Met Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Gln

1 5 10 15

Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly

20 25 30

<210> 26

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽P2

<400> 26

Gln Ala Glu Phe Tyr Gln Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe

1 5 10 15

Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys

20 25 30

<210> 27

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽P3

<400> 27

Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val

1 5 10 15

Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe

20 25 30

<210> 28

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽P4

<400> 28

Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg

1 5 10 15

Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly

20 25 30

<210> 29

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽P5

<400> 29

Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe

1 5 10 15

Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala

20 25 30

<210> 30

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽P6

<400> 30

Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala

1 5 10 15

Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn

20 25 30

<210> 31

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽P7

<400> 31

Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg

1 5 10 15

Ser Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn

20

<210> 32

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人MOG-35-55

<400> 32

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Pro Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys

20

<210> 33

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 小鼠MOG-35-55

<400> 33

Met Glu Val Gly Trp Tyr Arg Ser Pro Phe Ser Arg Val Val His Leu

1 5 10 15

Tyr Arg Asn Gly Lys

20

<210> 34

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IRBP 1177-1191

<400> 34

Ala Asp Gly Ser Ser Trp Glu Gly Val Gly Val Val Pro Asp Val

1 5 10 15

<210> 35

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抑制蛋白291-310

<400> 35

Asn Arg Glu Arg Arg Gly Ile Ala Leu Asp Gly Lys Ile Lys His Glu

1 5 10 15

Asp Thr Asn Leu

20

<210> 36

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 磷转导素65-96

<400> 36

Lys Glu Arg Met Ser Arg Lys Met Ser Ile Gln Glu Tyr Glu Leu Ile

1 5 10 15

His Gln Asp Lys Glu Asp Glu Gly Cys Leu Arg Lys Tyr Arg Arg Gln

20 25 30

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 恢复蛋白48-52

<400> 37

Gln Phe Gln Ser Ile

1 5

<210> 38

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 恢复蛋白64-70

<400> 38

Lys Ala Tyr Ala Gln His Val

1 5

<210> 39

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 恢复蛋白62-81

<400> 39

Pro Lys Ala Tyr Ala Gln His Val Phe Arg Ser Phe Asp Ala Asn Ser

1 5 10 15

Asp Gly Thr Leu

20

<210> 40

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 恢复蛋白149-162

<400> 40

Glu Lys Arg Ala Glu Lys Ile Trp Ala Ser Phe Gly Lys Lys

1 5 10

<210> 41

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胶原蛋白II 261-274

<400> 41

Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro Gly

1 5 10

<210> 42

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胶原蛋白II 259-273

<400> 42

Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys Gly Glu Pro

1 5 10 15

<210> 43

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 胶原蛋白II 257-270

<400> 43

Glu Pro Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Glu Gln Gly Pro Lys

1 5 10

<210> 44

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 修饰的胶原蛋白II257-270

<400> 44

Ala Pro Gly Ile Ala Gly Phe Lys Ala Glu Gln Ala Ala Lys

1 5 10

<210> 45

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤维蛋白原-alpha 40-59

<400> 45

Val Glu Arg His Gln Ser Ala Cys Lys Asp Ser Asp Trp Pro Phe Cys

1 5 10 15

Ser Asp Glu Asp

20

<210> 46

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤维蛋白原-alpha 616-625

<400> 46

Thr His Ser Thr Lys Arg Gly His Ala Lys Ser Arg Pro Val Arg Gly

1 5 10 15

Ile His Thr Ser

20

<210> 47

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤维蛋白原-alpha 79-91

<400> 47

Gln Asp Phe Thr Asn Arg Ile Asn Lys Leu Lys Asn Ser

1 5 10

<210> 48

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 纤维蛋白原-alpha 121-140

<400> 48

Asn Asn Arg Asp Asn Thr Tyr Asn Arg Val Ser Glu Asp Leu Arg Ser

1 5 10 15

Arg Ile Glu Val

20

<210> 49

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 波形蛋白59-79

<400> 49

Gly Val Tyr Ala Thr Arg Ser Ser Ala Val Arg Leu Arg Ser Ser Val

1 5 10 15

Pro Gly Val Arg Leu

20

<210> 50

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 波形蛋白26-44

<400> 50

Ser Ser Arg Ser Tyr Val Thr Thr Ser Thr Arg Thr Tyr Ser Leu Gly

1 5 10 15

Ser Ala Leu

<210> 51

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 波形蛋白256-275

<400> 51

Ile Asp Val Asp Val Ser Lys Pro Asp Leu Thr Ala Ala Leu Arg Asp

1 5 10 15

Val Arg Gln Gln

20

<210> 52

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 波形蛋白415-433

<400> 52

Leu Pro Asn Phe Ser Ser Leu Asn Leu Arg Glu Thr Asn Leu Asp Ser

1 5 10 15

Leu Pro Leu

<210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> alpha-烯醇酶5-21

<400> 53

Lys Ile His Ala Arg Glu Ile Phe Asp Ser Arg Gly Asn Pro Thr Val

1 5 10 15

Glu

<210> 54

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人软骨糖蛋白39 259-271

<400> 54

Pro Thr Phe Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Glu

1 5 10

<210> 55

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 髓鞘碱性蛋白85-99

<400> 55

Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg

1 5 10 15

<210> 56

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 髓鞘碱性蛋白145-164

<400> 56

Val Asp Ala Gln Gly Thr Leu Ser Lys Ile Phe Lys Leu Gly Gly Arg

1 5 10 15

Asp Ser Arg Ser

20

<210> 57

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白脂蛋白139-151

<400> 57

Cys His Cys Leu Gly Lys Trp Leu Gly His Pro Asp Lys Phe Val Gly

1 5 10 15

<210> 58

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 蛋白脂蛋白95-116

<400> 58

Gly Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr Ile Cys Gly

1 5 10 15

Lys Gly Leu Ser Ala Thr

20

<210> 59

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOG 1-25

<400> 59

Gly Gln Phe Arg Val Ile Gly Pro Arg His Pro Ile Arg Ala Leu Val

1 5 10 15

Gly Asp Glu Val

20

<210> 60

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOG 94-116

<400> 60

Gly Gly Phe Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gln Glu Glu Ala

1 5 10 15

Ala Met Glu Leu Lys Val Glu

20

<210> 61

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOG 145-160

<400> 61

Val Phe Leu Cys Leu Gln Tyr Arg Leu Arg Gly Lys Leu Arg Ala Glu

1 5 10 15

<210> 62

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MOG 194-208

<400> 62

Leu Val Ala Leu Ile Ile Cys Tyr Asn Trp Leu His Arg Arg Leu

1 5 10 15

<210> 63

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> alpha2-麦醇溶蛋白61-71

<400> 63

Pro Gln Pro Glu Leu Pro Tyr Pro Gln Pro

1 5 10

<210> 64

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> alpha-2麦醇溶蛋白58-77

<400> 64

Leu Gln Pro Phe Pro Gln Pro Gln Leu Pro Tyr Pro Gln Pro Gln Leu

1 5 10 15

Pro Tyr Pro Gln

20