胆红素氧化酶的活性改善方法和胆红素氧化酶制品

摘要

提供能够改善胆红素氧化酶(BOD)的活性的方法。本发明的一个实施方式涉及的BOD的活性改善方法是将包含BOD和特定的活性改善剂的BOD溶液放置在脱氧气氛下的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及改善胆红素氧化酶的活性的方法(以下称为“活性改善方法”)。另外，本发明涉及用于改善胆红素氧化酶的活性的胆红素氧化酶制品。另外，本发明涉及高活性型胆红素氧化酶的制造方法。

背景技术

胆红素氧化酶(以下也酌情简称为“BOD”)是催化将胆红素氧化为胆绿素的反应的酶。BOD例如在临床检查的领域中用于测定生物样本中的胆红素的浓度。另外，BOD具有将吲哚类似体氧化的性质，因此期待着在染发剂中的应用。

现在商业上供给的BOD制品除了BOD以外，包含(a)对酶反应给予适宜的pH的缓冲剂以及根据需要使用的(b)(b-1)表面活性剂等控制反应条件的成分和(b-2)糖类和/或非活性蛋白质等一般的赋形剂等。现在商业上供给的BOD制品除了BOD以外，在将上述的成分一起冻结干燥的状态下流通。干燥状态的BOD在使用时溶解于包含表面活性剂和/或缓冲剂的规定的溶剂中而使用。在制品中所含的BOD在干燥状态下比较稳定，但存在着在一旦溶解的溶液状态下容易失活的问题。例如，将市售的BOD试剂在Tris-H

另外，干燥状态的BOD在每次使用时需要将必要量溶解的操作，因此也具有使用时的工序数的增加以及使用时BOD的粉体飞散引起的对作业者的BOD的暴露等问题。另外，BOD制品从流通成本的观点出发，优选在常温下流通。

鉴于上述的实际情况，研究了稳定地保存BOD制品(特别是溶液状态)的BOD的方法。例如，在专利文献1中公开了使用了还原剂(硫代硫酸钠)的BOD的稳定化方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平10-42869号公报(1998年2月17日公开)

发明内容

发明要解决的课题

如上所述，BOD是期待其在产业上大幅利用的酶。本发明人独自设定简便地使BOD的活性改善的技术课题，研究了其解决手段。即，本发明的一个实施方式涉及的目的在于提供能够改善BOD的活性的手段。具体地，本发明的一个实施方式提供使BOD的活性改善的方法、能够改善BOD的活性的BOD制品和高活性型胆红素氧化酶的制造方法。

再有，专利文献1中记载的技术为用于解决稳定地保存BOD的技术课题的技术，并不是用于解决使BOD的活性改善的技术课题的发明。

用于解决课题的手段

本发明人为了解决上述课题而深入研究，结果发现：通过将包含BOD和特定的物质(后述的“活性改善剂”)的BOD溶液放置在脱氧气氛下，从而可解决上述课题，完成了本发明。

即，本发明的一个实施方式为胆红素氧化酶的活性改善方法，其特征在于，将包含胆红素氧化酶和活性改善剂的胆红素氧化酶溶液在脱氧气氛下放置，其中，所述活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

另外，本发明的另一实施方式为胆红素氧化酶制品，其特征在于，在容器内包含胆红素氧化酶和活性改善剂，所述容器内为脱氧气氛，所述活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

另外，本发明的另一实施方式为高活性型胆红素氧化酶的制造方法，其特征在于，包括如下工序：将包含胆红素氧化酶和活性改善剂的胆红素氧化酶溶液放置在脱氧气氛下，其中，所述活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

发明的效果

根据本发明的一个实施方式，获得能够改善BOD的活性的效果。

附图说明

图1为表示将本发明的一个实施方式涉及的未添加活性改善剂的BOD溶液、或者本发明的一个实施方式涉及的包含活性改善剂的BOD溶液在特定的温度环境下放置一定期间时的BOD的活性的变化的坐标图。

图2为表示本发明的一个实施方式涉及的活性改善剂或对比物质产生的ABTS初始吸光度(A

图3为表示本发明的一个实施方式涉及的活性改善剂或对比物质产生的DMBQ初始吸光度(A

具体实施方式

以下对于本发明的一个实施方式进行说明，但本发明并不限定于此。本发明并不限定于以下说明的各构成，可在权利要求中所示的范围内进行各种变形。即，对于将不同的实施方式或实施例中各自公开的技术手段组合而得到的实施方式或实施例，也包含在本发明的技术范围内。进而，通过将各实施方式中各自公开的技术手段组合，从而能够形成新的技术特征。另外，在本说明书中记载的全部专利文献在本说明书中作为参考文献援引。另外，只要本说明书中没有特别说明，表示数值范围的“A～B”意指“A以上(包含A且比A大)且B以下(包含B且比B小)”。

在本说明书中，也有时将本发明的一个实施方式涉及的X(X为任意的固有名词，例如活性改善方法、酶溶液、BOD、活性改善剂、高活性型BOD的制造方法等)简称为“本X”。

[1.本发明的一个实施方式的技术思想]

本发明人对于改善BOD的酶活性的方法进行了深入研究。其结果，本发明人令人惊奇地发现如下的新认识：通过使用ABTS初始吸光度(A

[2.活性改善方法]

本活性改善方法是将包含BOD和活性改善剂的BOD溶液放置在脱氧气氛下的方法。其中，上述活性改善剂是ABTS初始吸光度(A

本活性改善方法通过利用上述活性改善剂，从而具有能够简便地改善BOD的活性的优点。

本说明书中只要没有特别说明，则“BOD溶液”意指至少包含BOD和活性改善剂的溶液。再有，在BOD溶液中可包含除BOD和活性改善剂以外的物质。

在本说明书中，“改善BOD的活性”是指，与包含BOD和活性改善剂的BOD溶液在脱氧气氛下放置之前的BOD活性相比、包含BOD和活性改善剂的BOD溶液在脱氧气氛下放置后的BOD活性改善。

再有，BOD的活性多用相对于该BOD的质量的活性(活性/质量)表示，因此，也有时将活性称为“比活性”。即，也将活性改善方法称为比活性改善方法，也将活性改善剂称为比活性改善剂。

比活性能够如下所述算出。用只包含BOD的BOD溶液在波长280nm下的吸光度(A

对于本活性改善方法而言，越大幅地改善BOD的活性越优选。在本活性改善方法中，在将BOD放置前的BOD的活性设为100％时，与放置BOD前相比，优选使BOD的活性改善105％以上，更优选改善120％以上，进一步优选改善150％以上，特别优选改善200％以上。

在本活性改善方法中，对放置包含BOD和活性改善剂的BOD溶液的期间并无特别限定，至少放置到BOD的活性改善即可。在本活性改善方法中，从生产效率的观点出发，为了改善BOD的活性所需的、BOD溶液的放置期间越短越优选。在本活性改善方法中，BOD溶液的放置期间优选例如为50天以下，优选为40天以下，优选为30天以下。

在本活性改善方法中，对放置BOD溶液的温度并无特别限定，只要为至少改善BOD的活性的温度即可。在本活性改善方法中，从生产效率的观点出发，优选将BOD溶液放置在10℃以上的温度环境下。在本活性改善方法中，优选放置BOD溶液的温度例如为30℃以上，优选为40℃以上，优选为50℃以上。如果为上述构成，则具有如下优点：能够进一步改善BOD的活性，并且能够用短期改善BOD的活性。在本活性改善方法中，放置BOD溶液的温度的上限优选为BOD不失活的温度，例如优选在60℃以下的温度环境下放置BOD溶液。

本说明书中，BOD的活性简洁地如下所述评价。对于包含ABTS基质的溶液添加了BOD后，使得到的溶液在37℃下反应。该反应中，通过历时测定该溶液在波长436nm处的吸光度的增加量，从而评价BOD的活性。在后述的试验例中说明BOD的活性的具体的测定方法和评价方法。

(2-1)BOD

作为可应用本活性改善方法的BOD，能够列举出(1)由任意的生物得到的、公知的全部BOD(非重组BOD)；(2)使将来自任意的生物的BOD编码的基因能够在任意的生物体内或试管内显现而得到的重组BOD；(3)通过来自任意的生物的BOD的氨基酸序列的置换、插入和缺失等变异而得到的变异BOD；以及(4)以BOD的稳定化和BOD的酶活性的改善为目的的、用任意的载体修饰的BOD等。作为上述生物，例如可列举出漆斑菌属(例如疣孢漆斑菌)、微紫青霉(Penicillium janthinellum)、地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis))、谷氨酸棒状杆菌、大肠埃希菌、双胞蘑(Agaricus bisporus)、裂褶菌属、灵芝科、菊科植物、紫花苜蓿、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母和曲霉属等，但并不限定于这些。另外，成为将BOD编码的基因的来源的生物与为了得到BOD而引入该基因并使其显现的生物可以相同也可不同。

BOD可以是(1)由漆斑菌属得到的BOD(非重组BOD)，也可以是(2)通过来自漆斑菌属的BOD的氨基酸序列的置换、插入和缺失等变异而得到的变异BOD，还可以是(3)使编码来自漆斑菌属的BOD的基因在任意的生物体内或试管内显现而得到的重组BOD，还可以是(4)对编码属于漆斑菌属的BOD的基因根据任意的生物的基因序列进行了密码子的最优化后引入该生物而在该生物体内显现得到的重组BOD。例如，重组BOD可以是(1)将编码来自任意的生物的BOD的基因引入曲霉属、在曲霉属显现而得到的BOD，也可以是(2)对编码来自任意的生物的BOD的基因根据曲霉属的基因序列进行了密码子的最优化后引入曲霉属、在曲霉属显现而得到的BOD。更具体地，重组BOD优选为(1)将编码来自漆斑菌属的BOD的基因引入曲霉属、在曲霉属显现而得到的BOD，更优选为(2)对编码来自漆斑菌属的BOD的基因根据曲霉属的基因序列进行了密码子的最优化后引入曲霉属、在曲霉属显现得到的BOD。

对本活性改善方法中使用的BOD的浓度并无特别限定，可根据该BOD的用途适当地设定。

(2-2)活性改善剂

本活性改善剂是通过与BOD一起在脱氧气氛下放置从而能够使BOD的活性改善的物质，也可称为活性改善助剂。本活性改善剂只要是ABTS初始吸光度(A

作为本活性改善剂，优选为选自天然来源的、无机盐类、有机化合物、碳水化合物、氨基酸、维生素、脂肪酸、脂质、蛋白质和肽等中的至少一种以上的物质。另外，本活性改善剂可以是上述的组中列举的物质的任意的组合。

作为这样的活性改善剂，并无特别限定，例如可列举出选自(a)亚硫酸钠、尿酸、乙醛酸、N-乙酰基-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸盐酸盐、L-抗坏血酸、生育酚、生育酚衍生物、Trolox等无机物、和(b)蛋白胨类(酪蛋白蛋白胨、兽肉蛋白胨、心肌蛋白胨、明胶蛋白胨和大豆蛋白胨等)、提取物类(肉提取物、鱼提取物、植物提取物、麦芽提取物和酵母提取物)、寡聚肽、谷胱甘肽(还原型)、玉米浸液、大豆粉、小麦麸等有机物中的至少一个以上的物质。

作为上述无机物，例如能够使用从和光纯药株式会社等获得的无机物。另外，作为上述有机物，例如可列举出选自极东制药工业株式会社制麦芽提取物、极东制药工业株式会社制鱼粉末提取物、极东制药工业株式会社制粉末酵母提取物、极东制药工业株式会社制极东蛋白胨、极东制药工业株式会社制蛋白胨A、极东制药工业株式会社制パティケース、极东制药工业株式会社制马铃薯蛋白胨CP、Asahi Group Foods,Ltd.制的酵母提取物(例如Meast P1G和イーストックS-Pd)、オリエンタル酵母工业株式会社制造的玉米浸液(也简称为“CSL”)、日本制药株式会社制造的多聚蛋白胨、不二制油株式会社制造的作为大豆寡聚肽的ハイニュートAM、昭和产业株式会社制造的大豆粉88、日本BD株式会社制造的Tryptone和日本BD株式会社制酵母提取物等中的至少一个以上的物质，但并不限定于这些。在本活性改善剂为选自上述组中的至少一个的情况下，本活性改善方法能够进一步改善BOD的活性。本说明书中列举的各种的活性改善剂可单独使用1种，也可将多种组合使用。

另外，在本活性改善方法中，BOD溶液中所含的活性改善剂的最佳的浓度可根据BOD溶液中的BOD的浓度、活性改善剂的种类等变动。因此，BOD溶液中所含的活性改善剂的最终浓度可在获得本发明的一个实施方式涉及的效果的范围内适当地设定。

(2-3)脱氧气氛

在本活性改善方法中，为了防止BOD的氧化，优选为在BOD存在的气氛中尽可能不存在氧的状态(即，脱氧气氛)。因此，在本活性改善方法中，将包含BOD和活性改善剂的BOD溶液放置在“脱氧气氛”中。在本活性改善方法中所谓“脱氧气氛”，意指放置BOD溶液的气氛中的氧浓度比自然状态(换言之，常温和常压)下存在的氧浓度低的状态。

在本活性改善方法中，通过在脱氧气氛下放置BOD溶液，从而具有能够容易地改善BOD的活性的优点。

在本活性改善方法中，从容易地改善BOD的活性的观点出发，优选放置BOD溶液的气氛中的氧浓度为不到0.5体积％，特别优选不到0.1体积％。

在本活性改善方法中，对用于实现脱氧气氛的方法并无特别限定。例如，在本活性改善方法中，(1)可通过在容纳BOD溶液的容器中设置脱氧剂，从而实现脱氧气氛，(2)可通过在由具有脱氧剂的成分的材质制作的容器中容纳BOD溶液，从而实现脱氧气氛，(3)可通过用非活性气体(氮气和氩气等稀有气体)置换容器中的氧，从而实现脱氧气氛，(4)可通过在真空或减压条件下放置BOD溶液，从而实现脱氧气氛。用于实现这些脱氧气氛的方法可单独使用1种方法，也可将多种方法组合来使用。

从简便的观点出发，优选上述(1)的方法。作为上述(1)中使用的脱氧剂，例如可列举出三菱瓦斯化学株式会社制エージレス(注册商标)、三菱瓦斯化学株式会社制エージレスオーマック(注册商标)、三菱瓦斯化学株式会社制アネロパック(注册商标)、鸟岛产业株式会社制エバーフレッシュ、Powdertech Co.,Ltd.制ワンダーキープ(注册商标)等，但并不限定于这些。

再有，在本活性改善方法中，从更容易地改善BOD的活性的观点出发，优选除了将包含BOD的BOD溶液在脱氧气氛下放置以外，使BOD溶液中的溶存氧浓度成为低溶存氧状态(优选为不到0.2mg/L，特别优选为不到0.04mg/L)。BOD溶液中的溶存氧浓度更优选为保存BOD溶液的气氛中的上述的优选的氧浓度下的、溶液中的饱和氧浓度以下。再有，溶液中的饱和氧浓度可依赖于溶液的温度而变动。例如，在空气气氛的氧浓度为0.5体积％的情况下，溶液中的饱和氧浓度在25℃下为0.2mg/L，在0℃下为0.35mg/L。BOD溶液中的溶存氧浓度的优选的方式(低溶存氧状态)通过对于BOD溶液进行公知的脱气操作而实现。

(2-4)ABTS初始吸光度减少率

在本说明书中，将包含ABTS的溶液(ABTS溶液)在波长436nm处的吸光度称为ABTS初始吸光度(A

在本活性改善方法中，测定上述活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

本活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

(2-5)DMBQ初始吸光度(A

本说明书中，将在包含DMBQ的溶液(DMBQ溶液)中刚添加活性改善剂后的混合液在波长256nm处的吸光度设为DMBQ初始吸光度(A

在本活性改善方法中，测定上述活性改善剂的DMBQ初始吸光度(A

本活性改善剂的DMBQ初始吸光度(A

(2-6)溶剂

在本活性改善方法中，BOD与活性改善剂一起包含在溶液中。作为用于形成BOD溶液的溶剂，只要能够将本BOD和本活性改善剂溶解，则并无特别限定，能够使用以往公知的溶剂。本溶剂从能够容易地将本BOD和本活性改善剂溶解的方面出发，优选为水(例如蒸馏水)。

本BOD溶液根据使用本BOD溶液的用途，可具有任意的pH。本BOD溶液为了稳定地保持该BOD溶液中含有的BOD的立体结构，优选具有pH6～10的pH。本BOD溶液为了具有所期望的pH，优选包含缓冲剂。作为上述缓冲剂，可使用以往公知的缓冲剂。另外，本BOD溶液为了具有所期望的pH，可使用以往公知的酸或碱采用以往公知的方法来调整pH。

(2-7)其他

本BOD溶液只要能够改善BOD的活性，则可包含BOD、活性改善剂和溶剂以外的任意的物质。本BOD溶液例如可包含缓冲剂、酸、碱、无机盐、有机盐、金属盐、糖类、氨基酸、非活性蛋白质、肽、脂肪酸、脂质、表面活性剂和树脂等。

(2-8)用途

基于本活性改善方法放置、改善了BOD的活性后的BOD溶液可用于任意的用途。采用本活性改善方法改善了BOD的活性后的BOD溶液例如能够用于染发、生物样本中的胆红素的浓度的测定、生物样本中的胆红素的除去、化妆品、食品加工、酶燃料电池(例如酶生物电池、酶电池等)和蛋白质的交联等。

[3.BOD制品]

本发明的另一实施方式提供BOD制品，其在容器内包含BOD和活性改善剂，所述容器内为脱氧气氛，所述活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

本BOD制品通过具有上述构成，从而具有能够改善BOD制品中所含的BOD的活性的优点。

本BOD制品中所含的、BOD和活性改善剂可以是粉末等固体状，但优选为采用适当的溶剂溶解而成的溶液(即，BOD溶液)。BOD在溶液的状态下不稳定，但根据本BOD制品，BOD即使为溶液状态，也能够改善BOD的活性。

在本BOD制品中所含的BOD和活性改善剂为溶液状态的情况下，具有如下优点：(a)在每次使用时不需要将BOD和活性改善剂溶解的操作，并且(b)使用时也不必担心BOD的粉体飞散引起的对作业者的BOD的暴露。

应予说明，本BOD制品中所含的BOD、活性改善剂和溶剂等的说明能够援引上述[2.活性改善方法]的项的说明。另外，本BOD制品可进一步含有上述(2-7)其他的项中说明的任意的物质。另外，在本BOD制品中，容器内的脱氧气氛可采用上述(2-3)脱氧气氛的项中说明的用于形成脱氧气氛的方法实现。

(3-1)容器

本BOD制品中可使用的容器只要是至少能够容纳BOD和活性改善剂的容器，则对容器的材质、形状、大小等没有限定。容器可以是能够将该容器内的脱氧状态保持一定期间的容器，也可以是能够使该容器内成为脱氧气氛的容器。容器的材质可以为玻璃制，也可以为树脂制。另外，容器的形状可以是瓶状，也可以是袋状。作为袋状的容器，可利用带有拉链的树脂制袋(例如ジップロック(注册商标)等)。容器的大小可根据容纳的BOD和活性改善剂、或BOD溶液的体积适当地设计。

为了容易且长期地保持脱氧状态，本容器优选为由不透过氧气的材料(或难以透过氧气的材料)构成的容器。另外，本容器可由包含具有脱氧剂的性质的成分的材料构成。另外，为了可进一步改善BOD的活性，本容器优选为半密闭容器，更优选为不会使所有物质透过的密闭容器。

对于本BOD制品而言，可通过在包含BOD和活性改善剂的容器中加入溶剂，从而将BOD和活性改善剂溶解以制成BOD溶液。因此，本BOD制品中的容器优选为对于上述溶剂具有耐性的容器。

(3-2)本BOD制品的具体形态的一例

对本BOD制品的形态并无特别限定，例如为具有容器可开闭的盖的瓶形状，也可为在盖部的内侧包括包装好的脱氧剂、在容器内部容纳BOD和活性改善剂的形态(形态A)。在形态A的情况下，在容器内部容纳的BOD和活性改善剂可以为液体状，也可以为固体状。在将固体状的BOD和活性改善剂在形态A中容纳于容器内部的情况下，即使在通过将溶剂加入容器中来将BOD和活性改善剂溶解从而制成BOD溶液后，也能够使用与容纳BOD和活性改善剂的容器相同的容器，接着将BOD溶液在脱氧气氛下放置，改善BOD的活性。

在BOD和活性改善剂为粉末等固体状的情况下，包装好的脱氧剂不必设在盖部，可与BOD和活性改善剂一起封入容器内。利用容器内的脱氧剂，容器内部成为脱氧气氛。进而，容器内的空气可被氮气等非活性气体置换。

另外，也可以是如下的形态：在带有拉链的树脂制袋内容纳BOD、活性改善剂、包装好的脱氧剂。

(3-3)用途

本BOD制品可用于任意的用途。本BOD制品例如能够用于染发、生物样本中的胆红素的浓度的测定、生物样本中的胆红素的除去、化妆品、食品加工、酶燃料电池(例如酶生物电池、酶电池等)和蛋白质的交联等。

[4.高活性型BOD的制造方法]

本发明的另一实施方式涉及的高活性型BOD的制造方法为包含将包含BOD和活性改善剂的BOD溶液在脱氧气氛下放置的工序的方法。其中，上述活性改善剂是ABTS初始吸光度(A

本发明的另一实施方式涉及的高活性型BOD的制造方法通过具有上述构成，从而具有能够提供BOD的活性被改善的高活性型BOD的优点。所谓高活性型BOD，与实施该制造方法之前的BOD相比，为通过实施该制造方法从而比活性上升的BOD。

将本发明的另一实施方式涉及的高活性型BOD的制造方法也简称为本制造方法。

本制造方法中的BOD、活性改善剂和溶剂等的说明能够援引上述[2.活性改善方法]的项的说明。另外，在本制造方法中，可进一步使用上述(2-7)其他的项中说明的任意的物质。另外，在本制造方法中，用于形成脱氧气氛下的方法可采用上述(2-3)脱氧气氛的项中说明的用于形成脱氧气氛的方法实现。

本制造方法在放置的工序之后，可进一步包含将BOD溶液冻结干燥以得到固体(粉末)状的BOD的工序。在本制造方法包含得到固体状的BOD的工序的情况下，本制造方法能够作为固体提供高活性型BOD。

采用本制造方法得到的高活性型BOD如上述(2-8)用途的项中说明那样，能够用于各种用途。

再有，本发明也包含采用本发明的一个实施方式涉及的高活性型BOD的制造方法制造的BOD(高活性型BOD)。

本发明的一个实施方式可以是以下这样的构成。

[1]胆红素氧化酶的活性改善方法，其特征在于，将包含胆红素氧化酶和活性改善剂的胆红素氧化酶溶液在脱氧气氛下放置，其中，所述活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

[2][1]所述的胆红素氧化酶的活性改善方法，其特征在于，将所述胆红素氧化酶溶液在10℃以上的温度环境下放置。

[3]胆红素氧化酶制品，其特征在于，在容器内包含胆红素氧化酶和活性改善剂，所述容器内为脱氧气氛，所述活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

[4][3]所述的胆红素氧化酶制品，其中，所述胆红素氧化酶和活性改善剂为溶液状态。

[5]高活性型胆红素氧化酶的制造方法，其特征在于，包含如下工序：将包含胆红素氧化酶和活性改善剂的胆红素氧化酶溶液在脱氧气氛下放置，其中，所述活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

【实施例】

以下通过实施例对本发明的一个实施方式具体地说明，但本发明并不限定于这些实施例(试验例)。

本实施例中使用的本活性改善剂和其他物质(以下称为对比物质)如下所示。应予说明，在本实施例中仅使用乙醛酸，并用使用氢氧化钾溶液调节为pH7.0，。

(活性改善剂)

·尿酸(和光纯药株式会社制造)

·乙醛酸(和光纯药株式会社制造)

·粉末麦芽提取物(极东制药工业株式会社制造)

·粉末鱼提取物(极东制药工业株式会社制造)

·粉末酵母提取物(极东制药工业株式会社制造)

·CSLソルリス095E(オリエンタル酵母工业株式会社制造)(在表1、3、7和8以及图2和3中表示为CSL)

·Meast P1G(Asahi Group Foods,Ltd.制造)

·蛋白胨A(极东制药工业株式会社制造)

·大豆粉88(昭和产业株式会社制造)

·酵母提取物(日本BD株式会社制造)

·パティケース(极东制药工业株式会社制造)

·Hipolypeptone(多聚蛋白胨)(日本制药株式会社制造)

·蛋白胨(极东制药工业株式会社制造)

·亚硫酸钠(和光纯药株式会社制造)

·谷胱甘肽(还原型)(和光纯药株式会社制造)

·L-半胱氨酸盐酸盐(和光纯药株式会社制造)

·N-乙酰基-L-半胱氨酸(和光纯药株式会社制造)

·L-抗坏血酸(和光纯药株式会社制造)

·Trolox(Sigma-Aldrich公司制造)

(对比物质)

·脲(和光纯药株式会社制造)

·硫酸铵(NACALAI TESQUE,INC.制造)

·二硫苏糖醇(DTT)(和光纯药株式会社制造)

·巯基乙酸铵(佐佐木化学株式会社制造)

·半胱胺盐酸盐(佐佐木化学株式会社制造)

·甘油单巯基乙酸酯(在表1、2、7和8以及图2和3中表示为GMT)(佐佐木化学株式会社制造)。

(试验例1)采用本活性改善方法的BOD的活性的改善

将包含BOD和本活性改善剂或对比物质的BOD溶液在脱氧气氛下且30℃的温度环境下放置一定期间。放置后，通过测定BOD的活性，从而对采用本活性改善方法的BOD的活性的改善进行了评价。

在试验例1中，作为BOD，将来自疣孢漆斑菌MT-1的BOD基因(基因库登录号：D12579.1)引入曲霉属后，将在该曲霉属显现的基因组重组BOD(以下也简称为BOD)使用公知的技术精制后使用。来自疣孢漆斑菌MT-1的BOD基因根据曲霉属的基因序列进行了密码子的最优化后引入曲霉属。另外，将精制的BOD以该BOD的浓度成为1.0mg/mL的方式溶解于50mM甘氨酸-KOH(pH8.5)缓冲液中，作为BOD酶溶液使用。

BOD的酶活性如下所述测定。在50mM的磷酸钾缓冲液(pH6.5)1780μL中加入20mM的ABTS基质溶液200μL，制作混合溶液(1980μL)，将该混合溶液在37℃下温育1分钟。然后，在混合溶液中添加20μL的包含BOD的溶液(具体地，后述的评价用BOD溶液)，将得到的混合溶液(2mL)在37℃下温育。在混合溶液的温育的同时，包含评价用BOD溶液的刚添加后(0秒)在内，每隔20秒钟测定了该混合溶液在波长436nm处的吸光度。由评价用BOD溶液的刚添加后的混合溶液在波长436nm处的吸光度和评价用BOD溶液的从添加开始经过1分钟后的混合溶液在波长436nm处的吸光度，计算了评价用BOD溶液的添加后每1分钟的、混合溶液在波长436nm处的吸光度的增加率。由该增加率算出评价用BOD溶液中的BOD的活性(单位)。在本说明书中，将每1分钟1μmol的ABTS氧化的酶量定义为1单位。

试验例1的具体的试验方法如下所述。在包含BOD的BOD酶溶液中添加上述的本活性改善剂中的1种，制作了BOD溶液(为本发明的一个实施方式涉及的BOD溶液)。另外，在上述BOD酶溶液中添加上述的对比物质中的1种，制作BOD溶液。进而，制作在上述BOD酶溶液中代替活性改善剂或对比物质而添加了蒸馏水的BOD溶液，制成对照的BOD溶液(表1～表3中表示为未添加)。将各BOD溶液中的活性改善剂或对比物质的最终浓度在表1中表示为“mM”或“百分率(％)”(相对于BOD溶液100mL的活性改善剂或对比物质的量(g))。

[表1]

表1：各BOD溶液中使用的活性改善剂或对比物质的最终浓度

然后，将这些BOD溶液的各个和脱氧剂(三菱瓦斯化学株式会社制アネロパック)封入一个容器内后，将容器密闭，制作BOD容器。将该BOD容器在脱氧气氛下且30℃的温度环境下放置了47天(表2)或14天(表3)。放置后，从BOD容器中取得BOD溶液，作为评价用BOD溶液。

采用上述的方法测定了评价用BOD溶液中的BOD的活性(单位)。对于BOD的活性，算出了将放置开始时(第0天)的BOD的活性(单位)设为100％时的放置规定天数后的BOD的活性(单位)的相对值作为活性(％)。将放置了47天时的结果示于表2中，将放置了14天时的结果示于表3中。

[表2]

(表2)

[表3]

(表3)

由表2和表3可知，在将包含本活性改善剂的BOD溶液在脱氧气氛下放置的情况下，放置后的BOD溶液中的BOD与放置前的BOD溶液中的BOD相比，具有更高的酶活性。即，可知本活性改善方法能够改善BOD的活性。另一方面，关于对照，可知放置后的BOD溶液中的BOD与放置前的BOD溶液中的BOD相比，具有低的酶活性。另外可知，在将包含对比物质的BOD溶液放置的情况下，即使在脱氧气氛下放置的情况下，放置后，BOD溶液中的BOD也(1)显示比放置前的BOD溶液中的BOD低的酶活性，并且(2)显示与对照大体相同或者比对照低的酶活性。即，可知对比物质不能改善BOD的活性。

在试验例1中，将(a)(a-1)包含BOD的BOD酶溶液和(a-2)包含本活性改善剂中的1种的BOD溶液与(b)脱氧剂封入一个容器内后，将容器密闭得到的BOD容器也可以说是本发明的一个实施方式中的BOD制品。另外，将包含本活性改善剂的BOD溶液在脱氧气氛下放置后得到的BOD与放置前的BOD相比，比活性上升，因此也可以说是高活性型BOD。即，试验例1也是本活性改善方法的实施，也可说是本BOD制品的制造，也可说是本发明的一个实施方式涉及的高活性型胆红素氧化酶的制造方法的实施。

(试验例2)本活性改善方法中的将BOD溶液放置时的温度环境的研究

对将包含BOD和本活性改善剂的BOD溶液在脱氧气氛下放置时的、温度环境进行了研究。

试验例2的具体的试验方法如下所述。采用与试验例1同样的步骤，制作了包含活性改善剂的BOD溶液。另外，制作不含活性改善剂的(未添加的)BOD溶液，作为对照。在试验例2中，使用L-抗坏血酸或尿酸作为活性改善剂，就BOD溶液中的最终浓度而言，使L-抗坏血酸为4mM，使尿酸为20mM。另外，在试验例2中，使BOD酶溶液中的BOD的浓度为3.0mg/mL。

将上述BOD溶液的各个和脱氧剂(三菱瓦斯化学株式会社制アネロパック·ケンキ)封入不透过氧气的一个容器(小袋)内后，将容器密闭，制作BOD容器。通过将该BOD容器在室温(约25℃)下放置约2小时，从而使容器内成为脱氧气氛。然后，将BOD容器在设定为5℃、10℃、20℃、30℃、40℃或50℃的恒温室内放置一定期间。其中，对于(a)未添加的BOD溶液，放置1天、3天、7天、14天或29天，对于(b)包含L-抗坏血酸的BOD溶液，放置1天、3天、7天或14天，对于(c)包含尿酸的BOD溶液，放置了1天、3天、8天、14天或28天。对于各条件，准备了3个样品(BOD容器)。放置后，从各BOD容器中取得BOD溶液，作为评价用BOD溶液。

采用上述的方法测定评价用BOD溶液中的BOD的活性(单位)。对于BOD的活性，算出将放置开始时(第0天)的BOD的活性(单位)设为100％时的放置规定天数后的BOD的活性(单位)的相对值作为活性(％)。将3个样品的平均值示于表4～6中。在表4中示出对照的结果，在表5中示出使用了L-抗坏血酸作为活性改善剂时的结果，在表6中示出使用了尿酸作为活性改善剂时的结果。另外，将3个样品的平均值和标准误差示于图1中。

[表4]

表4.未添加

[表5]

表5.L-抗坏血酸

[表6]

表6.尿酸

图1为表示将本发明的一个实施方式涉及的未添加活性改善剂的BOD溶液或者本发明的一个实施方式涉及的包含活性改善剂的BOD溶液在特定的温度环境下放置了一定期间时的、BOD的活性的变化的坐标图。图1的(a)表示未添加本活性改善剂的BOD溶液的结果，将表4表示为坐标图。图1的(b)表示包含L-抗坏血酸作为本活性改善剂的BOD溶液的结果，将表5表示为坐标图。图1的(c)表示包含尿酸作为本活性改善剂的BOD溶液的结果，将表6表示为坐标图。由表4～6和图1可知，如果是对照，在所有的条件下，通过BOD容器的放置，BOD的活性降低，没有发现BOD的活性的改善。另一方面，在使用了本活性改善剂的情况下，在大量的条件下，与放置前的BOD的活性相比，通过BOD容器的放置，发现了BOD的活性的改善。

对于使用了L-抗坏血酸的情形具体地说明。这种情况下，在40℃以上的温度环境下将BOD容器放置的情况下在1天后，在30℃的温度环境下将BOD容器放置的情况下在3天后，和在20℃的温度环境下将BOD容器放置的情况下在7天后，分别与放置前的BOD的活性相比，BOD的活性提高了约2倍以上。

对于使用了尿酸的情形具体地说明。这种情况下，在40℃以上的温度环境下将BOD容器放置的情况下在1天后，与放置前的BOD的活性相比，BOD的活性提高了约1.8或约2倍。另外，在30℃的温度环境下将BOD容器放置的情况下在3天后和在20℃的温度环境下将BOD容器放置的情况下在8天后，分别与放置前的BOD的活性相比，BOD的活性提高了约1.8倍。

在使用了L-抗坏血酸的情况和使用了尿酸的情况下，在两者的情况下，在5℃的温度环境下将BOD容器放置的情况下，都没有发现在10℃以上的温度环境下将BOD容器放置时所实现的BOD的活性的改善。

由以上的结果暗示：在本活性改善方法中，优选将BOD溶液在10℃以上的温度环境下放置，在将BOD溶液在更高温度环境下放置的情况下，能够在短期间改善BOD的活性。

与试验例1同样地，试验例2也是本活性改善方法的实施，也可称为本BOD制品的制造，还可称为本发明的一个实施方式涉及的高活性型胆红素氧化酶的制造方法的实施。

(试验例3)活性改善剂的ABTS初始吸光度(A

对于试验例1中使用的本活性改善剂和对比物质，评价了ABTS初始吸光度(A

具体的评价方法如下所述。作为ABTS，使用了Roche Diagnostics K.K.制ABTS。以ABTS的浓度成为20mM的方式，将ABTS溶解于50mM甘氨酸-KOH缓冲液(pH8.5)中，制备了ABTS溶液。使用分子吸光度计SpectraMax Plus384(日本Molecular Device公司制造)，在光路长1.0cm下测定了ABTS溶液在波长436nm处的吸光度(ABTS初始吸光度(A

接着，在反应溶液A刚制作后，即，对于ABTS溶液刚添加活性改善剂溶液或对比物质溶液后，使反应溶液A在25℃下反应1分钟。然后，立即，使用与ABTS溶液的吸光度测定中使用时相同类型的分子吸光度计测定反应溶液A在波长436nm处的吸光度。另外，代替活性改善剂溶液或对比物质溶液而对195μLABTS溶液添加5μL蒸馏水，制作不含活性改善剂或对比物质的反应溶液A，制成对照(在表2和图2中表示为未添加)。对于对照，在使反应溶液A在25℃下反应1分钟后，使用上述分子吸光度计测定了反应溶液A在波长436nm处的吸光度。对如上所述得到的、ABTS初始吸光度(A

[表7]

表7：活性改善剂或对比物质的ABTS初始吸光度(A

表7表示相对于ABTS溶液在波长436nm处的吸光度(ABTS初始吸光度(A

在图2中，对于未添加的反应溶液A和包含脲或硫酸铵的反应溶液A而言，可知ABTS初始吸光度没有变化。另一方面，可知包含本活性改善剂的反应溶液A的ABTS初始吸光度减少率为0.10％以上。

(试验例4)活性改善剂的DMBQ初始吸光度(A

对于试验例1中使用的本活性改善剂和对比物质，评价了DMBQ初始吸光度(A

具体的评价方法如下所述。作为DMBQ，使用了东京化成工业株式会社制DMBQ。首先，制作1mM的DMBQ溶液。使用紫外可见分光光度计UV-160A(岛津制作所株式会社制造)在光路长1.0cm下测定了1mM的DMBQ溶液在波长256nm处的吸光度(A

[表8]

表8：用于评价DMBQ初始吸光度(A

在(a)反应溶液D的刚制作后(即，试验刚开始后，在图3的(a)中表示为0分钟)和(b)将反应溶液D在25℃下放置后每经过10秒，使用紫外可见分光光度计UV-160A测定反应溶液D在波长256nm处的吸光度。其中，将刚制作后的反应溶液D在波长256nm处的吸光度作为DMBQ初始吸光度(A

图3为表示本发明的一个实施方式涉及的活性改善剂或对比物质引起的DMBQ初始吸光度(A

再有，试验例4中使用的粉末麦芽提取物、粉末鱼提取物、粉末酵母提取物、CSL、Meast P1G、蛋白胨A、大豆粉88、酵母提取物、パティケース、HiPolypeptone和蛋白胨(1)反应溶液D在波长256nm处的吸光度的相对的减少率(％)(图3(a))没有从100％变化，并且(2)DMBQ初始吸光度(A

【产业上的可利用性】

根据本发明的一个实施方式，能够改善BOD的活性。因此，本发明能够适合用在染发的领域、临床检查的领域、化妆品的领域、酶燃料电池(例如酶生物电池、酶电池等)领域和食品加工领域等利用BOD的广阔的领域中。