含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法及含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的制造方法

摘要

本申请公开一种含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法，该制造方法包括：酵母增殖步骤，该步骤中，将被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的酵母在含有异亮氨酸及缬氨酸的培养基中进行培养，以使所述酵母增殖；以及浓郁滋味赋予物质生成步骤，该步骤中，在所述培养基中的异亮氨酸的含量小于0.2质量％时，在所述培养基中加入缬氨酸，培养所述酵母，而生成浓郁滋味赋予物质；所述浓郁滋味赋予物质是γ‑Glu‑Abu及γ‑Glu‑Abu‑Gly中的至少任一种。

说明书

技术领域

本发明涉及一种含有γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly中的至少任一种的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法，及使用所述酵母的含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物(エキス)的制造方法。

背景技术

由酵母菌体制备的酵母抽提物具有赋予食品鲜味、浓郁滋味等的功能，作为诸如调味料等食品添加剂等在食品领域中被广泛使用。由于近年来趋向于追求天然，所以对于酵母抽提物的需要呈增加趋势。

关于赋予食品浓郁滋味的成分之一，已知有作为由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽的谷胱甘肽(以下有时称为“GSH”)。

迄今为止，关于用来提高酵母菌体中的GSH含量的技术，提出了制成使DOA1基因的至少一部分及MET30基因的至少一部分缺损或变异后所得的酵母变异株的技术(例如参照专利文献1)，以及，对具有变异型MET30基因的酵母变异株进行突变处理，得到2株以上的谷胱甘肽含量高的酵母变异株，通过使所得的酵母变异株交配来获得GSH含量更高的酵母变异株的技术(例如参照专利文献2)。

此外，关于赋予食品浓郁滋味的成分，还已知有γ-Glu-X、γ-Glu-X-Gly(X表示除了Cys及其衍生物以外的氨基酸或氨基酸衍生物)(例如参照专利文献3)。

迄今为止，关于用来提高所述赋予浓郁滋味的成分含量的技术，提出了在添加了Abu(L-2-氨基丁酸)及γ-Glu-Abu(L-γ-谷氨酰基-L-2氨基丁酸)的培养基中培养酵母，由所得的菌体制备包含γ-Glu-Abu的酵母抽提物的技术(例如参照专利文献4)，以及以降低细胞内的乙酰乳酸合酶活性的方式进行改良，且提高酵母菌体内的选自Abu、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Abu-Gly中的至少1种的含量的技术(例如参照专利文献5)等。

如上所述，对提高赋予食品浓郁滋味的成分的含量的技术进行了各种研究，但在考虑到以工业规模生产等的情况下，γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly中的至少任一种在酵母或酵母抽提物中的含量尚不足够，现状是，强烈要求快速提供进一步提高所述含量的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2010-29147号公报

专利文献2：日本专利特开2011-160739号公报

专利文献3：日本专利第5857973号公报

专利文献4：日本专利第5954178号公报

专利文献5：国际公开第2015/005378号

发明内容

[发明要解决的问题]

本发明的课题在于解决以往的所述诸多问题，而达成以下目的。也就是说，本发明的目的在于提供一种高程度地含有γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly中的至少任一种的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法及含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的制造方法。

[解决问题的技术手段]

本发明人等为了达成所述目的进行了锐意研究，结果得出如下见解：使被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的酵母增殖，在培养基中的异亮氨酸的含量小于0.2质量％时，在所述培养基中加入缬氨酸，培养酵母，由此能够显著提高所述酵母中的γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly中的至少任一种的含量。

本发明是基于本发明人等的所述见解的发明，解决所述问题的技术手段如下所述。即：

＜1＞一种含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法，其特征在于包括：酵母增殖步骤，该步骤中，将被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的酵母在含有异亮氨酸及缬氨酸的培养基中进行培养，以使所述酵母增殖；及

浓郁滋味赋予物质生成步骤，该步骤中，在所述培养基中的异亮氨酸的含量小于0.2质量％时，在所述培养基中加入缬氨酸，培养所述酵母，而生成浓郁滋味赋予物质；

所述浓郁滋味赋予物质是γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly中的至少任一种。

＜2＞一种含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的制造方法，其特征在于：由含有浓郁滋味赋予物质的酵母制备酵母抽提物，所述含有浓郁滋味赋予物质的酵母是通过所述＜1＞至＜4＞中所述的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法获得的。

[发明的效果]

根据本发明，能够解决以往的所述诸多问题，而达成所述目的，能够提供一种高程度地含有γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly中的至少任一种的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法及含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的制造方法。

附图说明

图1A是表示对试验例1的主培养(日文为“本培養”)中的培养上清液中的异亮氨酸的含量进行测定所得的结果的图。

图1B是表示对试验例1的主培养中的培养上清液中的缬氨酸的含量进行测定所得的结果的图。

图1C是表示对试验例1的主培养中的酵母干燥菌体重量进行测定所得的结果的图。

图1D是表示对试验例1的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu的量进行测定所得的结果的图。

图1E是表示对试验例1的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu-Gly的量进行测定所得的结果的图。

图1F是表示对试验例1的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的Abu的量进行测定所得的结果的图。

图2A是表示对试验例2的主培养中的培养上清液中的异亮氨酸的含量进行测定所得的结果的图。

图2B是表示对试验例2的主培养中的培养上清液中的缬氨酸的含量进行测定所得的结果的图。

图2C是表示对试验例2的主培养中的酵母干燥菌体重量进行测定所得的结果的图。

图2D是表示对试验例2的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu的量进行测定所得的结果的图。

图2E是表示对试验例2的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu-Gly的量进行测定所得的结果的图。

图2F是表示对试验例2的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的Abu的量进行测定所得的结果的图。

图3A是表示对试验例3的主培养中的培养上清液中的异亮氨酸的含量进行测定所得的结果的图。

图3B是表示对试验例3的主培养中的培养上清液中的缬氨酸的含量进行测定所得的结果的图。

图3C是表示对试验例3的主培养中的酵母干燥菌体重量进行测定所得的结果的图。

图3D是表示对试验例3的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu的量进行测定所得的结果的图。

图3E是表示对试验例3的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu-Gly的量进行测定所得的结果的图。

图3F是表示对试验例3的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的Abu的量进行测定所得的结果的图。

图4A是表示对试验例5的主培养中的培养上清液中的异亮氨酸的含量进行测定所得的结果的图-1。

图4B是表示对试验例5的主培养中的培养上清液中的缬氨酸的含量进行测定所得的结果的图-1。

图4C是表示对试验例5的主培养中的酵母干燥菌体重量进行测定所得的结果的图-1。

图4D是表示对试验例5的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu的量进行测定所得的结果的图-1。

图4E是表示对试验例5的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu-Gly的量进行测定所得的结果的图-1。

图4F是表示对试验例5的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的Abu的量进行测定所得的结果的图-1。

图4G是表示对试验例5的主培养中的培养上清液中的异亮氨酸的含量进行测定所得的结果的图-2。

图4H是表示对试验例5的主培养中的培养上清液中的缬氨酸的含量进行测定所得的结果的图-2。

图4I是表示对试验例5的主培养中的酵母干燥菌体重量进行测定所得的结果的图-2。

图4J是表示对试验例5的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu的量进行测定所得的结果的图-2。

图4K是表示对试验例5的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的γ-Glu-Abu-Gly的量进行测定所得的结果的图-2。

图4L是表示对试验例5的主培养中的酵母干燥菌体每单位重量中的Abu的量进行测定所得的结果的图-2。

具体实施方式

(含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法)

本发明的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法至少包括增殖步骤及浓郁滋味赋予物质生成步骤，根据需要，还包括其它步骤。

本发明中的浓郁滋味赋予物质是指γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly中的至少任一种物质。另外，在本发明中，Abu及Glu是L体。

＜增殖步骤＞

所述增殖步骤是以下步骤，即，将被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的酵母在含有异亮氨酸及缬氨酸的培养基中进行培养，以使所述酵母增殖。

-酵母-

所述酵母被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性。

所述酵母可以是酿酒酵母，也可以是裂殖酵母。

作为所述酿酒酵母，可例举从属于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等酵母属、产朊假丝酵母(Candida utilis)等假丝酵母属、甲醇酵母(Pichia pastoris)等毕赤酵母属、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等汉逊酵母属等的酵母等。

作为所述裂殖酵母，可例举从属于粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)等裂殖酵母属等的酵母等。

其中，优选酵母抽提物的生产中经常使用的酿酒酵母或产朊假丝酵母。

所述酵母可以是单倍体，也可以是具有二倍性或在此之上的多倍性的酵母。

已知所述被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的酵母高程度地含有选自酵母菌体内的Abu、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Abu-Gly中的至少1种(参照国际公开第2015/005378号)。

所述被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的酵母可以使用通过改良等来制作的酵母，也可以使用市售品。

所述乙酰乳酸合酶是指具有催化由丙酮酸及α-丁酮酸(α-KB)生成α-乙酰羟基丁酸及CO

作为改良酵母以使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低，并成为需异亮氨酸及缬氨酸性的方法，没有特别限制，能够适当地选择周知的方法，例如可例举国际公开第2015/005378号中所记载的方法等。

具体来说，例如通过破坏编码乙酰乳酸合酶的活性次单元的ILV2基因，而使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低，并成为需异亮氨酸及缬氨酸性。

所述ILV2基因的碱基序列信息能够从公共数据库等中获取，例如酿酒酵母的ILV2基因的碱基序列揭示在Saccharomyces Genome Database(http://www.yeastgenome.org/)中。

破坏所述ILV2基因的方法并没有特别限制，能够适当选择周知的方法。

关于乙酰乳酸合酶活性降低的情况，例如能够通过由改良前的酵母和改良后的酵母分别制备粗酶液，对粗酶液的乙酰乳酸合酶活性比较来进行确认。乙酰乳酸合酶活性例如能够通过周知的方法(F.C.Stormer and H.E.Umbarger,Biochem.Biophys.Res.Commun17,5,587-592(1964))进行测定。

所述酵母除具有被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的性质以外，根据需要还可以具有其它性质。

关于所述其它性质，只要不损害本发明的效果，则没有特别限制，能够根据目的适当选择，但优选增强谷胱甘肽的生成能力，更优选还具有耐苏氨酸性。

增强所述酵母的谷胱甘肽的生成能力的方法没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如通过周知的方法，使被改良为增强谷胱甘肽的生成能力的酵母和所述被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的酵母进行交配，由此能够挑选出被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性，且谷胱甘肽的生成能力得到增强的酵母。

所述被改良为增强谷胱甘肽的生成能力的酵母可以使用通过改良等来制作的酵母，也可以使用市售品。

改良酵母以增强谷胱甘肽的生成能力的方法没有特别限制，能够适当选择周知的方法，例如可例举如下方法：诸如日本专利特开2010-29147号公报(日本专利第5496480号公报)中所记载的使DOA1基因的至少一部分及MET30基因的至少一部分缺损或变异的方法；诸如日本专利特开2011-160739号公报(日本专利第5667365号公报)中所记载的对具有变异型MET30基因的酵母变异株进行突变处理，获得2株以上的谷胱甘肽含量高的酵母变异株，使所得的酵母变异株交配，由此获得谷胱甘肽含量更高的酵母变异株的方法等。

关于谷胱甘肽的生成能力增强的情况，例如能够按照Titze等人的方法(Analytical Biochemistry,Vol.27,p502,1969)来测定改良前的酵母和改良后的酵母中的总谷胱甘肽量，比较该总谷胱甘肽量，由此进行确认。

获取具有所述耐苏氨酸性的酵母的方法没有特别限制，能够适当选择周知的方法，例如可例举在培养基中添加苏氨酸，挑选生长的酵母的方法等。

-培养基-

关于所述增殖步骤中使用的培养基，只要至少包含异亮氨酸及缬氨酸且所述酵母能够增殖，则没有特别限制，能够根据目的适当选择。

关于所述增殖步骤中使用的培养基中的异亮氨酸的含量，只要所述酵母能够增殖，则没有特别限制，能够根据目标酵母的量等适当选择，但优选0.01质量％～2.0质量％，更优选0.1质量％～1.0质量％。

关于所述增殖步骤中使用的培养基中的缬氨酸的含量，只要所述酵母能够增殖，则没有特别限制，能够根据目标酵母的量等适选择，但优选0.01质量％～2.0质量％，更优选0.1质量％～1.0质量％。

所述增殖步骤中使用的培养基中除了异亮氨酸及缬氨酸以外的成分及其量并没有特别限制，能够适当选择用于培养酵母等微生物的成分。

例如，作为碳源，可以例举葡萄糖、蔗糖、乙酸、乙醇、糖蜜、亚硫酸纸浆废液等。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。

作为氮源，可以例举氨、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机盐、玉米浸液、酪蛋白、酵母抽提物、蛋白胨等含氮有机物等。它们可以单独使用1种，也可以并用2种以上。

此外，还可以在培养基中添加过磷酸石灰、磷酸铵等磷酸成分、氯化钾、氢氧化钾等钾成分、硫酸镁、氯化镁等镁成分、锌、铜、锰、铁离子等无机盐、维生素等。

-培养-

所述增殖步骤中的所述酵母的培养形式没有特别限制，能够适当选择一般的酵母的培养形式，例如可以例举分批培养、补料分批培养、连续培养等。其中，从以工业规模进行生产的观点出发，优选补料分批培养、连续培养。

所述增殖步骤中的所述酵母的培养条件没有特别限制，能够适当地选择一般的酵母的培养条件。

例如，温度优选20℃～40℃，更优选25℃～35℃。

pH优选3.5～7.5，更优选4.0～6.9。

此外，所述培养优选在有氧条件下进行，更优选在进行通气或搅拌的同时进行培养。所述通气的量和搅拌的条件没有特别限制，能够考虑培养的容量、时间、菌的初始浓度等而适当选择，例如通气能够在0.2V.V.M.(Volume per volume per minutes，通气比)～2V.V.M左右下进行，搅拌能够以50rpm～900rpm左右进行。

培养时间没有特别限制，能够根据目标酵母的量适当选择。

所述增殖步骤后的培养物中的酵母的量没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以例举以酵母干燥菌体重量计为0.5％～6％左右等。

所述酵母干燥菌体重量的测定方法没有特别限制，能够适当选择周知的方法。

＜浓郁滋味赋予物质生成步骤＞

所述浓郁滋味赋予物质生成步骤是如下步骤，即，在所述培养基中的异亮氨酸的含量小于0.2质量％时，在所述培养基中加入缬氨酸，培养所述酵母，而生成浓郁滋味赋予物质。

-加入缬氨酸时的培养基中的异亮氨酸的量-

关于在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中在培养基中加入缬氨酸时的培养基中的异亮氨酸的含量，只要小于0.2质量％则没有特别限制，能够根据目的适当选择，但优选0.05质量％以下，更优选0.02质量％以下，特别优选0.01质量％以下。

所述培养基中的异亮氨酸的量的测定方法没有特别限制，能够适当选择周知的方法，例如可以例举下文中说明的实施例的项目中所记载的方法等。

-加入缬氨酸时的培养基中的缬氨酸的量-

关于在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中在培养基中加入缬氨酸时的培养基中的缬氨酸的含量，没有特别限制，能够根据目的适当选择，但优选0.1质量％以下，更优选0.05质量％以下，特别优选0.01质量％以下。

所述培养基中的缬氨酸的量的测定方法没有特别限制，能够适当选择周知的方法，例如可以例举下文中说明的实施例的项目中所记载的方法等。

-加入培养基中的缬氨酸的量-

关于在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中加入培养基中的缬氨酸的量，只要能够生成所述浓郁滋味赋予物质，则没有特别限制，能够根据目的适当选择，以每次的量(质量)计，在酵母干燥菌体每单位重量中，优选0.5％以上，更优选1％以上，特别优选2.5％以上。当处于所述优选范围内时，能够使所述浓郁滋味赋予物质的生成量变得更多，从此方面来说较为有利。

关于所述加入培养基中的缬氨酸的量的上限值，只要不损害本发明的效果，则没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以例举：以每次的量计，在酵母干燥菌体每单位重量中为5％等。

在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中在培养基中加入缬氨酸的次数可以是1次，也可以是2次以上。

-加入培养基中的苏氨酸的量-

在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中，优选在培养基中进一步加入苏氨酸。

所述苏氨酸可以和所述缬氨酸在同一时期加入培养基中，也可以在不同时期加入培养基中，但从能够使所述浓郁滋味赋予物质的生成量变得更多的方面出发，优选和缬氨酸在同一时期加入。

关于在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中加入培养基中的苏氨酸的量，只要不损害本发明的效果，则没有特别限制，能够根据目的适当选择，以每次的量(质量)计，在酵母干燥菌体每单位重量中，优选0.5％以上，更优选1％以上，特别优选2.5％以上。当处于所述优选范围内时，能够使所述浓郁滋味赋予物质的生成量变得更多，从此方面来说较为有利。

关于所述加入培养基中的苏氨酸的量的上限值，只要不损害本发明的效果，则没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以例举：以每次的量计，在酵母干燥菌体每单位重量中为10％等。

在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中在培养基中加入苏氨酸的次数可以是1次，也可以是2次以上。

-培养基-

关于所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中所使用的培养基，除了所述异亮氨酸及缬氨酸、以及视需要加入的苏氨酸的量以外，还可以使用和所述增殖步骤中使用的培养基相同的培养基。

-培养-

所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中的所述酵母的培养形式、培养条件没有特别限制，能够适当选择一般的酵母的培养形式，例如能够和所述增殖步骤相同。

-浓郁滋味赋予物质-

关于在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中获得的酵母中的所述浓郁滋味赋予物质的含量，没有特别限制，能够根据目的适当选择，以γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly的合计量(质量)计，在酵母干燥菌体每单位重量中，优选0.3％以上，更优选0.6％以上，进一步优选1.0％以上，特别优选1.3％以上。

关于在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中获得的酵母中的所述浓郁滋味赋予物质的含量的上限值，只要不损害本发明的效果，则没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以例举：以γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly的合计量(质量)计，在酵母干燥菌体每单位重量中为5％等。

所述γ-Glu-Abu和所述γ-Glu-Abu-Gly的含量的比率没有特别限制，能够根据目的适当选择。

所述酵母中的浓郁滋味赋予物质的量的测定方法没有特别限制，能够适当选择周知的方法，例如可以例举下文中说明的实施例的项目中所记载的方法等。

另外，所述酵母还可以包含除了γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly以外的有助于赋予浓郁滋味的成分。

＜其它步骤＞

关于所述其它步骤，只要不损害本发明的效果，则没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可以例举制备所述增殖步骤中使用的酵母的预培养步骤等。

关于所述预培养步骤中的所述酵母的培养方法、培养条件及培养基，没有特别限制，能够根据目的适当选择一般情况下用于培养酵母等微生物的培养方法、培养条件及培养基。

在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中获得的酵母的培养物也可以进行干燥处理而制成所述浓郁滋味赋予物质的含量高的酵母干燥菌体。

所述干燥处理的方法没有特别限制，能够适当选择制备酵母干燥菌体时通常实施的方法，例如可以例举冷冻干燥法、喷雾干燥法、转筒干燥法等。

此外，所得的酵母干燥菌体也可以加工成粉末状。

根据本发明的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法，能够制造高程度地含有所述浓郁滋味赋予物质的酵母，还能够适用于以工业规模生产。

(含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的制造方法)

本发明的含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的制造方法是，由通过所述本发明的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法获得的含有浓郁滋味赋予物质的酵母制备酵母抽提物。

所述制备酵母抽提物的方法并没有特别限制，能够适当地选择一般的酵母抽提物的制备方法，例如可例举：自我分解法，即利用酵母菌体内本来就有的蛋白质分解酶等来使菌体溶解；酶分解法，即添加源自微生物或植物的酵素制剂来使酵母溶解；热水提取法，即通过在热水中浸渍一定时间来使菌体溶解；酸碱分解法，即添加各种酸或碱来使菌体溶解；冷冻融解法，即通过进行1次以上的冷冻和融解来使菌体破碎；以及物理破碎法，即通过物理刺激使菌体破碎；等。

所述物理刺激没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可例举超音波处理；高压下的均匀化；及通过与玻璃珠等固形物混合进行磨碎等。

-浓郁滋味赋予物质-

所述酵母抽提物中的所述浓郁滋味赋予物质的含量没有特别限制，能够根据目的适当选择，以γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly的合计量(质量)计，在酵母抽提物每单位干燥重量中，优选大于1％，更优选5％以上，特别优选10％以上。

关于所述酵母抽提物中的所述浓郁滋味赋予物质的含量的上限值，只要不损害本发明的效果，则没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如可例举：以γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly的合计量(质量)计，在酵母抽提物每单位干燥重量中为17％等。

所述γ-Glu-Abu和所述γ-Glu-Abu-Gly的含量的比率并没有特别限制，能够根据目的适当选择。

所述酵母抽提物中的浓郁滋味赋予物质的量的测定方法并没有特别限制，能够适当选择周知的方法，例如可例举和所述酵母中的浓郁滋味赋予物质的量的测定方法同样地进行测定的方法等。

另外，所述酵母抽提物也可以包含除了γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly以外的有助于赋予浓郁滋味的成分。

根据本发明的含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的制造方法，能够制造高程度地含有所述浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物，还能够适用于以工业规模生产。

通过本发明的制造方法获得的含有浓郁滋味赋予物质的酵母及含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的用途没有特别限制，能够根据目的适当选择，例如能够用于各种饮食品或补充品等。

实施例

以下，例举制备例及试验例，对本发明进行具体说明，但本发明不受这些制备例及试验例的任何限定。

(制备例1：酵母的制备)

以如下方式制备出酵母株，该酵母株被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性，且谷胱甘肽的生成能力得到增强，具有耐苏氨酸性。

＜母株(单倍体：a型)＞

作为被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的株，使用作为ILV2变异株的NCYC868株(a型)(从National Collection of Yeast Cultures取得)。

＜母株(单倍体：α型)＞

作为被改良为增强谷胱甘肽的生成能力的株，使用日本专利特开2011-160739号公报(日本专利第5667365号公报)中所记载的酿酒酵母ABYC1588株(保藏号为FERM BP-10924，是保藏在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(茨城县筑波市东1-1-1)的株，保藏日期为2007年10月19日)，通过常用方法而取得了单倍体(α型)。

＜挑选-1＞

通过常用方法将所述单倍体(a型)与所述单倍体(α型)接合，以如下方式来培养。

-预培养-

在5mL的YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose，酵母浸出粉胨葡萄糖)培养基中植菌1白金环的菌落，在30℃下培养了一夜后，将此时的培养液作为预培养液。

-主培养-

在200mL附带挡板的三角烧瓶中准备下述组成的糖蜜脲培养基，接种全部所述预培养液，并在30℃、搅拌转速为200rpm的条件下培养48小时。

--糖蜜脲培养基--

(Difco公司制造)

通过常用方法测定所述主培养后的酵母干燥菌体重量(以下有时称为“DCW”)。此外，按照Titze等人的方法(Analytical Biochemistry,Vol.27,p502,1969)测定所述主培养后的酵母中的总谷胱甘肽量(以下有时称为“GSH含量”)。

以所述测定所得的DCW和GSH含量作为指标，挑选出多个优异的2倍体株。

＜挑选-2＞

对所述＜挑选-1＞中挑选出的2倍体株进行四分体(Tetrad)分离。将分离出的菌涂抹在以下的培养基上，单离出仅在(iv)含有异亮氨酸及缬氨酸的SD(SyntheticDropout，酵母选择营养缺陷型)培养基中生长的株(同时需异亮氨酸及缬氨酸性的株)。

-培养基-

(i)SD培养基

(ii)含有0.01质量％异亮氨酸的SD培养基

(iii)含有0.01质量％缬氨酸的SD培养基

(iv)含有0.01质量％异亮氨酸及0.01质量％缬氨酸的SD培养基

对于所述单离出的株，和所述＜挑选-1＞中所记载的培养同样地进行预培养及主培养。

通过常用方法来测定所述培养后的酵母干燥菌体重量。此外，以如下方式测定所述培养后的酵母中的作为浓郁滋味赋予物质的γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly、以及作为浓郁滋味赋予物质前驱物的Abu的含量。

-浓郁滋味赋予物质等的测定-

使用6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(AQC)对肽进行荧光衍生化，并利用LC-MS/MS(liquid chromatography tandem mass spectrometry，液相色谱-串联质谱法)进行检测，由此进行浓郁滋味赋予物质等的测定。

具体来说，在稀释到适当浓度的样品2.5μL或包含1μM的Abu、γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly的标准溶液2.5μL中，添加MillQ水2.5μL、5μM内部标准物质溶液(3-methyl-His-d2(西格玛(Sigma)公司)、Gly-d2(西格玛公司)；均被稳定同位素标记)5μL、硼酸缓冲液(日本Waters公司制造的AccQ-Fluor(注册商标)试剂盒附带品)30μL。

在所述混合物中添加AQC试剂溶液(通过使所述试剂盒的试剂粉末溶解在1mL乙腈中而制备)10μL。在55℃下加热所得的混合物10分钟，其后加入0.1％的甲酸水溶液100μL，制成分析样品。

其次，利用下述反相的液相色谱仪分离出如上所述制备的分析样品后，导入质量分析装置中。分离条件设置如下。

--分离条件--

(1)HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱仪)：Agilent 1200系列

(2)分离管柱：Unison UK-Phenyl(内径2.0mm，长度100mm，粒径3μm(Imtakt公司制造))

(3)管柱温度：40℃

(4)流动相A：用氨水将25mM甲酸水溶液调整成pH6.0的水溶液

(5)流动相B：甲醇

(6)流速：0.25mL/min

(7)溶出条件：溶出是使用流动相A与流动相B的混合液来进行。流动相B相对于混合液的比率如下。0分钟(5％)、0分钟～17分钟(5％～40％)、17分钟～17.1分钟(40％～80％)、17.1分钟～19分钟(80％)、19分钟～19.1分钟(80％～5％)、19.1分钟～27分钟(5％)。

其后，将根据所述分离条件溶出的Abu、γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly的衍生化物导入质量分析计，并通过质量色谱图来进行定量。分析条件设置如下。

--分析条件--

(1)质量分析装置：AB Sciex API3200 QTRAP

(2)检测模式：Selected Ion Monitoring(正离子模式)

(3)选择离子：参照下述表1

[表1]

Abu、γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly的衍生化物的定量是使用解析软件Analystver 1.4.2(AB Sciex)来进行。关于用来进行定量的内部标准物质，在Abu的衍生化物的情况下，使用3-methyl-His-d2的衍生化物，在γ-Glu-Abu或γ-Glu-Abu-Gly的衍生化物的情况下，使用Gly-d2的衍生化物。

另外，在定量γ-Glu-Abu时，在极少数情况下因样品而出现夹杂峰，在此情况，作为第2质量分析器的选择离子，使用145.2或104.1而进行定量。

以所述测定所得的浓郁滋味赋予物质的含量和酵母干燥菌体重量作为指标，挑选出优异的单倍体株。

＜2倍体的获取＞

对于所述＜挑选-2＞中获得的单倍体的株，筛选为a型和α型，并通过常用方法实施交配，从而获取多个2倍体株。

＜挑选-3＞

对于所述＜2倍体的获取＞中得到的株，使用烧瓶或广口保温瓶，以如下方式来实施补料分批培养。

-培养(烧瓶)-

和所述＜挑选-1＞中记载的培养同样地进行预培养及主培养。

-培养(广口保温瓶)-

--预培养--

制作2个3,000mL容量的下述组成的培养基(Marubishi Bioengineering小型发酵罐)。所述培养基在混合后，利用高压蒸气灭菌器在121℃下灭菌15分钟。

[培养基]

在所述组成的预培养用培养基中植菌1白金环的在YPD平板培养基中生长的所述＜2倍体的获取＞中获得的株，并在以下培养条件下培养。

培养结束后，通过离心分离(3,000g×5分钟)回收全部菌体，利用等量的杀菌水清洗菌体。其后，再次进行离心分离，回收菌体，使菌体在杀菌水中悬浮，并进行调整以使固形物成分浓度成为10质量％～20质量％，将所得的液体作为预培养菌体液。

[培养条件]

·培养温度：30℃

·振荡：400rpm

·培养时间：24小时

·通气量：3L/min(1V.V.M.)

--主培养--

使用下述组成的培养基，并在下述培养条件下通过补料分批培养来培养所述株。

[培养基]

[培养条件]

·培养温度：30℃

·培养条件：18小时

·pH：利用25％苛性钠或47％硫酸进行控制，以使pH的下限成为5.5，上限成为6.7。

·搅拌：600rpm～800rpm

·补料分批培养基：糖蜜(糖度36％) 870mL～1,000mL

氨水(10％) 100mL～200mL

磷酸(85％) 5g～20g

通过常用方法来测定所述主培养后的酵母干燥菌体重量。此外，和所述＜挑选-2＞的项目中所记载的方法同样地测定所述主培养后的酵母中的浓郁滋味赋予物质的含量。

以所述测定所得的浓郁滋味赋予物质的含量和酵母干燥菌体重量作为指标，挑选出优异的2倍体株(以下有时称为“K16株”)。

所述K16株被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低，并为需异亮氨酸及缬氨酸性，且谷胱甘肽的生成能力得到增强。

＜挑选-4＞

将所述＜挑选-3＞中获得的K16株涂抹在向YPD培养基中添加2质量％苏氨酸而成的培养基上，在30℃下进行培养，获取2个生长的菌落(以下有时称为“K16-1株”、“K16-2株”)。

对于所述各菌落，和所述＜挑选-1＞中所记载的培养同样地进行预培养及主培养。

通过常用方法测定所述主培养后的酵母干燥菌体重量。此外，和所述＜挑选-2＞的项目中所记载的方法同样地测定所述主培养后的酵母中的浓郁滋味赋予物质等的含量。

结果，关于酵母干燥菌体每单位重量中的浓郁滋味赋予物质含量，γ-Glu-Abu在K16-1株中为0.43％，在K16-2株中为0.52％，γ-Glu-Abu-Gly在K16-1株中为0.46％，在K16-2株中为0.70％。另外，关于酵母干燥菌体每单位重量中的Abu的含量，在K16-1株及K16-2株中均为0.53％。

另外，所述＜挑选-3＞中获得的K16株也同样地进行培养，对酵母干燥菌体重量及浓郁滋味赋予物质等的含量进行测定，结果，关于酵母干燥菌体每单位重量中的浓郁滋味赋予物质的含量，γ-Glu-Abu为0.08％，γ-Glu-Abu-Gly为0.10％。此外，酵母干燥菌体每单位重量中的Abu的含量为0.06％。

由以上结果可知，通过对酵母赋予耐苏氨酸性，浓郁滋味赋予物质的含量提高，此外，浓郁滋味赋予物质前驱物的含量也提高。

(试验例1)

使用所述制备例1中获得的K16-2株，并在下述＜试验例1-1＞及＜试验例1-2＞的项目中所记载的条件下进行培养，除此以外，和所述制备例1的＜挑选-3＞中使用广口保温品的情况同样地进行预培养及主培养。

＜试验例1-1＞

在所述主培养中，在开始培养7小时后，在培养基中添加1,000ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为2.9％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为118ppm(0.0118质量％)，缬氨酸的含量为363ppm(0.0363质量％)。此外，即将添加所述缬氨酸之前的培养基中的酵母的量在酵母干燥菌体重量中为3.45％。

＜试验例1-2＞

在所述主培养中，在开始培养6小时后，在培养基中添加2,000ppm的异亮氨酸，此外，在7小时后，在培养基中添加1,000ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为2.9％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为1,973ppm(0.1973质量％)，缬氨酸的含量为899ppm(0.0899质量％)。此外，即将添加所述缬氨酸之前的培养基中的酵母的量在酵母干燥菌体重量中为3.36％。

＜测定＞

-培养上清液中的异亮氨酸及缬氨酸的含量的测定-

以如下方式测定所述主培养开始时、4小时后、6小时后、7小时后、8小时后、9小时后、10小时后、12小时后、14小时后及16小时后的培养上清液中的异亮氨酸及缬氨酸的含量。

将结果表示在图1A(异亮氨酸)、图1B(缬氨酸)中。另外，在图1A～1B中，“●、实线”表示试验例1-1的结果，“□、虚线”表示试验例1-2的结果。

--异亮氨酸及缬氨酸的含量的测定--

关于缬氨酸及异亮氨酸的含量，使用Waters公司(美国)制造的“Acquity UPLC”分析装置，通过AccQ-Tag Ultra(AccQ-Tag Ultra)标记化法来测定。

-酵母干燥菌体重量的测定-

通过常用方法测定所述主培养开始时、2小时后、4小时后、6小时后、7小时后、8小时后、9小时后、10小时后、11小时后、12小时后、13小时后、14小时后、16小时后及18小时后的酵母干燥菌体重量(以下有时称为“DCW”)。

将结果表示在图1C中。另外，在图1C中，“●、实线”表示试验例1-1的结果，“□、虚线”表示试验例1-2的结果。

-浓郁滋味赋予物质等的测定-

在所述主培养开始6小时后、7小时后、8小时后、9小时后、10小时后、11小时后、12小时后、13小时后、14小时后及16小时后回收酵母，和所述(制备例1)的＜挑选-2＞的项目中所记载的方法同样地测定作为浓郁滋味赋予物质的γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly、以及作为浓郁滋味赋予物质前驱物的Abu在酵母中的含量(在酵母干燥菌体每单位重量中的量)。

将结果表示在图1D(γ-Glu-Abu)、图1E(γ-Glu-Abu-Gly)及图1F(Abu)中。另外，在图1D～1F中，“●、实线”表示试验例1-1的结果，“□、虚线”表示试验例1-2的结果。

如图1A～1F所示，在所述主培养中，在当培养上清液中的异亮氨酸的含量小于0.2质量％时添加缬氨酸而培养酵母的试验例1-1中，生成了作为浓郁滋味赋予物质的γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly，此外，还确认到生成了作为浓郁滋味赋予物质前驱物的Abu。另一方面，在当培养上清液中的异亮氨酸的含量为0.2质量％时添加缬氨酸而培养酵母的试验例1-1中，浓郁滋味赋予物质及其前驱物的生成是非常少的。

因此确认到，通过本发明的方法，能够显著地提高浓郁滋味赋予物质的生成量。

(试验例2)

使用所述制备例1中获得的K16-2株，并在下述＜试验例2-1＞～＜试验例2-3＞的项目中所记载的条件下进行培养，除此以外，和所述制备例1的＜挑选-3＞中使用广口保温瓶的情况同样地进行预培养及主培养。

＜试验例2-1＞

在所述主培养中，在开始培养6小时后，在培养基中添加1,000ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为3.3％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为361ppm(0.0361质量％)，缬氨酸的含量为911ppm(0.0911质量％)。此外，即将添加所述缬氨酸之前的培养基中的酵母的量在酵母干燥菌体重量中为2.98％。

＜试验例2-2＞

在所述主培养中，在开始培养7小时后，在培养基中添加1,000ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为2.9％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为118ppm(0.0118质量％)，缬氨酸的含量为363ppm(0.0363质量％)。此外，即将添加所述缬氨酸之前的培养基中的酵母的量在酵母干燥菌体重量中为3.45％。

＜试验例2-3＞

在所述主培养中，在开始培养8小时后，在培养基中添加1,000ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为2.5％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为14.9ppm(0.00149质量％)，缬氨酸的含量为18.6ppm(0.00186质量％)。此外，即将添加所述缬氨酸之前的培养基中的酵母的量在酵母干燥菌体重量中为4.01％。

＜测定＞

-培养上清液中的异亮氨酸及缬氨酸的含量的测定-

和所述试验例1同样地测定所述主培养开始时、4小时后、6小时后、7小时后、8小时后、9小时后、10小时后、12小时后、14小时后及16小时后的培养上清液中的异亮氨酸及缬氨酸的含量。

将结果表示在图2A(异亮氨酸)、图2B(缬氨酸)中。另外，在图2A～2B中，“△、实线”表示试验例2-1的结果，“●、实线”表示试验例2-2的结果，“◇、实线”表示试验例2-3的结果。

-酵母干燥菌体重量的测定-

和所述试验例1同样地测定所述主培养开始时、2小时后、4小时后、6小时后、7小时后、8小时后、9小时后、10小时后、11小时后、12小时后、13小时后、14小时后、16小时后及18小时后的酵母干燥菌体重量。

将结果表示在图2C中。另外，在图2C中，“△、实线”表示试验例2-1的结果，“●、实线”表示试验例2-2的结果，“◇、实线”表示试验例2-3的结果。

-浓郁滋味赋予物质等的测定-

在所述主培养开始6小时后、7小时后、8小时后、9小时后、10小时后、11小时后、12小时后、13小时后、14小时后及16小时后回收酵母，和所述(制备例1)的＜挑选-2＞的项目中所记载的方法同样地测定作为浓郁滋味赋予物质的γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly、以及作为浓郁滋味赋予物质前驱物的Abu在酵母中的含量(在酵母干燥菌体每单位重量中的量)。

将结果表示在图2D(γ-Glu-Abu)、图2E(γ-Glu-Abu-Gly)及图2F(Abu)中。另外，在图2D～2F中，“△、实线”表示试验例2-1的结果，“●、实线”表示试验例2-2的结果，“◇、实线”表示试验例2-3的结果。

如图2A～2F所示，在所述主培养中添加缬氨酸时的培养上清液中的异亮氨酸及缬氨酸的含量越少，所生成的浓郁滋味赋予物质及其前驱物越多。

(试验例3)

使用所述制备例1中获得的K16-2株，并在下述＜试验例3-1＞及＜试验例3-2＞的项目中所记载的条件下进行培养，除此以外，和所述制备例1的＜挑选-3＞中使用广口保温瓶的情况同样地进行预培养及主培养。

＜试验例3-1＞

在所述主培养中，在开始培养8小时后，在培养基中添加1,000ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为2.5％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为14.9ppm(0.00149质量％)，缬氨酸的含量为18.6ppm(0.00186质量％)。此外，即将添加所述缬氨酸之前的培养基中的酵母的量在酵母干燥菌体重量中为4.01％。

＜试验例3-2＞

在所述主培养中，在开始培养8小时后，在培养基中添加1,000ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为2.6％)及2,000ppm的苏氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为5.2％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸及苏氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为14.5ppm(0.00145质量％)，缬氨酸的含量为18.3ppm(0.00183质量％)。此外，即将添加所述缬氨酸之前的培养基中的酵母的量在酵母干燥菌体重量中为3.86％。

＜测定＞

-培养上清液中的异亮氨酸及缬氨酸的含量的测定-

和所述试验例1同样地测定所述主培养开始时、4小时后、6小时后、7小时后、8小时后、9小时后、10小时后、12小时后、14小时后及16小时后的培养上清液中的异亮氨酸及缬氨酸的含量。

将结果表示在图3A(异亮氨酸)、图3B(缬氨酸)中。另外，在图3A～3B中，“◇、实线”表示试验例3-1的结果，“●、单点划线”表示试验例3-2的结果。

-酵母干燥菌体重量的测定-

和所述试验例1同样地测定所述主培养开始时、2小时后、4小时后、6小时后、7小时后、8小时后、9小时后、10小时后、11小时后、12小时后、13小时后、14小时后、16小时后及18小时后的酵母干燥菌体重量。

将结果表示在图3C中。另外，在图3C中，“◇、实线”表示试验例3-1的结果，“●、单点划线”表示试验例3-2的结果。

-浓郁滋味赋予物质等的测定-

在所述主培养开始6小时后、7小时后、8小时后、9小时后、10小时后、11小时后、12小时后、13小时后、14小时后及16小时后回收酵母，和所述(制备例1)的＜挑选-2＞的项目中所记载的方法同样地测定作为浓郁滋味赋予物质的γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly、以及作为浓郁滋味赋予物质前驱物的Abu在酵母中的含量(在酵母干燥菌体每单位重量中的量)。

将结果表示在图3D(γ-Glu-Abu)、图3E(γ-Glu-Abu-Gly)及图3F(Abu)中。另外，在图3D～3F中，“◇、实线”表示试验例3-1的结果，“●、单点划线”表示试验例3-2的结果。

如图3A～3F所示，在所述主培养中在添加缬氨酸时还加入苏氨酸，由此生成了更多的浓郁滋味赋予物质及其前驱物。

(试验例4)

将所述试验例3-2的培养条件下的主培养的培养时间变更为在添加了缬氨酸及苏氨酸之后还培养12小时，除此以外，以相同方式进行培养，使用其后所得的培养物(也就是主培养开始20小时后的培养物)，以如下方式制备酵母抽提物。

首先，通过对所述培养物进行离心分离处理，将培养物中含有的酵母以沉淀的形式回收，用蒸留水清洗。其后，加入适量的蒸留水以使菌体浓度成为10重量％～15重量％，制作酵母悬浮液。在85℃下加热所述酵母悬浮液70秒钟，其后快速冷却，进行离心分离，由此回收抽提物部分。对回收的抽提物部分进行干燥，制得酵母抽提物。

＜＜测定＞＞

-浓郁滋味赋予物质的测定-

和所述(制备例1)的＜挑选-2＞的项目中所记载的方法同样地测定所述酵母抽提物中的作为浓郁滋味赋予物质的γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly的含量(在酵母抽提物每单位干燥重量中的量)。结果，γ-Glu-Abu在酵母抽提物每单位干燥重量中的含量为9.40％，γ-Glu-Abu-Gly在酵母抽提物每单位干燥重量中的含量为1.13％。因此确认到，通过本发明的方法，能够制造浓郁滋味赋予物质在酵母抽提物每单位干燥重量中的含量大于10％的酵母抽提物。

(试验例5)

使用所述制备例1中获得的K16-2株，并在下述＜试验例5-1＞～＜试验例5-5＞的项目中所记载的条件下进行培养，除此以外，和所述制备例1的＜挑选-3＞中使用广口保温瓶的情况同样地进行预培养及主培养。

＜试验例5-1＞

在所述主培养中，不添加缬氨酸及苏氨酸而继续进行主培养(对照)。

＜试验例5-2＞

在所述主培养中，在开始培养7.5小时后，在培养基中添加500ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为1.5％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为12.3ppm(0.00123质量％)，缬氨酸的含量为16.0ppm(0.00160质量％)。

＜试验例5-3＞

在所述主培养中，在开始培养7.5小时后，在培养基中添加1,000ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为3.0％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为0ppm，缬氨酸的含量为0ppm。

＜试验例5-4＞

在所述主培养中，在开始培养7.5小时后，在培养基中添加1,500ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为4.5％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为0ppm，缬氨酸的含量为0ppm。

＜试验例5-5＞

在所述主培养中，在开始培养7.5小时后，在培养基中添加1,000ppm的缬氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为3.0％)及1,000ppm的苏氨酸(在酵母干燥菌体每单位重量中为3.0％)，继续进行主培养。

另外，即将添加所述缬氨酸及苏氨酸之前的培养上清液中的异亮氨酸的含量为0ppm，缬氨酸的含量为7.5ppm(0.00075质量％)。

＜测定＞

-培养上清液中的异亮氨酸及缬氨酸的含量的测定-

和所述试验例1同样地测定所述主培养开始时、2小时后、4小时后、6小时后、7.5小时后、8小时后、9小时后、10小时后、12小时后及14小时后的培养上清液中的异亮氨酸及缬氨酸的含量。

将结果表示在图4A及图4G(异亮氨酸)、图4B及图4H(缬氨酸)中。另外，在图4A、4B、4G、4H中，“△、虚线”表示试验例5-1的结果，“〇、实线”表示试验例5-2的结果，“■、单点划线”表示试验例5-3的结果，“□、实线”表示试验例5-4的结果，“◇、单点划线”表示试验例5-5的结果。

-酵母干燥菌体重量的测定-

和所述试验例1同样地测定所述主培养开始时、2小时后、4小时后、6小时后、8小时后、9小时后、10小时后、11小时后、12小时后及14小时后的酵母干燥菌体重量。

将结果表示在图4C及图4I中。另外，在图4C及图4I中，“△、虚线”表示试验例5-1的结果，“〇、实线”表示试验例5-2的结果，“■、单点划线”表示试验例5-3的结果，“□、实线”表示试验例5-4的结果，“◇、单点划线”表示试验例5-5的结果。

-浓郁滋味赋予物质等的测定-

在所述主培养开始8小时后、9小时后、10小时后、11小时后、12小时后及14小时后回收酵母，和所述(制备例1)的＜挑选-2＞的项目中所记载的方法同样地测定作为浓郁滋味赋予物质的γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly、以及作为浓郁滋味赋予物质前驱物的Abu在酵母中的含量(在酵母干燥菌体每单位重量中的量)。

将结果表示在图4D及图4J(γ-Glu-Abu)、图4E及图4K(γ-Glu-Abu-Gly)以及图4F及图4L(Abu)中。另外，在图4D、4E、4F、4J、4K、4L中，“△、虚线”表示试验例5-1的结果，“〇、实线”表示试验例5-2的结果，“■、单点划线”表示试验例5-3的结果，“□、实线”表示试验例5-4的结果，“◇、单点划线”表示试验例5-5的结果。

如图4A～4L所示，通过增加在所述主培养中添加的缬氨酸的量，生成了更多的浓郁滋味赋予物质及其前驱物。此外，在本试验例中还确认到，通过在添加缬氨酸时也加入苏氨酸，会生成更多的浓郁滋味赋予物质及其前驱物。

作为本发明的形态，例如可例举以下形态等。

＜1＞一种含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法，其特征在于包括：

酵母增殖步骤，该步骤中，将被改良为使细胞内的乙酰乳酸合酶活性降低并为需异亮氨酸及缬氨酸性的酵母在含有异亮氨酸及缬氨酸的培养基中进行培养，以使所述酵母增殖；及

浓郁滋味赋予物质生成步骤，该步骤中，在所述培养基中的异亮氨酸的含量小于0.2质量％时，在所述培养基中加入缬氨酸，培养所述酵母，而生成浓郁滋味赋予物质；

所述浓郁滋味赋予物质是γ-Glu-Abu及γ-Glu-Abu-Gly中的至少任一种。

＜2＞根据所述＜1＞所述的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法，其特征在于：所述酵母为被改良为增强谷胱甘肽的生成能力的酵母。

＜3＞根据所述＜1＞至＜2＞中任一项所述的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法，其特征在于：在所述浓郁滋味赋予物质生成步骤中，在所述培养基中进一步加入苏氨酸。

＜4＞根据所述＜1＞至＜3＞中任一项所述的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法，其特征在于：所述含有浓郁滋味赋予物质的酵母中的浓郁滋味赋予物质的含量在酵母干燥菌体每单位重量中为0.3％以上。

＜5＞一种含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的制造方法，其特征在于：由含有浓郁滋味赋予物质的酵母制备酵母抽提物，所述含有浓郁滋味赋予物质的酵母是通过所述＜1＞至＜4＞中任一项所述的含有浓郁滋味赋予物质的酵母的制造方法获得的。

＜6＞根据所述＜5＞所述的含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物的制造方法，其特征在于：所述含有浓郁滋味赋予物质的酵母抽提物中的浓郁滋味赋予物质在酵母抽提物每单位干燥重量中大于1％。