抗CDH6抗体-吡咯并苯并二氮杂环庚三烯衍生物缀合物

摘要

本发明解决了如下的问题：提供可以特异性结合CDH6且具有高内化活性的抗体；包含所述抗体且具有高抗肿瘤活性的抗体‑药物缀合物；使用所述抗体‑药物缀合物制备且对肿瘤具有治疗作用的药物；使用所述抗体、抗体‑药物缀合物或药物治疗肿瘤的方法等。根据本发明，在此提供：具有内化活性的抗CDH6抗体；包含彼此结合的抗CDH6抗体和新型PBD衍生物且具有高抗肿瘤活性的抗CDH6抗体‑药物缀合物；以及药物产品和用于治疗肿瘤的方法，在其中各自使用所述抗CDH6抗体或抗CDH6抗体‑药物缀合物。

说明书

技术领域

本发明涉及可用作抗肿瘤药物的抗体-药物缀合物，其通过经由接头结构部分连接结合CDH6并具有内化作用的抗CDH6抗体和吡咯并苯并二氮杂环庚三烯衍生物而获得。

背景技术

钙粘着蛋白是存在于细胞膜表面上的糖蛋白，并且作为细胞-细胞粘附分子通过其N末端胞外结构域的钙离子依赖性结合，或作为负责细胞-细胞相互作用的信号分子发挥功能。经典钙粘着蛋白属于钙粘着蛋白超家族中并且是由五个细胞外结构域(EC结构域)、一个跨膜区域和一个细胞内结构域构成的单次跨膜蛋白。根据其氨基酸序列的同源性，经典钙粘着蛋白被分类为I型家族(其代表为E-钙粘着蛋白和N-钙粘着蛋白)和II型家族。

钙粘着蛋白6(CDH6)是由790个氨基酸构成的单次跨膜蛋白，其被分类为II型钙粘着蛋白家族，并且该蛋白具有N-末端细胞外和C-末端细胞内结构域。人CDH6基因在1995年被首次克隆(非专利文献1)，并且其序列可以参考例如登录号NM_004932和NP_004923(NCBI)。

CDH6在发育期间在脑和肾脏中特异性表达，并且已报道在中枢神经系统的回路形成(非专利文献2和3)和肾中的肾单位发育(非专利文献4和5)中起重要作用。在成年人的正常组织中的CDH6的表达局限于肾脏的肾小管、胆管上皮细胞等。

同时，已知在一些类型的人成年癌症中，CDH6在肿瘤部位特异性过表达。对于人肾细胞癌，尤其是肾透明细胞癌，已经报道了CDH6表达与预后不良的相关性以及其作为肿瘤标志物的适用性(非专利文献6和7)。对于人卵巢癌，也已经报道了CDH6的高表达(非专利文献8)。还已经报道CDH6参与人甲状腺癌的上皮-间质转化(非专利文献9)。此外，已经报道CDH6也在人胆管癌和人小细胞肺癌中表达(非专利文献12和13)。

癌症在死亡原因中排名很高。尽管预计癌症患者的数量随着人口老龄化而增加，但治疗需求尚未获得充分满足。常规化疗剂的问题在于：由于它们的低选择性，这些化疗剂不仅对肿瘤细胞是毒性的，而且对正常细胞也是毒性的，并从而具有不良反应；并且化疗剂不能以足够的量施用，并且因此不能以充分的程度产生其效果。因此，近年来，已经开发了更高选择性的分子靶药物或抗体药物，其靶向在癌细胞中展示突变或高表达特征的分子，或靶向参与细胞恶性转化的特定分子。

抗体在血液中高度稳定，并且特异性结合其靶抗原。由于这些原因，预期不良反应的下降，并且已经对于在癌细胞表面上高度表达的分子开发了大量抗体药物。依赖于抗体的抗原特异性结合能力的技术之一是使用抗体-药物缀合物(ADC)。ADC是缀合物，其中将结合癌细胞表面上表达的抗原且可以通过这种结合将抗原内化至细胞中的抗体与具有细胞毒性活性的药物缀合。ADC可以有效地将药物递送至癌细胞，并且因此可以预期通过在癌细胞中积累药物来杀死癌细胞(非专利文献10和专利文献1和2)。关于ADC，包含与单甲基澳瑞他汀E缀合的抗CD30单克隆抗体的Adcetris(TM) (本妥昔单抗vedotin)已例如被批准作为霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的治疗药物。此外，包含与美坦新缀合的抗HER2单克隆抗体的Kadcyla(TM) (曲妥珠单抗美坦新)用于治疗HER2阳性的进行性或复发性乳腺癌。

适合作为抗肿瘤药物的ADC的靶抗原的特征是：所述抗原在癌细胞表面上特异性高表达，但在正常细胞中低表达或不表达；所述抗原可以内化至细胞中；所述抗原不从细胞表面分泌等。此外，适合用于ADC的抗体的重要特征是除了特异性结合靶抗原外，所述抗体还具有高内化能力。抗体的内化能力取决于靶抗原和抗体二者的性质。难以从靶标的分子结构预测适于内化的抗原结合位点，或者从抗体的结合强度、物理性质等预测具有高内化能力的抗体。因此，开发具有高效力的ADC的重要挑战是获得具有针对靶抗原的高内化能力的抗体(非专利文献11)。

包含与特异性结合CDH6的EC结构域5(EC5)的抗CDH6抗体缀合的DM4的ADC被称为靶向CDH6的ADC(专利文献3)。

待缀合用于ADC的药物的有用实例是吡咯并苯并二氮杂环庚三烯(吡咯并苯并二氮杂䓬，PBD)。PBD表现出细胞毒性，例如，通过结合DNA小沟中的PuGPu序列。蒽霉素(天然存在的PBD)在1965年首次发现，并且自此发现以来，已经发现了各种天然存在的PBD及其PBD类似物(非专利文献14至17)。

PBD的一般结构式由下式代表：

[式1]

已知在A和C环部分中的取代基的数目、类型和位点不同的PBD，和在B和C环部分中的不饱和度不同的PBD。

已知PBD通过形成二聚体结构而展示急剧增强的细胞毒性(非专利文献18、19)，并且已经报道了具有二聚体PBD的各种ADC(专利文献4至16)。然而，尚不知道在其C2-位具有螺环的PBD及其ADC形式。

引文列表

专利文献

专利文献1：WO2014/057687

专利文献2：US2016/0297890

专利文献3：WO2016/024195

专利文献4：WO2013/173496

专利文献5：WO2014/130879

专利文献6：WO2017/004330

专利文献7：WO2017/004025

专利文献8：WO2017/020972

专利文献9：WO2016/036804

专利文献10：WO2015/095124

专利文献11：WO2015/052322

专利文献12：WO2015/052534

专利文献13：WO2016/115191

专利文献14：WO2015/052321

专利文献15：WO2015/031693

专利文献16：WO2011/130613

非专利文献

非专利文献1：Shimoyama Y, 等人, Cancer Research, 2206-2211, 55, May15, 1995

非专利文献2：Inoue T, 等人, Developmental Biology, 183-194, 1997

非专利文献3：Osterhout J A, 等人, Neuron, 632-639, 71, Aug 25, 2011

非专利文献4：Cho E A, 等人, Development, 803-812, 125, 1998

非专利文献5：Mah S P, 等人, Developmental Biology, 38-53, 223, 2000

非专利文献6：Paul R, 等人, Cancer Research, 2741-2748, July 1, 57,1997

非专利文献7：Shimazui T, 等人, Cancer, 963-968, 101(5), Sep.1, 2004

非专利文献8：Koebel M, 等人, PLoS Medicine, 1749-1760, 5(12), e232,Dec. 2008

非专利文献9：Gugnoni M, 等人, Oncogene, 667-677, 36, 2017

非专利文献10：Polakis P., Pharmacological Reviews, 3-19, 68, 2016

非专利文献11：Peters C, 等人, Bioscience Reports, 1-20, 35, 2015

非专利文献12：Goeppert B, 等人, Epigenetics, 780-790, 11(11), 2016

非专利文献13：Yokoi S, 等人, American Journal of Pathology, 207-216,161, 1, 2002

非专利文献14：Julia Mantaj, 等人, Angewandte Chemie InternationlEdition 2016, 55, 2-29

非专利文献15：Dyeison Antonow.等人, Chemical Reviews 2010, 111, 2815-2864

非专利文献16：In Antibiotics III. Springer Verlag, New York, pp.3-11

非专利文献17：Accounts of Chemical Research 1986, 19, 230

非专利文献18：Journal of the American Chemical Society 1992, 114, 4939

非专利文献19：Journal of Organic Chemistry 1996, 61, 8141。

发明概述

技术问题

本发明的一个目的是提供特异性结合CDH6且具有高内化活性的抗体，包含所述抗体且具有高抗肿瘤活性的抗体-药物缀合物，包含所述抗体-药物缀合物并具有对肿瘤的治疗作用的药物产品，使用所述抗体、所述抗体-药物缀合物或药物产品治疗肿瘤的方法等。

问题的解决方案

本发明人已针对实现上述目的进行了深入研究，并且发现，令人惊讶地，特异性结合CDH6的细胞外结构域3(在本说明书中，也称为EC3)的抗体具有针对表达CDH6的细胞的极高的内化活性，并且可用作ADC的抗体。本发明人还通过将抗CDH6抗体连接至新型PBD衍生物而成功获得了抗CDH6抗体-药物缀合物，并且发现抗CDH6抗体-药物缀合物具有强烈的抗肿瘤活性。

本发明涉及以下内容。

[1]由下式(X)代表的抗体-药物缀合物：

[式2]

其中m

Ab代表IgG抗体或其功能片段，所述IgG抗体特异性结合包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列且具有允许细胞摄取的内化能力，

L代表连接键合至Ab的N297的聚糖(N297聚糖)和D的接头，

N297聚糖可以是重构的聚糖，且

D是下式中的任一者：

[式3]

其中星号(*)代表与L的键合。

[2]根据[1]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段针对至少任何一种选自以下抗体(1)至(8)的抗体表现出对于与包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列的结合的竞争性抑制活性：

(1)具有轻链和重链的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:23中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:26中的位置20至471的氨基酸序列组成，

(2)具有轻链和重链的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:39中的位置20至471的氨基酸序列组成，

(3)具有轻链和重链的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成，

(4)具有轻链和重链的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:35中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成，

(5)具有轻链和重链的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:47中的位置20至471的氨基酸序列组成，

(6)具有轻链和重链的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:65中的位置20至471的氨基酸序列组成，

(7)具有轻链和重链的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:67中的位置20至471的氨基酸序列组成，和

(8)具有轻链和重链的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:69中的位置20至471的氨基酸序列组成。

[3]根据[1]或[2]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含选自以下(1)至(4)的CDRL1、CDRL2和CDRL3；以及CDRH1、CDRH2和CDRH3：

(1)由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3；以及由SEQID NO:17中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:18中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:19中显示的氨基酸序列组成的CDRH3，

(2)由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3；以及由SEQID NO:17中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:30中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:19中显示的氨基酸序列组成的CDRH3，

(3)由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3；以及由SEQID NO:57中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:58中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:59中显示的氨基酸序列组成的CDRH3，和

(4)由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3，以及由SEQID NO:62中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:63中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:64中显示的氨基酸序列组成的CDRH3。

[4]根据[1]至[3]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含选自以下可变区(1)至(4)的任何一个轻链可变区：

(1)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区，

(2)由SEQ ID NO:37中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区，

(3)与(1)和(2)的氨基酸序列中的除了CDR序列以外的骨架区的序列具有至少95%的序列同一性的氨基酸序列，和

(4)在(1)至(3)的氨基酸序列中的除了CDR序列以外的骨架区的序列中具有一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；和

选自以下可变区(5)至(11)的任何一个重链可变区：

(5)由SEQ ID NO:41中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(6)由SEQ ID NO:45中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(7)由SEQ ID NO:49中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(8)由SEQ ID NO:55中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(9)由SEQ ID NO:60中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(10)与(5)至(9)的氨基酸序列中的除了每个CDR序列以外的骨架区的序列具有至少95%的序列同一性的氨基酸序列，和

(11)在(5)至(10)的氨基酸序列中的除了每个CDR序列以外的骨架区的序列中具有一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。

[5]根据[1]至[4]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含以下(1)至(6)中的任何一个：

(1)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:41中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(2)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:45中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(3)由SEQ ID NO:37中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:45中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(4)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:49中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(5)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:55中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，和

(6)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:60中显示的氨基酸序列组成的重链可变区。

[6]根据[1]至[5]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段具有以下(1)至(7)中的任何一个：

(1)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:39中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(2)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(3)由SEQ ID NO:35中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(4)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:47中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(5)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:65中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(6)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:67中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，和

(7)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:69中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[7]根据[6]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段具有由SEQ IDNO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:39中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[8]根据[6]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段具有由SEQ IDNO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[9]根据[6]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段具有由SEQ IDNO:35中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[10]根据[6]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段具有由SEQ IDNO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:47中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[11]根据[6]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段具有由SEQ IDNO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:65中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[12]根据[6]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段具有由SEQ IDNO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:67中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[13]根据[6]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段具有由SEQ IDNO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:69中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[14]根据[1]至[13]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中

L由-Lb-La-Lp-NH-B-CH

B代表1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基或2,5-噻吩基，

Lp代表选自以下的任何一个：

-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-和-GGPL-，

La代表选自以下的任何一个：

-C(=O)-CH

-C(=O)-(CH

-C(=O)-CH

-C(=O)-CH

-C(=O)-CH

-CH

-OC(=O)-，

且

Lb代表下式：

[式4]

[式5]

或

[式6]

其中，在以上显示的Lb的每个结构式中，每个星号*代表与La的键合，且每条波浪线代表与由Ab呈现的聚糖或重构的聚糖的键合。

[15]根据[1]至[14]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中

L代表选自以下结构式的任何一个：

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

其中Z

[式7]

Z

[式8]

Z

[式9]

其中，在Z

B代表1,4-苯基。

[16]根据[1]至[15]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中

L代表选自以下的任何一个：

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

其中B代表1,4-苯基，且Z

[式10]

其中，在Z

[17]根据[1]至[16]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体是IgG1、IgG2或IgG4。

[18]根据[1]至[17]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述N297聚糖是重构的聚糖。

[19]根据[1]至[18]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述N297聚糖是N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或其混合物或N297-(Fuc)SG，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式代表的结构：

[式11]

[式12]

[式13]

其中波浪线代表与抗体的Asn297的键合，

所述N297聚糖中的*-L(PEG)-代表*-(CH

[20]根据[19]所述的抗体-药物缀合物，其中n

[21]由下式(XII)代表的抗体-药物缀合物：

[式14]

其中，在上面显示的每个结构式中，

m

Ab代表IgG抗体或其功能片段，所述IgG抗体特异性结合包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列且具有允许细胞摄取的内化能力，

Ab的N297聚糖代表N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物，和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式代表的结构：

[式15]

[式16]

[式17]

其中每条波浪线代表与抗体的Asn297 (N297)的键合，

所述N297聚糖中的*-L(PEG)-代表*-(CH

在右端的氨基经由酰胺键键合至N297聚糖中的β-Man的1-3和1-6支链的每条或任一条中的非还原末端的唾液酸的2-位置的羧酸，且每个星号*代表与对应的结构式中的三唑环的1-或3-位置的氮原子的键合。

[22]根据[21]所述的抗体-药物缀合物，其中由式(XII)代表的化合物由下式(XII')代表：

[式18]

[23]由下式(XIII)代表的抗体-药物缀合物：

[式19]

其中，在上面显示的每个结构式中，

m

Ab代表IgG抗体或其功能片段，所述IgG抗体特异性结合包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列且具有允许细胞摄取的内化能力，且

Ab的N297聚糖代表N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物，和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式代表的结构：

[式20]

[式21]

[式22]

其中每条波浪线代表与抗体的Asn297 (N297)的键合，

所述N297聚糖中的*-L(PEG)-代表*-(CH

[24]根据[23]所述的抗体-药物缀合物，其中由式(XIII)代表的化合物由下式(XIII')代表：

[式23]

[25]由下式(XIV)代表的抗体-药物缀合物：

[式24]

其中，在上面显示的每个结构式中，

m

Ab代表IgG抗体或其功能片段，所述IgG抗体特异性结合包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列且具有允许细胞摄取的内化能力，且

Ab的N297聚糖代表N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物，和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式代表的结构：

[式25]

[式26]

[式27]

其中每条波浪线代表与抗体的Asn297 (N297)的键合，

所述N297聚糖中的*-L(PEG)-代表*-(CH

[26]根据[25]所述的抗体-药物缀合物，其中由式(XIV)代表的化合物由下式(XIV')代表：

[式28]

[27]由下式(XV)代表的抗体-药物缀合物：

[式29]

其中，在上面显示的每个结构式中，

m

Ab代表IgG抗体或其功能片段，所述IgG抗体特异性结合包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列且具有允许细胞摄取的内化能力，且

Ab的N297聚糖代表N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2及其混合物，和N297-(Fuc)SG中的任一个，其中N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2和N297-(Fuc)SG具有由下式代表的结构：

[式30]

[式31]

[式32]

其中每条波浪线代表与抗体的Asn297 (N297)的键合，

所述N297聚糖中的*-L(PEG)-代表*-(CH

[28]根据[27]所述的抗体-药物缀合物，其中由式(XV)代表的化合物由下式(XV')代表：

[式33]

[29]根据[21]至[28]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含选自以下(1)至(4)的CDRL1、CDRL2和CDRL3以及CDRH1、CDRH2和CDRH3：

(1)由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3；以及由SEQID NO:17中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:18中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:19中显示的氨基酸序列组成的CDRH3，

(2)由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3；以及由SEQID NO:17中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:30中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:19中显示的氨基酸序列组成的CDRH3，

(3)由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3；以及由SEQID NO:57中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:58中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:59中显示的氨基酸序列组成的CDRH3，和

(4)由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3，以及由SEQID NO:62中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:63中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:64中显示的氨基酸序列组成的CDRH3。

[30]根据[21]至[29]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含以下(1)至(6)中的任何一个：

(1)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:41中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(2)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:45中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(3)由SEQ ID NO:37中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:45中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(4)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:49中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，

(5)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:55中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，和

(6)由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:60中显示的氨基酸序列组成的重链可变区。

[31]根据[21]至[30]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含以下(1)至(7)中的任何一个：

(1)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:39中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(2)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(3)由SEQ ID NO:35中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(4)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:47中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(5)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:65中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，

(6)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:67中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链，和

(7)由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:69中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[32]根据[31]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含由SEQID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:39中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[33]根据[31]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含由SEQID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[34]根据[31]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含由SEQID NO:35中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:43中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[35]根据[31]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含由SEQID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:47中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[36]根据[31]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含由SEQID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:65中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[37]根据[31]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含由SEQID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:67中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[38]根据[31]所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体或其功能片段包含由SEQID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:69中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[39]根据[1]至[38]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物中每抗体分子缀合的药物分子的平均数目为1至3。

[40]根据[1]至[38]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体-药物缀合物中每抗体分子缀合的药物分子的平均数目为3至5。

[41]根据[1]至[40]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中所述抗体含有重链，所述重链具有选自以下的一种或两种或更多种修饰：N-连接糖基化、O-连接糖基化、N-末端加工、C-末端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化、向N-末端添加甲硫氨酸残基、脯氨酸残基的酰胺化和从羧基末端缺失一个或两个氨基酸。

[42]根据[1]至[41]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其中在重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失。

[43]用于产生聚糖-重构抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

i)产生IgG抗体或其功能片段，所述IgG抗体特异性结合包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列且具有允许细胞摄取的内化能力，

ii)用水解酶处理步骤i)中获得的抗体以产生(Fucα1,6)GlcNAc-抗体；和

iii)-1在转糖苷酶存在的情况下使(Fucα1,6)GlcNAc-抗体和聚糖供体分子反应，所述聚糖供体分子通过如下获得：将具有叠氮基的PEG接头引入至MSG (9)或SG (10)中的唾液酸的2-位置的羧酸的羰基，和将还原末端噁唑啉化，或

iii)-2在转糖苷酶存在的情况下使(Fucα1,6)GlcNAc-抗体和聚糖供体分子反应，所述聚糖供体分子通过如下获得：将具有叠氮基的PEG接头引入至α-氨基任选地被保护的(MSG-)Asn或(SG-)Asn中的唾液酸的2-位置的羧酸的羰基和Asn中的羧酸的羰基，引起水解酶的作用，且然后将还原末端噁唑啉化。

[44]用于产生根据[1]至[42]中任一项所述的抗体-药物缀合物的方法，其包括使通过根据[43]所述的方法获得的聚糖-重构的抗体和药物接头反应的步骤。

[45]根据[1]至[42]中任一项所述的抗体-药物缀合物，其通过根据[44]所述的方法产生。

[46]抗体或其功能片段，其包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区含有由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3，且所述重链可变区含有由SEQ ID NO:57中显示的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO:58中显示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO:59中显示的氨基酸序列组成的CDRH3。

[47]抗体或其功能片段，其包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区含有由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3；且所述重链可变区含有由SEQ ID NO:62中显示的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO:63中显示的氨基酸序列组成的CDRH2和由SEQ ID NO:64中显示的氨基酸序列组成的CDRH3。

[48]根据[46]所述的抗体或其功能片段，其包含由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:55中显示的氨基酸序列组成的重链可变区。

[49]根据[47]所述的抗体或其功能片段，其包含由SEQ ID NO:33中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区和由SEQ ID NO:60中显示的氨基酸序列组成的重链可变区。

[50]根据[46]或[48]所述的抗体或其功能片段，其具有由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:67中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[51]根据[47]或[49]所述的抗体或其功能片段，其具有由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:69中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[52]抗体或其功能片段，其具有由SEQ ID NO:31中的位置21至233的氨基酸序列组成的轻链和由SEQ ID NO:65中的位置20至471的氨基酸序列组成的重链。

[53]多核苷酸，其编码根据[46]至[52]中任一项所述的抗体。

[54]表达载体，其含有根据[53]所述的多核苷酸。

[55]用根据[54]所述的表达载体转化的宿主细胞。

[56]用于产生根据[46]至[52]所述的抗体或其功能片段的方法，其包括以下步骤：培养根据[55]所述的宿主细胞，和从获得自培养步骤的培养物收集靶抗体。

[57]抗体或其功能片段，其通过根据[56]所述的方法获得。

[58]药物组合物，其包含根据[1]至[42]和[45]中任一项所述的抗体-药物缀合物或根据[46]至[52]和[57]中任一项所述的抗体或其功能片段。

[59]根据[58]所述的药物组合物，其为抗肿瘤药物。

[60]根据[59]所述的药物组合物，其中所述肿瘤是表达CDH6的肿瘤。

[61]根据[60]所述的药物组合物，其中所述肿瘤是肾细胞癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、卵巢癌、卵巢浆液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、子宫癌、胰腺癌、威尔姆斯氏肿瘤或神经母细胞瘤。

[62]用于治疗肿瘤的方法，其包括向个体施用根据[1]至[42]和[45]中任一项所述的抗体-药物缀合物，根据[46]至[52]和[57]中任一项所述的抗体或其功能片段或根据[58]至[61]中任一项所述的药物组合物。

[63]根据[62]所述的治疗方法，其中所述肿瘤是表达CDH6的肿瘤。

[64]根据[62]或[63]所述的治疗方法，其中所述肿瘤是肾细胞癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、卵巢癌、卵巢浆液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、子宫癌、胰腺癌、威尔姆斯氏肿瘤或神经母细胞瘤。

[65]根据[62]至[64]中任一项所述的治疗方法，其包括向个体同时、分开或连续施用根据[1]至[42]和[45]中任一项所述的抗体-药物缀合物；根据[46]至[52]和[57]中任一项所述的抗体或其功能片段；或根据[58]至[61]中任一项所述的药物组合物和至少一种抗肿瘤药物。

本发明的有利效果

本发明的抗CDH6抗体的特征是特异性识别CDH6的EC结构域3(EC3)并具有高内化活性。可以预期，通过施用至具有表达CDH6的癌细胞的患者，抗CDH6抗体-药物缀合物实现优异的抗肿瘤作用和安全性，所述抗CDH6抗体-药物缀合物通过经由接头连接本发明的抗CDH6抗体和本发明的新型PBD衍生物而制备。具体地，本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物可用作抗肿瘤药剂。

附图简述

[图1]图1显示检查大鼠抗CDH6单克隆抗体rG019和阴性对照抗体大鼠IgG2b各自与对照细胞(阴影)或hCDH6转染的293细胞(空心实线)的结合的流式细胞术结果。横坐标描绘FITC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图2-1]图(1)显示大鼠抗CDH6单克隆抗体rG019或阴性对照抗体大鼠IgG2b针对对照细胞(阴影)或全长hCDH6-转染的293细胞(空心实线)的结合活性。图(2)显示大鼠抗CDH6单克隆抗体rG019或阴性对照抗体大鼠IgG2b针对对照细胞(阴影)或EC1-缺失的hCDH6-转染的293细胞(空心实线)的结合活性。图(3)显示大鼠抗CDH6单克隆抗体rG019或阴性对照抗体大鼠IgG2b针对对照细胞(阴影)或EC2-缺失的hCDH6-转染的293细胞(空心实线)的结合活性。在图(1)至(3)中，横坐标描绘FITC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图2-2]图(4)显示大鼠抗CDH6单克隆抗体rG019或阴性对照抗体大鼠IgG2b针对对照细胞(阴影)或EC3-缺失的hCDH6-转染的293细胞(空心实线)的结合活性。图(5)显示大鼠抗CDH6单克隆抗体rG019或阴性对照抗体大鼠IgG2b针对对照细胞(阴影)或EC4-缺失的hCDH6-转染的293细胞(空心实线)的结合活性。图(6)显示大鼠抗CDH6单克隆抗体rG019或阴性对照抗体大鼠IgG2b针对对照细胞(阴影)或EC5-缺失的hCDH6-转染的293细胞(空心实线)的结合活性。在图(4)至(6)中，横坐标描绘FITC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图3]图3显示评估在5种类型的人肿瘤细胞系(人卵巢肿瘤细胞系NIH:OVCAR-3、PA-1和OV-90和人肾细胞肿瘤细胞系786-O、Caki-1)上的CDH6的表达的流式细胞术结果。横坐标描绘FITC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。阴影柱状图显示阴性对照mIgG1用于染色，且空心实线柱状图显示抗人CDH6抗体用于染色。

[图4]图4显示人嵌合抗CDH6抗体chG019与人CDH6和猴CDH6的结合。横坐标描绘抗体浓度，且纵坐标描绘基于平均荧光强度的结合的抗体的量。

[图5-1]图5-1显示四种人源化hG019抗体(H01L02、H02L02、H02L03和H04L02)、抗CDH6抗体NOV0712或阴性对照抗体hIgG1针对对照细胞(阴影)或全长hCDH6-转染的293α细胞(空心实线)的结合活性。横坐标描绘APC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图5-2]图5-2显示四种人源化hG019抗体(H01L02、H02L02、H02L03和H04L02)、抗CDH6抗体NOV0712或阴性对照抗体hIgG1针对对照细胞(阴影)或EC1-缺失的hCDH6-转染的293α细胞(空心实线)的结合活性。横坐标描绘APC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图5-3]图5-3显示四种人源化hG019抗体(H01L02、H02L02、H02L03和H04L02)、抗CDH6抗体NOV0712或阴性对照抗体hIgG1针对对照细胞(阴影)或EC2-缺失的hCDH6-转染的293α细胞(空心实线)的结合活性。横坐标描绘APC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图5-4]图5-4显示四种人源化hG019抗体(H01L02、H02L02、H02L03和H04L02)、抗CDH6抗体NOV0712或阴性对照抗体hIgG1针对对照细胞(阴影)或EC3-缺失的hCDH6-转染的293α细胞(空心实线)的结合活性。横坐标描绘APC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图5-5]图5-5显示四种人源化hG019抗体(H01L02、H02L02、H02L03和H04L02)、抗CDH6抗体NOV0712或阴性对照抗体hIgG1针对对照细胞(阴影)或EC4-缺失的hCDH6-转染的293α细胞(空心实线)的结合活性。横坐标描绘APC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图5-6]图5-6显示四种人源化hG019抗体(H01L02、H02L02、H02L03和H04L02)、抗CDH6抗体NOV0712或阴性对照抗体hIgG1针对对照细胞(阴影)或EC5-缺失的hCDH6-转染的293α细胞(空心实线)的结合活性。横坐标描绘APC荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图6]图6显示检查786-O/hCDH6稳定表达细胞系(空心实线)及其亲本细胞系786-O(阴影)中的人CDH6的表达的流式细胞术结果。横坐标描绘Alexa Fluor 647荧光强度，其指示结合的抗体的量，且纵坐标描绘细胞计数。

[图7]图7显示使用标记的NOV0712 (上图)或标记的H01L02 (下图)的四种未标记的人源化hG019抗体(H01L02、H02L02、H02L03和H04L02)、抗CDH6抗体NOV0712或阴性对照hIgG1的结合竞争测定。横坐标描绘添加的未标记抗体的最终浓度，且纵坐标描绘基于平均荧光强度的结合的抗体的量。

[图8]图8显示其中在NIH:OVCAR-3细胞、786-O细胞或PA-1细胞中，使用与抑制蛋白合成的毒素(皂草素)缀合的抗人IgG试剂Hum-ZAP或作为阴性对照的未与毒素缀合的Fc(γ)片段特异性F(ab')2片段山羊抗人IgG评估四种人源化hG019抗体(H01L02、H02L02、H02L03和H04L02)、抗CDH6抗体NOV0712和阴性对照抗体的内化活性的结果。在每个条目下方显示细胞存活率(%)，其被计算为当将补充有阴性对照而不是Hum-ZAP的孔中的活细胞数定义为100%时的相对存活率。

[图9]图9显示抗LPS抗体-PBD (ADC11)、H01L02-PBD (ADC1)、H01L02A-PBD(ADC5)、H11L02A-PBD (ADC7)和H31L02A-PBD (ADC6)各自对于CDH6阳性的人卵巢肿瘤细胞系NIH：OVCAR-3、OV-90、PA-1和CDH6阳性的人肾细胞癌细胞系786-O的IC50 (50%抑制浓度)(nM)。

[图10]图10显示H01L02-PBD (ADC1)、NOV0712-DM4和抗LPS抗体-PBD (ADC11)各自的体内抗肿瘤效果。使用动物模型进行评估，其中将CDH6-阳性的人卵巢肿瘤细胞系OV-90接种至免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘天数，且纵坐标描绘肿瘤体积。误差范围描绘SE值。

[图11]图11显示H01L02-PBD (ADC1)、NOV0712-DM4和抗LPS抗体-PBD (ADC11)各自的体内抗肿瘤效果。使用动物模型进行评估，其中将CDH6-阳性的人肾肿瘤细胞系Caki-1接种至免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘天数，且纵坐标描绘肿瘤体积。误差范围描绘SE值。

[图12]图12显示H01L02-PBD (ADC1)、H01L02A-PBD (ADC5)、H31L02A-PBD (ADC6)和抗LPS抗体-PBD (ADC11)各自的体内抗肿瘤效果。使用动物模型进行评估，其中将CDH6-阳性的人卵巢肿瘤细胞系NIH:OVCAR-3接种至免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘天数，且纵坐标描绘肿瘤体积。误差范围描绘SE值。

[图13]图13显示H01L02-PBD (ADC1)、H01L02A-PBD (ADC5)、H31L02A-PBD (ADC6)和H11L02A-PBD (ADC7)各自的体内抗肿瘤效果。使用动物模型进行评估，其中将CDH6-阳性的人卵巢肿瘤细胞系OV-90接种至免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘天数，且纵坐标描绘肿瘤体积。误差范围描绘SE值。

[图14]图14显示H01L02A-PBD (ADC5)、H31L02A-PBD (ADC6)和抗LPS抗体-PBD(ADC11)各自的体内抗肿瘤效果。使用动物模型进行评估，其中将CDH6-阳性的人卵巢肿瘤细胞系PA-1接种至免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘天数，且纵坐标描绘肿瘤体积。误差范围描绘SE值。

[图15]图15显示H01L02A-PBD (ADC5)、H31L02A-PBD (ADC6)和抗LPS抗体-PBD(ADC11)各自的体内抗肿瘤效果。使用动物模型进行评估，其中将CDH6-阳性的人肾肿瘤细胞系786-O接种至免疫缺陷小鼠中。横坐标描绘天数，且纵坐标描绘肿瘤体积。误差范围描绘SE值。

实施方案的描述

在下文中，将参考附图描述用于实施本发明的优选实施方案。应注意，下面描述的实施方案仅说明了本发明的代表性实施方案，并且不应由于这些实例而将本发明的范围进行狭义解释。

在本说明书中，所使用的术语“癌症”具有与术语“癌”和“肿瘤”的含义相同的含义。

在本说明书中，所使用的术语“基因”不仅包括DNA，而且包括其mRNA和cDNA以及其cRNA。

在本说明书中，所使用的术语“多核苷酸”或“核苷酸”具有与核酸的含义相同的含义，并且还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。在本说明书中，除非另有说明，否则术语“多核苷酸”和“核苷酸”可以彼此可互换使用。

在本说明书中，可以彼此可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”。

在本说明书中，术语“细胞”包括个体动物中的细胞和培养的细胞。

在本说明书中，可以使用术语“CDH6”具有与CDH6蛋白的含义相同的含义。在本说明书中，人CDH6也称为“hCDH6”。

在本说明书中，术语“细胞毒性活性”用于意指以任何给定的方式对细胞造成病理变化。所述术语不仅意指直接外伤，而且意指造成细胞的所有类型的结构或功能损伤，诸如DNA切割、碱基二聚体的形成、染色体切割、对细胞有丝分裂装置的损伤以及各种类型的酶的活性降低。

在本说明书中，短语“在细胞中发挥毒性”用于意指以任何给定方式在细胞中表现出毒性。所述术语不仅意指直接外伤，而且意指造成细胞的所有类型的结构、功能或代谢影响，诸如DNA切割、碱基二聚体的形成、染色体切割、对细胞有丝分裂装置的损伤、各种类型的酶的活性降低和细胞生长因子的效果的抑制。

在本发明中，术语“抗体的功能片段”，也称为“抗体的抗原结合片段”，用于意指具有针对抗原的结合活性的抗体的部分片段，包括Fab、F(ab')2、Fv、scFv、双抗体、由抗体片段形成的线性抗体和多特异性抗体等。在抗体的抗原结合片段中还包括Fab'，其为通过在还原条件下处理F(ab')2而获得的抗体可变区的单价片段。然而，抗体的抗原结合片段不限于这些分子，只要抗原结合片段具有抗原结合能力即可。这些抗原结合片段不仅包括通过用适当酶处理抗体蛋白的全长分子而获得的那些，而且包括使用基因工程改造的抗体基因在适当宿主细胞中产生的蛋白。

本发明的功能片段包括具有IgG重链Fc区中的待用N-连接聚糖修饰的良好保守的天冬酰胺(Asn297或N297)以及Asn297周围的氨基酸、同时保留与抗原的结合活性的功能片段。

在本说明书中，术语“表位”用于意指抗CDH6抗体结合的CDH6的特定部分肽或部分三维结构。这种表位，即上述CDH6的部分肽，可以通过本领域技术人员众所周知的方法确定，例如免疫测定。首先，产生抗原的各种部分结构。关于产生此类部分结构，可以应用已知的寡核苷酸合成技术。例如，通过本领域技术人员众所周知的遗传重组技术产生一系列多肽，其中CDH6已经从其C-末端或N-末端以合适长度连续截短。其后，研究抗体对这些多肽的反应性，并粗略确定识别位点。其后，合成进一步更短的肽，并且可以随后研究其对这些肽的反应性，从而确定表位。当与具有多个胞外结构域的膜蛋白结合的抗体靶向作为表位的由多个结构域构成的三维结构时，可以通过改变特定胞外结构域的氨基酸序列，并且从而改变所述三维结构，来确定抗体结合的结构域。还可以通过经由X-射线结构分析指出与抗体相邻的抗原的氨基酸残基，来确定作为与特定抗体结合的抗原的部分三维结构的表位。

在本说明书中，短语“结合相同表位的抗体”用于意指结合共同表位的抗体。如果第二抗体结合第一抗体结合的部分肽或部分三维结构，则可以确定第一抗体和第二抗体结合相同的表位。或者，即使表位的特定序列或结构尚未确定，可以通过证实第二抗体与第一抗体竞争第一抗体与抗原的结合(即，第二抗体干扰第一抗体与抗原的结合)，确定第一抗体和第二抗体结合相同的表位。在本说明书中，短语“结合相同表位”是指其中通过这些确定方法中的任何一种或两种确定第一抗体和第二抗体结合共同表位的情况。当第一抗体和第二抗体结合相同的表位且进一步地，第一抗体具有特殊效果诸如抗肿瘤活性或内化活性时，可预期第二抗体具有与第一抗体的活性相同的活性。

在本说明书中，术语“CDR”用于意指互补决定区。已知抗体分子的重链和轻链各自具有三个CDR。这样的CDR也称为高变区，并且位于抗体的重链和轻链的可变区中。这些区域具有特别高度可变的一级结构，并且在重链和轻链的每一个的多肽链的一级结构上分开至三个位点。在本说明书中，关于抗体的CDR，重链的CDR从重链的氨基酸序列的氨基-末端侧起分别被称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而轻链的CDR从轻链的氨基酸序列的氨基-末端侧起分别被称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。这些位点在三维结构上彼此接近定位，并且决定抗体对抗原(所述抗体与其结合)的特异性。

在本说明书中，短语“在严格条件下杂交”用于意指杂交在市售的杂交溶液ExpressHyb杂交溶液(由Clontech Laboratories, Inc.制造)中在68℃下实施，或者杂交如下条件(或与其等同的条件)下实施，其中使用DNA固定化过滤器，在0.7-1.0M NaCl存在下，在68℃下实施杂交，并且随后将所得物在68℃下用0.1-2倍浓度的SSC溶液(其中1倍浓度的SSC由150mM NaCl和15mM柠檬酸钠组成)洗涤，用于鉴定。

在本说明书中，术语“一个至几个”用于意指1个至10个、1个至9个、1个至8个、1个至7个、1个至6个、1个至5个、1个至4个、1个至3个或1个或2个。

1. CDH6

钙粘着蛋白是存在于细胞膜表面上的糖蛋白，并且作为细胞-细胞粘附分子通过其N末端胞外结构域的钙离子依赖性结合，或作为负责细胞-细胞相互作用的信号分子发挥功能。经典钙粘着蛋白属于钙粘着蛋白超家族并且是由五个细胞外结构域(EC结构域)、一个跨膜区域和一个细胞内结构域构成的单次跨膜蛋白。

CDH6(钙粘着蛋白6)是由790个氨基酸构成的单次跨膜蛋白，其被分类为II型钙粘着蛋白家族，并且该蛋白具有N-末端细胞外和C-末端细胞内结构域。人CDH6基因是1995年首次克隆的(非专利文献1)，并且其序列可以在例如登录号NM_004932和NP_004923 (NCBI)下参考。

用于本发明的CDH6蛋白可以直接从人或非人哺乳动物(例如大鼠、小鼠或猴)的表达CDH6的细胞中纯化，并且随后可以使用，或者可以制备上述细胞的细胞膜级分并且可以作为CDH6蛋白使用。或者，CDH6也可以通过在体外合成或通过遗传操作而允许宿主细胞产生CDH6而获得。根据这种遗传操作，可以获得CDH6蛋白，具体地，将CDH6 cDNA并入到能够表达CDH6 cDNA的载体中，并且随后在含有酶、底物和转录和翻译所需的能量材料的溶液中合成CDH6，或者通过转化其他原核生物或真核生物的宿主细胞，从而允许其表达CDH6。基于上述遗传操作的表达CDH6的细胞或表达CDH6的细胞系也可以用于呈递CDH6蛋白。或者，可以直接向待免疫的动物施用已并入CDH6 cDNA的表达载体，并且CDH6可以在如此免疫的动物体内表达。

此外，术语“CDH6”中还包括如下的蛋白，其由包含在上述CDH6的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或添加的氨基酸序列组成，并且具有与CDH6蛋白等同的生物活性。

人CDH6蛋白具有SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列。人CDH6蛋白的细胞外区域由以下构成：具有SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列中的第54位至第159位氨基酸的细胞外结构域1(在本说明书中，也称为EC1)，具有SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列中的第160位至第268位氨基酸的细胞外结构域2(在本说明书中，也称为EC2)，具有SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列中的第269位至第383位氨基酸的细胞外结构域3(在本说明书中，也称为EC3)，具有SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列中的第384位至第486位氨基酸的细胞外结构域4(在本说明书中，也称为EC4)，和具有SEQ ID NO:1中显示的氨基酸序列中的第487位至第608位氨基酸的细胞外结构域5(在本说明书中，也称为EC5)。EC1至EC5的氨基酸序列分别由SEQID NO:2至6代表(表1)。

2. 抗CDH6抗体的产生

本发明的抗CDH6抗体的一个实例可以包括这样的抗CDH6抗体，其识别包含SEQ IDNO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列，且具有内化活性。本发明的抗CDH6抗体的一个实例可以包括这样的抗CDH6抗体，其特异性识别包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列，且具有内化活性。本发明的抗CDH6抗体的一个实例可以包括这样的抗CDH6抗体，其识别由SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列组成的氨基酸序列，且具有内化活性。本发明的抗CDH6抗体的一个实例可以包括这样的抗CDH6抗体，其特异性识别由SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列组成的氨基酸序列，且具有内化活性。如应用至抗体的短语“特异性识别包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列”或“特异性识别EC3结构域”用于意味着，与CDH6的其他胞外结构域相比，抗体强烈识别或强烈结合CDH6的EC3结构域。

本发明的抗CDH6抗体可以衍生自任何物种。所述物种的优选实例可包括人、猴、大鼠、小鼠和兔。当本发明的抗CDH6抗体衍生自除人以外的物种时，优选通过众所周知的技术使抗CDH6抗体嵌合或人源化。本发明的抗体可以是多克隆抗体，或者可以是单克隆抗体，且优选单克隆抗体。

本发明的抗CDH6抗体是可以靶向肿瘤细胞的抗体。具体地，本发明的抗CDH6抗体具有能够识别肿瘤细胞的特性，能够与肿瘤细胞结合的特性，和/或通过细胞摄取而内化至肿瘤细胞中的特性等。因此，本发明的抗CDH6抗体可以经由接头与具有抗肿瘤活性的化合物缀合，以制备抗体-药物缀合物。

可以通过流式细胞术确认抗体对肿瘤细胞的结合活性。可以通过以下证实抗体至肿瘤细胞中的摄取：(1)使用结合抗体的二级抗体(荧光标记的)，在荧光显微镜下观察细胞摄取的抗体的测定(Cell Death and Differentiation 2008, 15, 751-761)，(2)使用结合抗体的二级抗体(荧光标记的)，测量细胞摄取荧光量的测定(Molecular Biology ofthe Cell Vol. 15, 5268-5282, 2004年12月)，或(3)使用结合抗体的免疫毒素的Mab-ZAP测定，其中所述毒素在细胞摄取时释放，从而抑制细胞生长(Bio Techniques 28: 162-165, 2000年1月)。白喉毒素的催化区域和蛋白G的重组缀合蛋白可用作免疫毒素。

在本说明书中，术语“高内化能力”用于意指已经施用上述抗体和皂草素标记的抗大鼠IgG抗体的表达CDH6的细胞的存活率(其通过相对于定义为100%的没有添加抗体的细胞存活率的比率指示)，优选为70%或更少，且更优选为60%或更少。

抗体-药物缀合物包含发挥抗肿瘤作用的缀合的化合物。因此，优选但非必需的，抗体本身应具有抗肿瘤作用。为了特异性和/或选择性地在肿瘤细胞中发挥抗肿瘤化合物的细胞毒性的目的，重要且优选的是所述抗体应具有内化并转移到肿瘤细胞中的特性。

抗CDH6抗体可以通过如下获得：按本领域通常实施的方法，使用充当抗原的多肽免疫动物，并且随后收集和纯化在其活体中产生的抗体。优选使用保留三维结构的CDH6作为抗原。这种方法的实例可包括DNA免疫方法。

抗原的来源不限于人，并且因此也可以使用来源于非人动物如小鼠或大鼠的抗原免疫动物。在此方面，可以通过检验所获得的结合异源抗原的抗体与人抗原的交叉反应性来选择适用于人类疾病的抗体。

此外，可以根据已知方法，将产生针对抗原的抗体的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合(例如，Kohler和Milstein, Nature(1975)256, 495-497；和Kennet, R.编辑,Monoclonal Antibodies, 365-367, Plenum Press, N. Y.(1980))以建立杂交瘤，从而获得单克隆抗体。

在下文中，将具体描述获得针对CDH6的抗体的方法。

(1)抗原的制备

可以根据遗传操作，通过允许宿主细胞产生编码抗原蛋白的基因而获得抗原。具体地，产生能够表达抗原基因的载体，并且随后将载体导入宿主细胞，从而在其中表达基因，并且随后，可以纯化表达的抗原。抗体还可以通过使用基于上述遗传操作的抗原表达细胞或表达所述抗原的细胞系免疫动物的方法来获得。

或者，也可以不使用抗原蛋白，通过将抗原蛋白的cDNA并入表达载体中，然后将所述表达载体施用至待免疫的动物，并在因此免疫的所述动物体内表达抗原蛋白，从而在其中产生针对所述抗原蛋白的抗体。

(2)抗CDH6单克隆抗体的产生

用于本发明的抗CDH6抗体没有特别限制。例如，可以适当地使用由本申请的序列表中所示的氨基酸序列指定的抗体。用于本发明的抗CDH6抗体理想地是具有以下特性的抗体：

(1)具有以下特性的抗体：

(a)特异性结合CDH6，和

(b)具有通过与CDH6结合而内化至表达CDH6的细胞中的活性；

(2)根据上述(1)所述的抗体或上述抗体，其中，所述CDH6是人CDH6；和

(3)特异性识别人CDH6的EC3，并具有内化活性。

获得本发明的针对CDH6的抗体的方法没有特别限制，只要可以获得抗CDH6抗体即可。优选使用保留其构象的CDH6作为抗原。

获得所述抗体的方法的一个优选实例可包括DNA免疫方法。DNA免疫方法是涉及以下的方法：用抗原表达质粒转染动物(例如小鼠或大鼠)个体，并随后在所述个体中表达抗原以诱导针所述抗原的免疫。转染方法包括将质粒直接注射到肌肉中的方法，将诸如脂质体或聚乙烯亚胺的转染试剂注射到静中脉的方法，使用病毒载体的方法，使用基因枪注射附接质粒的金颗粒的方法，将大量质粒溶液快速注入静脉中的流体动力学方法等。关于将表达质粒注射到肌肉中的转染方法，作为提高表达水平的方法，已知称为体内电穿孔的技术，其涉及将电穿孔应用于质粒的肌内注射部位(Aihara H, Miyazaki J. NatBiotechnol. 1998年9月; 16 (9): 867-70 或Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R,Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. ProcNatl Acad Sci U S A. 1999年4月13日; 96 (8): 4262-7)。该方法通过使用透明质酸酶处理肌肉，随后肌内注射质粒来进一步提高表达水平(McMahon JM1, Signori E, WellsKE, Fazio VM, Wells DJ., Gene Ther. 2001 Aug; 8 (16): 1264-70)。此外，杂交瘤的产生可以通过已知方法进行，并且也可以使用例如Hybrimune杂交瘤生产系统(Cyto PulseSciences, Inc.)进行。

获得单克隆抗体的具体实例还可包括以下程序：

(a)通过将CDH6 cDNA并入表达载体(例如，pcDNA3.1；Thermo Fisher ScientificInc.)中，并通过例如电穿孔或使用基因枪的方法，将载体直接施用至待免疫的动物(例如，大鼠或小鼠)，从而在所述动物体内表达CDH6，可以诱导免疫应答。如果需要增加抗体滴度，通过电穿孔等的载体施用可以进行一次或多次，优选多次；

(b)从已诱导免疫应答的上述动物收集含有产生抗体的细胞的组织(例如，淋巴结)；

(c)制备骨髓瘤细胞(下文称为“骨髓瘤”)(例如，小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞)；

(d)产生抗体的细胞和骨髓瘤之间的细胞融合；

(e)选择产生目标抗体的杂交瘤组；

(f)分成单细胞克隆(克隆)；

(g)任选地，培养杂交瘤用于单克隆抗体的大量生产，或培育其中接种杂交瘤的动物；和/或

(h)研究由此产生的单克隆抗体的生理活性(内化活性)和结合特异性，或检测抗体作为标记试剂的特性。

用于测量本文中使用的抗体滴度的方法的实例可包括但不限于流式细胞术和细胞ELISA。

如此建立的杂交瘤株的实例可包括产生抗CDH6抗体的杂交瘤rG019。应注意，在本说明书中，由产生抗CDH6抗体的杂交瘤rG019产生的抗体被称为“rG019抗体”或简称为“rG019”。

rG019抗体的轻链可变区由SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列组成。rG019抗体的轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:11中显示的核苷酸序列编码。rG019抗体的轻链可变区具有由SEQ ID NO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3。rG019抗体的重链可变区由SEQ ID NO:15中显示的氨基酸序列组成。rG019抗体的重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:16中显示的核苷酸序列编码。rG019抗体的重链可变区具有由SEQ IDNO:17中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:18中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:19中显示的氨基酸序列组成的CDRH3。

进一步，即使再次通过“2. 抗CDH6抗体的产生”中的步骤(a)至(h)独立地获得单克隆抗体，或者通过使用另一种方法分开获得单克隆抗体，可以获得具有与rG019抗体的内化活性等效的内化活性的抗体。此类抗体的一个实例是结合与rG019抗体所结合的表位相同的表位的抗体。如果新产生的单克隆抗体结合rG019抗体结合的部分肽或部分三维结构，则可以确定该单克隆抗体结合与rG019抗体所结合的表位相同的表位。通过证实单克隆抗体与rG019抗体竞争与CDH6的结合(即，单克隆抗体干扰rG019抗体和CDH6之间的结合)，甚至当未确定表位的特定序列或结构时，可以确定单克隆抗体结合与抗CDH6抗体所结合的表位相同的表位。如果已经证实表位身份，则强烈预期该单克隆抗体具有与rG019抗体等效的抗原结合能力、生物活性和/或内化活性。

(3)其他抗体

本发明的抗体还包括为了降低对人的异源抗原性的目的而人工修饰的遗传重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体，以及上述针对CDH6的单克隆抗体。这些抗体可以通过已知方法来产生。

嵌合抗体的实例可包括这样的抗体，其中可变区和恒定区彼此异源，例如通过将小鼠或大鼠衍生的抗体的可变区与人衍生的恒定区缀合而形成的嵌合抗体(参见Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984))。

衍生自大鼠抗人CDH6抗体的嵌合抗体的实例包括由以下组成的抗体：包含本说明书中描述的大鼠抗人CDH6抗体(例如，rG019抗体)的轻链可变区和人衍生的恒定区的轻链，以及包含大鼠抗人CDH6抗体的重链可变区和人衍生的恒定区的重链。

衍生自大鼠抗人CDH6抗体的嵌合抗体的其他实例包括由以下组成的抗体：包含用其他氨基酸残基取代本说明书中描述的大鼠抗人CDH6抗体(例如，rG019抗体)的轻链可变区中的氨基酸的一个至几个残基、1至3个残基、1或2个残基、优选1个残基的轻链可变区的轻链，以及包含用其他氨基酸残基取代大鼠抗人CDH6抗体的重链可变区中的氨基酸的一个至几个残基、1至3个残基、1或2个残基、优选1个残基的重链可变区的重链。该抗体可以具有任何给定的人衍生的恒定区。

衍生自大鼠抗人CDH6抗体的嵌合抗体的其他实例包括由以下组成的抗体：包含用其他氨基酸残基取代本说明书中描述的大鼠抗人CDH6抗体(例如，rG019抗体)的轻链可变区中的任何1至3个CDR中的氨基酸的1或2个残基、优选1个残基的轻链可变区的轻链，以及包含用其他氨基酸残基取代大鼠抗人CDH6抗体的重链可变区中的任何1至3个CDR中的氨基酸的1或2个残基、优选1个残基的重链可变区的重链。该抗体可以具有任何给定的人衍生的恒定区。

衍生自rG019抗体的嵌合抗体的实例包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链包含由SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区，且所述重链包含由SEQ ID NO:15中显示的氨基酸序列组成的重链可变区。该抗体可以具有任何给定的人衍生的恒定区。

衍生自rG019抗体的嵌合抗体的其他实例包括由以下组成的抗体：包含用其他氨基酸残基取代由SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区中的氨基酸的一个至几个残基、1至3个残基、1或2个残基、优选1个残基的轻链可变区的轻链，以及包含用其他氨基酸残基取代由SEQ ID NO:15中显示的氨基酸序列组成的重链可变区中的氨基酸的一个至几个残基、1至3个残基、1或2个残基、优选1个残基的重链可变区的重链。该抗体可以具有任何给定的人衍生的恒定区。

衍生自rG019抗体的嵌合抗体的其他实例包括由以下组成的抗体：包含用其他氨基酸残基取代由SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区中的任何1至3个CDR中的氨基酸的1或2个残基(优选1个残基)的轻链可变区的轻链，以及包含用其他氨基酸残基取代由SEQ ID NO:15中显示的氨基酸序列组成的重链可变区中的任何1至3个CDR中的氨基酸的1或2个残基(优选1个残基)的重链可变区的重链。该抗体可以具有任何给定的人衍生的恒定区。

衍生自rG019抗体的嵌合抗体的其他实例包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链包含由SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区，且所述重链包含由SEQ IDNO:28中显示的氨基酸序列组成的重链可变区。该抗体可以具有任何给定的人衍生的恒定区。SEQ ID NO:28中显示的氨基酸序列是在SEQ ID NO:15中显示的氨基酸序列中的CDRH2中半胱氨酸残基被脯氨酸残基取代的序列。

衍生自rG019抗体的嵌合抗体的具体实例包括由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:23中显示的轻链全长氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:26中显示的重链全长氨基酸序列组成。在本说明书中，该嵌合抗人CDH6抗体被称为“嵌合G019抗体”、“chG019抗体”或“chG019”。chG019抗体的轻链全长氨基酸序列由SEQ ID NO:24中显示的核苷酸序列编码，且chG019抗体的重链全长氨基酸序列由SEQ ID NO:27中显示的核苷酸序列编码。

chG019抗体的轻链可变区的氨基酸序列与rG019抗体的轻链可变区的氨基酸序列相同，并且由SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列组成。chG019抗体的轻链具有由SEQ IDNO:12中显示的氨基酸序列组成的CDRL1，由SEQ ID NO:13中显示的氨基酸序列组成的CDRL2，和由SEQ ID NO:14中显示的氨基酸序列组成的CDRL3，其分别与rG019的轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3相同。chG019抗体的轻链可变区的氨基酸由SEQ ID NO:25中显示的核苷酸序列编码。

chG019抗体的重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:28中显示的氨基酸序列组成。chG019抗体的重链具有由SEQ ID NO:17中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ IDNO:30中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:19中显示的氨基酸序列组成的CDRH3。SEQ ID NO:28中显示的氨基酸序列是在SEQ ID NO:15中显示的氨基酸序列中的CDRH2中半胱氨酸残基被脯氨酸残基取代的序列。由SEQ ID NO:30中显示的氨基酸序列组成的CDRH2是在SEQ ID NO:18中显示的rG019 CDRH2中半胱氨酸残基被脯氨酸残基取代的序列。chG019抗体的重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO:29中显示的核苷酸序列编码。

人源化抗体的实例可包括通过仅将互补决定区(CDR)并入人衍生的抗体而形成的抗体(参见Nature(1986)321，p. 522-525)，通过根据CDR移植方法，将来自一些骨架区以及CDR序列的氨基酸残基并入人抗体形成的抗体(国际公开号WO90/07861)，和通过修饰一些CDR的氨基酸序列同时保留抗原结合能力而形成的抗体。

在本说明书中，衍生自rG019抗体或chG019抗体的人源化抗体不限于特定的人源化抗体，只要人源化抗体保留对于rG019抗体或chG019抗体独特的所有6个CDR序列并且具有内化活性。可以进一步修饰该人源化抗体的一些CDR的氨基酸序列，只要所述抗体具有内化活性。

chG019抗体的人源化抗体的具体实例可以包括以下的任何给定组合：轻链，其包含由选自以下的任何一种氨基酸序列组成的轻链可变区：(1)由SEQ ID NO:33或37中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区，(2)与上述氨基酸序列(1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列(优选与除了每个CDR序列以外的骨架区的序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列)，和(3)包含上述氨基酸序列(1)中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；和重链，其包含由选自以下的任何一种氨基酸序列组成的重链可变区：(4)由SEQ IDNO:41、45、49、55或60中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，(5)与上述氨基酸序列(4)具有至少95%的同一性的氨基酸序列(优选与除了每个CDR序列以外的骨架区的序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列)，和(6)包含上述氨基酸序列(4)中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。

或者，还可以使用具有人源化重链或轻链以及衍生自大鼠抗体或嵌合抗体的另一链的抗体。这种抗体的实例可以包括以下的任何给定组合：轻链，其包含由选自以下的任何一种氨基酸序列组成的轻链可变区：(1)由SEQ ID NO:33或37中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区，(2)与上述氨基酸序列(1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列(优选与除了每个CDR序列以外的骨架区的序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列)，和(3)包含上述氨基酸序列(1)中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；和重链，其包含由选自以下的任何一种氨基酸序列组成的重链可变区：(4)由SEQ ID NO:15或28中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，(5)与上述氨基酸序列(4)具有至少95%的同一性的氨基酸序列(优选与除了每个CDR序列以外的骨架区的序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列)，和(6)包含上述氨基酸序列(4)中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。这种抗体的其他实例可以包括以下的任何给定组合：轻链，其包含由选自以下的任何一种氨基酸序列组成的轻链可变区：(1)由SEQ ID NO:10中显示的氨基酸序列组成的轻链可变区，(2)与上述氨基酸序列(1)具有至少95%的同一性的氨基酸序列(优选与除了每个CDR序列以外的骨架区的序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列)，和(3)包含上述氨基酸序列(1)中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列；和重链，其包含由选自以下的任何一种氨基酸序列组成的重链可变区：(4)由SEQ ID NO:41、45、49、55或60中显示的氨基酸序列组成的重链可变区，(5)与上述氨基酸序列(4)具有至少95%的同一性的氨基酸序列(优选与除了每个CDR序列以外的骨架区的序列具有至少95%的同一性的氨基酸序列)，和(6)包含上述氨基酸序列(4)中的一个或几个氨基酸的缺失、取代或添加的氨基酸序列。

本说明书中的氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。保守氨基酸取代是在与某些氨基酸侧链相关的氨基酸组内发生的取代。优选的氨基酸基团如下：酸性基团=天冬氨酸和谷氨酸；碱性基团=赖氨酸、精氨酸和组氨酸；非极性基团=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸；和不带电极性家族=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。其他优选的氨基酸基团如下：脂肪族羟基基团=丝氨酸和苏氨酸；含酰胺基团=天冬酰胺和谷氨酰胺；脂肪族基团=丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；和芳香族基团=苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。优选进行这种氨基酸取代而不损害具有原始氨基酸序列的物质的特性。

具有上述轻链和重链的优选组合的抗体的实例包括由以下组成的抗体：具有SEQID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列(在本说明书中，也称为hL02轻链可变区氨基酸序列)的轻链或具有SEQ ID NO:.37中显示的轻链可变区氨基酸序列(在本说明书中，也称为hL03轻链可变区氨基酸序列)的轻链，和具有SEQ ID NO:41中显示的重链可变区氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH01重链可变区氨基酸序列)的重链，具有SEQ ID NO:45中显示的重链可变区氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH02重链可变区氨基酸序列)的重链或具有SEQ ID NO:49中显示的重链可变区氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH04重链可变区氨基酸序列)的重链，具有SEQ ID NO:55中显示的重链可变区氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH11重链可变区氨基酸序列)的重链或具有SEQ ID NO:60中显示的重链可变区氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH31重链可变区氨基酸序列)的重链。

SEQ ID NO:55中显示的hH11重链可变区氨基酸序列具有由SEQ ID NO:57中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:58中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQID NO:59中显示的氨基酸序列组成的CDRH3。SEQ ID NO:60中显示的hH31重链可变区氨基酸序列具有由SEQ ID NO:62中显示的氨基酸序列组成的CDRH1，由SEQ ID NO:63中显示的氨基酸序列组成的CDRH2，和由SEQ ID NO:64中显示的氨基酸序列组成的CDRH3。

所述抗体的优选实例包括：

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:41中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:45中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:49中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:55中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:60中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:37中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:41中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:37中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:45中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:37中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:49中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:37中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:55中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；和

由具有SEQ ID NO:37中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:60中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体。

所述抗体的更优选实例包括：

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:41中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:45中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:49中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:37中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:45中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:55中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体；和

由具有SEQ ID NO:33中显示的轻链可变区氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO:60中显示的重链可变区氨基酸序列的重链组成的抗体。

具有轻链和重链的优选组合的抗体的其他实例包括由以下组成的抗体：由SEQ IDNO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列(在本说明书中，也称为hL02轻链全长氨基酸序列)组成的轻链或由SEQ ID NO:35中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列(在本说明书中，也称为hL03轻链全长氨基酸序列)组成的轻链或由SEQ ID NO:39中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH01重链全长氨基酸序列)组成的重链，由SEQ ID NO:43中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH02重链全长氨基酸序列)组成的重链，由SEQ ID NO:47中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH04重链全长氨基酸序列)组成的重链，由SEQ ID NO:65中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH01A重链全长氨基酸序列)组成的重链，由SEQ ID NO:67中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH11A重链全长氨基酸序列)组成的重链或由SEQ ID NO:69中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列(在本说明书中，也称为hH31A重链全长氨基酸序列)组成的重链。

另一种优选抗体的实例包括，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:39中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:43中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:47中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:65中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:67中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:69中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:35中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:39中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:35中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:43中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:35中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:47中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:35中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:65中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:35中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:67中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成，或

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:35中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:69中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成。

一种更优选抗体的实例包括

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:39中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成(在本说明书中，也称为"H01L02抗体"或"H01L02")，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:43中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成(在本说明书中，也称为"H02L02抗体"或"H02L02")，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:47中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成(在本说明书中，也称为"H04L02抗体"或"H04L02")，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:35中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:43中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成(在本说明书中，也称为"H02L03抗体"或"H02L03")，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:65中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成(在本说明书中，也称为"H01L02A抗体"或"H01L02A")，

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:67中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成(在本说明书中，也称为"H11L02A抗体"或"H11L02A")，和

由轻链和重链组成的抗体，所述轻链由SEQ ID NO:31中显示的轻链全长氨基酸序列中的位置21至233的氨基酸序列组成，且所述重链由SEQ ID NO:69中显示的重链全长氨基酸序列中的位置20至471的氨基酸序列组成(在本说明书中，也称为"H31L02A抗体"或"H31L02A")。

通过将显示与上述重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列高同一性的序列组合在一起，可以选择与上述抗体中的每一个具有等同的生物活性的抗体。此同一性通常为80%或更多、优选90%或更多、更优选95%或更多且最优选99%或更多的同一性。此外，还通过组合包含对于重链或轻链的氨基酸序列其一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的重链和轻链的氨基酸序列，可以选择与上述抗体中的每一个具有等同的生物活性的抗体。

可以通过使用Clustal W版本2的默认参数比对序列来测定两种类型的氨基酸序列之间的同一性(Larkin MA, Blackshields G, Brown NP, Chenna R, McGettigan PA,McWilliam H, Valentin F, Wallace IM, Wilm A, Lopez R, Thompson JD, Gibson TJ和Higgins DG (2007),"Clustal W and Clustal X version 2.0", Bioinformatics. 23(21): 2947-2948)。

应注意，在SEQ ID NO:31中显示的hL02轻链全长氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，且由位置129至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。

在SEQ ID NO:35中显示的hL03轻链全长氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置21至128的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，且由位置129至233的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。

在SEQ ID NO:39中显示的hH01重链全长氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至141的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，且由位置142至471的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。

在SEQ ID NO:43中显示的hH02重链全长氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至141的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，且由位置142至471的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。

在SEQ ID NO:47中显示的hH04重链全长氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至141的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，且由位置142至471的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。

在SEQ ID NO:65中显示的hH01A重链全长氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至141的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，且由位置142至471的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。

在SEQ ID NO:67中显示的hH11A重链全长氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至141的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，且由位置142至471的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。

在SEQ ID NO:69中显示的hH31A重链全长氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由位置20至141的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，且由位置142至471的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。

本发明的抗体的其他实例可以包括结合CDH6的人抗体。抗CDH6人抗体是指仅具有衍生自人染色体的抗体的基因序列的人抗体。抗CDH6人抗体可以通过使用具有人染色体片段的产生人抗体的小鼠的方法获得，所述人染色体片段包含人抗体的重链和轻链基因(参见Tomizuka, K.等人, Nature Genetics(1997)16, p. 133-143；Kuroiwa, Y. 等人,Nucl.Acids Res.(1998)26, p. 3447-3448；Yoshida, H. 等人, Animal CellTechnology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y.,Matsuda, T.和Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999；Tomizuka, K.等人, Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97, p. 722-727；等)。

这种产生人抗体的小鼠可以通过使用遗传修饰的动物特异性地产生，其内源免疫球蛋白重链和轻链的基因座已经被破坏，并且代之以使用酵母人工染色体(YAC)载体等引入人免疫球蛋白重链和轻链的基因座，随后从这种基因修饰动物产生敲除动物和转基因动物，并且随后将这些动物彼此繁殖。

另外，根据遗传重组技术，也可以通过使用编码这种人抗体的每条重链和轻链的cDNA，或优选用包含此类cDNA的载体转化真核细胞，并随后培养转化的细胞，并产生遗传修饰的人单克隆抗体，从而可以从培养物上清液中获得抗体，来获得抗CDH6人抗体。

在该上下文中，例如可以使用真核细胞，并优选哺乳动物细胞，例如CHO细胞、淋巴细胞或骨髓瘤，作为宿主。

获得已从人抗体文库中选择的噬菌体展示衍生的人抗体的方法也是已知的(参见Wormstone，IM等人，Investigative Ophthalmology＆Visual Science.(2002)43 (7),p.2301-2308；Carmen, S.等人, Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002), 1 (2), p. 189-203；Siriwardena, D. 等人, Ophthalmology(2002)109 (3),p. 427-431；等)。

例如，可以应用噬菌体展示方法，其包括使人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)在噬菌体表面上表达，且然后选择与抗原结合的噬菌体(Nature Biotechnology(2005),23,(9), pp. 1105-1116)。

通过分析由于其与抗原的结合能力而被选择的噬菌体基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。

一旦确定了与抗原结合的scFv的DNA序列，就产生具有上述序列的表达载体，然后将产生的表达载体导入合适的宿主中并允许其在其中表达，从而获得人抗体(国际公开号WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438,和WO95/15388, Annu.Rev. Immunol(1994)12, p. 433-455, Nature Biotechnology(2005)23 (9), p. 1105-1116)。

如果新产生的人抗体结合本说明书中描述的任一种大鼠抗人CDH6抗体、嵌合抗人CDH6抗体或人源化抗人CDH6抗体(例如，rG019抗体、chG019抗体、H01L02抗体、H02L02抗体、H02L03抗体、H04L02抗体、H01L02A抗体、H11L02A抗体或H31L02A抗体)与之结合的部分肽或部分三维结构，则可以确定人抗体结合大鼠抗人CDH6抗体、嵌合抗人CDH6抗体或人源化抗人CDH6抗体与之结合的相同表位。或者，通过证实人抗体与本说明书中描述的大鼠抗人CDH6抗体、嵌合抗人CDH6抗体或人源化抗人CDH6抗体(例如，rG019抗体、chG019抗体、H01L02抗体、H02L02抗体、H02L03抗体、H04L02抗体、H01L02A抗体、H11L02A抗体或H31L02A抗体)竞争抗体与CDH6的结合(例如，所述人抗体干扰rG019抗体、chG019抗体、H01L02抗体、H02L02抗体、H02L03抗体、H04L02抗体、H01L02A抗体、H11L02A抗体或H31L02A抗体与CDH6(优选CDH6的EC3)的结合)，可以确定所述人抗体结合本说明书中描述的大鼠抗人CDH6抗体、嵌合抗人CDH6抗体或人源化抗人CDH6抗体与之结合的相同表位，即使尚未确定表位的具体序列或结构。在本说明书中，当通过这些确定方法中的至少任何一种确定人抗体“结合相同的表位”时，得出结论，新制备的人抗体与本说明书中描述的大鼠抗人CDH6抗体、嵌合抗人CDH6抗体或人源化抗人CDH6抗体“结合相同的表位”。当证实人抗体结合相同的表位时，则预期人抗体应当具有与大鼠抗人CDH6抗体、嵌合抗人CDH6抗体或人源化抗人CDH6抗体(例如，rG019抗体、chG019抗体、H01L02抗体、H02L02抗体、H02L03抗体、H04L02抗体、H01L02A抗体、H11L02A抗体或H31L02A抗体)等同的生物活性。

根据已知方法等评价通过上述方法获得的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体其对抗原的结合活性，使得可以选择优选的抗体。

用于比较抗体特性的另一指标的一个实例可以包括抗体的稳定性。差示扫描量热计(DSC)是能够迅速而精确地测量热变性中点(Tm)的装置，所述热变性中点(Tm)充当蛋白的相对结构稳定性的良好指标。通过使用DSC测量Tm值并对获得的值进行比较，可以比较热稳定性的差异。已知抗体的保存稳定性与抗体的热稳定性具有一定的相关性(Lori Burton等人，Pharmaceutical Development and Technology(2007)12，第265-273页)，并且因此，可以使用热稳定性作为指标来选择的优选抗体。用于选择抗体的指标的其他实例可以包括在合适的宿主细胞中的高产率和在水溶液中的低凝集性。例如，由于具有最高产率的抗体并不总是表现出最高的热稳定性，因此有必要通过基于上述指标对其进行综合确定来选择最适合于对人施用的抗体。

本发明的抗体还包括抗体的修饰。所述修饰用于意指本发明的抗体，其是化学或生物学修饰的。这种化学修饰的实例包括化学部分与氨基酸骨架的结合，以及N-连接或O-连接的碳水化合物链的化学修饰。这种生物学修饰的实例包括已经历翻译后修饰的抗体(例如，N-连接或O-连接的糖基化、N-末端或C-末端加工、脱酰胺作用、天冬氨酸的异构化、甲硫氨酸的氧化和N-末端谷氨酰胺或N-末端谷氨酸转化为焦谷氨酸)，和由于允许使用原核生物宿主细胞表达而向其N-末端添加甲硫氨酸残基的抗体。另外，这种修饰意味着还包括能够检测或分离本发明的抗体或抗原的标记抗体，例如酶标记抗体，荧光标记抗体和亲和标记抗体。本发明的抗体的这种修饰可用于改善抗体的血液中的稳定性和保留、降低抗原性、检测或分离抗体或抗原等。

此外，通过调节与本发明的抗体结合的糖链修饰(糖基化、去岩藻糖基化等)，可以增强抗体依赖性细胞细胞毒性活性。作为调节抗体的糖链修饰的技术，国际公开号WO1999/54342、WO2000/61739、WO2002/31140和WO2007/133855等中描述的那些是已知的，但是技术不限于此。本发明的抗体还包括其中已经调节上述糖链修饰的抗体。

一旦分离出抗体基因，可以使用宿主和表达载体的适当组合将基因导入适当的宿主以产生抗体。抗体基因的具体实例可以是编码本说明书中描述的抗体的重链序列的基因和编码其中描述的抗体的轻链序列的基因的组合。在转化宿主细胞后，可以将这种重链序列基因和轻链序列基因插入单个表达载体中，或者可以将这些基因各自插入不同的表达载体中。

当真核细胞用作宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。具体地，动物细胞的实例可包括哺乳动物细胞，例如作为猴细胞的COS细胞(Gluzman，Y.，Cell(1981)23，p.175-182，ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)、中国仓鼠卵巢细胞的二氢叶酸还原酶缺陷型细胞系(CHO细胞，ATCC CCL-61)(Urlaub，G.和Chasin，LA Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77, p. 4126-4220)，和FreeStyle 293F 细胞(Invitrogen Corp.)。

当原核细胞用作宿主时，例如可以使用大肠杆菌(

将目标抗体基因引入这些细胞中进行转化，并且随后在体外培养转化的细胞以获得抗体。在上述培养中，存在产率取决于抗体的序列而不同的情况，且因此可以使用产率作为指标，从具有等同结合活性的抗体选择容易作为药物产生的抗体。因此，本发明的抗体还包括通过上述抗体产生方法获得的抗体，其包括培养转化的宿主细胞的步骤和从上述步骤获得的培养物中收集目标抗体或抗体的功能片段的步骤。

已知将通过培养哺乳动物细胞产生的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基缺失(Journal of Chromatography A, 705:129-134 (1995))，并且此外，已知将在重链羧基末端的两个氨基酸残基甘氨酸和赖氨酸缺失，并且位于羧基末端的脯氨酸残基被酰胺化(Analytical Biochemistry, 360:75-83 (2007))。然而，这些重链序列的缺失和修饰对抗体的抗原-结合活性和效应子功能(补体的活化、抗体依赖性细胞细胞毒性等)没有影响。因此，根据本发明的抗体也包括已经历上述修饰的抗体，和所述抗体的功能片段，并且此类抗体的特定实例包括包含在重链羧基端的1或2个氨基酸缺失的缺失突变体，和通过酰胺化上述缺失突变体(例如其中在羧基末端的脯氨酸残基被酰胺化的重链)形成的缺失突变体。然而，涉及根据本发明的抗体重链的羧基末端缺失的缺失突变体不限于上述缺失突变体，只要它们保留抗原结合活性和效应子功能即可。构成根据本发明的抗体的两条重链可以是选自全长抗体和上述缺失突变体的组的任一类型的重链，或者可以是选自上述组的任意两种类型的组合。各个缺失突变体的比例可受产生本发明抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件的影响。根据本发明的抗体的主要成分的实例可包括其中在两条重链的每个羧基末端缺失一个氨基酸残基的抗体。

本发明抗体同种型的实例可包括IgG (IgG1、IgG3和IgG4)。其中，优选IgG1、IgG2和IgG4。

如果使用IgG1作为本发明的抗体的同种型，则可以通过取代恒定区中的一些氨基酸残基来调节效应子功能。具有降低或减弱的效应子功能的IgG1变体的实例可以包括但不限于IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A)和IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A) (Journal ofVirology, Vol. 75, No. 24(Dec. 15, 2001), pp. 12161-12168)，并且IgG1的优选变体是IgG1 LALA。L234A，L235A指示在通过EU-索引编号(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,Vol. 63, No. 1 (May 15, 1969), pp. 78-85)指定的234-和235-位置用丙氨酸取代亮氨酸，并且G237A指示在通过EU-索引编号指定的237-位置用丙氨酸取代甘氨酸。

抗体的生物活性的典型实例可以包括但不限于抗原结合活性，通过与抗原结合而内化至表达抗原的细胞中的活性，中和抗原活性的活性，增强抗原活性的活性，抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)，补体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)，并且根据本发明的抗体的功能是对CDH6的结合活性，并且优选通过与CDH6结合而内化至CDH6表达细胞中的活性。除了细胞内化活性以外，本发明的抗体可以组合具有ADCC、CDC和/或ADCP的活性。

可以将获得的抗体纯化至同质状态。为了分离/纯化抗体，可以使用通常用于蛋白的分离/纯化方法。例如，所述抗体可以通过如下分离/纯化：适当选择和组合柱色谱、过滤器过滤、超滤、盐析、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等等(Strategies forProtein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, DanielR. Marshak等人编, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；和Antibodies: ALaboratory Manual.Ed Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但分离/纯化方法不限于此。

所述色谱的实例可以包括亲和色谱、离子交换色谱、疏水性色谱、凝胶过滤色谱、反向色谱和吸附色谱。

这些色谱可以使用液相色谱诸如HPLC或FPLC进行。

用于亲和色谱的柱的实例可以包括但不限于蛋白A柱和蛋白G柱。可以用作蛋白A柱的柱的实例包括Hyper D、POROS和Sepharose F. F. (Pharmacia)。

或者，可以用与抗原已经与之固定的载体，通过利用与抗原的结合活性来纯化抗体。

本发明涉及编码本发明的抗体的多核苷酸。本发明的多核苷酸优选为包含以下(a)至(e)中任一者中描述的多核苷酸的多核苷酸：

(a)编码本发明的CDH6抗体的重链氨基酸序列的多核苷酸和编码本发明的CDH6抗体的轻链氨基酸序列的多核苷酸的组合，

(b)编码本发明的CDH6抗体中的任一种的重链氨基酸序列(包括CDRH1至CDRH3的序列)的多核苷酸和编码本发明的CDH6抗体中的任一种的轻链氨基酸序列(包括CDRL1至CDRL3的序列)的多核苷酸的组合，

(c)编码包含本发明的CDH6抗体的重链可变区的氨基酸序列的重链氨基酸序列的多核苷酸和编码包含本发明的CDH6抗体的轻链可变区的氨基酸序列的轻链氨基酸序列的多核苷酸的组合，

(d)在严格条件下与由与根据(a)至(c)中任一者的多核苷酸互补的多核苷酸组成的核苷酸可杂交且编码能够结合CDH6的抗体的氨基酸序列的多核苷酸，和

(e)编码通过在根据(a)至(c)中任一者的多核苷酸中取代、缺失、添加或插入1至50、1至45、1至40、1至35、1至30、1至25、1至20、1至15、1至10、1至8、1至6、1至5、1至4、1至3、1或2或1个氨基酸而获得的多肽的氨基酸序列且编码能够结合CDH6的抗体的氨基酸序列的多核苷酸。

本发明包括编码本发明的抗体或所述抗体的功能片段或所述抗体或功能片段的修饰变体的核苷酸；包括其中插入的基因的重组载体；和包括其中引入的基因或载体的细胞。

本发明包括用于产生抗体或所述抗体的功能片段或所述抗体或功能片段的修饰变体的方法，所述方法包括以下步骤：培养细胞；和从培养物收集抗体或所述抗体的功能片段或所述抗体或功能片段的修饰变体。

本发明的抗体的氨基酸序列或核苷酸序列以及本发明中使用的蛋白的氨基酸序列或核苷酸序列列于表1-1至表1-14中。

3. 抗CDH6抗体-药物缀合物

本发明的抗体-药物缀合物由下式代表：

[式34]

其中

m

Ab代表IgG抗体或其功能片段，所述IgG抗体特异性结合包含SEQ ID NO:4中显示的氨基酸序列的氨基酸序列且具有允许细胞摄取的内化能力，

L代表接头，其连接键合至Ab的N297的聚糖(N297)和D，且

D是下式中的任一者：

[式35]

其中星号(*)代表与L的键合。

<药物>

在上述“2. 抗CDH6抗体的产生”中获得的抗CDH6抗体可以通过接头部分与药物缀合，以制备抗CDH6抗体-药物缀合物。药物没有特别限制，只要其具有可以连接到接头的取代基或分子部分即可。根据缀合的药物，抗CDH6抗体-药物缀合物可用于各种目的。这种药物的实例可以包括具有抗肿瘤活性的物质，对血液疾病有效的物质，对自身免疫疾病有效的物质，抗炎物质，抗微生物物质，抗真菌物质，抗寄生虫物质，抗病毒物质和抗麻醉物质。

<抗肿瘤化合物>

下面将描述使用抗肿瘤化合物作为在本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物中使用的化合物的实例。抗肿瘤化合物没有特别限制，只要该化合物具有抗肿瘤作用并且具有可以与接头结构连接的取代基或部分结构即可。在肿瘤细胞中切割部分或全部接头后，释放抗肿瘤化合物部分，使得抗肿瘤化合物显示出抗肿瘤作用。当在与药物的连接位置裂解接头时，抗肿瘤化合物以其原始结构释放以发挥其原有抗肿瘤作用。释放的充当药物的化合物是例如实施例10-7至10-10中所述的药物1至4。

在上述“2. 抗CDH6抗体的产生”中获得的抗CDH6抗体可以通过接头结构部分与抗肿瘤化合物缀合，以制备抗CDH6抗体-药物缀合物。

本发明中待使用的抗肿瘤化合物由下式中得到任一者代表：

[式36]

其中星号(*)代表与L的键合。

本发明的PBD衍生物在11'-位具有不对称碳，且因此存在光学异构体。在本文中，这些异构体和这些异构体的混合物都由单一式代表。因此，本发明的PBD衍生物包括所有光学异构体和任何比率的光学异构体的混合物。本发明的PBD衍生物的11'-位的绝对空间构型可以通过X-射线晶体结构分析或NMR(诸如Mosher法)对其晶体产物或中间体或其衍生物来确定。然后，可以通过使用结晶产物或用其空间构型已知的具有不对称中心的试剂衍生的中间体确定其绝对空间构型。根据需要，可以通过用常规的光学拆分方法或分离方法分离来获得根据本发明的合成化合物的立体异构体。

对于本发明的抗体-药物缀合物，可能存在立体异构体，由于不对称碳原子而导致的光学异构体，几何异构体，互变异构体或光学异构体，诸如d-型、l-型和阻转异构体，所述抗体-药物缀合物的游离药物或生产中间体，以及这些异构体、光学异构体和它们的混合物都包括在本发明中。

本发明中待使用的抗肿瘤化合物由下式中得到任一者代表：

[式37]

其中星号(*)代表与L的键合。

<接头结构>

将描述在本发明的抗体-药物缀合物中将抗肿瘤药物与抗体键合的接头结构。

接头L由下式代表：

-Lb-La-Lp-NH-B-CH

星号*代表与由D代表的抗肿瘤化合物的N10'-位置的氮原子的键合；Lb代表将La连接至Ab的聚糖或重构聚糖的间隔基。

B代表苯基或杂芳基，并且优选1,4-苯基、2,5-吡啶基、3,6-吡啶基、2,5-嘧啶基或2,5 -噻吩基，且更优选1,4-苯基。

Lp代表由在体内或在靶细胞中可切割的氨基酸序列组成的接头。Lp例如通过酶、诸如酯酶或肽酶的作用被切割。

Lp是由2至7个(优选2至4个)氨基酸构成的肽残基。也就是说，Lp由寡肽残基构成，其中2至7个氨基酸经由肽键连接。

Lp在N末端与Lb-La-中的La的羰基键合，并且在C末端与接头的部分-NH-B-CH

构成Lp的氨基酸不限于特定的氨基酸，并且例如为L-或D-氨基酸，且优选为L-氨基酸。所述氨基酸不仅可以是α-氨基酸，还可以包括具有例如β-丙氨酸、ε-氨基己酸或γ-氨基丁酸的结构的氨基酸，并且可以进一步包括非天然氨基酸，诸如N-甲基化氨基酸。

Lp的氨基酸序列不限于特定的氨基酸序列，并且构成Lp的氨基酸的实例可以包括但不限于甘氨酸(Gly；G)，缬氨酸(Val；V)，丙氨酸(Ala；A)，苯丙氨酸(Phe；F)，谷氨酸(Glu；E)，异亮氨酸(Ile；I)，脯氨酸(Pro；P)，瓜氨酸(Cit)，亮氨酸(Leu；L)，丝氨酸(Ser；S)，赖氨酸(Lys；K)和天冬氨酸(Asp；D)。其中优选的是甘氨酸(Gly；G)，缬氨酸(Val；V)，丙氨酸(Ala；A)和瓜氨酸(Cit)。

这些氨基酸中的任一个可以出现多次，并且Lp具有包括任意选择的氨基酸的氨基酸序列。药物释放模式可经由氨基酸类型控制。

接头Lp的具体实例可以包括但不限于-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-、-GGPL-、-EGGVA、-PI-、-GGF-、DGGF-、(D-)D-GGF-、-EGGF-、-SGGF-、-KGGF-、-DGGFG-、-GGFGG-、-DDGGFG-、-KDGGFG-和-GGFGGGF-。

在此，“(D-)V”指示D-缬氨酸，“(D)-P”指示D-脯氨酸，且“(D-)D”指示D-天冬氨酸。

接头Lp优选为以下中的任一个：-GGVA-、-GG-(D-)VA-、-VA-、-GGFG-、-GGPI-、-GGVCit-、-GGVK-、-GG(D-)PI-和-GGPL-。

接头Lp更优选为以下中的任一个：-GGVA-、-GGVCit-和-VA-。

Lb代表将La连接至Ab的聚糖或重构聚糖的间隔基。

没有特别限制的La代表选自以下组的任何一个。

-C(=O)-CH

-C(=O)-(CH

-C(=O)-CH

-C(=O)-CH

-C(=O)-CH

-CH

-OC(=O)-。

La更优选为-C(=O)-CH

间隔基Lb不限于特定的间隔基，并且例如，包括由下式代表的间隔基。

[式38]

[式39]

[式40]

在上面显示的Lb的结构式中，每个星号*代表与La的左端的-(C=O)或-(CH

在上面显示的Lb的每个结构式(Lb-1、Lb-2或Lb-3)中，通过叠氮基和环辛炔基的点击反应形成的三唑环位点提供了几何异构体的结构，并且Lb的分子作为两种结构中的任何一种或它们两者的混合物存在。本发明的抗体-药物缀合物的每个分子存在两个或四个(m

如果Lb是i)，则L优选由-Lb-La-Lp-NH-B-CH

L选自以下组：

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

-Z

其中Z

[式41]

Z

[式42]

Z

[式43]

其中，在结构式Z

B代表1,4-苯基。

假设本发明的抗体-药物缀合物通过如下过程表现出抗肿瘤活性，在所述过程中，所述抗体-药物缀合物的大分子迁移至肿瘤细胞中，且然后通过酶等切割接头部分(例如，Lp)以活化所述抗体-药物缀合物，其释放药物D的部分(在下文中称为游离药物(后面描述))。

因此，优选本发明的抗体-药物缀合物在肿瘤细胞外是稳定的。

<聚糖重构>

近来已经报道了通过酶促反应等重构抗体的异源糖蛋白以引入具有官能团的均质聚糖的方法(ACS Chemical Biology 2012, 7, 110, ACS Medicinal ChemistryLetters 2016, 7, 1005)。另外，已经尝试使用这种聚糖重构技术来位点特异性地引入药物以合成均质ADC (Bioconjugate Chemistry 2015, 26, 2233, Angew. Chem. Int. Ed.2016, 55, 2361-2367, US 2016361436)。

在本发明的聚糖重构中，使用水解酶，切割与蛋白(例如抗体)键合的异质聚糖，以在每个末端仅留下GlcNAc，由此产生具有GlcNAc的均质蛋白部分(以下称为“受体”)。随后，提供分开制备的任意聚糖(以下称为“供体”)，并且通过使用转糖苷酶将受体和供体连接在一起。由此，可以合成具有任意聚糖结构的均质糖蛋白。

在本发明中，“聚糖”是指经由糖苷键键合在一起的两个或更多个单糖的结构单元。特定的单糖和聚糖偶尔被缩写为“GlcNAc-”、“MSG-”等。当在结构式中使用这些缩写中的任一种时，显示该缩写的意图是在指示聚糖的缩写中不包括在还原端与另一结构单元的糖苷键中涉及的氧原子或氮原子，除非明确定义。

在本发明中，为了方便起见，指示单糖作为聚糖的基本单元，使得在环结构中，碳原子与构成环的氧原子的键合和与羟基(或糖苷键中涉及的氧原子)直接键合的位置被定义为1-位置(仅用于唾液酸的2-位置)，除非另外指明。实施例中化合物的名称各自在化学结构的角度来看作为整体提供，并且该规则不一定适用。

当在本发明中将聚糖指示为符号(例如，GLY、SG、MSG、GlcNAc)时，除非另有定义，否则该符号意欲包括范围至还原末端的碳原子，并且不包括N-或O-糖苷键中涉及的N或O。

在本发明中，除非特别说明，否则以使得在括号中指示侧链部分的方式(例如，“(SG-)Asn”)指示当聚糖与氨基酸的侧链连接时的部分结构。

本发明的Ab中的聚糖是N-连接的聚糖或O-连接的聚糖，且优选N-连接的聚糖。

N-连接的聚糖和O-连接的聚糖分别经由N-糖苷键和O-糖苷键与抗体的氨基酸侧链键合。

IgG在重链的Fc区的297-位置的天冬酰胺残基上具有非常保守的N-连接的聚糖(下文中称为“Asn297或N297”)，并且已知N-连接的聚糖有助于抗体分子的活性和动力学(Biotechnol. Prog., 2012, 28, 608-622, Sanglier-Cianferani, S., Anal. Chem.,2013, 85, 715-736)。

IgG的恒定区中的氨基酸序列非常保守，并且每个氨基酸由Edelman等人 (Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol. 63, No. 1 (May 15, 1969), pp. 78-85)中的Eu索引编号指定。例如，在Fc区域中添加N-连接聚糖的Asn297对应于Eu索引编号中的297-位置，并且即使氨基酸的实际位置通过分子的片段化或区域的缺失而变化，每个氨基酸也由Eu索引编号独特地指定。

在本发明的抗体-药物缀合物中，抗体或抗体的功能片段更优选经由聚糖与其Asn297的侧链键合(下文中称为“N297聚糖”)而与L键合，并且抗体或抗体的功能片段甚至更优选经由N297聚糖与L键合，其中N297聚糖是重构的聚糖。

具有重构的聚糖的抗体被称为聚糖-重构的抗体。

SGP，唾液酸糖肽的缩写，是代表性的N-连接的复合聚糖。SGP可以例如通过使用WO2011/0278681中描述的方法从鸡蛋的蛋黄分离/纯化。SGP的纯化产物是市售的(TokyoChemical Industry Co., Ltd., FUSHIMI Pharmaceutical Co., Ltd.)。例如，二唾液酸八糖(Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)，通过在SG的聚糖部分中的还原末端缺失一个GlcNAc而形成的聚糖(下文中称为“SG(10)”)，是市售的。

在本发明中，通过仅在SG(10)中的β-Man的任一支链中的非还原末端缺失唾液酸而形成的聚糖结构是指MSG(9)，并且仅在1-3个支链中具有唾液酸的结构被称为MSG1，并且仅在1-6个支链中具有唾液酸的结构被称为MSG2。

本发明的重构的聚糖是N297-(Fuc)MSG1，N297-(Fuc)MSG2，或N297-(Fuc)MSG1和N297-(Fuc)MSG2的混合物，或N297-(Fuc)SG，并且优选为N297-(Fuc)MSG1，N297-(Fuc)MSG2或N297-(Fuc)SG，且更优选N297-(Fuc)MSG1或N297-(Fuc)MSG2。

N297-(Fuc)MSG1由以下结构式或序列式代表：

[式44]

[式45]

在所述式中，波浪线代表与抗体的Asn297的键合，

L(PEG)代表-(CH

每个星号*代表与接头L的键合，特别是与接头L中的Lb的1,2,3-三唑环的1-或3-位置的氮原子的结合，且

n

N297-(Fuc)MSG2由以下结构式或序列式代表。

[式46]

[式47]

在所述式中，波浪线代表与抗体的Asn297的键合，

L(PEG)代表-(CH

星号*代表与接头L的键合，特别是与接头L中的Lb的1,2,3-三唑环的1-或3-位置的氮原子的结合，且

n

N297-(Fuc)SG由以下结构式或序列式代表。

[式48]

[式49]

在所述式中，波浪线代表与抗体的Asn297的键合，

L(PEG)代表-(CH

每个星号*代表与接头L的键合，特别是与接头L中的Lb的1,2,3-三唑环的1-或3-位置的氮原子的键合，且

n

如果本发明的抗体-药物缀合物中的抗体的N297聚糖是N297-(Fuc)MSG1、N297-(Fuc)MSG2或它们的混合物，则抗体-药物缀合物是两个接头L分子和两个药物D分子已经与其缀合(m

<抗体的制备>

聚糖-重构的抗体可以通过使用如下式中所举例说明的方法，例如根据WO2013/120066中描述的方法来产生。

[式50]

步骤R-1：在还原末端的壳二糖结构的GlcNAcβ1-4GlcNAc处的糖苷键的水解

这是通过用已知的酶促反应切割与靶抗体的氨基酸序列的297-位置的天冬酰胺键合的N-连接的聚糖(N297-连接的聚糖)而制备聚糖-截短的抗体的步骤。

缓冲溶液(例如50 mM磷酸盐缓冲溶液)中的靶抗体(20 mg/mL)通过使用水解酶、诸如酶EndoS在0℃至40℃下在还原末端的壳二糖结构中的GlcNAcβ1和4GlcNAc之间进行糖苷键的水解反应。反应时间为10分钟至72小时，且优选1小时至6小时。对于100 mg抗体，待使用的野生型EndoS的量为0.1至10 mg，优选0.1至3 mg。在反应结束后，实施各自在后面描述的用亲和色谱的纯化和/或用羟基磷灰石柱的纯化，以产生GlcNAcβ1和4GlcNAc之间的聚糖被水解的(Fucα1,6)GlcNAc抗体。

步骤R-2：转糖基化反应

这是通过使用酶促反应将(Fucα1,6)GlcNAc抗体键合至具有包括叠氮基团的PEG接头的MSG-(MSG1-、MSG2-)或SG-型聚糖噁唑啉(下文中称为“叠氮化物聚糖噁唑啉” )而产生聚糖-重构的抗体的步骤。

将缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲溶液)中的聚糖截短的抗体通过在催化量的转糖苷酶、诸如EndoS (D233Q/Q303L)存在的情况下在0℃至40下与叠氮化物聚糖噁唑啉反应进行转糖基化反应。反应时间为10分钟至72小时，且优选1小时至6小时。对于100 mg抗体，待使用的EndoS (D233Q/Q303L)的量为1至10 mg，优选1至3 mg，且待使用的叠氮化物聚糖噁唑啉的量为2当量至过量当量，优选2当量至20当量。

反应完成后，实施用亲和色谱的纯化和用羟基磷灰石柱的纯化，以得到纯化的聚糖-重构的抗体。

叠氮化物聚糖噁唑啉形式可以根据实施例11中描述的方法制备。通过使用合成有机化学领域中已知的反应(例如，缩合反应)，可以将N

缩合反应中使用的缩合剂的实例可以包括但不限于，N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)，羰基二咪唑(CDI)，2-(2H-苯并三唑-2-基)-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚(BOP)，1H-苯并三唑-1-基氧基三吡咯烷基鏻六氟磷酸盐((PyBOP)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU)，并且用于反应的溶剂的实例可以包括但不限于二氯甲烷、DMF、THF、乙酸乙酯及其混合溶剂。

反应温度通常为-20℃至100℃或溶剂的沸点，且优选在-5℃至50℃的范围内。根据需要，可以添加有机碱，诸如三乙胺、二异丙基乙基胺、N-甲基吗啉和4-二甲基氨基吡啶，或者无机碱，诸如碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾和碳酸氢钠。此外，例如，可以添加1-羟基苯并三唑或N-羟基琥珀酰亚胺作为反应加速剂。

MSG1可以通过用水解酶、诸如EndoM水解分离/纯化的(MSG-)Asn(在实施例11中)来获得。

根据已知的文章(J. Org Chem., 2009, 74(5), 2210-2212. Helv. Chim.Acta, 2012, 95, 1928-1936.)，可以从MSG1的还原末端的GlcNAc准备噁唑啉化。

对于用于N297聚糖的水解反应的酶，例如，可以使用EndoS或保留水解活性的酶变体。

通过使用糖基转移酶(例如，WO 2017010559)，诸如EndoS D233Q或EndoS D233Q/Q303L变体，使在上述水解反应中获得的(Fucα1,6)GlcNAc-抗体作为糖基受体分子和MSG-(MSG1-，MSG2-)或SG型糖基供体分子反应，可以获得包括MSG-(MSG1-，MSG2-)或SG型N297聚糖的上述结构的抗体。

如果抗体-药物缀合物中每抗体分子缀合的药物分子的数目m

如果抗体-药物缀合物中每抗体分子缀合的药物分子的数目m

供体分子中包括的MSG- (MSG1-，MSG2-)或SG-型聚糖具有在其中唾液酸的2-位置具有叠氮基的PEG接头(N

或者，可以通过将具有叠氮基的PEG接头(N

α-氨基的修饰基团的实例包括具有羟基乙酰基、PEG结构等的增强在水中的溶解度的修饰基团。

(MSG1-)Asn、(MSG-2)Asn或(SG-)Asn的α-氨基优选用任何保护基保护。如果用保护基团(例如，Fmoc基团)保护α-氨基，则在引入具有叠氮基的PEG接头之后并且在引起水解酶作用之前，可以根据需要除去保护基。

优选使用通过对于分子中包括的MSG (MSG1，MSG2)或SG-型聚糖的还原末端的GlcNAc用2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓-氯化物处理形成的活化形式、诸如噁唑啉。

可以采用用于转糖基化反应的各种酶(转糖苷酶)，其具有将复合聚糖转移至N297聚糖的活性；然而，EndoS D233Q，其水解反应通过用Gln取代EndoS的233-位置的Asp来抑制的修饰产物，是优选的转糖苷酶。使用EndoS D233Q的转糖基化反应描述于例如WO 2013/120066中。或者，可以使用通过向EndoS D233Q进一步添加突变而获得的修饰酶，诸如EndoSD233Q/Q303L (WO 2017010559)。

抗体的聚糖重构(糖水解和转糖基化反应)后，对抗体的纯化操作意欲分离用于反应的低分子量化合物和酶，并且凝胶过滤色谱，离子交换色谱，亲和色谱等等通常用于这种纯化，并且可以进一步实施用羟基磷灰石柱进行额外的纯化。也就是说，本发明提供了用于产生药物-缀合物形式的方法，所述方法在抗体的糖水解后从反应溶液纯化中间体的步骤之后，还包括用羟基磷灰石柱纯化的额外步骤。根据关于聚糖重构的报道的实例(J. Am.Chem. Soc. 2012, 134, 12308-12318., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 2361-2367)，可以仅用蛋白A柱(亲和色谱柱)纯化用水解酶处理抗体后的反应溶液；然而，已经证明该纯化方法不能完全除去水解酶(例如，EndoS)，这由于残留酶而影响随后的转糖基化反应。鉴于这种结果，对纯化方法进行检查，从而发现当以呈现的顺序使用蛋白A柱和羟基磷灰石柱(CHT柱, Bio-Rad Laboratories, Inc.)实施用水解酶处理抗体后的反应溶液的纯化时，随后的糖基化反应的反应效率得到增强，而没有任何残留酶的影响。

在制备聚糖-重构的抗体中，抗体的水溶液的浓缩、浓度的测量和缓冲液交换可以根据以下的通用操作A至C实施。

(通用操作A：抗体的水溶液的浓缩)

将抗体或抗体-药物缀合物的溶液置于Amicon Ultra (30,000至50,000 MWCO,Millipore Corporation)的容器中，并且将后面描述的抗体或抗体-药物缀合物的溶液使用离心机(Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.)通过离心操作(以2000 G至4000 G离心5至20分钟)进行浓缩。

(通用操作B：抗体浓度的测量)

抗体浓度的测量通过根据制造商指定的方法使用UV测量设备(Nanodrop 1000,Thermo Fisher Scientific Inc.)实施。然后，使用在抗体间不同的280 nm吸收系数(1.3mL mg

(通用操作C：抗体的缓冲液交换)

将缓冲溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水(pH 6.0)，磷酸盐缓冲液(pH 6.0))添加至抗体的水溶液，其根据通用操作A进行浓缩。将该操作实施几次，且然后通过使用通用操作B测量抗体浓度，并将其用缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水(pH 6.0)，磷酸盐缓冲液(pH 6.0))调节至10 mg/mL。

<缀合>

这个产生方法是通过经由SPAAC(张力-促进的炔叠氮化物环加成: J. AM. CHEM.SOC. 2004, 126, 15046-15047)反应将上述聚糖-重构的抗体缀合至产生中间体(2)来产生抗体-药物缀合物的方法。

[式51]

其中Ab代表聚糖-重构的抗体，

La'、Lp'和B'分别与La、Lp和B中所定义相同，且

J代表任何这些结构式，其中星号*代表与La'的键合。

[式52]

J-La'-Lp'-NH-B'-CH

SPAAC反应通过在适当溶剂(二甲亚砜(DMSO)，二甲基甲酰胺(DMF)，二甲基乙酰胺(DMA)，N-甲基-2-吡啶酮(NMP)，丙二醇(PG)等或其混合物)中混合抗体Ab的缓冲溶液(乙酸钠溶液，磷酸钠，硼酸钠溶液等，或其混合物)和溶解化合物(2)的溶液来进行。

待使用的化合物(2)的摩尔量为每摩尔抗体，2 mol至过量摩尔，优选1 mol至30mol，并且有机溶剂与抗体的缓冲液的比率优选为1至200% v/v。反应温度为0℃至37℃，且优选10℃至25℃，且反应时间为1至150小时，且优选6小时至100小时。反应中的pH优选为5至9。

可以根据上面描述的通用操作A至C和后面描述的通用操作D至F，通过缓冲液交换、纯化和测量抗体浓度以及每抗体分子缀合的药物分子的平均数目(DAR：药物与抗体的比率)来彼此鉴定抗体-药物缀合物化合物(ADC)。

(通用操作D：抗体-药物缀合物的纯化)

用含有市售的山梨糖醇(5%)的乙酸盐缓冲溶液(10mM，pH 5.5；本文中称为ABS)平衡NAP-25柱。向该NAP-25柱中应用抗体-药物缀合物的反应水溶液(约1.5至2.5mL)，并且用由制造商指定的量的缓冲液洗脱，以分离和收集抗体级分。将分离和收集的级分再次应用于NAP-25柱，并且总共重复两次或三次用缓冲液洗脱的凝胶过滤纯化操作，以得到具有未结合的药物接头的抗体-药物缀合物，除去二甲亚砜和丙二醇。必要时，可以通过通用操作A至C调节抗体-药物缀合物的溶液的浓度。

(通用操作E：抗体-药物缀合物的抗体浓度的测量)

抗体-药物缀合物中的缀合药物的浓度可以通过使用下面显示的朗伯-比尔定律来计算。使用朗伯-比尔定律的方程(I)如下：

[表达式1]]

此处，A280表示抗体-药物缀合物的水溶液在280 nm处的吸光度，ε280表示抗体-药物缀合物在280 nm处的摩尔吸收系数，且C (mol•L

[表达式2]

进一步，将两侧乘以抗体-药物缀合物的摩尔质量MW (g•mol

[表达式3]

将描述用于表达且应用于实施例的值。

使用的吸光度A280是抗体-药物缀合物的水溶液在280 nm处的UV吸光度的测量值。对于摩尔质量MW (g•mol

抗体-药物缀合物的摩尔吸收系数ε280可以通过以下表达式(IV)确定：

[表达式4]

ε

此处，ε

通过使用已知的计算方法(Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)，可以从抗体的氨基酸序列估计ε

从每次UV测量中获得的测量值计算ε

(通用操作F：抗体-药物缀合物中每抗体分子缀合的药物分子的平均数目的测量

抗体-药物缀合物中每抗体分子缀合的药物分子的平均数目可以通过高效液相色谱(HPLC)用以下方法测定。

(F-1用于HPLC分析的样品的制备(减少抗体-药物缀合物))

将抗体-药物缀合物的溶液(约1 mg/mL，60 μL)与二硫苏糖醇(DTT)的水溶液(100mM，15μL)混合。将该混合物在37℃下孵育30分钟以制备其中抗体-药物缀合物的L链和H链之间的二硫键被裂解的样品，并且该样品用于HPLC分析。

(F-2. HPLC分析)

HPLC分析在以下条件下实施。

HPLC系统：Agilent 1290 HPLC系统(Agilent Technologies)

检测器：紫外线吸收光谱仪(测量波长：280 nm，329 nm)

柱：BEH Phenyl (2.1 × 50 mm, 1.7 μm, Waters Acquity)

柱温：75℃

流动相A：0.1%三氟乙酸(TFA)-15%异丙醇水溶液

流动相B：0.075% TFA-15%异丙醇乙腈溶液

梯度程序：14%-36% (0 min至15 min)，36%-80%(15 min至17 min)，80%-14%(17min至17.1 min)，14%-14%(17.1 min至23 min)

样品注入体积：5μL。

(F-3. 数据分析)

(F-3-1)具有缀合药物分子的H链(具有一个缀合药物分子的H链：H

(F-3-2)由于每种药物-接头吸收UV，因此根据缀合的药物-接头分子的数目，使用下式用H链和药物-接头的摩尔吸收系数进行校正。

[表达式5]

在此，对于每种抗体的L链和H链的摩尔吸收系数(280 nm)，通过使用已知的计算方法(Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)从抗体的L链和H链的氨基酸序列估计值。在H01L02抗体的情况下，使用81480作为从氨基酸序列估计的H链的摩尔吸收系数。类似地，在H01L02A抗体的情况下，使用79829作为H链的摩尔吸收系数；在H01L02A抗体的情况下，使用80131作为H链的摩尔吸收系数；在H11L02A抗体的情况下，使用78696作为H链的摩尔吸收系数；在LPS抗体的情况下，使用77470作为H链的摩尔吸收系数；并且使用对于作为缀合前体的药物-接头1-4测量的摩尔吸收系数(280 nm)作为每种药物-接头的摩尔吸收系数(280 nm)。

(F-3-3)通过使用以下表达式计算每条链的峰面积与校正的峰面积的总和的比率(%)

[表达式6]

(F-3-4)通过使用以下表达式计算抗体-药物缀合物中每抗体分子缀合的药物分子的平均数目。

[表达式7]

缀合的药物分子的平均数目 = (H

4.药物

由于上述“2. 抗CDH6抗体的产生”部分或实施例中描述的本发明的抗CDH6抗体或抗体的功能片段结合肿瘤细胞表面上的CDH6并具有内化活性，所以它可以单独或与另外药物组合用作药物，且特别是作为癌症的治疗剂，所述癌症例如，肾细胞癌或卵巢肿瘤，例如，肾细胞癌、透明肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、卵巢癌、卵巢浆液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、胶质母细胞瘤、间皮瘤、子宫癌、胰腺癌、威尔姆氏瘤或神经母细胞瘤。

此外，本发明的抗CDH6抗体或抗体的功能片段可用于检测表达CDH6的细胞。

此外，因为本发明的抗CDH6抗体或抗体的功能片段具有内化活性，可以将其应用作为抗体-药物缀合物中的抗体。

当使用具有抗肿瘤活性(诸如细胞毒性活性)的药物作为药物时，上述“3. 抗CDH6抗体-药物缀合物”部分和实施例中描述的本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物是具有内化活性的抗CDH6抗体和/或抗体的功能片段和具有抗肿瘤活性(诸如细胞毒性活性)的药物的缀合物。由于该抗CDH6抗体-药物缀合物对表达CDH6的癌细胞显示出抗肿瘤活性，因此它可以用作药物，且特别是用作癌症的治疗剂和/或预防剂。

本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物可以吸收水分或具有吸附水，例如，当其留在空气中或经历重结晶或纯化程序时变成水合物。这种含水的化合物或药理学上可接受的盐也包括在本发明中。

当本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物具有碱性基团诸如氨基时，如果需要，它可以形成药理学上可接受的酸加成盐。这种酸加成盐的实例可包括：氢卤化物，如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐；无机酸盐，如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐；低级链烷磺酸盐，如甲磺酸盐、三氟甲磺酸盐和乙磺酸盐；芳基磺酸盐，如苯磺酸盐和对甲苯磺酸盐；有机酸盐，如甲酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、苹果酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、草酸盐和马来酸盐；和氨基酸盐、如鸟氨酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸盐。

当本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物具有酸性基团如羧基时，如果需要，它可以形成药理学上可接受的碱加成盐。这种碱加成盐的实例可包括：碱金属盐、如钠盐、钾盐和锂盐；碱土金属盐、如钙盐和镁盐；无机盐、如铵盐；和有机胺盐如二苄胺盐、吗啉盐、苯基甘氨酸烷基酯盐、乙二胺盐、N-甲基葡糖胺盐、二乙胺盐、三乙胺盐、环己胺盐、二环己胺盐、N,N'-二苄基乙二胺盐、二乙醇胺盐、N-苄基-N-(2-苯基乙氧基)胺盐、哌嗪盐、四甲基铵盐和三(羟甲基)氨基甲烷盐。

本发明还可包括抗CDH6抗体-药物缀合物，其中构成抗体-药物缀合物的一个或多个原子替换为原子的同位素。存在两种类型的同位素：放射性同位素和稳定同位素。同位素的实例可以包括氢的同位素(

例如，可以基于抑制细胞增殖反应的活性来测量体外细胞毒性。例如，培养过表达CDH6的癌细胞系，并将抗CDH6抗体-药物缀合物以不同浓度添加至培养系统中。其后，可以测量其对病灶形成、集落形成和球状体生长的抑制活性。在该背景下，例如，通过使用肾细胞肿瘤或卵巢肿瘤来源的癌细胞系，可以检查针对肾细胞肿瘤或卵巢肿瘤的细胞生长抑制活性。

可以在实验动物中测量对癌症的体内治疗效果，例如，通过将抗CDH6抗体-药物缀合物施用至已经接种了高度表达CDH6的肿瘤细胞系的裸鼠，且然后测量癌细胞的变化。在该背景下，例如，通过使用通过接种肾细胞癌-、肾透明细胞癌-、乳头状肾细胞癌-、卵巢癌-、卵巢浆液性腺癌-或甲状腺癌-来源的细胞从免疫缺陷小鼠衍生的动物模型，可以测量对肾细胞癌、肾透明细胞癌、乳头状肾细胞癌、卵巢癌、卵巢浆液性腺癌或甲状腺癌的治疗效果。

应用本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物的癌症的类型没有特别限制，只要在待治疗的癌细胞中表达CDH6即可。其实例可以包括肾细胞癌(例如，肾透明细胞癌或乳头状肾细胞癌)、卵巢癌、卵巢浆液性腺癌、甲状腺癌、胆管癌、肺癌(例如，小细胞肺癌或非小细胞肺癌)、胶质母细胞瘤、间皮瘤、子宫癌、胰腺癌、威尔姆氏瘤和神经母细胞瘤，尽管该癌症不限于此，只要该癌症表达CDH6即可。癌症的更优选实例可以包括肾细胞癌(例如，肾透明细胞癌和乳头状肾细胞癌)和卵巢癌。

本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物可以优选施用至哺乳动物，且更优选施用至人。

在包含本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物的药物组合物中使用的物质可以合适地选自药物添加剂和本领域通常使用的其他物质(就应用剂量或应用浓度而言)并随后使用。

本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物可以作为包含一种或多种药学上相容的组分的药物组合物施用。例如，药物组合物通常包含一种或多种药物载体(例如，无菌液体(例如，水和油(包括石油和动物来源、植物来源或合成来源的油(例如，花生油，大豆油，矿物油和芝麻油)))。当静脉内施用药物组合物时，水是更典型的载体。盐水溶液、葡萄糖水溶液和甘油水溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物媒介物是本领域已知的。如果期望，组合物还可包含痕量的保湿剂、乳化剂或pH缓冲剂。合适的药物载体的实例公开在E. W. Martin的"Remington's Pharmaceutical Sciences"中。处方与施用模式对应。

各种递送系统是已知的，并且它们可用于施用本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物。施用途径的实例可包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下途径。例如，可以通过例如注射或推注进行施用。根据具体的优选实施方案，通过注射进行上述抗体-药物缀合物的施用。肠胃外施用是优选的施用途径。

根据代表性实施方案，根据常规程序，将药物组合物作为适于静脉内施用于人的药物组合物开处方。用于静脉内施用的组合物通常是无菌和等渗水性缓冲溶液中的溶液。如果必需，药物还可含有增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射区域的疼痛(例如，利多卡因)。通常，上述成分单独提供或在单位剂型中的混合物中一起提供，作为包含在容器中的冷冻干燥粉末或无水浓缩物，所述容器通过密封到例如表示活性剂量的安瓿或小袋而获得。当药物通过注射施用时，可以使用例如含有无菌药物级的水或盐水的注射瓶施用。当药物通过注射施用时，可以提供无菌水或注射用盐水的安瓿，使得上述成分在施用前彼此混合。

本发明的药物组合物可以是仅包含本申请的抗CDH6抗体-药物缀合物的药物组合物，或者可以是包含抗CDH6抗体-药物缀合物和至少一种其他癌症治疗剂的药物组合物。本发明的抗CDH6抗体-药物缀合物也可以与其他癌症治疗剂一起施用，并且可以由此增强抗癌作用。用于此目的的其他抗癌剂可以连同抗体-药物缀合物同时、分开或连续地施用于个体。另外，其他抗癌剂和抗CDH6抗体-药物缀合物可各自以不同的施用间隔施用至主体。这种癌症治疗剂的实例可包括酪氨酸激酶抑制剂，包括伊马替尼、舒尼替尼和瑞格非尼，CDK4/6抑制剂(包括帕博西林(palbociclib))，HSP90抑制剂(包括TAS-116)，MEK抑制剂(包括MEK162)和免疫检查点抑制剂(包括纳武单抗，派姆单抗和易普利姆玛)，尽管癌症治疗剂不限于此，只要所述药物具有抗肿瘤活性即可。

这种药物组合物可以制备成冷冻干燥制剂或液体制剂形式的、具有选定组成和必需纯度的制剂。制备成冷冻干燥制剂的药物组合物可以是含有本领域中使用的适当药物添加剂的制剂。同样地，可以制备液体制剂，使得液体制剂含有本领域中使用的各种药物添加剂。

药物组合物的组成和浓度也根据施用方法而变化。关于包含在本发明的药物组合物中的抗CDH6抗体-药物缀合物对抗原的亲和力，即抗CDH6抗体-药物缀合物与抗原的解离常数(Kd值)，随亲和力增加(即，Kd值低)，即使其应用剂量减少，药物组合物也可以发挥药效。因此，抗体-药物缀合物的应用剂量也可以通过基于抗体-药物缀合物对抗原的亲和力的状态设定应用剂量来确定。当将本发明的抗体-药物缀合物施用至人时，其可以以例如约0.001至100mg/kg的剂量一次或以1至180天的间隔多次施用。它可以优选以0.1至50mg/kg的剂量施用，且更优选以1至50 mg/kg、1至30 mg/kg、1至20 mg/kg、1至15 mg/kg、2至50mg/kg、2至30 mg/kg、2至20 mg/kg或2至15 mg/kg的剂量，以1至4周、优选2至3周的间隔多次施用。

实施例

在下文中，将在以下实施例中具体描述本发明。然而，本发明不限于这些。此外，这些实施例不应以任何方式以限制的方式解释。应注意，在以下实施例中，除非另有说明，否则根据“"Molecular Cloning"(Sambrook, J., Fritsch, E. F.和Maniatis, T., ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989年出版)中描述的方法或本领域技术人员使用的实验手册中描述的其他方法，进行关于遗传操作的各个操作，或当使用市售的试剂或试剂盒时，所述实施例按照包括在所述市售的产品中的说明书实施。在本说明书中，除非另有说明，否则试剂、溶剂和起始材料可容易地从市售的来源获得。

[实施例1：获得具有内化活性的大鼠抗人CDH6抗体]

1)-1人和食蟹猴CDH6表达载体的构建

使用编码人CDH6蛋白(NP_004923)的cDNA表达载体(OriGene TechnologiesInc., RC217889)，根据本领域技术人员已知的方法将cDNA并入用于哺乳动物表达的载体中，以产生人CDH6表达载体pcDNA3.1-hCDH6。人CDH6 ORF(开放阅读框)的氨基酸序列显示于SEQ ID No:1中。

用从食蟹猴肾的总RNA合成的cDNA作为模板使用引物1 (5'-CACCATGAGAACTTACCGCTACTTCTTGCTGCTC-3') (SEQ ID No:8)和引物2 (5'-TTAGGAGTCTTTGTCACTGTCCACTCCTCC-3') (SEQ ID No:9)克隆编码食蟹猴CDH6蛋白的cDNA。证实获得的序列对应于食蟹猴CDH6 (NCBI, XP_005556691.1)的细胞外区域。还证实该序列对应于在EMBL中登记的食蟹猴CDH6 (EHH54180.1)的全长序列。根据本领域技术人员已知的方法将cDNA并入用于哺乳动物表达的载体中，以产生食蟹猴CDH6表达载体pcDNA3.1-cynoCDH6。食蟹猴CDH6 ORF的氨基酸序列显示于SEQ ID No:7中。

EndoFree Plasmid Giga Kit (Qiagen NV)用于所产生的质粒DNA的大量生产。

1)-2 免疫

对于免疫，使用WKY/Izm雌性大鼠(Japan SLC, Inc.)。首先，用透明质酸酶(Sigma-Aldrich Co. LLC)预处理每只大鼠的下肢，且然后将实施例1)- 1中产生的人CDH6表达载体pcDNA3.1-hCDH6肌内注射至相同部位。随后，使用ECM830 (BTX)，使用双针电极在相同部位进行体内电穿孔。近似每两周一次，重复相同的体内电穿孔，且其后，从大鼠收集淋巴结或脾脏，且用于产生杂交瘤。

1)-3杂交瘤的产生

根据电细胞融合，使用LF301 Cell Fusion Unit (BEX Co., Ltd.)，将淋巴结细胞或脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞(ATCC, No. CRL-1 581)融合，且然后将细胞悬浮并用ClonaCell-HY选择培养基D (StemCell Technologies Inc.)稀释，且然后在37℃和5% CO

1)-4根据细胞-ELISA方法筛选产生抗体的杂交瘤

1)-4-1用于细胞-ELISA的抗原基因表达细胞的制备

在补充有10% FBS的DMEM培养基中以5×10

1)-4-2细胞-ELISA

除去在实施例1)-4-1中制备的用表达载体转染的293α细胞的培养物上清液，且然后将来自每个杂交瘤的培养物上清液添加至用pcDNA3.1-hCDH6或pcDNA3.1-cynoCDH6或pcDNA3.1转染的293α细胞。将细胞在4℃下静置1小时。用补充有5% FBS的PBS(+)洗涤孔中的细胞一次，且然后向孔中添加已经用补充有5% FBS的PBS(+)稀释500倍的在兔中产生的抗大鼠IgG-过氧化物酶抗体(Sigma-Aldrich Co. LLC)。将细胞在4℃下静置1小时。将孔中的细胞用补充有5% FBS的PBS(+)洗涤三次，且然后以100μL/孔的量向孔中添加OPD显色溶液(其通过将邻苯二胺二盐酸盐(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)和H

1)-5根据流式细胞术选择性筛选结合食蟹猴CDH6的抗体

1)-5-1制备表达抗原基因的细胞用于流式细胞术分析

将293T细胞以5×10

1)-5-2 流式细胞术分析

通过流式细胞术进一步证实，由已通过实施例1)-4中的细胞-ELISA选择的产生人CDH6-和食蟹猴CDH6-结合抗体的杂交瘤产生的抗体对食蟹猴CDH6的结合特异性。将实施例1)-5-1中制备的瞬时表达的293T细胞的悬浮液离心，且然后除去上清液。其后，通过添加来自每个杂交瘤的培养物上清液，悬浮细胞。将细胞在4℃下静置1小时。用补充有5% FBS的PBS洗涤细胞两次，且然后通过添加用补充有5% FBS的PBS稀释500倍的抗大鼠IgG FITC缀合物(Sigma-Aldrich Co. LLC)，悬浮细胞。将细胞在4℃下静置1小时。将细胞用补充有5%FBS的PBS洗涤2次，并随后重悬于补充有5% FBS和2 μg/mL 7-氨基放线菌素D (MolecularProbes, Inc.)的PBS中，随后使用流式细胞仪(FC500；Beckman Coulter, Inc.)进行检测。使用FlowJo (TreeStar, Inc.)分析数据。在通过门控清除7-氨基放线菌素D阳性细胞，而从分析中除去死细胞后，产生活细胞的FITC荧光强度的柱状图。产生特异性结合细胞膜表面上表达的食蟹猴CDH6的抗体的杂交瘤基于以下结果选择，其中与用对照pcDNA3.1转染的293T细胞相比，在用pcDNA3.1-cynoCDH6转染的293T细胞中，抗体的柱状图移至强荧光强度侧。

1)-6 大鼠单克隆抗体的同种型的确定

从实施例1)-5中选择的产生大鼠抗CDH6抗体的杂交瘤中选择显现特异性且强烈结合人CDH6和猴CDH6的克隆rG019，并鉴定每种抗体的同种型。使用RAT MONOCLONALANTIBODY ISOTYPING TEST KIT (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.)确定抗体的重链亚类和轻链类型。作为结果，证实rG019具有IgG2b亚类的重链和κ链型的轻链。

1)-7 制备大鼠抗人CDH6抗体

1)-7-1培养物上清液的产生

从杂交瘤培养物上清液纯化大鼠抗人CDH6单克隆抗体。首先，用ClonaCell-HY选择培养基E (StemCell Technologies Inc.)充分增加产生大鼠抗CDH6单克隆抗体的各杂交瘤的体积，且然后将培养基更换为其中已添加20%的Ultra Low IgG FBS (ThermoFisher Scienftific Corp.)的Hybridoma SFM (Thermo Fisher Scienftific Corp.)。其后，将杂交瘤培养4至5天。收获所得的培养物上清液，并经通过0.8-μm过滤器和0.2-μm过滤器除去其中的不溶物。

1)-7-2 大鼠抗CDH6抗体的纯化

根据蛋白G亲和色谱，从实施例1)-7-1中制备的杂交瘤的培养物上清液纯化抗体(大鼠抗CDH6抗体(rG019))。抗体吸附在蛋白G柱(GE Healthcare Biosciences Corp.)上，然后用PBS洗涤柱，且然后用0.1 M甘氨酸/HCl水溶液(pH 2.7)洗脱抗体。将1 M Tris-HCl(pH 9.0)添加至洗脱液中，使得将pH调节至7.0至7.5。其后，使用离心UF Filter DeviceVIVASPIN20 (分子量截止值：UF30K, Sartorius Inc.)，将缓冲液用HBSor(25 mM组氨酸/5%山梨糖醇，pH 6.0)替换，同时浓缩抗体，使得抗体的浓度调整至1 mg/mL。最后，将抗体通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Inc.)过滤以获得纯化的样品。

[实施例2：大鼠抗CDH6抗体的体外评估]

2)-1通过流式细胞术评估大鼠抗CDH6抗体的结合能力

通过流式细胞术评估实施例1)-7中产生的大鼠抗CDH6抗体的人CDH6-结合活性。使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.)，将实施例1)-1中产生的pcDNA3.1-hCDH6瞬时引入293T细胞(ATCC)中。将细胞在37℃和5% CO

2)-2 通过流式细胞术分析大鼠抗CDH6抗体的CDH6-结合位点

2)-2-1 人CDH6的每种结构域缺失突变体的表达载体的构建

人CDH6的全长细胞外区域具有五个细胞外结构域，EC1 (SEQ ID NO:2)、EC2 (SEQID NO:3)、EC3 (SEQ ID NO:4)、EC4 (SEQ ID NO:5)和EC5 (SEQ ID NO:6)。待表达的基因由GeneArt合成，使得可以从全长人CDH6缺失五个EC结构域中的每一个，并且根据本领域技术人员已知的方法并入用于哺乳动物表达的p3xFLAG-CMV-9载体(Sigma-Aldrich Co.LLC)中，以产生缺乏EC1至EC5中任一种的每种结构域缺失突变体的表达载体。

2)-2-2 通过流式细胞术使用结构域缺失突变体的大鼠抗CDH6抗体的表位分析

通过流式细胞术分析，使用用每种EC结构域缺失载体转染的293α细胞系鉴定大鼠抗人CDH6抗体与之结合的表位。使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher ScientificInc.)，将实施例2)-2-1中产生的每种结构域缺失突变体表达载体或用于表达全长人CDH6的pcDNA3.1-hCDH6瞬时引入293α细胞系，所述293α细胞系是通过用整联蛋白αv和整联蛋白β3表达载体稳定转染而衍生自HEK293细胞的细胞系。将细胞在37℃和5% CO

2)-3 人肿瘤细胞系中的CDH6表达的证实

为了选择用于评估获得的抗体的CDH6-阳性人肿瘤细胞系，在已知数据库中检索CDH6表达信息，并且通过流式细胞术评估细胞膜表面上的CDH6的表达。将人卵巢肿瘤细胞系NIH:OVCAR-3、PA-1、OV-90和人肾细胞肿瘤细胞系786-O和Caki-1(全部获得自ATCC)各自在37℃和5% CO

[实施例3：rG019重链可变区和轻链可变区基因片段的扩增和测序

3)-1从产生rG019抗体的杂交瘤制备总RNA

为了扩增编码rG019的每个可变区的cDNA，使用TRIzol试剂(Ambion, Inc.)从产生G019抗体的杂交瘤制备总RNA。

3)-2 通过5'-RACE PCR扩增编码rG019重链可变区的cDNA和测定核苷酸序列

使用近似1μg实施例3)-1中制备的总RNA和SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)扩增编码重链可变区的cDNA。作为用于根据PCR扩增rG019重链基因的可变区的cDNA的引物，使用UPM (通用引物A混合物：与SMARTer RACEcDNA扩增试剂盒一起包括)和从已知大鼠重链的恒定区的序列设计的引物。

将通过5'-RACE PCR扩增的编码重链可变区的cDNA克隆至质粒中，且其后，对重链可变区的cDNA的核苷酸序列进行序列分析。

测定的编码rG019的重链可变区的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:16中，且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:15中。

3)-3 通过5'-RACE PCR扩增编码rG019轻链可变区的cDNA和测定核苷酸序列

扩增和测序通过与实施例3)-2中应用的方法相同的方法实施。然而，作为用于根据PCR扩增rG019轻链基因的可变区的cDNA的引物，使用UPM (通用引物A混合物：与SMARTerRACE cDNA扩增试剂盒一起包括)和从已知大鼠轻链的恒定区的序列设计的引物。

测定的编码rG019的轻链可变区的cDNA的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:11中，且其氨基酸序列显示于SEQ ID NO:10中。

[实施例4：人嵌合抗CDH6抗体chG019的产生]

4)-1 人嵌合抗CDH6抗体chG019表达载体的构建

4)-1-1嵌合和人源化轻链表达载体pCMA-LK的构建

使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将通过使用限制酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen Corp.)而获得的约5.4-kb片段与包含编码人轻链信号序列和人κ链恒定区的DNA序列(SEQ ID NO:20)的DNA片段结合，以产生pcDNA3.3/LK。

从pcDNA3.3/LK除去新霉素表达单元以构建pCMA-LK。

4)-1-2嵌合和人源化IgG1型重链表达载体pCMA-G1的构建

使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将通过使用XbaI和PmeI消化pCMA-LK以从其中除去编码轻链信号序列和人κ链恒定区的DNA序列而获得的DNA片段结合至包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的DNA序列(SEQ IDNO:21)的DNA片段，以构建pCMA-G1。

4)-1-3 chG019重链表达载体的构建

合成SEQ ID NO:27中显示的chG019重链的核苷酸序列中从核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将合成的DNA片段插入已经用限制酶BlpI切割的pCMA-G1的位点，以构建chG019重链表达载体。应注意的是，对于chG019重链，半胱氨酸被脯氨酸取代的CDR序列用于防止意外的二硫键。

4)-1-4 chG019轻链表达载体的构建

合成包含编码chG019轻链的DNA序列(SEQ ID NO:22)的DNA片段(GENEART)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将合成的DNA片段与已通过用XbaI和PmeI消化pCMA-LK以从其中除去编码轻链信号和人κ链恒定区的DNA序列而获得的DNA片段结合，以构建chG019轻链表达载体。

4)-2 人嵌合抗CDH6抗体chG019的产生和纯化

4)-2-1 chG019的产生

根据手册，培养并传代FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corp.)。将1.2×10

4)-2-2 chG019的纯化

根据rProtein A亲和色谱，通过一步法从实施例4)-2-1中获得的培养物上清液纯化抗体。将培养物上清液施加至已经用PBS平衡的MabSelectSuRe (GE HealthcareBiosciences Corp.)填充的柱上，且其后，以柱体积的两倍或更多倍的量用PBS洗涤柱。随后，用2 M精氨酸盐酸盐溶液(pH 4.0)洗脱抗体，使得收集含有抗体的级分。将级分透析(Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，使得用HBSor(25mM组氨酸/5%山梨糖醇，pH6.0)替代缓冲液。使用Centrifugal UF Filter DeviceVIVASPIN20 (分子量截止值: UF10K, Sartorius Inc.)，将抗体浓缩，使得将IgG的浓度调节至5 mg/ml或更高。最后，将抗体通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Inc.)过滤以获得纯化的样品。

4)-3 人嵌合抗CDH6抗体chG019的结合活性的评估

通过流式细胞术证实4)-2中纯化的人嵌合抗CDH6抗体chG019的CDH6-结合活性。使用Lipofectamine 2000，将实施例1)-1中产生的pcDNA3.1-hCDH6或pcDNA3.1-cynoCDH6、或pcDNA3.1瞬时引入293α细胞。将细胞在37℃和5% CO

[实施例5：人源化抗CDH6抗体的产生]

5)-1 抗CDH6抗体的人源化形式的设计

5)-1-1 chG019可变区的分子建模

chG019的可变区的分子建模利用称为同源建模的方法(Methods in Enzymology,203, 121-153, (1991))。使用在蛋白数据库(Nuc.Acid Res.35, D301-D303 (2007))中登记的与chG019的重链和轻链可变区具有高度序列同一性的结构(PDB ID:2I9L)作为模板，执行市售的蛋白三维结构分析程序BioLuminate (由Schrodinger, LLC制造)。

5)-1-2人源化hG019的氨基酸序列的设计

chG019通过CDR移植而人源化(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033(1989))。由KABAT等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))确定的人γ链亚组1和κ链亚组1的共有序列与chG019的骨架区具有高度同一性，且基于此，它们分别被选为重链和轻链的受体。通过参考例如Queen等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA86, 10029-10033 (1989))给出的标准分析三维模型，来选择待移植至受体上的供体残基。

5)-2 chG019重链的人源化

因此设计的三条重链被命名为hH01、hH02和hH04。hH01重链的全长氨基酸序列显示于SEQ ID NO:39中。编码SEQ ID NO:39的氨基酸序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:40中。重链hH02的全长氨基酸序列显示于SEQ ID NO:43中。编码SEQ ID NO:43的氨基酸序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:44中。重链hH04的全长氨基酸序列显示于SEQ ID NO:47中。编码SEQ ID NO:47的氨基酸序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:48中。

5)-3 chG019轻链的人源化

因此设计的两条轻链被命名为hL02和hL03。hL02轻链的全长氨基酸序列显示于SEQ ID NO:31中。编码SEQ ID NO:31的氨基酸序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:32中。轻链hL03的全长氨基酸序列显示于SEQ ID NO:35中。编码SEQ ID NO:35的氨基酸序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:36中。

5)-4通过组合重链和轻链设计人源化hG019

由hH01和hL02组成的抗体被命名为“H01L02抗体”或“H01L02”。由hH02和hL02组成的抗体被命名为“H02L02抗体”或“H02L02”。由hH02和hL03组成的抗体被命名为“H02L03抗体”或“H02L03”。由hH04和hL02组成的抗体被命名为“H04L02抗体”或“H04L02”。

5)-5 人源化抗CDH6抗体的表达

5)-5-1 人源化hG019重链表达载体的构建

5)-5-1-1 hH01重链表达载体的构建

合成SEQ ID NO:40中显示的hH01重链的核苷酸序列中从核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。通过与实施例4)-1-3中应用的方法相同的方法构建所述hH01重链表达载体。

5)-5-1-2 hH02重链表达载体的构建

合成SEQ ID NO:44中显示的hH02重链的核苷酸序列中从核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。通过与实施例4)-1-3中应用的方法相同的方法构建所述hH02重链表达载体。

5)-5-1-3 hH04重链表达载体的构建

合成SEQ ID NO:48中显示的hH04重链的核苷酸序列中从核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。通过与实施例4)-1-3中应用的方法相同的方法构建所述hH04重链表达载体。

5)-5-2 人源化hG019轻链表达载体的构建

5)-5-2-1 hL02轻链表达载体的构建

合成包含SEQ ID NO:32中显示的hL02轻链的核苷酸序列中从核苷酸位置37至399的编码hL02轻链可变区的DNA序列的DNA片段(GENEART)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将合成的DNA片段插入已经用限制酶BsiWI切割的pCMA-LK的位点，以构建hL02轻链表达载体。

5)-5-2-2 hL03轻链表达载体的构建

合成包含SEQ ID NO:36中显示的hL03轻链的核苷酸序列中从核苷酸位置37至399的编码hL03轻链可变区的DNA序列的DNA片段(GENEART)。通过与实施例5)-5-2-1中应用的方法相同的方法构建hL03轻链表达载体。

5)-5-3人源化hG019的制备

5)-5-3-1 H01L02、H02L02、H02L03和H04L02的产生

通过与实施例4)-2-1中应用的方法相同的方法产生抗体。通过组合实施例5)-4中显示的重链和轻链产生H01L02、H02L02、H02L03和H04L02。

5)-5-3-2 H01L02、H02L02、H02L03和H04L02的两步纯化

通过两步法，即通过rProtein A亲和色谱和陶瓷羟基磷灰石，从实施例5)-5-3-1中获得的培养物上清液纯化抗体。将培养物上清液施加至已经用PBS平衡的MabSelectSuRe(由GE Healthcare Biosciences Corp.制造)填充的柱，且其后，以柱体积的两倍或更多倍的量用PBS洗涤柱。随后，使用2 M精氨酸盐酸盐溶液(pH 4.0)洗脱抗体。将含有抗体的级分透析(Thermo Fisher Scientific Inc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，使得用PBS替代缓冲液。将抗体溶液用5mM磷酸钠/50mM MES/pH7.0的缓冲液稀释5倍，且然后施加至已经用5 mM NaPi/50 mM MES/30 mM NaCl/pH 7.0的缓冲液平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(Bio-Rad Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT 1-型羟基磷灰石柱)。以线性浓度梯度的氯化钠实施洗脱，使得收集含有抗体的级分。将该级分透析(Thermo Fisher ScientificInc., Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette)，使得用HBSor (25mM组氨酸/5%山梨糖醇，pH6.0)替代缓冲液。将抗体用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (分子量截止值：UF10K, Sartorius Inc.)浓缩，由此将IgG浓度调节至20mg/ml。最后，将抗体通过Minisart-Plus过滤器(Sartorius Inc.)过滤以获得纯化的样品。

[参考实施例1：抗CDH6抗体NOV0712的产生]

参考国际公开号WO 2016/024195中描述的NOV0712的轻链全长和重链全长氨基酸序列(分别为国际公开号WO 2016/024195中的SEQ ID NO:235和SEQ ID NO:234)产生实施例中使用的抗CDH6抗体NOV0712。

参考实施例1)-1 抗CDH6抗体NOV0712

参考实施例1)-1-1 抗CDH6抗体NOV0712重链表达载体的构建

合成SEQ ID NO:54中显示的NOV0712重链的核苷酸序列中从核苷酸位置36至428的编码NOV0712重链可变区的DNA片段(GENEART)。通过与实施例4)-1-3中应用的方法相同的方法构建NOV0712重链表达载体。由NOV0712重链表达载体表达的NOV0712重链的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:53中。在SEQ ID NO:53中显示的氨基酸序列中，由位置1至19的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列。

参考实施例1)-1-2 抗CDH6抗体NOV0712轻链表达载体的构建

合成包含SEQ ID NO:52中显示的NOV0712轻链的核苷酸序列中从核苷酸位置37至405的编码NOV0712轻链可变区的DNA序列的DNA片段(GENEART)。通过与实施例5)-5-2-1中应用的方法相同的方法构建NOV0712轻链表达载体。由NOV0712轻链表达载体表达的NOV0712轻链的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:51中。在SEQ ID NO:51中显示的氨基酸序列中，由位置1至20的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列。

参考实施例1)-2 抗CDH6抗体NOV0712的制备

参考实施例1)-2-1 抗CDH6抗体NOV0712的产生

通过与实施例4)-2-1中应用的方法相同的方法产生NOV0712。

参考实施例1)-2-2 抗CDH6抗体NOV0712的一步纯化

通过与实施例4)-2-2中应用的方法相同的方法，从参考实施例1)-2-1中获得的培养物上清液纯化抗CDH6抗体NOV0712(参考浓度：5 mg/l HBSor)。

[实施例6：人源化hG019和NOV0712的体外评估]

6)-1 人源化hG019的结合活性的评估

抗体和抗原(重组人CDH6 Fc His嵌合体，R&D Systems, Inc.)之间的解离常数根据捕获方法通过使用Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences Corp.)测量，所述捕获方法包括用固定化的抗His抗体捕获作为配体的抗原，且然后使用抗体作为分析物测量解离常数。通过胺偶联方法将近似1000 RU的抗组氨酸抗体(His捕获试剂盒，GE HealthcareBiosciences Corp.)共价结合至传感器芯片CM5 (GE Healthcare Biosciences Corp.)。还以与上述相同的方式将抗体固定化至参考室。补充有1 mM CaCl

[表2]

6)-2 人源化hG019和NOV0712的CDH6-结合位点的分析

6)-2-1 使用结构域缺陷突变体的表位分析

使用Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific Inc.)，将实施例2)-2-1中产生的每种结构域缺失突变体表达载体或用于全长人CDH6表达的pcDNA3.1-hCDH6瞬时引入细胞中。将细胞在37℃和5% CO

6)-2-2 抗体的结合竞争测定

6)-2-2-1 786-O/hCDH6稳定表达细胞系的产生

786-O/hCDH6稳定表达细胞系通过用用于全长人CDH6表达的重组逆转录病毒感染786-O细胞(ATCC)而产生。通过使用编码人CDH6蛋白(NP_004923)的cDNA表达载体(OriGeneTechnologies Inc., RC217889)并根据本领域技术人员已知的方法将cDNA整合至逆转录病毒载体pQCXIN (Clontech Laboratories, Inc.)中来产生人CDH6表达逆转录病毒载体(pQCXIN-hCDH6)。使用FuGene HD (Promega Corp.)，将pQCXIN-hCDH6瞬时引入逆转录病毒包装细胞RetroPack PT67 (Clontech Laboratories, Inc.)中。48小时后，回收含有重组逆转录病毒的培养物上清液，且然后将其添加至786-O细胞培养系统中，使得感染细胞。从感染后3天起，在37℃和5% CO

6)-2-2-2 使用标记的H01L02和标记的NOV0712的结合竞争测定

标记的H01L02和标记的NOV0712使用Alexa Fluor 488单克隆抗体标记试剂盒(Thermo Fisher Scientific Inc.)产生。离心6)-2-2-1中产生的786-O/hCDH6稳定表达细胞系的细胞悬浮液，且然后除去上清液。其后，通过添加标记的NOV0712或标记的H01L02(最终浓度：5 nM)且进一步添加实施例5)-5-3中已制备的4种人源化hG019抗体(克隆号：H01L02、H02L02、H02L03和H04L02)中每一种或参考实施例1中已制备的抗CDH6抗体NOV0712或作为阴性对照的人IgG1 (Calbiochem)(最终浓度：如图7的横坐标中所示)来悬浮细胞。将细胞在4℃下静置1小时。其后，将细胞用补充有5% FBS的PBS洗涤两次，随后使用流式细胞仪(Canto II; BD Biosciences)进行检测。使用FlowJo (TreeStar, Inc.)分析数据。结果显示于图7中。横坐标描绘添加的未标记抗体的最终浓度，且纵坐标描绘基于平均荧光强度的结合的抗体的量。当将未标记的NOV0712添加至补充有标记的NOV0712的细胞中时，通过用未标记的抗体替换，以添加浓度依赖性的方式减少结合的标记抗体的量，因为它们彼此竞争结合相同的表位。另一方面，即使将4种人源化hG019抗体中每一种或作为阴性对照的人IgG1添加至补充有标记的NOV0712的细胞中，结合的标记的抗体的量也没有变化，表明这些抗体的表位不同，且因此彼此不竞争结合。同样，当将4种未标记的人源化hG019抗体中每一种添加至补充有标记的H01L02的细胞中时，通过用未标记的抗体替换，以添加浓度依赖性的方式减少结合的标记抗体的量，因为它们彼此竞争结合相同的表位。另一方面，即使将NOV0712或作为阴性对照的人IgG1添加至补充有标记的H01L02的细胞中，结合的标记的抗体的量也没有变化，表明这些抗体的表位不同，且因此彼此不竞争结合。

6)-3 人源化hG019和NOV0712的内化活性的评估

使用与抑制蛋白合成的毒素(皂草素)缀合的抗人IgG试剂Hum-ZAP (AdvancedTargeting Systems)评估人源化hG019和NOV0712的内化活性。具体地，将人CDH6-阳性卵巢肿瘤细胞系NIH:OVCAR-3 (ATCC)以4 x 10

[实施例7：人源化hG019变体的产生]

7)-1人源化hG019变体的设计

7)-1-1具有修饰的H01L02可变区的变体的设计

通过用丙氨酸取代实施例5)-2中描述的hH01氨基酸序列中的第71位酪氨酸而设计的重链被指定为hH11，且通过用丝氨酸取代该序列中的第81位谷氨酰胺且用丙氨酸取代该序列中的第123位苯丙氨酸而设计的重链被指定为hH31。hH11重链可变区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:55中。编码SEQ ID NO:55的氨基酸序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:56中。hH31重链可变区的氨基酸序列显示于SEQ ID NO:60中。编码SEQ ID NO:60的氨基酸序列的核苷酸序列显示于SEQ ID NO:61中。

7)-1-2人重链的LALA的设计

通过用丙氨酸残基取代在实施例5)-2中描述的hH01氨基酸序列的位置234和235(通过EU索引指定)的亮氨酸残基来设计重链(在本文中称为"hH01A")。通过用丙氨酸残基取代位置234和235(通过EU索引指定)的亮氨酸残基，设计具有实施例7)-1-1中设计的hH11可变区的重链，即IgG1的同种型(在本文中称为"hH11A")。通过用丙氨酸残基取代位置234和235(通过EU索引指定)的亮氨酸残基，设计具有(实施例7)-1-1中设计的) hH31可变区的重链，即IgG1的同种型(在本文中称为"hH31A")。

7)-2通过组合使用重链和轻链设计结合亲和力改变的人源化hG019的变体

具有hH01A和hL02的抗体被指定为“H01L02A抗体”或“H01L02A”。具有hH11A和hL02的抗体被指定为“H11L02A抗体”或“H11L02A”。具有hH31A和hL02的抗体被指定为“H31L02A抗体”或“H31L02A”。

7)-3结合亲和力改变的人源化hG019的变体的表达

7)-3-1 人源化IgG1 LALA型重链表达载体pCMA-G1LALA的构建

使用包含编码SEQ ID NO:71中显示的人重链信号序列和人IgG1 LALA恒定区的氨基酸序列的DNA序列的DNA片段，以与实施例4)-1-2中相同的方式构建pCMA-G1LALA。

7)-3-2 hH01A重链表达载体的构建

合成SEQ ID NO:66中显示的hH01A的核苷酸序列中从核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒(Clontech Laboratories, Inc.)，将合成的DNA片段插入已经用限制酶BlpI切割的pCMA-G1LALA的位点，以构建hH01A表达载体。

7)-3-3 hH11A重链表达载体的构建

合成SEQ ID NO:68中显示的hH11A的核苷酸序列中从核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。以与实施例7)-3-2中相同的方式构建hH11A表达载体。

7)-3-4 hH31A重链表达载体的构建

合成SEQ ID NO:70中显示的hH31A的核苷酸序列中从核苷酸位置36至440的DNA片段(GENEART)。以与实施例7)-3-2中相同的方式构建hH31A表达载体。

7)-4结合亲和力改变的人源化hG019的变体的制备

7)-4-1 H01L02A、H11L02A和H31L02A的产生

以与实施例4)-2-1中相同的方式实施产生。使用实施例5)-5-2-1中构建的轻链表达载体和实施例7)-3中构建的重链表达载体，获得H链表达载体和L链表达载体的组合，即H01L02A、H11L02A、H31L02A，其对应于实施例7)-2中所述的H和L链的组合。

7)-4-2 H01L02A、H11L02A和H31L02A的两步纯化

使用实施例7)-4-1中获得的培养上清液，以与实施例5)-5-3-2中相同的方式实施纯化。

[实施例8：结合亲和力改变的人源化hG019变体的的体外评估]

8)-1 H01L02A、H11L02A、H31L02A的结合活性的评估

通过使用Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences Corp.)，根据捕获方法测量实施例7)-4中制备的H01L02A、H11L02A和H31L02A各自的构建体和人CDH6的解离常数，所述捕获方法包括通过His Capture Kit (由GE Healthcare Bioscience制造)的方式用固定的抗组氨酸抗体捕获作为配体的抗原，且然后使用抗体作为分析物测量解离常数。作为传感器芯片，使用CM5 (由GE Healthcare Bioscience制造)。作为运行缓冲液，使用含有20mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM CaCl

[表3]

[实施例9：作为对照的抗LPS抗体的产生]

参考WO2015/046505产生抗LPS抗体。实施例中使用的抗LPS抗体的同种型是IgG1(也称为抗-LPS抗体)。实施例中使用的抗LPS抗体的轻链和重链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73中。

[实施例10：生产中间体的合成]

[实施例10-1：中间体1]

[式53]

步骤1：(6S)-6-(羟基甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-甲酸苄酯(1-2)

在0℃下以小份向6

步骤2：(6S)-6-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-5-甲酸苄酯(1-3)

向室温下在步骤1中获得的化合物(1-2) (27.9 g, 107 mmol)和咪唑(14.5 g,214 mmol)于二氯甲烷(300 mL)中的溶液中添加叔丁基二甲基甲硅烷基氯(24.2 g, 160mmol)，并将所得物在室温下搅拌18小时。将反应溶液用饱和柠檬酸水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，且然后在减压下蒸馏。将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯 = 100:0 (v/v)至50:50 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(1-3) (32.5g, 81%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.34 (5H, m), 5.23-5.11 (2H, m), 4.10-3.48(4H, m), 3.16-3.14 (1H, m), 2.15-2.04 (1H, m), 1.81-1.77 (1H, m), 0.91-0.88(9H, m), 0.65-0.55 (4H, m), 0.08-0.01 (6H, m)。

MS (APCI) m/z: 376 (M+H)+

步骤3：(6S)-6-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚烷(1-4)

在室温下向步骤2中获得的化合物(1-3) (32.5 g, 86.5 mmol)于乙醇(400 mL)中的溶液中添加7.5%钯碳催化剂(水含量：54%, 5.00 g)，并将所得物在氢气气氛下在室温下搅拌6小时。将反应溶液通过硅藻土过滤，并将滤液在减压下蒸馏，以得到期望化合物(1-4) (21.3 g，定量)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 3.79-3.77 (1H, m), 3.71-3.69 (1H, m), 3.65-3.60(1H, m), 3.01-2.98 (2H, m), 1.81-1.71 (2H, m), 0.90 (9H, s), 0.65-0.57 (4H,m), 0.08 (3H, s), 0.07 (3H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 242 (M+H)+

步骤4：[(6S)-6-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基](5-甲氧基-2-硝基-4-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}苯基)甲酮(1-5)

在冰冷却下向5-甲氧基-2-硝基-4-{三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}苯甲酸(52.2g, 141 mmol, US 20150283262)和1-羟基苯并三唑一水合物(23.8 g, 155 mmol)于二氯甲烷(500 mL)中的溶液中添加N,N'-二环己基碳二亚胺(35.0 g, 170 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌。在甲酸消失后，向其中缓慢逐滴添加步骤3中获得的化合物(1-4) (34.1g, 141 mmol)和三乙胺(29.4 mL, 212 mmol)于二氯甲烷(100 mL)中的溶液。将反应溶液在室温下搅拌过夜后，将饱和碳酸氢钠水溶液添加至反应混合物中，并将反应混合物用氯仿萃取。有机层用水和盐水洗涤，并经无水硫酸镁干燥。将所得物在减压下蒸馏，并向所得残余物中添加乙酸乙酯和二乙醚，并通过过滤除去固体内容物，并将滤液在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0 (v/v)至25:75 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(1-5)(55.0 g, 66%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.72-7.66 (1H, m), 6.80-6.73 (1H, m), 4.53-4.49(1H, m), 4.04-3.95 (1H, m), 3.91-3.88 (3H, m), 3.59-3.54 (1H, m), 3.36-3.25(0.5H, m), 3.01-2.96 (1.5H, m), 2.24-2.20 (0.3H, m), 2.09-2.05 (0.7H, m),2.00-1.97 (0.7H, m), 1.69-1.67 (0.3H, m), 1.32-1.24 (3H, m), 1.12-1.05 (18H,m), 0.93-0.91 (6H, m), 0.79-0.77 (3H, m), 0.71-0.62 (2H, m), 0.57-0.40 (2H,m), 0.12-0.10 (4H, m), 0.11-0.15 (2H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 593 (M+H)+

步骤5：(2-氨基-5-甲氧基-4-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}苯基)[(6S)-6-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]甲酮(1-6)

在氮气气氛下，向步骤4中获得的化合物(1-5) (55.0 g, 92.8 mmol)于乙醇(300mL)中的溶液中添加7.5%钯碳(10.0 g)。立即用氢气球替换氮气球，并且将反应混合物在氢气气氛下在室温下剧烈搅拌。原材料消失后，将反应混合物过滤，并将滤液在减压下蒸馏，以得到期望化合物(1-6)(52.2 g, 100%)，其直接用于随后的反应。

1H-NMR (CDCl3) δ: 6.71 (1H, s), 6.25 (1H, s), 4.55-4.28 (2H, m), 3.97(1H, m), 3.75-3.62 (3H, m), 3.70 (3H, s), 3.09-3.07 (1H, m), 2.24-2.19 (1H,m), 1.81-1.68 (1H, m), 1.27-1.22 (3H, m), 1.09-1.05 (18H, m), 0.90 (9H, s),0.65-0.46 (4H, m), 0.07-0.03 (6H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 563 (M+H)+

步骤6：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙氨酰胺(1-7)

在乙醇-冰浴上向步骤5获得的化合物(1-6) (18.6 g, 33.0 mmol)和三乙胺(6.26 mL, 45.2 mmol)于THF (300mL)中的溶液中缓慢添加三光气(4.22 g, 14.2 mmol)。添加后，将N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-[4-(羟基甲基)苯基]-L-丙氨酰胺(11.4 g, 30.2 mmol, WO 2011130598)和三乙胺(6.26 mL, 45.2 mmol)于THF (100 mL)和N,N-二甲基甲酰胺(30 mL)中的溶液缓慢逐滴添加至冰冷却的反应混合物中。逐滴添加后，除去冰浴，并将反应混合物在氮气气氛下在40℃下搅拌。原材料消失后，将水添加至反应混合物中，并将反应混合物用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。过滤、随后在减压下蒸馏后，将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0 (v/v)至40:60 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(1-7) (23.5 g, 74%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.99 (1H, m), 8.58 (1H, s), 7.80 (1H, s), 7.55-7.53(2H, m), 7.34-7.32 (2H, m), 6.77-6.75 (2H, m), 5.94-5.87 (1H, m), 5.40-5.38(1H, m), 5.33-5.29 (1H, m), 5.23-5.21 (1H, m), 5.13 (1H, m), 5.10 (2H, m),4.69-4.64 (1H, m), 4.62-4.52 (2H, m), 4.06-4.03 (1H, m), 3.98 (1H, m), 3.76-3.65 (6H, m), 3.04 (1H, m), 2.28-2.26 (1H, m), 2.18-2.13 (1H, m), 1.46 (3H,m), 1.32-1.25 (3H, m), 1.11-1.09 (18H, m), 0.99-0.84 (15H, m), 0.65-0.40 (4H,m), 0.08-0.00 (6H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 966 (M+H)+

步骤7：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羟基甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙氨酰胺(1-8)

在室温下向步骤6中获得的化合物(1-7) (23.5 g, 24.3 mmol)于THF (50 mL)、甲醇(50 mL)和水(44 mL)中的溶液中添加乙酸(200 mL)。将反应混合物在室温下搅拌。原材料消失后，将反应混合物用乙酸乙酯萃取。有机层用水和盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。过滤、随后在减压下蒸馏后，将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯 = 100:0(v/v)至0:100 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(1-8) (18.0 g, 87%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.64-8.62 (1H, m), 8.50 (1H, m), 7.69 (1H, m),7.55-7.53 (2H, m), 7.34-7.32 (2H, m), 6.79-6.75 (3H, m), 5.91-5.89 (1H, m),5.39 (1H, m), 5.32-5.29 (1H, m), 5.23-5.21 (1H, m), 4.68-4.54 (4H, m), 4.31(1H, m), 4.06-4.04 (1H, m), 3.81-3.79 (3H, m), 3.76 (3H, s), 3.63-3.61 (1H,m), 3.13-3.11 (1H, m), 2.16-2.13 (1H, m), 1.87-1.81 (2H, m), 1.46-1.43 (3H,m), 1.30-1.24 (3H, m), 1.12-1.08 (18H, m), 0.98-0.91 (6H, m), 0.63-0.45 (4H,m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 852 (M+H)+

步骤8：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-5'-氧代-8'-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(1-9)

在氮气气氛下在-78℃下，向二甲亚砜(3.75 mL, 52.8 mmol)于二氯甲烷(300mL)中的溶液中缓慢逐滴添加草酰氯(2.17 mL, 25.3 mmol)。逐滴添加后，将反应混合物在-78℃下搅拌。将步骤7中获得的化合物(1-8) (18.0 g, 21.1 mmol)于二氯甲烷(50.0mL)中的溶液缓慢添加至反应混合物中。在-78℃下将三乙胺(14.6 mL, 105 mmol)添加反应溶液中。添加后，除去冷浴，并将温度缓慢升至室温。原材料消失后，将水添加至反应混合物中，并将反应混合物用氯仿(200 mL)萃取。有机层用水和盐水洗涤，并经无水硫酸镁干燥。过滤、随后在减压下蒸馏后，将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0(v/v)至0:60 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(1-9)(16.5 g, 92%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.51-8.36 (1H, m), 7.54-7.38 (2H, m), 7.22-7.07(3H, m), 6.73-6.64 (1H, m), 5.94-5.87 (2H, m), 5.33-5.22 (3H, m), 5.09 (1H,m), 4.97 (1H, m), 4.64-4.58 (4H, m), 4.02-4.00 (1H, m), 3.86-3.83 (3H, m),3.75-3.70 (1H, m), 3.61-3.54 (2H, m), 3.38-3.29 (1H, m), 2.40 (1H, m), 2.16-2.14 (1H, m), 1.74-1.71 (1H, m), 1.44 (3H, m), 1.18-1.16 (3H, m), 1.05-1.00(18H, m), 0.97-0.92 (6H, m), 0.72-0.60 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 850 (M+H)+

步骤9：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-氧代-8'-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(1-10)

在氮气气氛下在0℃下向步骤8中获得的化合物(1-9) (12.0 g, 14.1 mmol)和2,6-二甲基吡啶(6.58 mL, 56.5 mmol)于二氯甲烷(200 mL)中的溶液中缓慢逐滴添加三氟甲磺酸叔丁基二甲基甲硅烷酯(9.73 mL, 42.3 mmol)。在冰冷却下搅拌10分钟后，除去冰浴，并将反应混合物在室温下搅拌。原材料消失后，将水添加至反应混合物中，其用氯仿萃取。有机层用水和盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。过滤、随后在减压下蒸馏后，将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0(v/v)至25:75(v/v)]纯化，以得到期望化合物(1-10) (8.12 g, 60%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.67-8.45 (1H, m), 7.50-7.44 (2H, m), 7.19 (1H, s),7.13 (2H, m), 6.95 (2H, m), 6.62-6.57 (2H, m), 6.01 (1H, m), 5.95-5.86 (1H,m), 5.33-5.13 (3H, m), 4.82 (1H, m), 4.65-4.54 (3H, m), 4.03-4.01 (1H, m),3.84-3.82 (3H, m), 3.73-3.66 (1H, m), 3.50-3.48 (1H, m), 3.27 (1H, m), 2.37-2.33 (1H, m), 2.19-2.13 (1H, m), 1.54-1.43 (3H, m), 1.22-1.13 (3H, m), 1.10-1.00 (18H, m), 0.97-0.91 (6H, m), 0.81 (9H, s), 0.76-0.59 (4H, m), 0.19--0.09(6H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 964 (M+H)+

步骤10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-8'-羟基-7'-甲氧基-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(1-11)

向步骤9中获得的化合物(1-10) (8.12 g, 8.42 mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(90mL)和水(2 mL)中的溶液中添加乙酸锂(0.611 g, 9.26 mmol)，并将所得物在室温下搅拌。原材料消失后，将水添加至反应混合物中，其用乙酸乙酯萃取。有机层用水和盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。过滤、随后在减压下蒸馏后，将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0 (v/v)至0:100 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(1-11)(5.48 g, 81%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.76-8.60 (1H, m), 8.02-7.56 (1H, m), 7.45-7.44(2H, m), 7.21 (1H, s), 7.10-7.09 (2H, m), 6.81-6.74 (1H, m), 6.65 (1H, s),6.23 (1H, s), 6.01-5.99 (1H, m), 5.95-5.84 (1H, m), 5.41-5.20 (2H, m), 5.16(1H, m), 4.84 (1H, m), 4.67-4.54 (4H, m), 4.05-4.03 (1H, m), 3.87 (3H, s),3.71 (1H, m), 3.55-3.51 (1H, m), 3.26 (1H, m), 2.35 (1H, m), 2.18-2.12 (1H,m), 1.55-1.42 (3H, m), 0.97-0.92 (6H, m), 0.81 (9H, s), 0.76-0.61 (4H, m),0.20--0.06 (6H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 808 (M+H)+

[实施例10-2：中间体2]

[式54]

步骤1：N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酸(2-2)

在室温下向甘氨酰甘氨酸(0.328 g, 2.49 mmol)、N,N-二异丙基乙胺(0.433 mL,2.49 mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(20 mL)中的溶液中添加1-{[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮(2-1) (1.00 g, 2.49 mmol,Click Chemistry Tools)和水(10 mL)，并将所得物在室温下搅拌过夜。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[氯仿:CMW = 100:0(v/v)至0:100(v/v)]纯化，以得到期望化合物(0.930 g, 89%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 12.58 (1H, s), 8.14-8.12 (1H, m), 8.08-8.07 (1H,m), 7.69-7.68 (1H, m), 7.62-7.61 (1H, m), 7.53-7.45 (3H, m), 7.40-7.29 (3H,m), 5.05-5.01 (1H, m), 3.73-3.72 (2H, m), 3.66-3.60 (3H, m), 2.66-2.60 (1H,m), 2.33-2.24 (1H, m), 2.08-2.04 (1H, m), 1.81-1.77 (1H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 420 [(M+H)+]。

[实施例10-3：药物-接头1]

[式55]

步骤1：(2R,11aS)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-8-羟基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(3-2)

在氮气气氛下向(2R,11aS)-8-(苄基氧基)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(3-1) (25.5 g, 41.6 mmol, WO 2016149546)于THF (150 mL)和乙醇(150 mL)中的溶液中添加5%钯碳(水含量：54%, 10.0 g)，且然后将反应溶液在氢气气氛下在室温下搅拌3天。将氯仿添加至反应溶液中，将其通过硅藻土过滤，且然后将滤液在减压下蒸馏。所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0 (v/v)至50:50 (v/v)]，以得到期望化合物(3-2)(19.4 g, 89%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.36 (1H, s), 7.25 (1H, s), 6.01 (1H, s), 5.45-5.43(1H, m), 4.69-4.67 (1H, m), 4.60-4.55 (1H, m), 4.23-4.21 (1H, m), 3.96 (3H,s), 3.76-3.68 (2H, m), 3.63-3.61 (1H, m), 3.56-3.53 (1H, m), 2.88-2.83 (1H,m), 2.03-2.00 (1H, m), 1.00-0.98 (2H, m), 0.87 (9H, s), 0.10 (6H, s), 0.02(9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 523 (M+H)+

步骤2：(2R,11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(3-3)

在室温下向步骤1中获得的化合物(3-2) (10.8 g, 20.7 mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(30 mL)中的溶液中添加1,5-二溴戊烷(23.8 g, 103 mmol)和碳酸钾(3.43 g, 24.8mmol)。在室温搅拌3小时后，将水添加至反应溶液中，其用乙酸乙酯萃取。将获得的有机层用盐水洗涤，并经硫酸钠干燥，并在减压下蒸馏。所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 90:10 (v/v)至50:50 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-3)(14.5 g, 定量)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.34 (1H, s), 7.21 (1H, s), 5.52-5.49 (1H, m),4.63-4.62 (1H, m), 4.58-4.55 (1H, m), 4.24-4.22 (1H, m), 4.07-4.04 (2H, m),3.92 (3H, s), 3.82-3.64 (3H, m), 3.56-3.53 (1H, m), 3.45-3.43 (2H, m), 2.86-2.84 (1H, m), 2.04-2.00 (1H, m), 1.97-1.87 (4H, m), 1.66-1.62 (2H, m), 1.01-0.98 (2H, m), 0.87 (9H, s), 0.10 (6H, s), 0.04 (9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 673 [81Br, (M+H)+], 671 [79Br, (M+H)+]。

步骤3：(2R,11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-2-羟基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(3-4)

在0℃下，向步骤2中获得的化合物(3-3) (21.5 mmol)于THF(40 mL)中溶液中添加四丁基氟化铵(28.0 mL, 28.0 mmol)的1 mol/L THF溶液。在室温搅拌30分钟后，将水添加至反应溶液中，其用乙酸乙酯萃取，并将获得的有机层用盐水洗涤。将所得物经硫酸钠干燥，且然后在减压下蒸馏。所得残余物通过硅胶柱色谱[氯仿:甲醇= 97.5:2.5 (v/v)至92.5:7.5 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-4)(11.3 g, 94%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.34 (1H, s), 7.21 (1H, s), 5.53-5.50 (1H, m),4.69-4.64 (2H, m), 4.32-4.30 (1H, m), 4.10-4.00 (2H, m), 3.91 (3H, s), 3.88-3.75 (2H, m), 3.73-3.64 (2H, m), 3.45-3.44 (2H, m), 2.99-2.96 (1H, m), 2.15-2.09 (1H, m), 1.99-1.85 (5H, m), 1.68-1.62 (2H, m), 1.01-0.95 (2H, m), 0.04(9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 559 [81Br, (M+H)+], 557 [79Br, (M+H)+]。

步骤4：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-2,5,11(3H,10H,11aH)-三酮(3-5)

将步骤3中获得的化合物(3-4) (11.3 g, 20.2 mmol)、四丁基溴化铵(0.325 g,1.01 mmol)和溴化钾(0.240 g, 2.02 mmol)溶解于饱和碳酸氢钠水溶液(60 mL)/二氯甲烷(60 mL)中，在0℃下向其中添加nor-AZADO (0.0279 g, 0.202 mmol)和次氯酸钠五水合物(2.03 g, 27.2 mmol)，并将所得物在0℃下搅拌30分钟。由于原材料剩余，因此在0℃下向其中添加次氯酸钠五水合物(1.00 g, 13.4 mmol)，并将所得物在0℃下搅拌15分钟。在0℃下向其中进一步添加次氯酸钠五水合物(0.300 g, 4.03 mmol)，并将所得物在0℃下搅拌15分钟，并通过TLC证实原材料的消失。将硫代硫酸钠水溶液添加至反应溶液中，其用氯仿萃取，并将所得有机层经硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 75:25(v/v)至40:60(v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-5) (9.74g, 87%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.33 (1H, s), 7.24 (1H, s), 5.56-5.53 (1H, m),4.71-4.69 (1H, m), 4.66-4.63 (1H, m), 4.27-4.22 (1H, m), 4.12-4.02 (2H, m),3.93-3.88 (4H, m), 3.82-3.75 (1H, m), 3.69-3.67 (1H, m), 3.61-3.56 (1H, m),3.46-3.44 (2H, m), 2.82-2.77 (1H, m), 1.97-1.89 (4H, m), 1.68-1.64 (2H, m),1.05-0.93 (2H, m), 0.04 (9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 557 [81Br, (M+H)+], 555 [79Br, (M+H)+]。

步骤5：三氟甲磺酸(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-2-酯(3-6)

在-40℃下向步骤4中获得的化合物(3-5) (9.74 g, 17.5 mmol)于二氯甲烷(160mL)中的溶液中添加2,6-二甲基吡啶(8.17 mL, 70.1 mmol)，并将所得物在-40℃下搅拌10分钟。在-40℃下将无水三氟甲磺酸(8.85 mL, 52.6 mmol)添加至反应溶液中，并将所得物在-40℃下搅拌30分钟。向反应溶液中添加10%柠檬酸水溶液，其用氯仿萃取，并将获得的有机层经硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 95:5 (v/v)至70:35 (v/v)]纯化，且然后通过NH2硅胶色谱[己烷:乙酸乙酯= 95:5(v/v)至65:35 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-6)(7.10 g, 59%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.32 (1H, s), 7.24 (1H, s), 7.15-7.14 (1H, m),5.56-5.53 (1H, m), 4.70-4.68 (1H, m), 4.66-4.63 (1H, m), 4.11-4.01 (2H, m),3.94-3.90 (4H, m), 3.84-3.75 (1H, m), 3.73-3.68 (1H, m), 3.46-3.44 (2H, m),3.18-3.14 (1H, m), 1.96-1.88 (4H, m), 1.69-1.61 (2H, m), 1.02-0.92 (2H, m),0.04 (9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 689 [81Br, (M+H)+], 687 [79Br, (M+H)+]。

步骤6：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(3-7)

在室温下向步骤5中获得的化合物(3-6) (2.00 g, 2.91 mmol)、4-甲氧基苯基硼酸(0.884 g, 5.82 mmol)、四(三苯基膦)钯(0)(0.336 g, 0.291 mmol)和碳酸钠(1.23 g,11.6 mmol)的混合物添加甲苯(20 mL)、乙醇(10 mL)和水(10 mL)。将反应溶液在室温下搅拌30分钟，且然后将反应溶液用乙酸乙酯萃取，并将萃取物用水和盐水洗涤。有机层经硫酸钠干燥，且然后在减压下蒸馏。所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 90:10 (v/v)至50:50 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-7)(1.71 g, 91%)。1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38-7.37 (3H, m), 7.33 (1H, s), 7.25 (1H, s), 6.89-6.88 (2H, m), 5.56-5.54 (1H,m), 4.71-4.68 (1H, m), 4.65-4.62 (1H, m), 4.09-4.04 (2H, m), 3.96-3.91 (4H,m), 3.85-3.66 (5H, m), 3.46-3.45 (2H, m), 3.16-3.12 (1H, m), 1.99-1.94 (4H,m), 1.69-1.64 (2H, m), 1.00-0.98 (2H, m), 0.04 (9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 647 [81Br, (M+H)+], 645 [79Br, (M+H)+]。

步骤7：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1, 11a-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5-酮(3-8)

将步骤6中获得的化合物(3-7) (0.789 g, 1.22 mmol)溶解于乙醇(10 mL)和THF(10 mL)中，并在0℃下向其中添加硼氢化锂的2.0 M四氢呋喃溶液(6.11 mL, 12.2 mmol)，并将所得物在0℃下搅拌3小时。将水添加至反应溶液中，其用氯仿萃取，并将获得的有机层经硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物溶解于二氯甲烷(10 mL)、乙醇(20mL)和水(10 mL)中，在室温下向其中添加硅胶(4 g)，并将所得物在室温下搅拌4天。通过过滤除去硅胶，并向其中添加水，并将所得物用氯仿萃取。所得有机层经硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 60:40 (v/v)至25:75(v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-8)(0.496 g, 81%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.90-7.89 (1H, m), 7.53 (1H, s), 7.40-7.40 (1H, m),7.35-7.34 (2H, m), 6.92-6.90 (2H, m), 6.83-6.81 (1H, m), 4.43-4.40 (1H, m),4.13-4.06 (2H, m), 3.96 (3H, s), 3.84 (3H, s), 3.61-3.57 (1H, m), 3.47-3.36(3H, m), 2.00-1.92 (4H, m), 1.67-1.63 (2H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 501 [81Br, (M+H)+], 499 [79Br, (M+H)+]。

步骤8：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,10,11,11a-四氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5-酮(3-9)

在0℃下向步骤7中获得的化合物(3-8) (0.496 g, 0.992 mmol)于二氯甲烷(20mL)中的溶液中添加三乙酰氧基硼氢化钠(0.421 g, 1.99 mmol)。在室温下搅拌2小时后，向其中添加饱和碳酸氢钠水溶液，并将所得物用氯仿萃取。有机层经硫酸钠干燥，并在减压下蒸馏，且然后将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 60:40 (v/v)至25:75 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-9)(0.426 g, 86%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.53-7.53 (2H, m), 7.32-7.30 (2H, m), 6.89-6.87(2H, m), 6.05 (1H, s), 4.33-4.27 (2H, m), 4.00-3.98 (2H, m), 3.86 (3H, s),3.82 (3H, s), 3.57-3.55 (2H, m), 3.42-3.38 (3H, m), 2.76-2.72 (1H, m), 1.96-1.88 (4H, m), 1.65-1.62 (2H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 503 [81Br, (M+H)+], 501 [79Br, (M+H)+]。

步骤9：(11aS)-8-[(5-溴戊基)氧基]-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-11,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-10(5H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(3-10)

在0℃下向步骤8中获得的化合物(3-9)(0.426 g, 0.849 mmol)于二氯甲烷(30mL)中的溶液中添加吡啶(0.102 mL 1.27 mmol)和氯甲酸烯丙酯(0.374 mL, 3.54 mmol)，并将所得物在0℃下搅拌15分钟。向反应溶液中添加10%柠檬酸水溶液，其用氯仿萃取，并将获得的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，且然后经硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 90:10 (v/v)至50:50 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-10)(0.465 g, 94%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38 (1H, s), 7.31-7.29 (2H, m), 7.26-7.25 (1H, m),6.89-6.87 (2H, m), 6.71 (1H, s), 5.80-5.78 (1H, m), 5.14-5.11 (2H, m), 4.65-4.62 (1H, m), 4.39-4.26 (3H, m), 4.03-4.01 (2H, m), 3.92 (3H, s), 3.82 (3H,s), 3.66-3.64 (1H, m), 3.46-3.44 (2H, m), 3.30-3.27 (1H, m), 2.72-2.68 (1H,m), 1.96-1.88 (4H, m), 1.68-1.60 (2H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 587 [81Br, (M+H)+], 585 [79Br, (M+H)+]。

步骤10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(3-11)

在室温下向实施例10-1的步骤10中获得的化合物(1-11) (0.130 g, 0.161mmol)和步骤9中获得的化合物(3-10) (0.104 g, 0.177 mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液中添加碳酸钾(0.0266 g, 0.193 mmol)，并将所得物在室温下搅拌过夜。反应溶液用乙酸乙酯稀释，并用水和盐水洗涤，且然后经硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，且然后将所得残余物通过NH2-硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 70:30 (v/v)至0:100 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-11)(0.184 g, 87%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.76 (1H, s), 7.58-7.56 (2H, m), 7.39 (1H, s),7.32-7.30 (2H, m), 7.26-7.24 (2H, m), 7.19-7.17 (3H, m), 6.90-6.88 (2H, m),6.78 (1H, s), 6.68-6.66 (1H, m), 6.37 (1H, s), 5.99-5.93 (3H, m), 5.34-5.20(6H, m), 4.66-4.01 (11H, m), 3.90 (3H, s), 3.89 (3H, s), 3.78-3.54 (9H, m),3.31-3.28 (2H, m), 2.73-2.69 (1H, m), 2.38-2.35 (1H, m), 2.19-2.13 (1H, m),1.82-1.80 (2H, m), 1.46-1.29 (6H, m), 0.98-0.90 (6H, m), 0.83 (9H, s), 0.69-0.63 (4H, m), 0.19-0.16 (6H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1312 (M+H)+

步骤11：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(3-12)

在室温下向步骤10中获得的化合物(3-11) (0.1837 g, 0.140 mmol)和乙酸(0.048 mL, 0.840 mmol)于THF (5.00 mL)中的溶液中添加四丁基氟化铵的1 mol/L四氢呋喃溶液(0.700 mL, 0.700 mmol)，并将所得物在室温下搅拌3小时。反应溶液用乙酸乙酯稀释，且有机层用饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，且然后经硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶色谱[氯仿:甲醇= 99.5:0.5(v/v)至95:5(v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-12)(0.178 g, 定量)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.86 (1H, s), 7.60-7.59 (2H, m), 7.39 (1H, s),7.32-7.20 (7H, m), 6.90-6.88 (2H, m), 6.78 (1H, s), 6.68 (1H, s), 6.38 (1H,s), 5.90-5.87 (3H, m), 5.39-5.22 (6H, m), 4.72-4.02 (11H, m), 3.90 (3H, s),3.88 (3H, s), 3.83 (3H, s), 3.70-3.63 (6H, m), 3.32-3.29 (3H, m), 2.73-2.69(1H, m), 2.43-2.40 (1H, m), 2.12-2.06 (1H, m), 1.77-1.74 (2H, m), 1.39-1.25(6H, m), 0.96-0.89 (6H, m), 0.73-0.66 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1198 (M+H)+

步骤12：L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(3-13)

在室温下向步骤11中获得的化合物(3-12) (0.140 mmol)于二氯甲烷(2 mL)中的溶液中添加吡咯烷(0.0579 mL, 0.700 mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(0.0162 g, 0.0140mmol)，并将所得物在室温下搅拌15分钟。在减压下蒸馏后，将所得残余物通过硅胶色谱[氯仿:甲醇 = 99.5:0.5(v/v)至92.5:7.5(v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-13)(0.143 g,99%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 9.12 (1H, s), 7.94-7.92 (1H, m), 7.57-7.53 (4H, m),7.33-7.31 (2H, m), 7.20-7.18 (3H, m), 6.90-6.88 (2H, m), 6.36 (1H, s), 6.07(1H, s), 5.91-5.88 (1H, m), 5.47-5.44 (1H, m), 5.21-5.13 (1H, m), 4.66-4.58(3H, m), 4.32 (1H, s), 4.03-3.49 (17H, m), 3.38-3.29 (4H, m), 3.15-3.14 (1H,m), 2.77-2.73 (1H, m), 2.57 (2H, s), 2.43-2.40 (1H, m), 2.32-2.27 (1H, m),1.81-1.39 (8H, m), 0.98-0.96 (3H, m), 0.85-0.83 (3H, m), 0.75-0.62 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1030 (M+H)+

步骤13：N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(3-14)

在室温下向实施例10-2的步骤1中获得的化合物(2-2) (0.0640 g, 0.153 mmol)和N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉(0.0446 g, 0.180 mmol)的混合物中添加二氯甲烷(2 mL)，并将所得物在室温下搅拌15分钟。向反应溶液中添加步骤12中获得的化合物(3-13) (0.143 g, 0.139 mmol)于二氯甲烷(2 mL)中的溶液，并将所得物在室温下搅拌5小时，且然后在减压下蒸馏。所得残余物通过硅胶柱色谱[氯仿:甲醇= 99.5:0.5 (v/v)至92.5:7.5 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(3-14)(0.103 g, 52%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 9.93 (1H, s), 8.21-8.16 (2H, m), 8.07-8.04 (1H,m), 7.83-7.64 (2H, m), 7.60-7.55 (3H, m), 7.51-7.28 (10H, m), 7.19-7.16 (2H,m), 7.10-7.04 (1H, m), 6.92-6.90 (2H, m), 6.76-6.70 (1H, m), 6.39 (1H, s),5.77-5.75 (1H, m), 5.21-5.18 (1H, m), 5.03-4.99 (1H, m), 4.82-4.79 (1H, m),4.37-4.35 (1H, m), 4.21-4.20 (2H, m), 4.02-3.24 (26H, m), 3.16-3.13 (1H, m),2.79-2.59 (2H, m), 2.39-2.28 (2H, m),

2.05-1.97 (2H, m), 1.91-1.77 (4H, m), 1.57-1.54 (3H, m), 1.28-1.23(3H, m),

0.85-0.80 (6H, m), 0.67-0.61 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1431 (M+H)+

[实施例10-4：药物-接头2]

[式56]

步骤1：(2R,11aS)-8-(3-溴丙氧基)-2-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(4-1)

以与实施例10-3的步骤2中相同的方式，使实施例10-3的步骤1中获得的化合物(3-2) (5.06 g, 9.67 mmol)与1,3-二溴丙烷 (4.93 mL, 48.4 mmol)反应，以得到期望化合物(4-1) (4.85 g, 78%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.35 (1H, s), 7.26 (1H, s), 5.52-5.50 (1H, m),4.65-4.63 (1H, m), 4.61-4.55 (1H, m), 4.25-4.14 (3H, m), 3.92 (3H, s), 3.82-3.62 (5H, m), 3.57-3.54 (1H, m), 2.86-2.84 (1H, m), 2.41-2.39 (2H, m), 2.06-1.99 (1H, m), 1.03-0.97 (2H, m), 0.87 (9H, s), 0.10 (6H, s), 0.04 (9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 645 [81Br, (M+H)+], 643 [79Br, (M+H)+]。

步骤2：(2R,11aS)-8-(3-溴丙氧基)-2-羟基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮 (4-2)

以与实施例10-3的步骤3中相同的方式，使步骤1中获得的化合物(4-1) (4.85 g,7.54 mmol)反应，以得到期望化合物(4-2) (4.05 g, 定量)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.35 (1H, s), 7.26 (1H, s), 5.53-5.51 (1H, m),4.66-4.61 (2H, m), 4.32-4.30 (1H, m), 4.21-4.16 (2H, m), 3.91-3.85 (4H, m),3.82-3.74 (1H, m), 3.71-3.59 (4H, m), 2.99-2.96 (1H, m), 2.43-2.37 (2H, m),2.15-2.09 (2H, m), 1.04-0.96 (2H, m), 0.04 (9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 531 [81Br, (M+H)+], 529 [79Br, (M+H)+]。

步骤3：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-2,5,11(3H,10H,11aH)-三酮(4-3)

以与实施例10-3的步骤4中相同的方式，使步骤2中获得的化合物(4-2) (7.54mmol)反应，以得到期望化合物(4-3) (3.73 g, 93%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.34 (1H, s), 7.29 (1H, s), 5.56-5.53 (1H, m),4.72-4.69 (1H, m), 4.67-4.61 (1H, m), 4.23-4.17 (3H, m), 3.97-3.88 (4H, m),3.82-3.75 (1H, m), 3.74-3.56 (4H, m), 2.82-2.77 (1H, m), 2.43-2.38 (2H, m),1.06-0.94 (2H, m), 0.08-0.00 (9H, m)。

步骤4：三氟甲磺酸(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-2-酯(4-4)

以与实施例10-3的步骤5中相同的方式，使步骤3中获得的化合物(4-3) (3.73 g,7.08 mmol)反应，以得到期望化合物(4-4) (3.27 g, 70%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.33 (1H, s), 7.29 (1H, s), 7.15-7.15 (1H, m),5.56-5.54 (1H, m), 4.70-4.65 (2H, m), 4.21-4.18 (2H, m), 3.94-3.91 (4H, m),3.81-3.79 (1H, m), 3.70-3.64 (3H, m), 3.19-3.15 (1H, m), 2.47-2.38 (2H, m),1.02-1.00 (2H, m), 0.04 (9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 661 [81Br, (M+H)+], 659 [79Br, (M+H)+]。

步骤5：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(4-5)

以与实施例10-3的步骤6中相同的方式，使步骤4中获得的化合物(4-4) (3.27 g,4.96 mmol)反应，以得到期望化合物(4-5) (2.49 g, 81%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.49-7.47 (2H, m), 7.40 (1H, s), 7.31-7.24 (2H,m), 6.93-6.88 (2H, m), 5.33-5.31 (1H, m), 5.25-5.18 (1H, m), 4.81-4.80 (1H,m), 4.23-4.10 (2H, m), 3.85 (3H, s), 3.77 (3H, s), 3.70-3.59 (3H, m), 3.52-3.40 (2H, m), 3.15-3.08 (1H, m), 2.33-2.27 (2H, m), 0.86-0.74 (2H, m), -0.07(9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 619 [81Br, (M+H)+], 617 [79Br, (M+H)+]。

步骤6：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1, 11a-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5-酮(4-6)

以与实施例10-3的步骤7中相同的方式，使步骤5中获得的化合物(4-5) (2.49 g,4.04 mmol)反应，以得到期望化合物(4-6) (1.59 g, 84%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 473 [81Br, (M+H)+], 471 [79Br, (M+H)+]。

步骤7：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-1,10,11,11a-四氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5-酮(4-7)

以与实施例10-3的步骤8中相同的方式，使步骤6中获得的化合物(4-6) (1.59 g,3.38 mmol)反应，以得到期望化合物(4-7) (1.39 g, 87%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.54 (1H, s), 7.54-7.51 (1H, m), 7.32-7.29 (2H, m),6.89-6.87 (2H, m), 6.10 (1H, s), 4.32-4.28 (2H, m), 4.14-4.13 (2H, m), 3.85(3H, s), 3.82 (3H, s), 3.63-3.62 (2H, m), 3.57-3.55 (2H, m), 3.40-3.36 (1H,m), 2.76-2.72 (1H, m), 2.40-2.37 (2H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 475 [81Br, (M+H)+], 473 [79Br, (M+H)+]。

步骤8：(11aS)-8-(3-溴丙氧基)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-11,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-10(5H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(4-8)

以与实施例10-3的步骤9中相同的方式，使步骤7中获得的化合物(4-7) (1.40 g,0.2.95 mmol)反应，以得到期望化合物(4-8) (0.885 g, 54%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.34 (1H, s), 7.27-7.25 (2H, m), 7.22 (1H, s),6.86-6.84 (2H, m), 6.73 (1H, s), 5.76-5.74 (1H, m), 5.11-5.09 (2H, m), 4.62-4.59 (2H, m), 4.33-4.31 (1H, m), 4.16-4.13 (3H, m), 3.88 (3H, s), 3.79 (3H,s), 3.60-3.59 (3H, m), 3.27-3.23 (1H, m), 2.69-2.65 (1H, m), 2.37-2.34 (2H,m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 559 [81Br, (M+H)+], 557 [79Br, (M+H)+]。

步骤9：N-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-L-缬氨酰-N-[4-({[(11'aS)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}丙氧基)-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙氨酰胺(4-9)

以与实施例10-3的步骤10中相同的方式，使步骤8中获得的化合物(4-8) (0.0381g, 0.0683 mmol)与实施例10-1的步骤10中获得的化合物(1-11) (0.0552 g, 0.0683mmol)反应，以得到期望化合物(4-9) (0.0712 g, 81%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1284 (M+H)+。

步骤10：N-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-L-缬氨酰-N-[4-({[(11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}丙氧基)-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙氨酰胺(4-10)

以与实施例10-3的步骤11中相同的方式，使步骤9中获得的化合物(4-9) (0.0712g, 0.0554 mmol)反应，以得到期望化合物(4-10) (0.0671 g, 定量)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1170 (M+H)+。

步骤11：L-缬氨酰-N-[4-({[(11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}丙氧基)-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙氨酰胺(4-11)

以与实施例10-3的步骤12中相同的方式，使步骤10中获得的化合物(4-10)(0.0571 mmol)反应，以得到期望化合物(4-11) (0.0574 g, 99%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 9.16 (1H, s), 7.93-7.91 (1H, m), 7.55-7.52 (1H, m),7.50-7.47 (3H, m), 7.35-7.32 (2H, m), 7.21 (1H, s), 7.13-7.11 (2H, m), 6.90-6.87 (2H, m), 6.40 (1H, s), 6.08 (1H, s), 5.90-5.87 (1H, m), 5.37-5.34 (1H,m), 4.73-4.53 (3H, m), 4.23-4.08 (5H, m), 3.89 (3H, s), 3.82 (3H, s), 3.78-3.72 (5H, m), 3.57-3.51 (3H, m), 3.38-3.30 (3H, m), 2.76-2.71 (1H, m), 2.36-2.24 (4H, m), 1.78-1.42 (6H, m), 1.00-0.98 (3H, m), 0.87-0.84 (3H, m), 0.74-0.62 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1002 (M+H)+。

步骤12：N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰-L-缬氨酰-N-[4-({[(11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}丙氧基)-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙氨酰胺(4-12)

以与实施例10-3的步骤13中相同的方式，使步骤11中获得的化合物(4-11)(0.189 g, 0.189 mmol)与实施例10-2的步骤1中获得的化合物(2-2) (0.087 g, 0.207mmol)反应，以得到期望化合物(4-12) (0.169 g, 64%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1402 (M+H)+。

[实施例10-5：药物-接头3]

[式57]

步骤1：(6S,6'S)-5,5'-{1,5-戊烷二基双[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)羰基]}双(5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-甲酸)二甲酯(5-2)

在0℃下向4,4'-[1,5-戊烷二基双(氧基)]双(5-甲氧基-2-硝基苯甲酸) (5-1)(5.41 g, 10.9 mmol, Journal of Medicinal Chemistry 2004, 47, 1161)于二氯甲烷(50 mL)中的溶液中添加草酰氯(5.63 mL, 65.7 mmol)，并向其中逐滴添加N,N-二甲基甲酰胺(0.0844 mL, 1.09 mmol)。将反应溶液的温度升至室温，并将反应溶液搅拌2小时。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物溶解于二氯甲烷(100 mL)中，将其在氮气气氛下于-40℃下逐滴添加至(6S)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-甲酸甲酯盐酸盐(4.28 g, 24.1 mmol,Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847)和三乙胺(6.07 mL, 43.8 mmol)的二氯甲烷溶液(100 mL)中。将反应溶液的温度升至0℃，并将反应溶液搅拌2小时。向反应混合物中添加1N盐酸(100 mL)，且有机层用水和盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，以得到期望化合物(5-2)(8.40 g, 定量)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.71 (2H, s), 6.88 (2H, s), 4.63 (2H, m), 4.15-4.12 (4H, m), 3.94 (6H, s), 3.71 (6H, s), 3.25 (2H, m), 3.10 (2H, m), 2.31-2.28 (2H, m), 1.90-1.83 (6H, m), 1.60-1.58 (2H, m), 0.71-0.49 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 769 (M+H)+。

步骤2：{1,5-戊烷二基双[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)]}双{[(6S)-6-(羟基甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]甲酮}(5-3)

向步骤1中获得的化合物(5-2) (8.40 g, 10.9 mmol)于THF (100mL)中的溶液中添加硼氢化锂(714 mg, 32.8 mmol)，并将所得物在0℃下搅拌30分钟，且然后将温度升至室温，并进行搅拌1小时。在0℃下添加1N盐酸后，将所得物用乙酸乙酯萃取，并用盐水洗涤，且然后经无水硫酸钠干燥。在减压下蒸馏掉溶剂，以得到期望化合物(5-3)(7.70 g, 99%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.67 (2H, s), 7.05 (2H, s), 4.86-4.74 (2H, m),4.22-4.12 (6H, m), 3.92 (6H, s), 3.83-3.73 (2H, m), 3.62-3.51 (2H, m), 3.29(1H, m), 3.11 (2H, m), 2.96 (1H, m), 2.12-2.03 (2H, m), 1.82-1.77 (6H, m),1.59-1.56 (2H, m), 0.67-0.41 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 713 (M+H)+。

步骤3：二乙酸戊-1,5-二基双[氧基(5-甲氧基-2-硝基苯-4,1-二基)羰酯(6

将步骤2中获得的化合物(5-3) (7.70 g, 10.8 mmol)溶解于吡啶(20 mL)和乙酸酐(10 mL, 105.9 mmol)中，将其在室温下搅拌。将所得物在减压下蒸馏，以得到期望化合物(5-4)(8.38 g, 97%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.68 (2H, s), 7.03 (2H, s), 4.47-4.46 (2H, m),4.36-4.27 (4H, m), 4.13-4.11 (6H, m), 3.92 (6H, s), 3.16 (2H, m), 2.98 (2H,m), 2.17 (1H, m), 2.06 (6H, s), 1.84 (4H, m), 1.68 (1H, m), 1.58 (2H, m),0.64-0.45 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 797 (M+H)+。

步骤4：二乙酸1,5-戊烷二基双[氧基(2-氨基-5-甲氧基苯-4,1-二基)羰酯(6S)-5-氮杂螺[2.4]庚-5,6-二基甲烷二基]酯(5-5)

向步骤3中获得的化合物(5-4) (8.28 g, 10.4 mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(100mL)中的溶液中添加5%钯碳(水含量：54%，1.00 g)，且然后将反应溶液在氢气气氛下在室温下剧烈搅拌6小时。将所得物通过硅藻土过滤，且然后将滤液在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[氯仿:甲醇= 100:0(v/v)至90:10(v/v)]纯化，以得到期望化合物(5-5)(5.05 g, 66%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 6.66 (2H, s), 6.36 (2H, s), 5.11 (4H, s), 4.49(2H, s), 4.19 (4H, m), 3.90 (4H, m), 3.62 (6H, s), 3.48-3.46 (2H, m), 3.33(2H, s), 3.23-3.20 (2H, m), 2.01 (6H, s), 1.78-1.74 (6H, m), 1.55 (2H, m),0.61-0.58 (4H, m), 0.49-0.48 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 737 (M+H)+。

步骤5：乙酸{(6

向步骤4中获得的化合物(5-5) (5.05 g, 6.85 mmol)于二氯甲烷(100 mL)中的溶液中添加吡啶(1.10 mL, 13.7 mmol)，并在氮气气氛下在-78℃下向其中添加氯甲酸烯丙酯(0.725 mL, 6.85 mmol)，并将所得物搅拌2小时。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 70:30 (v/v)至100:0 (v/v), 氯仿:甲醇 = 100:0(v/v)至90:10 (v/v)]纯化，以得到作为期望化合物的双烯丙基氧基羰基形式(5-6b)(1.36 g, 22%)和单烯丙基氧基羰基形式(5-6) (2.63 g, 47%)。

二乙酸戊-1,5-二基双[氧基(5-甲氧基-2-{[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]氨基}苯-4,1-二基)羰酯(6

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 9.14 (2H, s), 7.14 (2H, s), 6.85 (2H, s), 5.94(2H, m), 5.33 (2H, m), 5.21 (2H, m), 4.55 (4H, m), 4.47 (1H, s), 4.23 (3H,s), 3.96 (4H, m), 3.74 (6H, s), 3.34 (6H, s), 3.31 (2H, m), 3.21 (2H, m),2.04 (6H, s), 1.79 (4H, m), 1.67 (2H, m), 1.56 (2H, m), 0.56-0.48 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 905 (M+H)+。

单烯丙基氧基羰基形式(5-6)：

1H-NMR (DMSO-D6)

δ: 9.14 (1H, s), 7.14 (1H, s), 6.85 (1H, s), 6.65 (1H, s), 6.35 (1H,s), 5.95 (1H, m), 5.33 (1H, m), 5.22 (1H, m), 5.11 (2H, s), 4.55 (2H, m),4.48 (2H, s), 4.23-4.14 (4H, m), 3.96 (2H, m), 3.90 (2H, m), 3.74 (3H, s),3.63 (3H, s), 3.49 (1H, m), 3.38-3.30 (4H, m), 3.21 (1H, m), 2.04 (3H, s),2.01 (3H, s), 1.77 (5H, m), 1.68 (1H, m), 1.56 (2H, m), 0.63-0.48 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 821 (M+H)+。

步骤6：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[2-({(6S)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基}羰基)-5-({5-[4-({(6S)-6-[(乙酰基氧基)甲基]-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基}羰基)-2-甲氧基-5-{[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]氨基}苯氧基]戊基}氧基)-4-甲氧基苯基]氨基甲酰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(5-7)

以与实施例10-1的步骤6中相同的方式使步骤5中获得的单烯丙基氧基羰基形式(5-6) (2.00 g, 2.44 mmol)与N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-[4-(羟基甲基)苯基]-L-丙氨酰胺(1.10 g, 2.92 mmol, WO2011130598)反应，以得到期望化合物(5-7)(2.64 g, 89%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 10.02 (1H, s), 9.14 (2H, s), 8.18 (1H, m), 7.59(2H, m), 7.33 (2H, m), 7.27 (1H, m), 7.14 (2H, s), 6.85 (2H, s), 5.99-5.86(2H, m), 5.31 (2H, n), 5.19 (2H, m), 5.03 (2H, s), 4.55 (2H, m), 4.48 (2H,n), 4.41 (2H, m), 4.23-4.21 (3H, m), 3.94-3.91 (4H, m), 3.88-3.86 (2H, m),3.74 (3H, s), 3.74 (3H, s), 3.34 (4H, s), 3.32-3.30 (2H, m), 3.20-3.18 (2H,m), 2.03 (6H, s), 1.96 (1H, m), 1.79 (4H, s), 1.66 (1H, m), 1.55 (2H, s),1.30 (3H, m), 0.88 (3H, m), 0.83 (3H, m), 0.54-0.49 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1224 (M+H)+。

步骤7：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-[4-({[(2-{[(6S)-6-(羟基甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]羰基}-5-{[5-(4-{[(6S)-6-(羟基甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]羰基}-2-甲氧基-5-{[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]氨基}苯氧基)戊基]氧基}-4-甲氧基苯基)氨基甲酰基]氧基}甲基)苯基]-L-丙氨酰胺(5-8)

向步骤6中获得的化合物(5-7) (2.64 g, 2.16 mmol)于甲醇(10 mL)中的溶液中添加碳酸钾(1.49 g, 10.8 mmol)，并将所得物在室温下搅拌3小时。将饱和氯化铵水溶液(100 mL)添加至反应混合物中，其用乙酸乙酯萃取。有机层经无水硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，以得到期望化合物(5-8)(2.21 g, 90%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 10.04 (1H, s), 9.18 (1H, s), 8.18 (1H, m), 7.59(2H, m), 7.33 (2H, m), 7.26 (1H, m), 7.22 (1H, s), 7.14 (2H, s), 6.89 (2H,s), 5.98-5.86 (2H, m), 5.31 (2H, m), 5.19 (2H, m), 5.04 (2H, s), 4.80 (2H,m), 4.55 (2H, m), 4.48 (2H, m), 4.41 (1H, m), 4.26 (2H, s), 3.96-3.94 (4H,m), 3.90-3.85 (1H, m), 3.74 (6H, s), 3.59 (2H, m), 3.33 (6H, s), 3.09 (1H,m), 1.93-1.83 (8H, m), 1.57-1.54 (2H, m), 1.30 (3H, m), 0.88 (3H, m), 0.83(3H, m), 0.52-0.43 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1140 (M+H)+。

步骤8：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-8'-{[5-({(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-5'-氧代-10'-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基}氧基)戊基]氧基}-7'-甲氧基-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(5-9)

向步骤7中获得的化合物(5-8) (2.03 g, 1.78 mmol)于二氯甲烷(50 mL)中的溶液中添加Dess-Martin高碘烷(1.59 g, 3.74 mmol)，并所得物在室温下搅拌过夜。将饱和碳酸氢钠水溶液(100 mL)添加至反应混合物中，其用氯仿萃取。有机层经无水硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[氯仿:甲醇= 100:0(v/v)至90:10(v/v)]纯化，以得到期望化合物(5- 9)(2.05 g, 定量)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 9.99 (1H, s), 8.16 (1H, m), 7.54 (2H, m), 7.32-7.22 (3H, m), 7.08-7.04 (2H, m), 6.80-6.72 (2H, m), 6.55 (2H, s), 5.94-5.86(2H, m), 5.75 (2H, m), 5.31-5.04 (2H, m), 4.81 (1H, m), 4.62 (1H, m), 4.48-4.38 (4H, m), 4.00-3.87 (4H, m), 3.79-3.76 (7H, m), 3.54 (2H, m), 3.42-3.40(2H, m), 3.33 (4H, s), 3.14 (2H, m), 2.35 (2H, m), 1.80-1.78 (4H, m), 1.59-1.56 (4H, m), 1.29 (3H, m), 0.87 (3H, m), 0.83 (3H, m), 0.70-0.59 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1136 (M+H)+。

步骤9：L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(5-10)

以与实施例10-3的步骤12中相同的方式，使步骤8中获得的化合物(5-9) (2.05g, 1.80 mmol)反应，以得到期望化合物(5-10) (1.02 g, 60%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 10.08 (1H, s), 7.57 (2H, m), 7.32-7.20 (3H, m),7.05 (2H, s), 6.68-6.60 (3H, m), 5.74 (1H, m), 4.99-4.58 (4H, m), 3.99-3.94(4H, m), 3.78-3.73 (6H, m), 3.66-3.38 (4H, m), 3.15-3.01 (3H, m), 2.40-2.34(3H, m), 1.89-1.81 (6H, m), 1.57-1.53 (4H, m), 1.28 (3H, m), 0.88 (3H, m),0.78 (3H, m), 0.64-0.55 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 950 (M+H)+。

步骤10：N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(5-11)

将步骤9中获得的化合物(5-10) (0.710 g, 0.747 mmol)和实施例10-2中的步骤1中获得的化合物(2-2) (0.313 g, 0.747 mmol)溶解于二氯甲烷(1.5 mL)和甲醇(0.1mL)的混合溶剂中。向其中添加氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓(0.264 g, 0.897 mmol)，并将所得物在室温下搅拌1小时。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[氯仿:甲醇= 100:0 (v/v)至80:20 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(5-11)(0.671 g, 66%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 9.91 (1H, s), 8.32 (1H, s), 8.23-7.91 (3H, m),7.81-7.19 (14H, m), 7.04 (1H, m), 6.80-6.62 (3H, m), 5.77-5.75 (1H, m), 5.20(1H, m), 5.01 (1H, m), 4.79 (1H, m), 4.46-4.35 (1H, m), 4.04 (4H, m), 3.86-3.38 (18H, m), 3.22-3.15 (2H, m), 2.67-2.63 (1H, m), 2.46-2.23 (3H, m), 2.09-1.91 (2H, m), 1.80-1.78 (5H, m), 1.57 (3H, m), 1.27 (3H, s), 1.11-1.04 (1H,m), 0.87-0.79 (6H, m), 0.63-0.55 (6H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1351 (M+H)+。

[实施例10-6：药物-接头4]

[式58]

步骤1：(6S)-5-[4-(苄基氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酰基]-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-甲酸甲酯(6-2)

经5分钟在冰冷却下向4-(苄基氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酸(6-1) (6.07 g,20.0 mmol, Tetrahedron 1995, 51, 5617)和N,N-二甲基甲酰胺(1.08 mL, 13.9 mmol)于二氯甲烷(100 mL)中的溶液中逐滴添加草酰氯(3.43 mL, 40.0 mmol)。将反应溶液在室温下搅拌5小时，且然后在减压下蒸馏，并将所得残余物溶解于二氯甲烷(20 mL)中，其在减压下蒸馏。重复该操作三次后，将残余物悬浮于二氯甲烷(5 mL)中，向其中添加过量的二乙醚和己烷，随后过滤并在减压下干燥，得到粗酰氯。将获得的酰氯溶解于二氯甲烷中，并冷却至-40℃(干冰-乙腈浴)，向其中缓慢添加(6S)-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-甲酸甲酯盐酸盐(4.22 g, 22.0 mmol, Tetrahedron Letters 2012. 53. 3847)和三乙胺(3.36 mL, 24.2mmol)。将反应混合物的温度升至室温过夜。向反应混合物中添加1 N盐酸，并将反应混合物用二氯甲烷萃取。将有机层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0至50:50]纯化，以得到期望化合物(6-2)(6.55 g, 80%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 441 (M+H)+

步骤2：(11a'S)-8'-(苄基氧基)-7'-甲氧基-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5',11'(10'H,11a'H)-二酮(6-3)

在氮气气氛下向步骤1中获得的化合物(6-2) (6.55 g, 16.0 mmol)于乙醇(150mL)和THF (150 mL)中的溶液中添加雷尼镍(7.00 g)。将一水合肼(7 mL)添加至反应混合物中，并将温度逐渐升至50℃。在50℃下搅拌2小时后，向其中添加雷尼镍(3.00 g)和一水合肼(3 mL)，并将所得物搅拌1小时。将THF (100 mL)添加至反应混合物中，其通过硅藻土过滤。将所得物在减压下蒸馏，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0(v/v)至25:75(v/v)]纯化，以得到期望化合物(6-3)(4.42 g, 73%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.82 (1H, s), 7.48 (1H, s), 7.42-7.35 (4H, m),7.32-7.31 (1H, m), 6.44 (1H, s), 5.16 (2H, s), 4.16-4.10 (1H, m), 3.93 (3H,s), 3.78-3.76 (1H, m), 3.39-3.37 (1H, m), 2.45-2.43 (1H, m), 2.24-2.21 (1H,m), 0.83-0.61 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 379 (M+H)+

步骤3：(11a'S)-8'-(苄基氧基)-7'-甲氧基-10'-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5',11'(10'H,11a'H)-二酮(6-4)

在-40℃下向步骤2中获得的化合物(6-3) (10.0 g, 26.4 mmol)于THF (150 mL)中的溶液中缓慢逐滴添加正丁基锂的2.6 mol/L正己烷溶液(12.0 mL, 31.8 mmol)。将反应溶液在-40℃下搅拌15分钟，且然后向其中缓慢逐滴添加2-(氯甲氧基)乙基三甲基甲硅烷(5.57 mL, 31.7 mmol)。将反应溶液在室温下搅拌3小时后，向其中添加水，并将所得物用乙酸乙酯萃取。有机层用水和盐水洗涤，并经无水硫酸钠干燥。在减压下蒸馏后，将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0(v/v)至30:70(v/v)]纯化，以得到期望化合物(6-4) (11.8 g, 88%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.45-7.44 (2H, m), 7.37-7.32 (4H, m), 7.28 (1H, s),5.48-5.46 (1H, m), 5.21 (2H, s), 4.50-4.48 (1H, m), 4.22-4.20 (1H, m), 3.95(3H, s), 3.73-3.70 (2H, m), 3.62-3.60 (1H, m), 3.41-3.38 (1H, m), 2.45-2.43(1H, m), 2.23-2.20 (1H, m), 0.98-0.96 (2H, m), 0.83-0.68 (4H, m), 0.04 (9H,s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 509 (M+H)+

步骤4：(11a'S)-8'-羟基-7'-甲氧基-10'-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5',11'(10'H,11a'H)-二酮(6-5)

在氮气气氛下，向步骤3中获得的化合物(6-4) (18.7 g, 36.8 mmol)于THF (50mL)和乙醇(100 mL)中的溶液中添加5%钯碳催化剂(5.00 g)。立即用氢气球代替氮气球，并将反应混合物在氢气气氛下搅拌6小时。反应混合物通过添加氯仿稀释，并通过硅藻土过滤，且然后在减压下蒸馏滤液，并将所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0(v/v)至25:75(v/v)]纯化，以得到期望化合物(6-5)(15.1 g, 98%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.38 (1H, s), 7.28 (1H, s), 6.01 (1H, s), 5.49-5.47(1H, m), 4.70-4.68 (1H, m), 4.24-4.22 (1H, m), 3.96 (3H, s), 3.76-3.71 (2H,m), 3.66-3.64 (1H, m), 3.42-3.39 (1H, m), 2.47-2.45 (1H, m), 2.23-2.21 (1H,m), 1.01-0.99 (2H, m), 0.89-0.63 (4H, m), 0.03 (9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 419 (M+H)+

步骤5：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基)氧基]-7'-甲氧基-10'-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5',11'(10'H,11a'H)-二酮(6-6)

以与实施例10-3的步骤2中相同的方式，使步骤4中获得的化合物(6-5) (2.77 g,6.62 mmol)反应，以得到期望化合物(6-6) (3.31 g, 88%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.36 (1H, s), 7.25 (1H, s), 5.55 (1H, m), 4.65 (1H,m), 4.24-4.23 (1H, m), 4.11-4.03 (2H, m), 3.93 (3H, s), 3.85-3.78 (1H, m),3.72-3.69 (2H, m), 3.46-3.39 (3H, m), 2.47-2.44 (1H, m), 2.25-2.22 (1H, m),1.95-1.91 (4H, m), 1.67-1.59 (1H, m), 1.03-0.95 (2H, m), 0.90-0.85 (1H, m),0.70-0.66 (4H, m), 0.05 (9H, s)。

步骤6：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基)氧基]-7'-甲氧基-1',11a'-二氢-5'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5'-酮(6-7)

以与实施例10-3的步骤7中相同的方式，使步骤5中获得的化合物(6-6) (3.31 g,5.83 mmol)反应，以得到期望化合物(6-7) (1.11 g, 45%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.81 (1H, m), 7.53 (1H, s), 6.82 (1H, s), 4.13-4.06(2H, m), 3.97 (3H, s), 3.88-3.83 (1H, m), 3.69 (1H, m), 3.52-3.39 (3H, m),2.55-2.52 (1H, m), 2.06-1.89 (5H, m), 1.67-1.63 (2H, m), 0.76-0.72 (4H, m)。

步骤7：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基)氧基]-7'-甲氧基-1',10',11',11a'-四氢-5'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5'-酮(6-8)

以与实施例10-3的步骤8中相同的方式，使步骤6中获得的化合物(6-7) (2.56 g,6.08 mmol)反应，以得到期望化合物(6-8) (1.15 g, 45%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.60 (1H, s), 6.07 (1H, s), 4.11-4.04 (1H, m), 3.99(2H, m), 3.87-3.84 (1H, m), 3.85 (3H, s), 3.73 (1H, m), 3.58-3.53 (2H, m),3.47-3.42 (3H, m), 2.03-1.78 (6H, m), 1.65-1.63 (2H, m), 0.77-0.56 (4H, m)。

步骤8：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基)氧基]-7'-甲氧基-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(6-9)

以与实施例10-3的步骤9中相同的方式，使步骤7中获得的化合物(6-8) (1.15 g,2.72 mmol)反应，以得到期望化合物(6-9) (1.14 g, 82%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.23 (1H, s), 6.69 (1H, s), 5.79 (1H, s), 5.13-5.10(2H, m), 4.68-4.66 (1H, m), 4.48-4.45 (2H, m), 4.01 (2H, m), 3.92 (3H, s),3.76 (1H, m), 3.54-3.37 (3H, m), 2.39 (1H, m), 1.95-1.90 (4H, m), 1.68-1.61(3H, m), 1.44 (1H, m), 0.75-0.66 (4H, m)。

步骤9：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-10'-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氢'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(6-10)

以与实施例10-3的步骤10中相同的方式，使步骤8中获得的化合物(6-9) (0.374g, 0.737 mmol)与实施例10-1的步骤10中获得的化合物(1-11) (0.452 g, 0.56 mmol)反应，以得到期望化合物(6-10) (0.589 g, 65%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1234 (M+H)+

步骤10：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-10'-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(6-11)

以与实施例10-3的步骤11中相同的方式，使步骤9中获得的化合物(6-10) (0.589g, 0.477 mmol)反应，以得到期望化合物(6-11) (0.382 g, 71%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.90 (1H, s), 7.55 (2H, m), 7.25-7.21 (2H, m), 6.74(2H, m), 6.38 (1H, s), 5.90-5.87 (5H, m), 5.33-5.09 (8H, m), 4.66-4.60 (8H,m), 3.98-3.91 (10H, m), 3.77-3.30 (12H, m), 2.42-2.36 (2H, m), 1.77-1.39 (6H,m), 0.91-0.70 (14H, m)。

步骤11：L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(6-12)

以与实施例10-3的步骤12中相同的方式，使步骤10中获得的化合物(6-11)(0.382 g, 0.341 mmol)反应，以得到期望化合物(6-12) (0.200 g, 62%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 952 (M+H)+

步骤12：N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酰胺(6-13)

以与实施例10-3的步骤13中相同的方式，使步骤11中获得的化合物(6-12)(0.0560 g, 0.0588 mmol)与实施例10-2的步骤1中获得的化合物(2-2) (0.022 g, 0.053mmol)反应，以得到期望化合物(6-13) (0.0500 g, 63%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 1354 (M+H)+

[药物部分的合成]

[实施例10-7：药物1]

[式59]

步骤1：氨基甲酸丙-2-烯-1-基 (2-{[(6S)-6-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}苯基)酯(7-1)

以与实施例10-3的步骤9中相同的方式，使实施例1的步骤5中获得的化合物(1-6)(4.59 g, 8.15 mmol)反应，以得到期望化合物(7-1) (4.86 g, 92%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.97 (1H, s), 7.77 (1H, s), 6.77 (1H, s), 5.97-5.94(1H, m), 5.39-5.21 (2H, m), 4.67-4.59 (3H, m), 4.00-3.98 (1H, m), 3.74-3.66(5H, m), 3.05-3.03 (1H, m), 2.30-2.28 (1H, m), 1.72-1.70 (1H, m), 1.30-1.27(3H, m), 1.11-1.05 (18H, m), 0.99-0.91 (9H, m), 0.61-0.53 (4H, m), 0.10-0.06(6H, m)。MS (APCI, ESI) m/z: 647 (M+H)+

步骤2：氨基甲酸丙-2-烯-1-基 (2-{[(6S)-6-(羟基甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基-5-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}苯基)酯 (7-2)

以与实施例10-1的步骤7中相同的方式，使步骤1中获得的化合物(7-1) (4.86 g,7.51 mmol)反应，以得到期望化合物(7-2) (3.42 g, 86%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 8.52 (1H, s), 7.71 (1H, s), 6.77 (1H, s), 6.00-5.94(1H, m), 5.35-5.27 (2H, m), 4.65-4.64 (3H, m), 4.33-4.31 (1H, m), 3.82-3.77(5H, m), 3.68-3.66 (1H, m), 3.15-3.13 (1H, m), 1.89-1.86 (2H, m), 1.30-1.26(3H, m), 1.14-1.10 (18H, m), 0.66-0.51 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 533 (M+H)+

步骤3：(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-5'-氧代-8'-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(7-3)

以与实施例10-1的步骤8中相同的方式，使步骤2中获得的化合物(7-2) (6.68 g,12.5 mmol)反应，以得到期望化合物(7-3) (6.44 g, 97%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.20 (1H, s), 6.69 (1H, s), 5.89-5.78 (2H, m),5.18-5.15 (2H, m), 4.62-4.60 (1H, m), 4.49-4.47 (1H, m), 3.85 (3H, s), 3.74-3.71 (1H, m), 3.59-3.57 (1H, m), 3.33-3.30 (2H, m), 2.43-2.40 (1H, m), 1.76-1.73 (1H, m), 1.28-1.20 (3H, m), 1.09-1.07 (18H, m), 0.74-0.65 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 531 (M+H)+

步骤4：(11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-氧代-8'-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(7-4)

以与实施例10-1的步骤9中相同的方式，使步骤3中获得的化合物(7-3) (3.24 g,6.10 mmol)反应，以得到期望化合物(7-4) (3.86 g, 98%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.20 (1H, s), 6.67 (1H, s), 6.01-5.98 (1H, m),5.79-5.73 (1H, m), 5.14-5.10 (2H, m), 4.64-4.61 (1H, m), 4.37-4.34 (1H, m),3.86 (3H, s), 3.72-3.69 (1H, m), 3.52-3.50 (1H, m), 3.29-3.26 (1H, m), 2.38-2.34 (1H, m), 1.55-1.51 (1H, m), 1.28-1.24 (3H, m), 1.15-1.07 (18H, m), 0.81-0.66 (13H, m), 0.21 (3H, s), 0.18 (3H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 645 (M+H)+

步骤5：(11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-8'-羟基-7'-甲氧基-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(7-5)

以与实施例10-1的步骤10中相同的方式，使步骤4中获得的化合物(7-4) (4.49g, 6.96 mmol)反应，以得到期望化合物(7-5) (3.24 g, 95%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.25 (1H, s), 6.73 (1H, s), 6.02-6.00 (1H, m), 5.91(1H, s), 5.77-5.75 (1H, m), 5.11-5.09 (2H, m), 4.64-4.62 (1H, m), 4.41-4.40(1H, m), 3.95 (3H, s), 3.72-3.70 (1H, m), 3.54-3.53 (1H, m), 3.29-3.26 (1H,m), 2.36-2.34 (1H, m), 1.56-1.54 (1H, m), 0.79-0.67 (13H, m), 0.21 (3H, s),0.20 (3H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 489 (M+H)+

步骤6：(11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-丙-2-烯-1-酯(7-6)

以与实施例10-3的步骤10中相同的方式，使步骤5中获得的化合物(7-5) (0.080g, 0.164 mmol)与实施例10-3的步骤9中获得的化合物(3-10) (0.095 g, 0.163 mmol)反应，以得到期望化合物(7-6) (0.160 g, 98%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.44-7.42 (3H, m), 7.12-7.10 (2H, m), 7.05-7.03(1H, m), 6.92-6.90 (2H, m), 6.61-6.59 (1H, m), 5.87-5.81 (3H, m), 5.10-5.07(4H, m), 4.66-4.55 (3H, m), 4.43-4.39 (2H, m), 4.21-3.94 (5H, m), 3.83 (3H,s), 3.81 (3H, s), 3.76 (3H, s), 3.65-3.62 (1H, m), 3.56-3.54 (1H, m), 3.42-3.39 (1H, m), 3.22-3.14 (2H, m), 2.77-2.73 (1H, m), 2.42-2.33 (1H, m), 1.81-1.79 (4H, m), 1.55-1.44 (3H, m), 0.82 (9H, s), 0.72-0.53 (4H, m), 0.19 (3H,s), 0.17 (3H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 993 (M+H)+

步骤7：(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(7-7)

以与实施例10-3的步骤11中相同的方式，使步骤6中获得的化合物(7-6) (160mg, 0.161 mmol)反应，以得到期望化合物(7-7) (141 mg, 定量)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.44-7.42 (3H, m), 7.08-7.06 (3H, m), 6.92-6.90(2H, m), 6.82-6.79 (1H, m), 6.56-6.54 (1H, m), 5.77-5.74 (3H, m), 5.09 (4H,s), 4.58-4.55 (3H, m), 4.43-4.41 (2H, m), 4.16-4.01 (5H, m), 3.81-3.81 (6H,m), 3.76 (3H, s), 3.64 (1H, s), 3.56-3.53 (1H, m), 3.42-3.38 (1H, m), 3.25-3.13 (2H, m), 2.74-2.70 (1H, m), 2.37-2.34 (1H, m), 1.82-1.79 (4H, m), 1.59-1.56 (3H, m), 0.66-0.62 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 879 (M+H)+

步骤8: (11a'S)-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}戊基)氧基]-1',11a'-二氢-5'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5'-酮 (7-8)

以与实施例10-3的步骤12中相同的方式，使步骤7中获得的化合物(7-7) (141mg, 0.161 mmol)反应，以得到期望化合物(7-8) (109.8 mg, 99%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.92-7.91 (1H, m), 7.45 (1H, s), 7.39-7.37 (2H,m), 7.33 (1H, s), 7.29 (1H, s), 6.92-6.89 (2H, m), 6.85 (1H, s), 6.56-6.54(1H, m), 6.31 (1H, s), 4.19-4.12 (2H, m), 4.05-3.99 (1H, m), 3.95-3.93 (2H,m), 3.82-3.79 (4H, m), 3.76 (3H, s), 3.66 (3H, s), 3.52-3.46 (3H, m), 3.30-3.21 (2H, m), 2.78-2.74 (1H, m), 2.45-2.42 (1H, m), 2.06-2.05 (1H, m), 1.89-1.82 (4H, m), 1.60-1.58 (2H, m), 0.80-0.63 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 693 (M+H)+

[实施例10-8：药物2]

[式60]

步骤1：[4-(苄基)-5-甲氧基-2-硝基苯基][(6S)-6-(羟基甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]甲酮(8-1)

在0℃下向实施例6的步骤1中获得的化合物(6-2) (6.49 g, 14.7 mmol)于四氢呋喃(147 mL)中的溶液中添加硼氢化锂(0.642 g, 29.5 mmol)，并将所得物在室温下搅拌2小时。向反应溶液中添加1 N盐酸，其用乙酸乙酯萃取。将获得的有机层用盐水洗涤，并经硫酸镁干燥，且然后在减压下蒸馏。将获得的粗产物(8-1)(6.94 g, 定量)用于随后的步骤。

MS (APCI, ESI) m/z: 413 (M+H)+

步骤2：(6S)-5-[4-(苄基氧基)-5-甲氧基-2-硝基苯甲酰基]-5-氮杂螺[2.4]庚烷-6-甲醛(8-2)

以与实施例10-1的步骤8中相同的方式，使步骤1中获得的化合物(8-1) (4.50 g,11.0 mmol)反应，以得到期望化合物(8-2) (1.94 g, 43%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 411 (M+H)+

步骤3：(11a'S)-8'-羟基-7'-甲氧基-1',10',11',11a'-四氢-5'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5'-酮(8-3)

在氮气气氛下向步骤2中获得的化合物(8-2) (1.94 g, 4.73 mmol)于四氢呋喃(25 mL)、乙酸乙酯(25 mL)和甲醇(25 mL)中的溶液中添加5%钯碳(水含量：54%，1.0 g)，且然后将反应溶液在氢气气氛下在室温下搅拌22小时。在将反应溶液通过硅藻土过滤后，将滤液在减压下蒸馏。所得残余物通过硅胶柱色谱[己烷:乙酸乙酯= 80:20 (v/v)至0:100(v/v)]纯化，以得到期望化合物(8-3)(1.20 g, 93%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.55 (1H, s), 6.16 (1H, s), 5.86 (1H, s), 4.08-4.02(2H, m), 3.86 (3H, s), 3.72-3.69 (1H, m), 3.57-3.37 (3H, m), 2.04-2.01 (1H,m), 1.78-1.75 (1H, m), 0.79-0.53 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 275 (M+H)+

步骤4：(11a'S)-8'-[(5-溴戊基o)氧基]-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(8-4)

以与实施例10-3的步骤2中相同的方式，使实施例10-7的步骤5中获得的化合物(7-5) (0.300 g, 0.614 mmol)反应，以得到期望化合物(8-4) (0.388 g, 99%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.24 (1H, s), 6.60 (1H, s), 6.02-5.98 (1H, m),5.80-5.75 (1H, m), 5.11-5.06 (2H, m), 4.68-4.64 (1H, m), 4.40-4.38 (1H, m),4.02-3.98 (2H, m), 3.92 (3H, s), 3.72-3.69 (1H, m), 3.54-3.52 (1H, m), 3.46-3.41 (2H, m), 3.29-3.26 (1H, m), 2.38-2.34 (1H, m), 1.94-1.87 (4H, m), 1.65-1.62 (2H, m), 1.55-1.55 (1H, m), 0.86 (9H, s), 0.75-0.67 (4H, m), 0.24-0.22(6H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 639 [81Br, (M+H)+], 637 [79Br, (M+H)+]。

步骤5：(11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(8-5)

以与实施例10-3的步骤10中相同的方式，使步骤4中获得的化合物(8-4) (0.203g, 0.318 mmol)与步骤3中获得的化合物(8-3) (0.131 g, 0.478 mmol)反应，以得到期望化合物(8-5) (0.0880 g, 33%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 831 (M+H)+

步骤6：(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(8-6)

以与实施例10-3的步骤11中相同的方式，使步骤5中获得的化合物(8-5) (0.0880g, 0.106 mmol)反应，以得到期望化合物(8-6) (0.0500 g, 66%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 717 (M+H)+

步骤7：(11a'S)-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-1',10',11',11a'-四氢-5'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5'-酮(8-7)

以与实施例10-3的步骤12中相同的方式，使步骤6中获得的化合物(8-6) (0.0500g, 0.0698 mmol)反应，以得到期望化合物(8-7) (0.0330 g, 77%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.80 (1H, m), 7.58 (1H, s), 7.52 (1H, s), 6.81 (1H,s), 6.05 (1H, s), 4.17-3.97 (5H, m), 3.94 (3H, s), 3.87 (1H, m), 3.84 (3H,s), 3.72-3.68 (3H, m), 3.51-3.45 (5H, m), 2.54-2.51 (1H, m), 2.03-1.90 (6H,m), 1.75-1.68 (2H, m), 0.66 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 615 (M+H)+

[实施例10-9：药物3]

[式61]

步骤1：双氨基甲酸二-2-丙烯-1-酯{1,5-戊烷二基双[氧基(6-{[(6S)-6-(羟基甲基)-5-氮杂螺[2.4]庚-5-基]羰基}-4-甲氧基苯-3, 1-二基)]}酯 (9-1)

以与实施例10-5的步骤7中相同的方式，使实施例10-5的步骤5中获得的双烯丙基氧基羰基形式(5-6b) (0.460 g, 0.508 mmol)反应，以得到期望化合物(9-1) (0.421 g,定量)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 9.19 (2H, s), 7.22 (2H, s), 6.89 (2H, s), 5.97-5.92 (2H, m), 5.33 (2H, m), 5.22 (2H, m), 4.81 (2H, m), 4.55 (4H, m), 4.26(2H, s), 3.96 (4H, m), 3.74 (6H, s), 3.62 (2H, m), 3.56 (2H, s), 3.37 (2H,m), 3.11 (2H, m), 1.88-1.78 (8H, m), 1.56-1.54 (2H, m), 0.54-0.43 (8H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 821 (M+H)+。

步骤2：(11a'S, 11a''''S)-8',8''-[戊-1,5-二基双(氧基)]双(11'-羟基-7'-甲氧基-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸) 二丙-2-烯-1-酯(9-2)

以与实施例10-5的步骤8中相同的方式，使步骤1中获得的化合物(9-1) (0.421g, 0.513 mmol)反应，以得到期望化合物(9-2) (0.326 g, 78%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.07 (2H, s), 6.80 (2H, s), 6.55 (2H, m), 5.84-5.81 (2H, m), 5.75 (2H, m), 5.09-5.05 (4H, m), 4.62 (2H, mz), 4.40 (2H, m),3.98 (4H, m), 3.81 (6H, s), 3.54 (2H, m), 3.43-3.37 (2H, m), 3.14 (2H, m),2.35 (2H, m), 1.81-1.79 (4H, m), 1.59-1.56 (4H, m), 0.70-0.59 (8H, m)。MS(APCI, ESI) m/z: 817 (M+H)+。

步骤3：(11a'S,11a''''S)-8',8''-[1,5-戊烷二基双(氧基)]双(7'-甲氧基-1',11a'-二氢-5'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5'-酮) (9-3)

以与实施例10-3的步骤12中相同的方式，使步骤2中获得的化合物(9-2) (0.326g, 0.399 mmol)反应，以得到期望化合物(9-3) (0.208 g, 85%)。

1H-NMR (DMSO-D6) δ: 7.91 (2H, m), 7.32 (2H, s), 6.84 (2H, s), 4.11(2H, m), 4.06 (2H, m), 3.82 (6H, s), 3.51-3.31 (6H, m), 2.43 (2H, m), 2.05(2H, m), 1.82-1.80 (4H, m), 1.60-1.58 (2H, m), 0.79-0.77 (2H, m), 0.68-0.64(6H, m)。MS (APCI, ESI) m/z: 613 (M+H)+。

[实施例10-10：药物4]

[式62]

步骤1：(2R,11aS)-2,8-二羟基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-2,3-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(10-1)

以与实施例10-3的步骤3中相同的方式，使实施例10-3的步骤1中获得的化合物(3-2) (5.00 g, 9.66 mmol)反应，以得到期望化合物(10-1) (3.95 g, 100%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 409 (M+H)+

步骤2：(2R,11aS)-2-羟基-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-8-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-2,3-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(10-2)

向步骤1中获得的化合物(10-1) (3.95 g, 9.67 mmol)于二氯甲烷(97 mL)中的溶液中添加咪唑(1.65 g, 24.2 mmol)、三异丙基甲硅烷基氯(2.46 mL, 11.6 mmol)和二甲基甲酰胺(5 mL)，并将所得物在室温下搅拌21小时。将水添加至反应溶液中，其用氯仿萃取，并将获得的有机层用水洗涤，且然后在减压下蒸馏。将所得残余物通过硅胶色谱[己烷:乙酸乙酯= 100:0 (v/v)至20:80 (v/v)]纯化，以得到期望化合物(10-2)(4.78 g, 87%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 565 (M+H)+

步骤3：(11aS)-7-甲氧基-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-8-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-2,5,11(3H,10H,11aH)-三酮

以与实施例10-3的步骤4中相同的方式，使步骤2中获得的化合物(4.78 g, 8.43mmol)反应，以得到期望化合物(10-3) (2.36 g, 50%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 563 (M+H)+

步骤4：三氟甲磺酸(11aS)-7-甲氧基-5,11-二氧代-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-8-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-2-酯(10-4)

以与实施例10-3的步骤5中相同的方式，使步骤3中获得的化合物(10-3) (1.53g, 2,72 mmol)反应，以得到期望化合物(1.27 g, 69%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.31 (2H, s), 7.15 (1H, m), 5.52 (1H, m), 4.65 (1H,m), 4.57 (1H, m), 3.95-3.89 (1H, m), 3.87 (3H, s), 3.75-3.58 (2H, m), 3.18-3.14 (1H, m), 1.33-1.25 (3H, m), 1.10 (18H, m), 1.00-0.96 (2H, m), 0.03 (9H,s)。

步骤5：(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-10-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]甲基}-8-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5,11(10H,11aH)-二酮(10-5)

以与实施例10-3的步骤6中相同的方式，使步骤4中获得的化合物(10-4) (0.519g, 0.747 mmol)反应，以得到期望化合物(10-5) (0.511 g, 定量)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.41-7.31 (5H, m), 6.91-6.85 (2H, m), 5.52 (1H, m),4.64 (1H, m), 4.57 (1H, m), 3.97-3.90 (1H, m), 3.88 (3H, s), 3.83 (3H, s),3.75-3.56 (2H, m), 3.19-3.09 (1H, m), 1.36-1.23 (3H, m), 1.11 (18H, m), 1.02-0.97 (2H, m), 0.03 (9H, s)。

MS (APCI, ESI) m/z: 653 [(M+H)+]

步骤6：(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-8-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-1, 11a-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5-酮(10-6)

以与实施例10-3的步骤7中相同的方式，使步骤5中获得的化合物(10-5) (0.178g, 0.272 mmol)反应，以得到期望化合物(10-6) (0.094 g, 68%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.87 (1H, m), 7.51 (1H, s), 7.41-7.39 (1H, m),7.36-7.33 (2H, m), 6.93-6.89 (2H, m), 6.86 (1H, s), 4.44-4.38 (1H, m), 3.90(3H, s), 3.83 (3H, s), 3.61-3.53 (1H, m), 3.41-3.34 (1H, m), 1.33-1.25 (3H,m), 1.11-1.06 (18H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 507 [(M+H)+]

步骤7：(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-8-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-1,10,11,11a-四氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-5-酮(10-7)

以与实施例10-3的步骤8中相同的方式，使用步骤6中获得的化合物(10-6)(0.063 g, 0.124 mmol)并使其反应，以得到期望化合物(10-7) (0.046 g, 72%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.53-7.48 (2H, m), 7.33-7.29 (2H, m), 6.90-6.86(2H, m), 6.13-6.11 (1H, m), 4.36-4.29 (1H, m), 4.11 (1H, s), 3.82 (3H, s),3.79 (3H, s), 3.59-3.50 (2H, m), 3.40-3.31 (1H, m), 2.78-2.68 (1H, m), 1.31-1.20 (3H, m), 1.13-1.02 (18H, m)。MS (APCI, ESI) m/z: 509 [(M+H)+]

步骤8：(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-8-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-11,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-10 (5H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(10-8)

以与实施例10-3的步骤9中相同的方式，使用步骤7中获得的化合物(10-7)(0.046 g, 0.090 mmol)并使其反应，以得到期望化合物(10-8) (0.03 g, 56%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.36 (1H, m), 7.31-7.28 (2H, m), 7.22 (1H, s),6.90-6.86 (3H, m), 6.75-6.72 (1H, m), 5.82-5.69 (1H, m), 5.18-5.08 (2H, m),4.59-4.52 (1H, m), 4.48-4.39 (1H, m), 4.39-4.29 (1H, m), 4.23-4.12 (1H, m),3.86 (3H, s), 3.82 (3H, s), 3.64-3.58 (1H, m), 3.32-3.25 (1H, m), 2.73-2.65(1H, m), 1.30-1.20 (2H, m), 1.12-1.06 (18H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 593 [(M+H)+]

步骤9：(11aS)-8-羟基-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-11,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-10 (5H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(10-9)

以与实施例10-1的步骤10中相同的方式，使步骤8中获得的化合物(10-8) (0.030g, 0.050 mmol)反应，以得到期望化合物(10-9) (0.015 g, 0.034 mmol)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.39-7.25 (4H, m), 6.92-6.78 (3H, m), 6.03-5.92(1H, m), 5.86-5.68 (1H, m), 5.20-5.07 (2H, m), 4.66-4.57 (1H, m), 4.52-4.40(1H, m), 4.40-4.27 (1H, m), 4.27-4.16 (1H, m), 3.95 (3H, s), 3.82 (3H, s),3.66-3.59 (1H, m), 3.32-3.21 (1H, m), 2.74-2.64 (1H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 437 [(M+H)+]

步骤10：(11a'S)-8'-(3-溴丙氧基)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(10-10)

以与实施例10-4的步骤1中相同的方式，使实施例10-7的步骤5中获得的化合物(0.131 g, 0.268 mmol)反应，以得到期望化合物(10-10) (0.086 g, 52%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.24 (1H, s), 6.65 (1H, s), 6.02 (1H, m), 5.87-5.71(1H, m), 5.15-5.04 (2H, m), 4.72-4.62 (1H, m), 4.44-4.32 (1H, m), 4.23-4.07(3H, m), 3.92 (3H, s), 3.77-3.47 (4H, m), 3.28 (1H, m), 2.37 (3H, m), 1.57-1.52 (1H, m), 0.86 (9H, s), 0.82-0.57 (4H, m), 0.21 (6H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 611 [81Br, (M+H)+], 609 [79Br, (M+H)+]

步骤11：(11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基}氧基)丙氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(10-11)

以与实施例10-3的步骤10中相同的方式，使步骤10中获得的化合物(10-10)(0.015 g, 0.034 mmol)和步骤9中获得的化合物(10-9) (0.030 g, 0.048 mmol)反应，以得到期望化合物(10-11) (0.032 g, 96%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 965 [(M+H)+]

步骤12：(11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[3-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基}氧基)丙氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-甲酸丙-2-烯-1-酯(10-12)

以与实施例10-3的步骤11中相同的方式，使步骤11中获得的化合物(10-11)(0.031 g, 0.032 mmol)反应，以得到期望化合物(10-12) (0.026 g, 95%)。

MS (APCI, ESI) m/z: 851 [(M+H)+]

步骤13：(11a'S)-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}丙氧基)-1',11a'-二氢-5'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-5'-酮 (10-13)

以与实施例10-3的步骤12中相同的方式，使步骤12中获得的化合物(10-12)(0.026 g, 0.030 mmol)反应，以得到期望化合物(10-13) (0.018 g, 88%)。

1H-NMR (CDCl3) δ: 7.80 (1H, m), 7.54-7.51 (3H, m), 7.33-7.29 (2H, m),6.91-6.85 (3H, m), 6.14 (1H, s), 4.35-4.17 (6H, m), 3.95 (3H, s), 3.85 (3H,s), 3.82 (3H, s), 3.76-3.25 (5H, m), 2.79-2.69 (1H, m), 2.52 (1H, m), 2.45-2.35 (1H, m), 2.03-1.96 (1H, m), 1.28-1.23 (2H, m), 0.78-0.69 (4H, m)。

MS (APCI, ESI) m/z: 665 [(M+H)+]

[实施例11：[N

[N

[式63]

(在图中，结构式右边的示意图代表由实施例12、13、14、15的每一个的反应式代表的中间体的示意图中的对应结构。)

步骤1：(MSG1-)Asn

将市售的不含单唾液酸-Asn的产物(1S2G/1G2S-10NC-Asn，由GlyTech, Inc.生产)(称为"(MSG-)Asn") (500 mg)在下述条件下通过反相HPLC进行分离/纯化，以分离为作为第1个主峰洗脱的(MSG1-)Asn(保留时间：约15至19 min)和作为第2个主峰洗脱的(MSG2-)Asn(保留时间：约21至26 min)。使用的洗脱液是0.1%甲酸水溶液，使用的设备是ELS-PDA触发制备系统(由JASCO Corporation生产)，使用的柱是Inertsil ODS-3 (10 um,30

步骤2：MSG1

将步骤1中获得的化合物(229 mg)溶解于200 mM磷酸盐缓冲溶液(pH 6.25)(1145μL)中，向其中添加EndoM (由Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.生产，1U/mL)的水溶液(100 μL)，并将所得物在35℃下孵育6天。反应完成后，将反应溶液用VIVASPIN 15R(Hydrosart膜，30K，6,000g)进行超滤，并将获得的过滤溶液通过反相HPLC进行分离/纯化。使用的洗脱液为0.1%三氟乙酸水溶液，使用的设备是ELS-PDA触发制备系统(由JASCOCorporation生产)，且使用的柱是Inertsil ODS-3 (由GL Sciences, Inc.生产)。将在洗脱期间UV检测到(210 nm)的含有期望化合物的级分收集在一起，并冷冻干燥，以得到期望化合物(117 mg)。

步骤3：[N

向5 mL取样管(Ina-Optica Co., Ltd.)中添加11-叠氮化物-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺(0.108 mL, 0.541 mmol)和步骤2中获得的MSG1 (117 mg, 0.068 mmol)的水溶液(1.2 mL)，并将所得物搅拌1小时，且然后冷冻干燥。冷冻干燥后，向5 mL采样管中添加O-(7-氮杂苯并三唑-1-基) -N,N,N',N'-四甲基铀六氟磷酸盐(103 mg, 0.27 mmol)的N,N-二甲基甲酰胺溶液(1.2 mL)和二异丙基乙胺(0.046 mL, 0.27 mmol)，随后在37℃下搅拌3小时。反应完成后，将反应溶液转移至离心管(50 mL)中，向其中预先添加二乙醚(20 mL)。使用小型离心机(Hitachi Koki Co., Ltd., CF16RX)使固体物质沉淀，并除去上清液。此外，添加二乙醚(10 mL)，并将所得物离心并倾析。随后，添加乙腈(10 mL)，并将所得物离心并倾析。将该操作重复两次，且然后将所得物在减压下干燥，以得到粗产物。将所得固体物质在与步骤2中相同的条件下通过反相HPLC进行纯化，以得到期望化合物(94.2 mg)。

步骤4：[N

向5 mL采样管(由Ina-Optica Co., Ltd生产)中添加步骤3中合成的化合物(100mg)和2-氯-1,3-二甲基-1H-苯并咪唑-3-鎓-氯化物(由FUSHIMI Pharmaceutical Co.,Ltd.生产, 56 mg, 0.257 mmol)的水溶液(520 μL)。冰冷却后，向反应溶液中添加磷酸三钾(165 mg, 0.78 mmol)的水溶液(520 μL)，随后在冰冷却下搅拌3小时。将所得反应溶液用Amicon Ultra (Ultracel 30K，由Merck Millipore生产)进行超滤，以除去固体物质。过滤的溶液通过凝胶过滤色谱法纯化。使用的设备是Purif-Rp2 (由Shoko Scientific Co.,Ltd.生产)，使用的柱是HiPrep 26/10 Desalting(由GE Healthcare生产)，使用的流动相是0.03%-NH

在实施例12至16中，将描述聚糖-重构的抗体的制备。

[实施例12：H01L02抗体-[MSG1-N

[式64]

(该式代表其中已经将叠氮基引入至MSG1-型N297聚糖的非还原末端的唾液酸的接头结构。在实施例12中，通过将叠氮基引入至N297聚糖而形成的中间体的接头结构与由该式代表的结构相同。)

步骤1：(Fucα1,6)GlcNAc-H01L02抗体的制备

向H01L02抗体溶液(约21.1 mg/mL)(50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0))(4.07ml)中添加0.233 mL野生型EndoS溶液(7.7 mg/mL, PBS)，并将溶液在37℃下孵育4小时。通过Experion电泳站(由Bio-Rad Laboratories, Inc.生产)检查反应的进展。反应完成后，根据以下方法进行通过亲和色谱的纯化和用羟基磷灰石柱的纯化。

(1)通过亲和色谱纯化

纯化设备：AKTA avant (由GE Healthcare生产)

柱：HiTrap rProtein A FF (5 mL)(由GE Healthcare生产)

流量：5 ml/min (装载中1.25 ml/min)

在多个分开操作中纯化以上获得的每种反应溶液。在样品的施加中，将反应溶液添加至该柱的上部，并使4 CV的结合缓冲液(20 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0))以1.25 mL/min流动，并且其5 CV(柱体积)以5mL/min进一步流动。在中间洗涤步骤中，使15 CV的洗涤溶液(20 mM磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，0.5 M氯化钠溶液)流动。在洗脱中，使6 CV的洗脱缓冲液(由Pierce生产的ImmunoPure IgG洗脱缓冲液)流动。立即用1 M Tris缓冲液(pH 9.0)中和洗脱液。通过使用通用操作C，将含有期望化合物的级分进行缓冲液交换，以交换至5 mM磷酸盐缓冲液/50 mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)溶液(pH 6.8)。

(2)通过羟基磷灰石色谱纯化

纯化设备：AKTA avant (由GE Healthcare生产)

柱：Bio-Scale Mini CHT I型盒(5 mL)(由Bio-Rad Laboratories, Inc.生产)

流速：5 mL/min(装载中1.25 mL/min)

将(1)中获得的溶液施加至该柱的上部，并且使4 CV的溶液A (5 mM磷酸盐缓冲液，50 mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)溶液(pH 6.8))以1.25 mL/min流动并且其3CV以5mL/min进一步流动。其后，用溶液A和溶液B (5 mM磷酸盐缓冲液，50 mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)(pH6.8)和2M氯化钠)进行洗脱。洗脱条件为溶液A：溶液B = 100:0至0:100 (15 CV)。进一步，使5CV的洗涤溶液(500 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.5))流动。

通过使用通用操作C，对含有期望化合物的级分进行缓冲液交换，以得到11.4 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0))(5.00 mL)。

步骤2：H01L02抗体-[MSG1-N

向步骤1中获得的11.4 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0))(5.00 mL)中添加实施例11的步骤4中合成的聚糖(9.00 mg)于50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中的溶液(0.180 mL)和5.10 mg/mL EndoS D233Q/Q303L溶液(PBS)(0.230mL)，并将所得物在30℃下孵育3小时。通过使用Experion电泳站(由Bio-RadLaboratories, Inc.生产)检查反应的进展。反应后，如步骤1中进行通过亲和色谱纯化和通过羟基磷灰石色谱纯化，且然后使用通用操作C，将含有期望化合物的级分进行缓冲液交换至磷酸盐缓冲盐水(pH 6.0)，以得到9.91 mg/mL H01L02抗体-[MSG1-N

[实施例13：H01L02A抗体-[MSG1-N

[式65]

步骤1：(Fucα1,6)GlcNAc-H01L02A抗体的制备

实施例12的步骤1中的操作用约21.6 mg/mL H01L02A抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)) (1.85 mL)实施以得到14.6 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02A抗体溶液(50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)) (2.0 mL)。

步骤2：H01L02A抗体-[MSG1-N

实施例12中的步骤2中的操作用步骤1中获得的14.6 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H01L02A抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0))(2.0 mL)实施以得到10.0 mg/mLH01L02A抗体-[MSG1-N

[实施例14：H31L02A抗体-[MSG1-N

[式66]

步骤1：(Fucα1,6)GlcNAcH31L02A抗体的制备

实施例12的步骤1中的操作用约23.2 mg/mL H31L02A抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)) (3.45 mL)实施以得到8.43 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H31L02A抗体溶液(50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)) (6.1 mL)。

步骤2：H31L02A抗体-[MSG1-N

实施例12中的步骤2中的操作用步骤1中获得的8.43 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H31L02A抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)) (5.00 mL)实施以得到6.52 mg/mLH31L02A抗体-[MSG1-N

[实施例15：H11L02A抗体-[MSG1-N

[式67]

步骤1：(Fucα1,6)GlcNAc-H11L02A抗体的制备

实施例12的步骤1中的操作用约24.2 mg/mL H11L02A抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)) (3.0 mL)实施以得到20.42 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H11L02A抗体溶液(50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)) (2.7 mL)。

步骤2：H11L02A抗体-[MSG1-N

实施例12中的步骤2中的操作用步骤1中获得的20.39 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-H11L02A抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)) (1.55 mL)实施以得到10.26 mg/mLH11L02A抗体-[MSG1-N

[实施例16：抗LPS抗体-[MSG1-N

[式68]

步骤1：(Fucα1,6)GlcNAc-抗LPS抗体的制备

使用约17 mg/mL抗LPS抗体溶液(25 mM组氨酸溶液(pH 6.0)，5%山梨糖醇溶液)(6.6 mL)进行实施例12的步骤1中的操作，以得到21.03 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-抗LPS抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)) (5.4 mL)。

步骤2：抗LPS抗体-[MSG1-N

使用步骤1中获得的21.03 mg/mL (Fucα1,6)GlcNAc-抗LPS抗体溶液(50 mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0))(5.4 mL)进行实施例12的步骤2中的操作，以得到9.89 mg/mL抗LPS抗体-[MSG1-N

在实施例17至27中，将描述ADC的合成。

[实施例17：ADC1]

如以下反应式中所举例说明，通过将实施例12的步骤2中获得的抗体与实施例10-3的步骤13中获得的药物-接头(3-14)缀合，合成实施例17中所述的ADC。在该式中，R代表实施例中使用的药物-接头。

[式69]

[式70]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例17的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向实施例12的步骤2中获得的抗体的磷酸盐缓冲盐水(pH 6.0)溶液(6.76 mg/mL, 1.50 mL)中添加1,2-丙二醇(1.42 mL)和实施例10-3的步骤13中获得的化合物(3-14)的10 mM二甲亚砜溶液(0.0836 mL；每抗体分子12当量)，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONE Corporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到6.00 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：1.37 mg/mL，抗体产率：8.23 mg (81%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.7。

[实施例18 ADC2]

如以下反应式中所举例说明，通过将实施例13的步骤2中获得的抗体与实施例10-4的步骤12中获得的药物-接头(4-12)缀合，合成实施例18中所述的ADC。在该式中，R代表实施例中使用的药物-接头。

[式71]

[式72]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例18的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向10mM乙酸盐缓冲液中添加实施例13的步骤2中获得的抗体的5%山梨糖醇(pH 5.5)溶液(10.0 mg/mL, 100 μL)、1,2-丙二醇(25 μL)以及实施例10-4的步骤12中获得的化合物(4-12)的10 mM二甲亚砜溶液(8 μL；每抗体分子12当量)和1,2-丙二醇(67 μL)的混合溶液，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONE Corporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到1.2 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：0.56 mg/mL，抗体产率：0.67 mg (67%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.9。

[实施例19：ADC3]

通过将实施例13的步骤2中获得的抗体与实施例10-5的步骤10中获得的药物-接头(5-11)缀合，合成实施例19中所述的ADC。

[式73]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例19的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向10 mM乙酸盐缓冲液中添加实施例13的步骤2中获得的抗体的5%山梨糖醇(pH 5.5)溶液(10.0 mg/mL, 100 μL)、1,2-丙二醇(25 μL)以及实施例10-5的步骤10中获得的化合物(5-11)的10 mM二甲亚砜溶液(8 μL；每抗体分子12当量)和1,2-丙二醇(67μL)的混合溶液，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONE Corporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到1.2 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：0.53 mg/mL，抗体产率：0.64 mg (64%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.9。

[实施例20：ADC4]

通过将实施例13的步骤2中获得的抗体与实施例12-6的步骤10中获得的药物-接头(6-13)缀合，合成实施例20中所述的ADC。

[式74]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例20的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向10 mM乙酸盐缓冲液中添加实施例13的步骤2中获得的抗体的5%山梨糖醇(pH 5.5)溶液(10.0 mg/mL, 100 μL)、1,2-丙二醇(25 μL)以及实施例10-6的步骤12中获得的化合物(6-13)的10 mM二甲亚砜溶液(8 μL；每抗体分子12当量)和1,2-丙二醇(67μL)的混合溶液，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONE Corporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到1.2 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：0.56 mg/mL，抗体产率：0.67 mg (67%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.9。

[实施例21：ADC5]

通过将实施例13的步骤2中获得的抗体与实施例10-3的步骤13中获得的药物-接头(3-14)缀合，合成实施例21中所述的ADC。

[式75]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例21的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向10 mM乙酸盐缓冲液中添加实施例13的步骤2中获得的抗体的5%山梨糖醇(pH 5.5)溶液(10.0 mg/mL, 1.70 mL)、1,2-丙二醇(0.850 mL)以及实施例10-3的步骤13中获得的化合物(3-14)的10 mM二甲亚砜溶液(0.141 mL；每抗体分子12当量)和1,2-丙二醇(0.710 mL)的混合溶液，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONECorporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到10.5 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：1.19 mg/mL，抗体产率：12.5 mg (73%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.8。

[实施例22：ADC6]

如以下反应式中所举例说明，通过将实施例14的步骤2中获得的抗体与实施例10-3的步骤13中获得的药物-接头(3-14)缀合，合成实施例22中所述的ADC。在该式中，R代表实施例中使用的药物-接头。

[式76]

[式77]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例22的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向实施例14的步骤2中获得的抗体的磷酸盐缓冲盐水(pH 6.0)溶液(10.1 mg/mL, 0.400 mL)中添加1,2-丙二醇(0.367 mL)和实施例10-3的步骤13中获得的化合物(3-14)的10 mM二甲亚砜溶液(0.0333 mL；每抗体分子12当量)，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONE Corporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到3.50 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：0.820 mg/mL，抗体产率：2.88 mg (81%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.9。

如以下反应式中所举例说明，通过将实施例15的步骤2中获得的抗体与实施例10-3至10-6中获得的药物-接头缀合，合成实施例23至26中所述的ADC。在该式中，R在那些实施例中使用的药物-接头间不同。

[实施例23：ADC7]

[式78]

[式79]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例23的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向10 mM乙酸盐缓冲液中添加实施例15的步骤2中获得的抗体的5%山梨糖醇(pH 5.5)溶液(10.54 mg/mL, 0.4 mL)、1,2-丙二醇(0.100 mL)以及实施例10-3的步骤13中获得的化合物(3-14)的10 mM二甲亚砜溶液(0.035 mL；每抗体分子12当量)和1,2-丙二醇(0.266 mL)的混合溶液，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONECorporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到2.5 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：1.01 mg/mL，抗体产率：2.53 mg (73%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.9。

[实施例24：ADC8]

[式80]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例24的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向10 mM乙酸盐缓冲液中添加实施例15的步骤2中获得的抗体的5%山梨糖醇(pH 5.5)溶液(2.8 mg/mL, 0.3 mL)、1,2-丙二醇(75 μL)以及实施例10-4的步骤12中获得的化合物(4-12)的10 mM二甲亚砜溶液(7 μL；每抗体分子12当量)和1,2-丙二醇(218μL)的混合溶液，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONE Corporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到2.5 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：0.22 mg/mL，抗体产率：0.56 mg (67%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.8。

[实施例25：ADC9]

[式81]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例25的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向10 mM乙酸盐缓冲液中添加实施例15的步骤2中获得的抗体的5%山梨糖醇(pH 5.5)溶液(2.8 mg/mL, 300 μL)、1,2-丙二醇(75 μL)以及实施例10-5的步骤10中获得的化合物(5-11)的10 mM二甲亚砜溶液(7 μL；每抗体分子12当量)和1,2-丙二醇(218μL)的混合溶液，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONE Corporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到2.5 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：0.25 mg/mL，抗体产率：0.62 mg (64%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.8。

[实施例26：ADC10]

[式82]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例26的步骤1中获得的化合物具有接头，其作为上面显示为R的两种结构的混合物。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向10 mM乙酸盐缓冲液中添加实施例15的步骤2中获得的抗体的5%山梨糖醇(pH 5.5)溶液(2.8 mg/mL, 300 μL)、1,2-丙二醇(75 μL)以及实施例10-6的步骤12中获得的化合物(6-13)的10 mM二甲亚砜溶液(7 μL；每抗体分子12当量)和1,2-丙二醇(218μL)的混合溶液，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONE Corporation)在室温下反应48小时。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到2.5 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：0.25 mg/mL，抗体产率：0.62 mg (74%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.8。

如以下反应式中所举例说明，通过将实施例16的步骤2中获得的抗体与实施例10-3的步骤13中获得的药物-接头(3-14)缀合，合成实施例27中所述的ADC。在该式中，R代表实施例中使用的药物-接头。

[实施例27：ADC11]

[式83]

[式84]

在步骤1中待形成的三唑环具有几何异构体，并且在实施例27的步骤1中获得的化合物具有两种类型的结构不同的接头。

步骤1：抗体和药物-接头的缀合

在室温下向实施例16的步骤2中获得的抗体的磷酸盐缓冲盐水(pH 6.0)溶液(9.89 mg/mL, 0.40 mL)中添加1,2-丙二醇(0.367 mL)和实施例10-3的步骤13中获得的化合物(3-14)的10 mM二甲亚砜溶液(0.0328 mL；每抗体分子12当量)，并且使所得物使用管旋转器(MTR-103, AS ONE Corporation)在室温下反应两天。

纯化操作：通过使用通用操作D纯化溶液，以得到2.50 mL期望化合物的溶液。

表征：通过使用通用操作E和F获得以下特征值。

抗体浓度：1.16 mg/mL，抗体产率：2.89 mg (72%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：1.8。

[实施例28]实施例10-1中显示的化合物(1-11)的构型分析

基于通过选择性1D ROESY光谱获得的相关性(下图)，分析[实施例10-1：中间体1]中描述的化合物(1-11)的11'-位的绝对空间构型进行分析。在1'α-H和11'-H之间；在3'α-H和11'-H之间；和在1'β-H和3'β-H之间观察到相关性。从分析发现，11'-位的绝对空间构型是S构型。

[式85]

在选择性1D ROESY光谱中获得的显著相关性

通过选择性1D ROESY光谱进行的相关性分析中使用的1H-NMR

作为结果，确定通过使用[实施例10-1：中间体1]中所述的化合物(1-9)、(1-10)和(1-11)和化合物(1-11)合成的这些合成中间体的1、2和4以及11'-位置的药物-接头的绝对空间构型各自为S。

因此，[实施例10-1：中间体1]中描述的步骤1至10显示如下：

[式86]

(1-9)：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-5'-氧代-8'-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺

(1-10)：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-5'-氧代-8'-{[三(丙-2-基)甲硅烷基]氧基}-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺

(1-11)：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-8'-羟基-7'-甲氧基-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺。

[实施例10-3：药物-接头1]中显示的步骤1至13显示如下：

[式87]

(3-11)：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺

(3-12)：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺

(3-13)：L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺 (3-13)

(3-14)：N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因e-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺。

[实施例10-4：药物-接头2]中显示的步骤1至12显示如下。

[式88]

(4-9)：N-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-L-缬氨酰-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}丙氧基)-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基) 苯基]-L-丙氨酸酰胺

(4-10)：N-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-L-缬氨酰-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-10-{[(丙-2-烯-1-基)氧基]羰基}-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}丙氧基)-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基) 苯基]-L-丙氨酸酰胺

(4-11)：L-缬氨酰-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}丙氧基)-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基) 苯基]-L-丙氨酸酰胺

(4-12)：N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因e-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰-L-缬氨酰-N-[4-({[(11'S,11'aS)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-(3-{[(11aS)-7-甲氧基-2-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-5,10,11,11a-四氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬-8-基]氧基}丙氧基)-5'-氧代-11',11'a-二氢-1'H,3'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-羰基]氧基}甲基) 苯基]-L-丙氨酸酰胺。

[实施例10-5：药物-接头3]中显示的步骤1至10显示如下。

[式89]

(5-9)：N-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-8'-{[5-({(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-5'-氧代-10'-[(2-丙烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基}氧基)戊基]氧基}-7'-甲氧基-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺

(5-10)：L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺

(5-11)：N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因e-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺。

[实施例10-6：药物-接头4]中显示的步骤1至12显示如下：

[式90]

(6-10)：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-10'-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氢'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺

(6-11)：N-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-{[5-({(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-10'-[(丙-2-烯-1-基氧基)羰基]-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基}氧基)戊基]氧基}-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺

(6-12)：L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺

(6-13)：N-[4-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因e-5(6H)-基)-4-氧代丁酰基]甘氨酰甘氨酰-L-缬氨酰-N-{4-[({[(11'S,11a'S)-11'-羟基-7'-甲氧基-8'-[(5-{[(11a'S)-7'-甲氧基-5'-氧代-5',10',11',11a'-四氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-8'-基]氧基}戊基)氧基]-5'-氧代-11',11a'-二氢-1'H-螺[环丙烷-1,2'-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂䓬]-10'(5'H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-丙氨酸酰胺。

在实施例17至27中获得的ADC的式中，R代表以下。

描述于实施例17、21、22、23或27中的R：

[式91]

描述于实施例18或24中的R：

[式92]

描述于实施例19或25中的R：

[式93]

描述于实施例20或26中的R：

[式94]

[参考实施例2：NOV0712-药物缀合物的产生]

参考实施例2)-1 抗体-药物缀合物NOV0712-DM4的产生

抗体和药物-接头的缀合：通过使用产生方法1中描述的普通程序B (使用1.51mLmg

纯化：通过产生方法1中描述的普通程序D纯化上述溶液，以获得28 mL含有标题抗体-药物缀合物"NOV0712-DM4"的溶液。

表征：使用产生方法1中描述的普通程序E (使用ε

抗体浓度：2.58 mg/mL，抗体产率：72.2 mg (93%)，每抗体分子缀合的药物分子的平均数(n)：3.0。

[实施例29：抗体-药物缀合物的体外活性的评估]

抗体-药物缀合物针对CDH6-阳性人肿瘤细胞系的体外细胞生长抑制活性的评估

将人卵巢肿瘤细胞系NIH：OVCAR-3、OV-90和PA-1以及人肾细胞肿瘤细胞系786-O(全部获得自ATCC)(在实施例2)-3中证实了CDH6在其中的表达)在37℃和5% CO

IC50 (nM) = 反对数((50-d) × (LOG10(b)-LOG10(a)) / (d-c) + LOG10 (b))

a：测试剂浓度a

b：测试剂浓度b

c：在测试剂浓度a下的活细胞比率

d：在测试剂浓度b下的活细胞比率

a、b满足以下关系：在夹着50%的活细胞比率的两个点，a > b。

其中添加单独的抗体-药物缀合物的细胞系的IC50值(nM)显示于图9中。在三种表现出体外高CDH6表达水平的卵巢肿瘤细胞系中，三种类型的抗CDH6抗体-药物缀合物的IC50值与ADC11(即不结合CDH6的抗体-药物缀合物)的IC50值相比极低。由此证明，这三种类型的抗CDH6抗体-药物缀合物以CDH6-表达特异性方式具有极强的细胞生长抑制活性，此外，抗体与CDH6的结合活性(表3)与抗体-药物缀合物的细胞生长抑制活性具有相关性。此外，在具有低体外CDH6表达水平的肾细胞肿瘤细胞系中，也证实类似的趋势(图9)。

[实施例30：抗体-药物缀合物的体内抗肿瘤作用1]

使用源自免疫缺陷小鼠的动物模型，通过接种CDH6-阳性的人肿瘤细胞系细胞，评估抗体-药物缀合物的抗肿瘤作用。4至5周龄BALB/c裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnl[nu]/CrlCrlj[Foxnlnu/Foxnlnu], Charles River Laboratories Japan Inc.)和SCID小鼠(CB17/Icr-Prkdc[scid]/CrlCrlj, Charles River Laboratories Japan Inc.)在SPF条件下适应3天或更长时间，然后用于实验中。给小鼠喂食灭菌固体饮食(FR-2, Funabashi Farms Co.,Ltd)并给予灭菌自来水(其已通过向自来水中添加5至15ppm次氯酸钠溶液来制备)。使用电子数字卡尺(CD-15CX, Mitutoyo Corp.)每周两次测量接种肿瘤的长径和短径，且然后根据以下表达式计算肿瘤的体积。

肿瘤体积(mm

将每种抗体-药物缀合物用ABS缓冲液(10 mM乙酸盐缓冲液，5%山梨糖醇，pH 5.5)(Nacalai Tesque, Inc.)稀释，并将稀释液以每个实施例中所示的剂量静脉内施用至每只小鼠的尾巴。以与上述相同的方式将ABS缓冲液施用于对照组(媒介物组)。每组六只小鼠用于实验中。

30)-1抗肿瘤作用(1)

将CDH6-阳性的人卵巢肿瘤细胞系OV-90 (ATCC)(其CDH6表达已在实施例2)-3中证实)悬浮于Matrigel (Corning Inc.)中，并将细胞悬浮液以2.5 × 10

在用NOV0712-DM4施用的该肿瘤模型中，在施用后30天观察肿瘤的再生长；然而，ADC1在0.4 mg/kg的极低剂量下表现出强烈的肿瘤消退作用，并且在施用后持续42天的长时段维持强烈的抗肿瘤作用。作为对照的ADC11(其既不结合小鼠肿瘤细胞也不结合抗肿瘤测试中使用的接种的人肿瘤细胞)没有显示抗肿瘤作用。证实与对照组(ABS缓冲液施用组)相比，在所有药物施用组中都没有重量损失。

30)-2抗肿瘤作用(2)

将CDH6-阳性的人肾细胞肿瘤细胞系Caki-1 (ATCC)(其CDH6表达已在实施例2)-3中证实)悬浮于Matrigel (Corning Inc.)中，并将细胞悬浮液以2.5 × 10

在该肿瘤模型中，NOV0712-DM4在10 mg/kg的剂量下未表现出抗肿瘤作用。另一方面，ADC1在0.4 mg/kg的极低剂量下发挥抗肿瘤作用。作为对照的ADC11(其既不结合小鼠肿瘤细胞也不结合抗肿瘤测试中使用的接种的人肿瘤细胞)在0.4 mg/kg的剂量下没有显示抗肿瘤作用(图11)。由此显示，取决于肿瘤细胞中CDH6的表达，特异性获得由ADC1表现出的抗肿瘤作用。证明本发明的ADC1是与常规缀合物NOV0712-DM4相比具有极强的抗肿瘤作用的抗体-药物缀合物。证实与对照组(ABS缓冲液施用组)相比，在所有药物施用组中都没有重量损失。

30)-3抗肿瘤作用(3)

将CDH6-阳性的人卵巢肿瘤细胞系NIH:OVCAR-3 (ATCC)(其CDH6表达已在实施例2)-3中证实)悬浮于Matrigel (Corning Inc.)中，并将细胞悬浮液以1 × 10

在该肿瘤模型中，ADC6表现出最强的抗肿瘤作用，ADC1和ADC5表现出几乎相同的第二强抗肿瘤作用。由此显示，用丙氨酸残基取代人抗体重链的位置234和235(基于EU索引指定)的亮氨酸残基几乎没有影响抗体-药物缀合物的抗肿瘤作用。作为对照的ADC11在0.4mg/kg的剂量下未表现出抗肿瘤作用(图12)。由此显示，依赖于肿瘤细胞中的CDH6的表达，特异性获得了由ADC1、ADC5和ADC5表现出的抗肿瘤作用。证实与对照组(ABS缓冲液施用组)相比，在所有药物施用组中都没有重量损失。

30)-4抗肿瘤作用(4)

将CDH6-阳性的人卵巢肿瘤细胞系OV-90 (ATCC)(其CDH6表达已在实施例2)-3中证实)悬浮于Matrigel (Corning Inc.)中，并将细胞悬浮液以2.5 × 10

在该肿瘤模型中，ADC5和ADC6各自在0.4 mg/kg的剂量下表现出最强的抗肿瘤作用，且ADC7在0.4 mg/kg的剂量下表现出第二强的抗肿瘤作用(图13)。从ADC5 (0.4 mg/kg)和ADC5 (0.2 mg/kg)的施用结果证实抗肿瘤作用取决于剂量而变化。在0.2 mg/kg的剂量下，ADC1和ADC5表现出基本上相同的抗肿瘤作用。由此显示，用丙氨酸残基取代人抗体重链的位置234和235(基于EU索引指定)的亮氨酸残基几乎没有影响抗体-药物缀合物的抗肿瘤作用。证实与对照组(ABS缓冲液施用组)相比，在所有药物施用组中都没有重量损失。

30)-5抗肿瘤作用(5)

将CDH6-阳性的人卵巢肿瘤细胞系PA-1 (ATCC)(其CDH6表达已在实施例2)-3中证实)悬浮于Matrigel (Corning Inc.)中，并将细胞悬浮液以7.5 × 10

在该肿瘤模型中，ADC5表现出最强的抗肿瘤作用。证实持续35天的长时间段未观察到肿瘤。ADC6表现出第二强的抗肿瘤作用(图14)。证实与对照组(ABS缓冲液施用组)相比，在所有药物施用组中都没有重量损失。

30)-6抗肿瘤作用(6)

将CDH6-阳性的人肾细胞肿瘤细胞系786-O (ATCC)(其CDH6表达已在实施例2)-3中证实)悬浮于Matrigel (Corning Inc.)中，并将细胞悬浮液以5 × 10

在该肿瘤模型中，ADC5和ADC6表现出强烈的抗肿瘤作用(图15)。ADC11(对照)没有表现出抗肿瘤作用(图15)。由此显示，取决于CDH6在肿瘤细胞中的表达，特异性获得了ADC5和ADC6的抗肿瘤作用。证实与对照组(ABS缓冲液施用组)相比，在所有药物施用组中都没有重量损失。

产业适用性

本发明提供了具有内化活性的抗CDH6抗体和包含所述抗体的抗体-药物缀合物。所述抗体-药物缀合物可用作癌症等的治疗药物。

序列表的自由文本

SEQ ID NO:1：人CDH6 ORF

SEQ ID NO:2：EC1

SEQ ID NO:3：EC2

SEQ ID NO:4：EC3

SEQ ID NO:5：EC4

SEQ ID NO:6：EC5

SEQ ID NO:7：食蟹猴CDH6 ORF

SEQ ID NO:8：食蟹猴CDH6引物1

SEQ ID NO:9：食蟹猴CDH6引物2

SEQ ID NO:10：rG019轻链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:11：rG019轻链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:12：rG019 CDRL1

SEQ ID NO:13：rG019 CDRL2

SEQ ID NO:14：rG019 CDRL3

SEQ ID NO:15：rG019重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:16：rG019重链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:17：rG019 CDRH1

SEQ ID NO:18：rG019 CDRH2

SEQ ID NO:19：rG019 CDRH3

SEQ ID NO:20：包含编码人轻链信号序列和人κ链恒定区的DNA序列的DNA片段

SEQ ID NO:21：包含编码人重链信号序列和人IgG1恒定区的DNA序列的DNA片段

SEQ ID NO:22：包含编码chG019轻链的DNA片段的DNA片段

SEQ ID NO:23：chG019轻链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:24：chG019轻链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:25：chG019轻链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:26：chG019重链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:27：chG019重链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:28：chG019重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:29：chG019重链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:30：chG019 CDRH2

SEQ ID NO:31：hL02轻链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:32：hL02轻链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:33：hL02轻链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:34：hL02轻链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:35：hL03轻链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:36：hL03轻链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:37：hL03轻链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:38：hL03轻链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:39：hH01重链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:40：hH01重链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:41：hH01重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:42：hH01重链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:43：hH02重链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:44：hH02重链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:45：hH02重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:46：hH02重链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:47：hH04重链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:48：hH04重链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:49：hH04重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:50：hH04重链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:51：NOV0712轻链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:52：编码SEQ ID No. 51中显示的氨基酸序列的核苷酸序列

SEQ ID NO:53：NOV0712重链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:54：编码SEQ ID No. 53中显示的氨基酸序列的核苷酸序列

SEQ ID NO:55：hH11重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:56：hH11重链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:57：hH11 CDRH1

SEQ ID NO:58：hH11 CDRH2

SEQ ID NO:59：hH11 CDRH3

SEQ ID NO:60：hH31重链可变区氨基酸序列

SEQ ID NO:61：hH31重链可变区核苷酸序列

SEQ ID NO:62：hH31 CDRH1

SEQ ID NO:63：hH31 CDRH2

SEQ ID NO:64：hH31 CDRH3

SEQ ID NO:65：hH01A重链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:66：hH01A重链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:67：hH11A重链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:68：hH11A重链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:69：hH31A重链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:70：hH31A重链全长核苷酸序列

SEQ ID NO:71：包含编码人重链信号序列和人IgG1 LALA恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段

SEQ ID NO:72：抗LPS抗体轻链全长氨基酸序列

SEQ ID NO:73：抗LPS抗体重链全长氨基酸序列