具有1,3-PDO生产力和降低的3-HP生产力的重组棒状杆菌以及使用其生产1,3-PDO的方法

摘要

本发明涉一种具有1,3‑PDO生产力和降低的3‑HP生产力的重组棒状杆菌(Corynebacterium)以及一种使用其生产1,3‑PDO的方法。当使用根据本发明的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)变体时，通过使用低成本甘油作为碳源抑制作为副产物的3‑HP的生产力，并且因此可以以高效率生产1,3‑PDO。

说明书

技术领域

本发明涉及一种具有1,3-PDO(1,3-丙二醇)生产能力和降低(抑制)的3-HP生产能力的重组棒状杆菌(Corynebacterium)以及使用其生产1,3-PDO的方法，并且更特别地涉及一种突变体微生物，其具有缺失或减弱的3-HP生产能力并且从甘油产生1,3-PDO，其中所述突变体微生物通过以下方式产生：将编码甘油易化蛋白的基因、编码甘油激酶的基因、编码甘油脱氢酶的基因、编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因和编码1,3-PDO氧化还原酶的基因引入谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，并且从所述谷氨酸棒状杆菌缺失或减弱编码醛脱氢酶的基因。

背景技术

1,3-丙二醇(1,3-PDO)是用作合成聚合物(诸如聚醚、聚氨酯和聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT))的单体的化学物质。主要用于生产1,3-PDO的常规方法是化学合成方法，并且可以使用丙烯醛的水合、在膦的存在下环氧乙烷的加氢甲酰化、或甘油的酶促转化。这些化学生产方法具有局限性，因为它们包括高成本且对环境有危害的生产过程(Lee等人,Renewable and Sustainable Energy Reviews,42(增刊C):963-972；美国专利号8,236,994B2)。

使用微生物生产1,3-PDO的生物方法主要使用诸如克雷伯氏菌属(Klebsiella)、梭状芽孢杆菌属(Clostridia)、肠杆菌属(Enterobacter)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和乳酸杆菌属(Lactobacilli)的微生物来进行。在所有这些方法中，通过使用甘油脱水酶将甘油转化为3-羟基丙醛(3-HPA)并且然后使用1,3-PDO氧化还原酶将3-HPA还原为1,3-PDO的两个连续代谢途径(图1)将甘油直接转化为1,3-PDO。DuPont Inc.已经通过将所述代谢途径引入大肠杆菌(E.coli)中而成功商业化了1,3-PDO。然而，存在缺点，其中包括用于生物合成1,3-PDO的大肠杆菌的大多数微生物与各种副产物(诸如甲酸盐、乙酸盐、乳酸盐、乙醇和2,3-丁二醇)一起产生。

谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是革兰氏阳性厌氧细菌，其被广泛用于氨基酸生产的发酵过程。另外，为了使用谷氨酸棒状杆菌生产各种化学物质和燃料，已经进行了大量的代谢工程研究，目的是实现消耗各种类型的碳源，诸如葡萄糖和木糖，但是关于生产1,3-PDO的研究很少，并且研究报道了使用葡萄糖和甘油作为碳源在谷氨酸棒状杆菌中通过用葡萄糖促进细胞生长来生产谷氨酸以及同时用甘油生产1,3-PDO(Huang等人,Scientific Reports,7:42246,2017)。

然而，作为1,3-PDO生物合成代谢途径中的中间体的3-羟基丙醛(3-HPA)在细胞中积累时具有毒性作用，并且充当3-羟基丙酸的前体，3-羟基丙酸是1,3-PDO的副产物之一。通过醛脱氢酶从3-HPA转化3-HP，这已被报道在通过在谷氨酸棒状杆菌中过表达GabD4(E209Q/E269Q)(GabD4的突变体酶)(编码源自杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)的醛脱氢酶的基因)生产3-HP的研究中(Chen等人,Metabolic Engineering,39:151,2017)。然而，这是由外源酶的过表达引起的效果，并且在仍然天然存在于谷氨酸棒杆菌中并且参与3-HP生物合成的醛脱氢酶中，没有与特异性接受作为底物的3-HPA的基因相关的报道。

因此，作为通过生物途径更有效地生产1,3-PDO的大量努力的结果，本发明诸位发明人已经发现，在培养谷氨酸棒状杆菌时，3-HP生产能力被抑制并且因此有效生产1,3-PDO，所述谷氨酸棒状杆菌通过引入编码甘油脱氢酶的基因、编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因和编码1,3-PDO氧化还原酶的基因而被赋予1,3-PDO生产能力，并且同时在所述谷氨酸棒状杆菌中，3-HPA生产能力通过缺失谷氨酸棒状杆菌中存在的候选醛脱氢酶基因而被抑制，从而产生具有1,3-PDO生产能力并且其中3-HP生产能力被抑制或缺失的突变体谷氨酸棒状杆菌。基于此发现，完成本发明。

发明内容

因此，已鉴于以上问题提出了本发明，并且本发明的目的是提供一种突变体谷氨酸棒状杆菌，其由于抑制的3-HP产生能力而能够有效生产1,3-PDO。

本发明的另一个目的是提供一种通过培养所述突变体谷氨酸棒状杆菌来生产1,3-PDO的方法。

根据本发明的一个方面，以上和其他目的可以提供一种突变体微生物来实现，所述突变体微生物具有缺失或减弱的3-HP生产能力并且从甘油产生1,3-PDO，其中(i)编码甘油易化蛋白的基因、(ii)编码甘油激酶的基因和编码甘油脱氢酶的基因、(iii)编码甘油脱水酶的基因、(iv)编码甘油再激活酶的基因和(v)编码1,3-PDO氧化还原酶的基因被引入谷氨酸棒状杆菌中，并且从所述谷氨酸棒状杆菌缺失或减弱编码醛脱氢酶的基因。

根据本发明的另一方面，提供了一种从甘油生产1,3-PDO的方法，其包括(a)在含甘油培养基中培养所述突变体微生物以产生1,3-PDO，以及(b)收集所产生的1,3-PDO。

附图说明

图1是说明根据本发明的突变体谷氨酸棒状杆菌的总体代谢途径的示意图，包括1,3-PDO生物合成代谢途径、3-HP生物合成代谢途径和甘油分解代谢途径。

图2示出了其中插入了编码甘油降解代谢途径的glpF、glpK和glpD基因的pCSglpFKD重组载体。

图3示出了为缺失NCgl0049基因(在13种醛脱氢酶候选物中)而产生的pCG-9ts-ALD1重组载体。

图4示出了通过插入编码甘油脱水酶的pduCDEGH基因簇而产生的pEK-pdu重组载体，以便构建3-HPA生物合成代谢途径。

图5示出了通过将编码大肠杆菌1,3-PDO氧化还原酶的yqhD基因插入pEK-pdu载体中而产生的pEK-pduyE重组载体，以便构建1,3-PDO生物合成代谢途径。

图6示出了通过将pCSglpFKD和pEK-pduyE载体引入其中缺失11种类型的醛脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌菌株中，在使用甘油作为单一碳源时3-HP产生的结果。

图7示出了通过将pCSglpFKD和pEK-pduyE载体引入其中缺失11种醛脱氢酶的谷氨酸棒状杆菌菌株中，在使用甘油作为单一碳源时1,3-PDO产生的结果。

具体实施方式

除非另外定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的意义相同的意义。一般而言，本文使用的术语是本领域所熟知且通常使用的术语。

在本发明中，具有增加的1,3-PDO生产能力的突变体谷氨酸棒状杆菌通过以下方式产生：在突变体谷氨酸棒状杆菌中抑制从与3-HPA(其为1,3-PDO的前体)相同的前体转化的3-HP的生产能力，以便使用具有1,3-PDO生产能力的突变体谷氨酸棒状杆菌改善1,3-PDO产率。

在本发明中，具有1,3-PDO生产能力的突变体谷氨酸棒状杆菌通过以下方式产生：将编码甘油脱氢酶的基因、编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因和编码1,3-PDO氧化还原酶的基因引入天然不具有1,3-PDO生产能力的谷氨酸棒状杆菌中。

在本发明中使用的编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因和编码1,3-PDO氧化还原酶的基因是Klebsiella pneumoniae(克雷伯氏肺炎菌)来源的pduCDEGH和大肠杆菌来源的yqhD，并且在将所述基因引入谷氨酸棒状杆菌中后确定1,3-PDO生产能力。

在本发明中使用的谷氨酸棒状杆菌是天然允许甘油扩散但当使用单一碳源时不允许细胞生长的微生物。出于此原因，通过引入编码甘油易化蛋白的基因、编码甘油激酶的基因和编码甘油脱氢酶的基因来产生能够从甘油碳源进行细胞生长的谷氨酸棒状杆菌。

在本发明中，源自大肠杆菌的glpF、glpK和glpD分别作为编码甘油易化蛋白的基因、编码甘油激酶的基因和编码甘油脱氢酶的基因被引入。

在本发明中，除了1,3-PDO外，引入了1,3-PDO生物合成代谢途径的谷氨酸棒状杆菌还产生作为主要副产物的3-HP(3-羟基丙酸)，并且3-HP是从3-HPA(3-羟基丙醛)通过醛脱氢酶转化的，3-HPA是与3-PDO相同的前体。从存在于谷氨酸棒状杆菌中的醛脱氢酶的候选酶中鉴定特异性地与3-HPA强烈反应的酶，并且确定通过体内培养获得的效果。

因此，在一方面，本发明涉及一种突变体微生物，其具有缺失或减弱的3-HP生产能力并且从甘油产生1,3-PDO，其中所述突变体微生物通过以下方式产生：将(i)编码甘油易化蛋白的基因、(ii)编码甘油激酶的基因和编码甘油脱氢酶的基因、(iii)编码甘油脱水酶的基因、(iv)编码甘油再激活酶的基因和(v)编码1,3-PDO氧化还原酶的基因引入谷氨酸棒状杆菌中，并且从所述谷氨酸棒状杆菌缺失或减弱编码醛脱氢酶的基因。

在本发明中，编码醛脱氢酶的基因(其为参与提供具有抑制的3-HP生产能力的突变体谷氨酸棒状杆菌的酶)包括谷氨酸棒状杆菌中存在的11种候选基因，即NCgl0049、NCgl0157、Ncgl0437、NCgl0463、NCgl0521、NCgl0523、NCgl0900、NCgl2272、NCgl2578、NCgl2619、和NCgl2698。

在本发明中，确定由于针对3-HP生物合成抑制选择的11种候选基因的缺失而引起的3-HP产生的变化，并且产生具有增加的1,3-PDO产生的突变体谷氨酸棒状杆菌。

在本发明中，可以缺失或减弱至少一种编码醛脱氢酶的基因。

在本发明中，编码甘油易化蛋白的基因、编码甘油激酶的基因、和编码甘油脱氢酶的基因可以分别是glpF、glpK和glpD，并且编码甘油脱水酶的基因、编码甘油再激活酶的基因、和编码1,3-PDO氧化还原酶的基因可以是pduCDEG或yqhD。

在本发明中，所述引入的基因可以通过选自tac、trc和tuf的强启动子过表达。

如本文所用，术语“固有活性”是指微生物天生具有的处于未修饰状态的酶的活性，表述“经修饰以具有与固有活性相比增强的活性”意指与修饰前的酶活性相比活性是新引入或改善的。

如本文所用，术语“酶活性的增强”不仅包括通过新引入酶的活性或将其改善而具有超出原始功能的作用，而且还包括基于内源基因活性的增加、由于内部或外部因素引起的内源基因扩增、基因表达的抑制性调节因子的缺失、基因拷贝数的增加、来自外部来源的基因的引入、表达调节序列的修饰(特别是启动子替代或修饰)而增加的酶活性，以及由于基因突变而增加的酶活性。

如本文所用，术语“经修饰以具有与固有活性相比增强的活性”意指这样的状态，在所述状态下操纵后微生物的活性与操纵前微生物的活性相比增加，所述操纵诸如展现出活性的基因或增加的相应基因的拷贝数的引入以及基因表达的抑制性调节因子的缺失或对表达调节序列的修饰(例如增强的启动子的使用)。

如本文所用，术语“缺失”涵盖其中通过对基因的一部分或全部碱基进行突变、替代或缺失的方法使基因不表达的情况，以及其中即使所述基因表达，其酶活性也不表达的情况；并且包括阻断相应基因的酶所介导的生物合成途径的所有操作。

如本文所用，术语“过表达”是指表达水平高于细胞中相应基因在正常状态中表达的水平，并且包括通过将存在于基因组上的基因的启动子用更强的启动子替代或者将相应基因克隆至表达载体中以与所述表达载体一起转化细胞而引起的表达水平的增加。

如本文所用，术语“载体”意指DNA产物，其含有与合适控制序列可操作连接的编码靶蛋白的多核苷酸的碱基序列，以在合适宿主中表达靶蛋白。控制序列包括能够启动转录的启动子、用于控制这种转录的任何操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及用于控制转录和翻译终止的序列。将载体转化至合适的宿主细胞中后，它可以独立于宿主基因组进行复制或执行功能，并可以与基因组整合。

由于质粒是最常用的载体类型，因此术语“质粒”和“载体”可以在本发明的说明书中可互换使用。为了本发明的目的，优选使用质粒载体。可用于此目的的典型质粒载体包括(a)有效进行复制使得每个宿主细胞中包括几百个质粒载体的复制起点，(b)用于筛选由质粒载体转化的宿主细胞的抗生素抗性基因，和(c)其中了插入外源DNA片段的限制性酶切位点。即使不存在合适的限制性酶切位点，也可以根据常规方法使用合成的寡核苷酸衔接体或接头容易地将所述载体和外源DNA连接。

连接后，应将载体转化到适当的宿主细胞中。本发明中优选的宿主细胞是原核细胞。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM101、大肠杆菌K12、大肠杆菌W3110、大肠杆菌X1776、大肠杆菌XL-1Blue(Stratagene)、大肠杆菌B、大肠杆菌B21等。然而，还可以使用诸如FMB101、NM522、NM538和NM539的大肠杆菌菌株，以及其他原核生物物种和属等。除了上文提及的大肠杆菌，如下菌株也可以用作宿主细胞：农杆菌属(Agrobacterium)的菌株，如农杆菌A4；芽孢杆菌属(Bacillus)菌株，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；其他肠细菌，如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)；以及假单胞菌属(Pseudomonas)的各种菌株。

原核细胞的转化可以使用1.82部分(Sambrook等人，同上引文)中描述的氯化钙方法容易地进行。可替代地，电穿孔(Neumann等人,EMBO J.,1:841,1982)可以用于这些细胞的转化。

用于过表达根据本发明的基因的载体可以是本领域已知的任何表达载体，并且优选地是基于pET的载体(Novagen)。当使用基于pET的载体进行克隆时，组氨酸基团与所表达的蛋白质的末端结合，从而可以有效地纯化所述蛋白质。所表达的蛋白质可以通过本领域已知的通用方法从所克隆的基因分离，并且可以使用Ni-NTA His-缀合的树脂(Novagen)使用色谱法进行特异性分离。在本发明中，所述重组载体可以是pET-SLTI66，并且所述宿主细胞可以是大肠杆菌或农杆菌。

如本文所用，术语“表达控制序列”意指对于与特定宿主生物可操作地连接的编码序列的表达所必需的DNA序列。这样的控制序列包括用于进行转录的启动子、用于控制这样的转录的任何操纵基因序列、用于编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及用于控制转录和翻译的终止的序列。例如，适用于原核生物的控制序列包括启动子，任选地操纵基因序列和核糖体结合位点。适用于真核细胞的控制序列包括启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。对基因在质粒中的表达水平具有最大影响的因子是启动子。优选地使用SRα启动子、巨细胞病毒来源的启动子等作为用于高表达的启动子。可以将多种多样的表达控制序列中的任何一种用于载体以便表达本发明的DNA序列。有用的表达控制序列包括例如SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、T3和T7启动子、噬菌体λ的主要操纵基因和启动子区域、fd编码蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他乙二醇裂解酶的启动子、磷酸酶的启动子(如Pho5)、酵母α-交配系统的启动子、和已知控制原核或真核细胞或病毒的基因表达的其他序列及其各种组合。T7启动子可用于在大肠杆菌中表达本发明的蛋白质。

当核酸序列基于功能性关系与另一核酸序列对齐时，它与其“可操作地连接”。它可以是一个或多个基因和一个或多个控制序列，其以这样的方式连接以便当合适的分子(例如，转录激活子蛋白)与所述一个或多个控制序列连接时能够进行基因表达。例如，当作为参与多肽分泌的前蛋白表达时，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接；当启动子或增强子影响序列的转录时，其与编码序列可操作地连接；或者当核糖体结合位点影响序列的转录时，其与编码序列可操作地连接；或者当被定位以促进翻译时，核糖体结合位点与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意指所连接的DNA序列与其接触，并且分泌前导序列与其接触并存在于阅读框中。然而，增强子不需要与其接触。这些序列通过在便利的限制酶切位点处的连接(ligation/linkage)进行连接。当不存在此类位点时，使用根据常规方法的合成的寡核苷酸衔接子或接头。

如本文所用，术语“表达载体”通常是指其中插入了异源DNA片段的重组载体，并且通常意指双链DNA片段。在本文中，异源DNA是在宿主细胞中不天然存在的外源DNA。一旦表达载体存在于宿主细胞中，它就可以独立于宿主染色体DNA进行复制，并且可以产生载体和其插入的(异源)DNA的若干个拷贝。

如本领域熟知的，为了增加转基因在宿主细胞中的表达水平，所述基因应当与在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列可操作地连接。优选地，表达控制序列和相应基因被包括在一个含有细菌选择标记和复制起点的表达载体中。当表达宿主是真核细胞时，表达载体应当在真核表达宿主中进一步包括有用的表达标记。

用上述表达载体转染或转化的宿主细胞构成本发明的另一方面。如本文所用，术语“转染”意指将DNA引入宿主中并使DNA可使用染色体外因子或染色体整合进行复制。如本文所用，术语“转化”意指表达载体容纳在宿主细胞中，而不管是否实际表达任何编码序列。

应当理解，并非所有载体和表达控制序列在表达本发明的DNA序列时都同样地起作用。同样，并非所有宿主针对同一表达系统都同样地起作用。然而，本领域技术人员将能够在没有过多的实验负担和不脱离本发明的范围的情况下从各种载体、表达控制序列和宿主中进行适当的选择。例如，对载体的选择应该在考虑宿主的情况下进行，因为所述载体应该在其中复制。还应考虑载体的复制数、控制复制数的能力和由相应载体编码的其他蛋白的表达(例如抗生素标记的表达)。在选择所述表达控制序列时，应考虑许多因素。例如，特别是关于可能的二级结构，应当考虑序列的相对强度、可控性和与本发明的DNA序列的相容性。可以在考虑诸如以下因素的情况下选择单细胞宿主：所选载体、由发明的DNA序列编码的产物的毒性、分泌特征、准确折叠蛋白质的能力、培养和发酵因素、以及从宿主中由根据本发明的DNA序列编码的产物的易纯化性。在这些因素的范围内，本领域技术人员可以选择能够在发酵或大型动物培养中表达本发明的DNA序列的各种载体/表达控制序列/宿主组合。作为用于通过表达克隆来克隆蛋白质的cDNA的筛选方法，可以应用结合方法、淘选方法、膜乳液方法等。

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对本领域技术人员明显的是，提供这些实施例仅用于举例说明本发明，而不应解释为限制本发明的范围。

在以下实施例中，仅给出了源自特定菌株的基因作为待引入的基因的例子，但是对于本领域技术人员将显而易见的是，可以不受限制地使用任何基因，只要它们在待引入它们的宿主中表达并且展现出相同的活性即可。实施例1：用于生产能够使用甘油作为单一碳源生长的突变体谷氨酸棒状杆菌的pCSglpFKD载体的产生

1-1：用于构建甘油分解代谢途径的pCSglpFKD载体的产生

谷氨酸棒状杆菌已知不能使用甘油作为单一碳源进行细胞生长。因此，为了构建甘油分解代谢途径，首先使用谷氨酸棒状杆菌穿梭载体pCES208s-H36-S3表达编码源自大肠杆菌W3110的酶并且负责甘油分解代谢途径的基因。

使用大肠杆菌W3110(ATCC 39936)的染色体DNA作为模板以及SEQ ID NO:1和2的引物进行PCR以获得编码甘油易化蛋白的glpFK基因片段和甘油激酶操纵子酶，并且使用SEQ ID NO:3和4的引物进行PCR以获得编码甘油-3-磷酸脱氢酶的glpD基因片段。为了将glpFK基因片段与glpD基因片段连接，使用SEQ ID NO:1和4的引物进行重叠PCR以产生glpFKD基因片段(SEQ ID NO:53)。为了用抗生素大观霉素线性化pCES208s-H36-S3载体((通过替代pCES208-H36载体(韩国专利特开平10-2013-0022691，或Yim S.S.等人,Biotechnol.Bioeng.,110:2959,2013,SEQ ID NO:54)的Km抗生素而获得的载体(SEQ IDNO:21))，使用SEQ ID NO:5和6的引物进行PCR，并且使用产生的glpFKD基因片段和Gibson组装方法构建pCSglpFKD载体(图2)。

[表1]

用于产生pCSglpFKD载体的引物

实施例2：用于抑制3-HP生物合成的醛脱氢酶缺失载体的产生

当从甘油产生1,3-PDO时，通过细胞中存在的醛脱氢酶将产生的前体3-HPA转化为3-HP。然而，尚未报道在谷氨酸棒状杆菌中催化接受作为底物的前体的反应的酶。因此，为了鉴定介导所述反应的醛脱氢酶并且从菌株的基因组中缺失编码所述酶的基因以从而抑制3-HP生物合成，首先选择谷氨酸棒状杆菌中存在的13种醛脱氢酶(表2)。

然后，为了确认通过缺失编码这13种醛脱氢酶的基因(SEQ ID NO:56至68)而对3-HP生物合成的抑制作用，首先产生包括转化到谷氨酸棒状杆菌中的pTacCC1-HrT载体的菌株(Cho等人,Metabolic Engineering,42:157-167,2017)。然后，产生i)各自含有12种类型的基因的sgRNA序列的pCG9ts系列，以及ii)各自与所产生的谷氨酸棒状杆菌菌株的13种基因结合的ssODN，以在谷氨酸棒状杆菌中进行基因缺失。

2-1：含有13种基因的sgRNA指导序列的pCG9ts系列载体的产生

首先，使用分析sgRNA指导序列的非特异性靶标并且提供最佳sgRNA指导序列的在线程序CRISPy-web(Blin等人,Synthetic and Systems Biotechnology,1(2):118-121,2016)，选择以下具有低的脱靶效应的最佳指导序列(表2)。

[表2]

使用CRISPy-web，用于13种任意种类的醛脱氢酶的sgRNA指导序列

为了产生包含sgRNA指导序列(SEQ ID NO:7至19)的pCG9ts系列载体，将靶向NCgl0049基因并且编码sgRNA-T1/TE序列的DNA片段(韩国专利申请号2017-0042124；Cho等人,Metabolic Engineering,42:157-167,2017)使用pUC19-sgRNA载体(韩国专利申请号2017-0042124；Cho等人,Metabolic Engineering,42:157-167,2017，SEQ ID NO:55)作为模板以及SEQ ID NO:20和23的引物进行扩增。使用SEQ ID NO:21和22的引物，通过PCR将扩增的DNA片段扩增。在将pEKts-Cas9载体(韩国专利申请号2017-0042124；Cho等人,Metabolic Engineering,42:157-167,2017，SEQ ID NO:66)用StuI酶处理后，用扩增的片段通过Gibson组装最终产生表达靶向NCgl0049基因的sgRNA以及Cas9蛋白的pCG9ts-ALD1载体。然后，以与以上相同的方式产生靶向编码13种任意种类的酶中的每一种的基因的片段(在SEQ ID NO:20、21和22的情况下相同；对于相应的基因以SEQ ID NO:24至35的顺序进行PCR)以产生pCG9ts-ALD2、pCG9ts-ALD3、pCG9ts-ALD4、pCG9ts-ALD5、pCG9ts-ALD6、pCG9ts-ALD7、pCG9ts-ALD8、pCG9ts-ALD9、pCG9ts-ALD10、pCG9ts-ALD11、pCG9ts-ALD12和pCG9ts-ALD13载体。

[表3]

用于扩增sgRNA-T1/TE片段的引物

[表4]

用于产生pCG9ts系列载体和13种随机选择的酶的引物

2-2：各自与13种类型的基因结合的ssODN的产生

设计用于缺失13种任意种类的靶基因的ssODN，使得sgRNA指导序列结合的位点位于ssODN的两个结合序列之间，并且全长为80个核苷酸(表5)。同时，ssODN由5’同源臂和3’同源臂组成，并且每个同源臂是40个碱基对，并且被设计为结合至包含与sgRNA指导序列互补的序列的靶基因区域的两端的外部分。当ssODN与靶标结合时，形成环结构，并且此部分成为发生缺失的区域。缺失区域的长度被设计为具有100个碱基对，使得可以通过PCR容易地检测靶基因的缺失。

[表5]

与任意13种醛脱氢酶基因结合的ssODN序列

实施例3：具有抑制的3-HP生产能力和改善的1,3-PDO生产能力的谷氨酸棒状杆菌的产生和确认

3-1：具有抑制的3-HP生产能力的谷氨酸棒状杆菌的产生

将实施例2-1和2-2中产生的pCG9ts-ALD载体和ssODN各自转化到野生型谷氨酸棒状杆菌(ATCC 13032)中，以便从基因组中缺失预期参与3-HP生物合成的编码任意13种醛脱氢酶的基因。然后，对于转化的突变体谷氨酸棒状杆菌菌株，通过在37℃ BHI板上固化去除pTacCC1-HrT载体(韩国专利申请号2017-0042124；Cho等人,Metabolic Engineering,42:157-167,201，SEQ ID NO:57)和pCG9ts-ALD载体。通过此过程产生的菌株在表6中示出。然而，不产生WAH3菌株和WAH9菌株，并且相应的两个基因被认为是细胞存活所必需的基因。

[表6]

11种任意醛脱氢酶缺失的谷氨酸棒状杆菌菌株

3-2：用于构建1,3-PDO生物合成代谢途径的pEK-pduyE载体的产生

为了构建1,3-PDO生物合成代谢途径，使用谷氨酸棒状杆菌的pEKEx1穿梭载体(Eikmanns等人,Gene 102:93,1991,SEQ ID NO:58)表达克雷伯氏肺炎菌DSMZ2026(KCTC4952)和大肠杆菌W3110来源的外源酶。

首先，使用克雷伯氏肺炎菌的DSMZ2026菌株的染色体DNA作为模板以及SEQ IDNO:49和50的引物进行PCR以获得编码甘油脱水酶和甘油再激活酶的pduCDEGH基因簇片段(SEQ ID NO:59)。为了将获得的pduCDEGH基因片段与作为穿梭载体的pEKEx1载体连接，通过用限制酶EcoRI和PstI处理并且然后使用Gibson组装进行连接来产生pEK-pdu载体(图4)。

然后，使用通过将源自大肠杆菌W3110的yqhD插入作为模板的pTac15k载体(来源于p15A，tac启动子，KmR)中而获得的pTac15kyqhD重组载体(重组载体(SEQ ID NO:60)以及SEQ ID NO:51和52的引物进行PCR以获得编码1,3-PDO氧化还原酶的yqhD基因片段。

为了将获得的基因片段与pEK-pdu载体连接，通过用DraI限制酶处理并且使用Gibson组装进行连接来产生pEK-pduyE载体(图5)。

[表7]

用于产生pEK-pduyE载体的引物

3-3：通过体内培养确认对3-HP生产能力的抑制以及1,3-PDO生产能力的改善

将实施例3-1中制备的每种菌株用用于构建甘油降解代谢途径的pCSglpFKD载体和用于构建1,3-PDO生物合成代谢途径的pEK-pduyE转化。然后，在补充有25μg/L的卡那霉素和200μg/L的大观霉素的BHIS板培养基(含有37g/L的脑心浸液(BHI)、91g/L的山梨糖醇和15g/L的琼脂)上进行选择。将11种转化的突变体微生物接种到含有10mL BHIS培养基(含有37g/L的脑心浸液(BHI)和91g/L的山梨糖醇)的试管中，并且在30℃下预培养16小时。然后，将1mL预培养溶液接种到在250mL挡板烧瓶中的25mL CGXII培养基(表8)中并且进行培养。将甘油的初始浓度设定为40g/L，并且在培养基中添加10g/L的酵母提取物，并且一式三份地进行烧瓶培养48小时。

[表8]

用于培养谷氨酸棒状杆菌的CGXII培养基的组分

用于测量3-HP浓度的HPLC条件如下。首先，使用Agilent 1100系列HPLC仪器，并且将DAD检测器、agilent MetaCarb 87H柱和另一个UV 210nm检测器用作检测器和柱。同时，在40℃下以0.5mL/min的流速进料0.1％H

结果是，如从图6和7可以出，用来自WAH13菌株的pCSglpFKD载体和pEK-pduyE载体转化的菌株最多地抑制了3-HP产生，并且因此最多地增加了1,3-PDO产生。另外，可以看出WAH1、WAH2、WAH5、WAH6和WAH7也展现出抑制的3-HP产生和增加的1,3-PDO产生。

工业实用性

根据本发明的突变体谷氨酸棒状杆菌可以使用廉价的甘油作为碳源通过抑制产生副产物3-HP的能力来以高效率产生1,3-PDO。

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员应理解，出于说明目的提供本说明书以阐述优选实施方案，并且不应理解为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求和其等同物限定。

序列文本

附有电子文件。

<110> 韩华思路信

韩国科学技术院

<120> 具有1,3-PDO生产力和降低的3-HP生产力的重组棒状杆菌以及使用其生产1,3-PDO的方法

<130> PP-B2190

<150> KR 10-2018-0058952

<151> 2018-05-24

<160> 68

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer)

<400> 1

ttggttggta ggagtagcat gggatccatg agtcaaacat caacctt 47

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer)

<400> 2

gtttccatct atatctcctt ttattcgtcg tgttcttccc 40

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer)

<400> 3

aaggagatat agatggaaac caaagatctg at 32

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer)

<400> 4

taattataat ggccggctgg gcctctagag ttacgacgcc agcgataacc 50

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer)

<400> 5

tctagaggcc cagccggcca ttataattag 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer)

<400> 6

ggatcccatg ctactcctac caaccaaggt 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 7

ttcgtggact aagaaacggt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 8

tgcaggattg tagacaggag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 9

ttcacctcag agacgattag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 10

tgtttgctaa agagtaggaa 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 11

aactccccgc gaaagatccg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 12

ttcggagaca cacacatgta 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 13

ccagtgactt tagagctagg 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 14

ccaactgata tcgtgctgta 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 15

gtcgccagtg tatgcgtgaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 16

gcgcagcaaa gctacgtttc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 17

atcgtcgtaa ggattgatat 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 18

gaggttatag cgccatttac 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA

<400> 19

cttgccaatc cgattagagc 20

<210> 20

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA-T1/TE片段的引物(primer)

<400> 20

tatagatatc ccgcggtata ttaattaata taaacgcaga aaggccc 47

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA-T1/TE片段的引物(primer)

<400> 21

tggatgatgg ggcgattcag gtatagatat cttgacaatt aatcatcggc t 51

<210> 22

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> sgRNA-T1/TE片段的引物(primer)

<400> 22

aaggtgttgc tgactcatac caggtataga tatcccgcgg tata 44

<210> 23

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 23

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggttcgtg gactaagaaa cggtgtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 24

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 24

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggtgcagg attgtagaca ggaggtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 25

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 25

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggttcacc tcagagacga ttaggtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 26

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 26

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggtgtttg ctaaagagta ggaagtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 27

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 27

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaactcc ccgcgaaaga tccggtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 28

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 28

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggttcgga gacacacaca tgtagtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 29

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 29

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggccagtg actttagagc tagggtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 30

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 30

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggccaact gatatcgtgc tgtagtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 31

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 31

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggtcgcc agtgtatgcg tgaagtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 32

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 32

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggcgcag caaagctacg tttcgtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 33

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 33

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggatcgtc gtaaggattg atatgtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 34

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 34

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtgggaggtt atagcgccat ttacgtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 35

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCG9ts-系列载体制备的引物(primer)

<400> 35

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggcttgcc aatccgatta gagcgtttta 60

gagctagaaa tagcaagt 78

<210> 36

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 36

ggtgccatgg gtgccaaaat gcgcaacatc ggcgaagctt cgacgaaggc gtcaccgtgg 60

gccccctggt tgaggaaaaa 80

<210> 37

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 37

actggattga cggcgcgatt tccccatcca cttccggcaa gctgctaaga cgtggggcaa 60

cctgtctatc gctaagcgcc 80

<210> 38

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 38

gactgttgtg gataactctt ctgcttggcg caaggacgac cagtgctgaa gccacttcac 60

gatgccgctg gtcttgtaaa 80

<210> 39

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 39

gtcggtagct ttcaaaagct cgcttcgccg atgttgtggc cactcgccat caatcagtga 60

acacccatgc agtgcggttg 80

<210> 40

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 40

ccacgattcc acccagtgga tgtccgcgct ctctgatgca cagagatcat ccacctggaa 60

gctggaaaat ccgttgcaga 80

<210> 41

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 41

gtaaccacct tgcttcgggt atagaagttg aaagactcag gacttcgatg tccatctgaa 60

attctcgagc tgtacggcca 80

<210> 42

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 42

gtcgagagta ctgacatgtc tgcatcagga aggataatcg cttgtctact ccggggtggc 60

ggacaagggc atcaccgaaa 80

<210> 43

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 43

cttcgaagaa tccgaaagca ccgacctgcg tgccttcctg tcctggtttc ccgcgaggca 60

ctgtatgacg gtgctcgtct 80

<210> 44

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 44

aacgatgttg actgctgctg cacgtgcacg acgcaggtcg ttggtgcgag gcagttggtg 60

gtgcaagatg cgccggagat 80

<210> 45

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 45

ctgcaggatt tccacgagct tggtgttgga atgcacagct cgcccaaagg cacacggacc 60

tgcttcatct gaatgccgtt 80

<210> 46

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 46

ggcatcaaca tcagcaatgg aagcttgttt gctttcggcg caaatgttgc agtcacaagg 60

tctcctaaag ttgattgtgg 80

<210> 47

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 47

cccttgaaag tgcaaaagca tgctcgacgt cttgctcatc atgaagttct ttaggcagcg 60

gacctaaagg aagacgtttg 80

<210> 48

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ssODN序列

<400> 48

ggaatgatct tgtcggatgc agcgcggttg atcagcttgc gccctctggg atgagatcgc 60

cgatgatgtt aatcagatac 80

<210> 49

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer) for pEK-pduyE preparation

<400> 49

acaatttcac acaggaaaca gaattcatga gatcgaaaag atttgaag 48

<210> 50

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer) for pEK-pduyE preparation

<400> 50

aaaacagcca agcttggctg cagttaagca tggcgatccc gaaatg 46

<210> 51

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer) for pEK-pduyE preparation

<400> 51

ttccaatgat gagcactttt ttgacaatta at 32

<210> 52

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 引物(primer) for pEK-pduyE preparation

<400> 52

gcgccacata gcagaacttt ttagcgggcg gcttcgtata tac 43

<210> 53

<211> 3895

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> glpFKD

<400> 53

atgagtcaaa catcaacctt gaaaggccag tgcattgctg aattcctcgg taccgggttg 60

ttgattttct tcggtgtggg ttgcgttgca gcactaaaag tcgctggtgc gtcttttggt 120

cagtgggaaa tcagtgtcat ttggggactg ggggtggcaa tggccatcta cctgaccgca 180

ggggtttccg gcgcgcatct taatcccgct gttaccattg cattgtggct gtttgcctgt 240

ttcgacaagc gcaaagttat tccttttatc gtttcacaag ttgccggcgc tttctgtgct 300

gcggctttag tttacgggct ttactacaat ttatttttcg acttcgagca gactcatcac 360

attgttcgcg gcagcgttga aagtgttgat ctggctggca ctttctctac ttaccctaat 420

cctcatatca attttgtgca ggctttcgca gttgagatgg tgattaccgc tattctgatg 480

gggctgatcc tggcgttaac ggacgatggc aacggtgtac cacgcggccc tttggctccc 540

ttgctgattg gtctactgat tgcggtcatt ggcgcatcta tgggcccatt gacaggtttt 600

gccatgaacc cagcgcgtga cttcggtccg aaagtctttg cctggctggc gggctggggc 660

aatgtcgcct ttaccggcgg cagagacatt ccttacttcc tggtgccgct tttcggccct 720

atcgttggcg cgattgtagg tgcatttgcc taccgcaaac tgattggtcg ccatttgcct 780

tgcgatatct gtgttgtgga agaaaaggaa accacaactc cttcagaaca aaaagcttcg 840

ctgtaatatg actacgggac aattaaacat gactgaaaaa aaatatatcg ttgcgctcga 900

ccagggcacc accagctccc gcgcggtcgt aatggatcac gatgccaata tcattagcgt 960

gtcgcagcgc gaatttgagc aaatctaccc aaaaccaggt tgggtagaac acgacccaat 1020

ggaaatctgg gccacccaaa gctccacgct ggtagaagtg ctggcgaaag ccgatatcag 1080

ttccgatcaa attgcagcta tcggtattac gaaccagcgt gaaaccacta ttgtctggga 1140

aaaagaaacc ggcaagccta tctataacgc cattgtctgg cagtgccgtc gtaccgcaga 1200

aatctgcgag catttaaaac gtgacggttt agaagattat atccgcagca ataccggtct 1260

ggtgattgac ccgtactttt ctggcaccaa agtgaagtgg atcctcgacc atgtggaagg 1320

ctctcgcgag cgtgcacgtc gtggtgaatt gctgtttggt acggttgata cgtggcttat 1380

ctggaaaatg actcagggcc gtgtccatgt gaccgattac accaacgcct ctcgtaccat 1440

gttgttcaac atccataccc tggactggga cgacaaaatg ctggaagtgc tggatattcc 1500

gcgcgagatg ctgccagaag tgcgtcgttc ttccgaagta tacggtcaga ctaacattgg 1560

cggcaaaggc ggcacgcgta ttccaatctc cgggatcgcc ggtgaccagc aggccgcgct 1620

gtttggtcag ttgtgcgtga aagaagggat ggcgaagaac acctatggca ctggctgctt 1680

tatgctgatg aacactggcg agaaagcggt gaaatcagaa aacggcctgc tgaccaccat 1740

cgcctgcggc ccgactggcg aagtgaacta tgcgttggaa ggtgcggtgt ttatggcagg 1800

cgcatccatt cagtggctgc gcgatgaaat gaagttgatt aacgacgcct acgattccga 1860

atatttcgcc accaaagtgc aaaacaccaa tggtgtgtat gtggttccgg catttaccgg 1920

gctgggtgcg ccgtactggg acccgtatgc gcgcggggcg attttcggtc tgactcgtgg 1980

ggtgaacgct aaccacatta tacgcgcgac gctggagtct attgcttatc agacgcgtga 2040

cgtgctggaa gcgatgcagg ccgactctgg tatccgtctg cacgccctgc gcgtggatgg 2100

tggcgcagta gcaaacaatt tcctgatgca gttccagtcc gatattctcg gcacccgcgt 2160

tgagcgcccg gaagtgcgcg aagtcaccgc attgggtgcg gcctatctcg caggcctggc 2220

ggttggcttc tggcagaacc tcgacgagct gcaagagaaa gcggtgattg agcgcgagtt 2280

ccgtccaggc atcgaaacca ctgagcgtaa ttaccgttac gcaggctgga aaaaagcggt 2340

taaacgcgcg atggcgtggg aagaacacga cgaataaaag gagatataga tggaaaccaa 2400

agatctgatt gtgatagggg gcggcatcaa tggtgctggt atcgcggcag acgccgctgg 2460

acgcggttta tccgtgctga tgctggaggc gcaggatctc gcttgcgcga cctcttccgc 2520

cagttcaaaa ctcattcacg gtggcctgcg ctaccttgag cactatgaat tccgcctggt 2580

cagcgaggcg ctggctgaac gtgaagtgct gctgaaaatg gccccgcata tcgccttccc 2640

gatgcgtttt cgcctgccac atcgtccgca tctgcgcccg gcgtggatga ttcgcattgg 2700

tctgtttatg tacgatcatc tgggtaaacg caccagcttg ccgggatcaa ctggtttgcg 2760

ttttggcgca aattcagtgt taaaaccgga aattaagcgc ggattcgaat attctgactg 2820

ttgggtagac gacgcccgtc tggtactcgc caacgcccag atggtggtgc gtaaaggcgg 2880

cgaagtgctt actcggactc gcgccacctc tgctcgccgc gaaaacggcc tgtggattgt 2940

ggaagcggaa gatatcgata ccggcaaaaa atatagctgg caagcgcgcg gcttggttaa 3000

cgccaccggc ccgtgggtga aacagttctt cgacgacggg atgcatctgc cttcgcctta 3060

tggcattcgc ctgatcaaag gcagccatat tgtggtgccg cgcgtgcata cccagaagca 3120

agcctacatt ctgcaaaacg aagataaacg tattgtgttc gtgatcccgt ggatggacga 3180

gttttccatc atcggcacta ccgatgtcga gtacaaaggc gatccgaaag cggtgaagat 3240

tgaagagagt gaaatcaatt acctgctgaa tgtgtataac acgcacttta aaaagcagtt 3300

aagccgtgac gatatcgtct ggacctactc cggtgtgcgt ccgctgtgtg atgatgagtc 3360

cgactcgccg caggctatta cccgtgatta cacccttgat attcatgatg aaaatggcaa 3420

agcaccgctg ctgtcggtat tcggcggtaa gctgaccacc taccgaaaac tggcggaaca 3480

tgcgctggaa aaactaacgc cgtattatca gggtattggc ccggcatgga cgaaagagag 3540

tgtgctaccg ggtggcgcca ttgaaggcga ccgcgacgat tatgccgctc gcctgcgccg 3600

ccgctatccg ttcctgactg aatcgctggc gcgtcattac gctcgcactt acggcagcaa 3660

cagcgagctg ctgctcggca atgcgggaac ggtaagcgat ctcggggaag atttcggtca 3720

tgagttctac gaagcggagc tgaaatacct ggtggatcac gaatgggtcc gccgcgccga 3780

cgacgccctg tggcgtcgca caaaacaagg catgtggcta aatgcggatc aacaatctcg 3840

tgtgagtcag tggctggtgg agtatacgca gcagaggtta tcgctggcgt cgtaa 3895

<210> 54

<211> 6538

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pCES208s-H36-S3

<400> 54

gatctttggg agcagtcctt gtgcgcttac gaggtgagcc ggtggggaac cgttatctgc 60

ctatggtgtg agccccccta gagagcttca agagcaatca gcccgaccta gaaaggaggc 120

caagagagag acccctacgg ggggaaccgt tttctgccta cgagatggca catttactgg 180

gaagctttac ggcgtcctcg tggaagttca atgcccgcag acttaagtgc tctattcacg 240

gtctgacgtg acacgctaaa ttcagacata gcttcattga ttgtcgccac gagccagtct 300

ctccctcaac agtcataaac caacctgcaa tggtcaagcg atttccttta gctttcctag 360

cttgtcgttg actggactta gctagttttt ctcgctgtgc tcgggcgtac tcactgtttg 420

ggtctttcca gcgttctgcg gcctttttac cgccacgtct tcccatagtg gccagagctt 480

ttcgccctcg gctgctctgc gtctctgtct gacgagcagg gacgactggc tggcctttag 540

cgacgtagcc gcgcacacgt cgcgccatcg tctggcggtc acgcatcggc ggcagatcag 600

gctcacggcc gtctgctccg accgcctgag cgacggtgta ggcacgctcg taggcgtcga 660

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cgccgtcgat cagctctcca gacgcttcag cggcgctcgg caggcttgct tcaagcgtgg 840

caagtgcttt tgcttccgca gtggcttttc ttgccgcttc gatacgtgcc cgtccgctag 900

aaaactcctg ctcatagcgt tttttaggtt tttctgtgcc tgagatcatg cgagcaacct 960

ccataagatc agctaggcga tccacgcgat tgtgctgggc atgccagcgg tacgcggtgg 1020

gatcgtcgga gacgtgcagt ggccaccggc tcagcctatg tgaaaaagcc tggtcagcgc 1080

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tgcctgctgc ggcatacacc ggatcaatga gccagatgag ctggcatttc ccgctcagtg 1200

gattcacgcc gatccaagct ggcgcttttt ccaggcgtgc ccagcgctcc aaaatcgcgt 1260

agacctcggg gtttacgtgc tcgattttcc cgccggcctg gtggctcggc acatcaatgt 1320

ccaggacaag cacggctgcg tgctgcgcgt gcgtcagagc aacatactgg caccgggcaa 1380

gcgattttga accaactcgg tataacttcg gctgtgtttc tcccgtgtcc gggtctttga 1440

tccaagcgct ggcgaagtcg cgggtcttgc tgccctggaa attttctctg cccaggtgag 1500

cgaggaattc gcggcggtct tcgctcgtcc agccacgtga tcgcagcgcg agctcgggat 1560

gggtgtcgaa cagatcagcg gaaaatttcc aggccggtgt gtcaatgtct cgtgaatccg 1620

ctagagtcat ttttgagcgc tttctcccag gtttggactg ggggttagcc gacgccctgt 1680

gagttaccgc tcacggggcg ttcaacattt ttcaggtatt cgtgcagctt atcgcttctt 1740

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cgctgacacg tcctgggcgg ccacggccac acgaaacgcg gcatttacga tgtttgtcat 1860

gcctgcgggc accgcgccac gatcgcggat aattctcgct gccgcttcca gctctgtgac 1920

gaccatggcc aaaatttcgc tcgggggacg cacttccagc gccatttgcg acctagccgc 1980

ctccagctcc tcggcgtggc gtttgttggc gcgctcgcgg ctggctgcgg cacgacacgc 2040

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gccccccctc gaggtcgacg gtacctctat ctggtgccct aaacggggga atattaacgg 3000

gcccagggtg gtcgcacctt ggttggtagg agtagcatgg gatcctctag aggcccagcc 3060

ggccattata attaggcctc gggggccgcg gccgctgcct ggcggcagta gcgcggtggt 3120

cccacctgac cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg 3180

gtctccccat gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga 3240

aagactgggc ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa 3300

atccgccggg agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac 3360

gcccgccata aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt 3420

tgccaccgcg gtggagctcc aattcgccct atagtgagtc gtattacgcg cggtgaccac 3480

catttgcccc atatcaccgt cggtactgat cccgtcgtca ataaaccgaa ccgctacacc 3540

ctgagcatca aactctttta tcagttggat catgtcggcg gtgtcgcggc caagacggtc 3600

gagcttcttc accagaatga catcaccttc ctccaccttc atcctcagca aatccagccc 3660

ttcccgatct gttgaactgc cggatgcctt gtcggtaaag atgcggttag cttttacccc 3720

tgcatctttg agcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg ttgctgactc ataccaggcc 3780

tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg agggagccac ggttgatgag agctttgttg 3840

taggtggacc agttggtgat tttgaacttt tgctttgcca cggaacggtc tgcgttgtcg 3900

ggaagatgcg tgatctgatc cttcaactca gcaaaagttc gatttattca acaaagccgc 3960

cgtcccgtca agtcagcgta atgctctgcc agtgttacaa ccattcaaat atgtatccgc 4020

tgagcaataa ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttgct 4080

gaaacctcag gcatttgaga agcacacggt cacactgctt ccggtagtca ataaaccggt 4140

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atcgtggccg gatcttgcgg cccctcggct tgaacgaatt gttagacatt atttgccgac 4260

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ggccaagcga tcttcttctt gtccaagata agcctgtcta gcttcaagta tgacgggctg 4380

atactgggcc ggcaggcgct ccattgccca gtcggcagcg acatccttcg gcgcgatttt 4440

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acctgcaaga atgtcattgc gctgccattc tccaaattgc agttcgcgct tagctggata 4740

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catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aatagctagc tcactcggtc ggagtgtata 5160

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ttccgtggca aagcaaaagt tcaaaatcac caactggtcc acctacaaca aagctctcat 5280

caaccgtggc tccctcactt tctggctgga tgatggggcg attcaggcct ggtatgagtc 5340

agcaacacct tcttcacgag gcagacctca gcgctagcgg agtgtatact ggcttactat 5400

gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa aaggctgcac 5460

cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc actgactcgc 5520

tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc ggagatttcc 5580

tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa agccgttttt 5640

ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc agtggtggcg 5700

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc tcgtgcgctc 5760

tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc gtttgtctca 5820

ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac tgtatgcacg 5880

aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 5940

cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt agaggagtta 6000

gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg tgactgcgct 6060

cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt cgaaaaaccg 6120

ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc aaaacgatct 6180

caagaagatc atcttattaa ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 6240

attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 6300

agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 6360

atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 6420

cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 6480

ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccg 6538

<210> 55

<211> 2856

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> pUC19-sgRNA

<400> 55

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

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accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

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actcgagcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc ctttcgtttt 540

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cctttctgcg tttataaagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 660

gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 720

gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 780

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tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 1320

gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 1380

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gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 1740

aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 1800

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cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 1920

ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 1980

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 2040

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 2100

ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 2160

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 2220

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 2280

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 2340

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 2400

gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 2460

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 2520

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 2580

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 2640

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 2700

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 2760

gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc atgacattaa 2820

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<210> 56

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl0049

<400> 56

atgactatta atgtctccga actacttgcc aaagtcccca cgggtctact gattggtgat 60

tcctgggtgg aagcatccga cggcggtact ttcgatgtgg aaaacccagc gacgggtgaa 120

acaatcgcaa cgctcgcgtc tgctacttcc gaggatgcac tggctgctct tgatgctgca 180

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cgcggttttg agctcgtagc agaacgtgca gaagagttcg ccaccctcat gaccttggaa 300

atgggcaagc ctttggctga agctcgcggc gaagtcacct acggcaacga attcctgcgc 360

tggttctctg aggaagcagt tcgtctgtat ggccgttacg gaaccacacc agaaggcaac 420

ttgcggatgc tgaccgccct caagccagtt ggcccgtgcc tcctgatcac cccatggaac 480

ttcccactag caatggctac ccgcaaggtc gcacctgcga tcgctgcagg ttgtgtcatg 540

gtgctcaagc cagctcgact taccccgctg acctcccagt attttgctca gaccatgctt 600

gatgccggtc ttccagcagg tgtcctcaat gtggtctccg gtgcttccgc ctctgcgatt 660

tccaacccga ttatggaaga cgatcgcctt cgtaaagtct ccttcaccgg ctccacccca 720

gttggccagc agctgctcaa aaaggctgcc gataaagttc tgcgcacctc catggaactt 780

ggtggcaacg cacctttcat tgtcttcgag gacgccgacc tagatctcgc gatcgaaggt 840

gccatgggtg ccaaaatgcg caacatcggc gaagcttgca ccgcagccaa ccgtttctta 900

gtccacgaat ccgtcgccga tgaattcggc cgtcgcttcg ctgcccgcct tgaagagcaa 960

gtcctaggca acggcctcga cgaaggcgtc accgtgggcc ccctggttga ggaaaaagca 1020

cgagacagcg ttgcatcgct tgtcgacgcc gccgtcgccg aaggtgccac cgtcctcacc 1080

ggcggcaagg ccggcacagg tgcaggctac ttctacgaac caacggtgct cacgggagtt 1140

tcaacagatg cggctatcct gaacgaagag atcttcggtc ccgtcgcacc gatcgtcacc 1200

ttccaaaccg aggaagaagc cctgcgtcta gccaactcca ccgaatacgg actggcctcc 1260

tatgtgttca cccaggacac ctcacgtatt ttccgcgtct ccgatggtct cgagttcggc 1320

ctagtgggcg tcaattccgg tgtcatctct aacgctgctg caccttttgg tggcgtaaaa 1380

caatccggaa tgggccgcga aggtggtctc gaaggaatcg aggagtacac ctccgtgcag 1440

tacatcggta tccgggatcc ttacgccggc tag 1473

<210> 57

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl0157

<400> 57

atgtctgaac cacaaaccat ctcgcactgg attgacggcg cgatttcccc atccacttcc 60

ggcaagaccg ctcctgtcta caatcctgca actggccagg tcaccgccaa tgttgcgctg 120

gctagccagg aagagatcga tgccaccatc gcttctgcca ccaaggctgc taagacgtgg 180

ggcaacctgt ctatcgctaa gcgccaagct gtgcttttca acttccgtga gctgctgaat 240

gctcgcaagg gtgagctggc ggagatcatc actgcagagc acggcaaggt cttgtccgat 300

gccatgggtg aaatcctgcg cggccaggaa gtcgtggagc ttgctaccgg tttcccacac 360

ctgcttaaag gtgcgttcaa cgagaacgtc tccaccggca ttgatgtgta ttccttgaag 420

cagccactgg gtgttgtcgg tatcatcagc ccgttcaact tccctgcgat ggtgccgatg 480

tggtttttcc caatcgcaat cgctgcaggc aacgcagtta ttttgaagcc ttcagagaag 540

gatccttcgg cagcgctgtg gatggctcag atctggaagg aagctggtct tccagacggc 600

gtattcaacg tgctccaggg cgacaagctg gctgttgatg gtttgctgaa cagccctgat 660

gtctctgcga tttccttcgt gggttccacc ccaatcgcaa agtacatcta cgagacttcc 720

gcgaagaacg gcaagcgcgt ccaggcgttg ggcggcgcga agaaccacat gctggtgctg 780

ccagatgctg atctggatct ggttgccgat caggcaatca acgcaggtta cggcgctgcc 840

ggtgagcgtt gcatggctgt ttctgtggtc ttggctattg aatctgttgc cgacgagctc 900

attgagaaga tcaaggagcg catcgacacc ctgcgcatcg gcaacggtgc cggcgacgag 960

cagggcgagc cgcacctggg cccactaatc accgacgtcc accgcgacaa ggtcgcttct 1020

tatgtcgaca tcgctgaggc cgacggcgcc aagatcatcg tggacgggcg taactgcgcc 1080

gtagacgggc acgaggaggg cttcttcttc ggccctacgc ttatcgacga catcccactc 1140

acgtcccgcg cctacaccga agaaatcttc ggcccggtcc tctctgtcgt tcgtgtcgca 1200

tccttcgacg aggcaattga gctgatcaac tccggtgaat tcggcaacgg aaccgcaatc 1260

ttcaccaacg atggtggagc ggcacgccgc ttccagcatg agatcgaagt gggcatgatc 1320

ggcatcaacg taccaatccc agtgcctgtt gcgtaccact ccttcggtgg ttggaagaac 1380

tccctcttcg gtgacgccaa ggcatatggc actcaaggtt ttgatttctt caccagggaa 1440

aaggcgatca ccagccgttg gctcgaccca gcaacccacg gtggcattaa cctcggtttc 1500

ccacagaacg attaa 1515

<210> 58

<211> 1035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl0248

<400> 58

atgaccacca tcgcagttgt tggtgcaacc ggccaggtcg gccaggttat gcgcaccctt 60

ttggaagagc gcaatttccc agctgacact gttcgtttct ttgcttcccc acgttccgca 120

ggccgtaaga ttgaattccg tggcacggaa atcgaggtag aagacattac tcaggcaacc 180

gaggagtccc tcaaggacat cgacgttgcg ttgttctccg ctggaggcac cgcttccaag 240

cagtacgctc cactgttcgc tgctgcaggc gcgactgttg tggataactc ttctgcttgg 300

cgcaaggacg acgaggttcc actaatcgtc tctgaggtga acccttccga caaggattcc 360

ctggtcaagg gcattattgc gaaccctaac tgcaccacca tggctgcgat gccagtgctg 420

aagccacttc acgatgccgc tggtcttgta aagcttcacg tttcctctta ccaggctgtt 480

tccggttctg gtcttgcagg tgtggaaacc ttggcaaagc aggttgctgc agttggagac 540

cacaacgttg agttcgtcca tgatggacag gctgctgacg caggcgatgt cggaccttat 600

gtttcaccaa tcgcttacaa cgtgctgcca ttcgccggaa acctcgtcga tgacggcacc 660

ttcgaaaccg atgaagagca gaagctgcgc aacgaatccc gcaagattct cggtctccca 720

gacctcaagg tctcaggcac ctgcgtccgc gtgccggttt tcaccggcca cacgctgacc 780

attcacgccg aattcgacaa ggcaatcacc gtggaccagg cgcaggagat cttgggtgcc 840

gcttcaggcg tcaagcttgt cgacgtccca accccacttg cagctgccgg cattgacgaa 900

tccctcgttg gacgcatccg tcaggactcc actgtcgacg ataaccgcgg tctggttctc 960

gtcgtatctg gcgacaacct ccgcaagggt gctgcgctaa acaccatcca gatcgctgag 1020

ctgctggtta agtaa 1035

<210> 59

<211> 1563

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl0437

<400> 59

atgatcaccg caaccgcact gcatgggtgt tcactgattg atggcgagtg ggtcgctgga 60

aaaaatggtg agattacagg attcgatccg cgcaccaatg cgagtctgaa cccttcctac 120

tctttagcaa acagcgcaca gctgcgcgcc gccacaacat cggcgaagcg agcttttgaa 180

agctaccgac tcactactcc agaggttaga gcagatttcc tggattccat cgctgacaac 240

atcgatgcgc tatccggcga gatcgtgcaa cgggcgagcc tggagacagg tttgggaact 300

acccgactca caggcgaagt agcccgcacc agcaaccagc tccgcctgtt tgcagaaacc 360

gtgagaagcg gacagttcca ccgagtacgc attgaacgag gaccgcggat tgatcttcgc 420

cagcgtcagg ttccgttggg accagtcgcg gtattcgggg caagcaactt ccccgtcgct 480

ttctctactg ctggtggcga tacagcatca gcgttggctg caggctgccc tgtggttttt 540

aaggcgcata atgcgcaccc tggaacagct gagctcgtcg ggcaagcggt gcggggagcc 600

gtcgaaaagc atgagtttga tgctggtgtg tttaaccttg tctacggccg tggcgtggaa 660

attggccagg agctggctgc ggatccgaat atcacggcaa tcggttttac cggttcacgc 720

cagggtggtt tggcactgtc acagactgcg tttagccgcc cagttcccgt tccagtcttt 780

gcagaaatga gtgccaccaa ccctgtgttc gtcttccccg gcgcgctggc ggatttggat 840

gcatcgagtt ccttggctga ggcgtttacc gcttccgtca ccggcagttc cgggcaattg 900

tgcaccaagc ctggcctcgt tttcatcccg cgcggtgttg ttggtgatgc ttttgtggcg 960

ctcgtagcag ccaaatttaa agaaaccacg ggtcaaacga tgctcacgca aggcatcgct 1020

caggcatggc agcgcggagt cgacaacctt gcagcacagc caagtgtaaa aatcctcgcc 1080

caaggcaccc ccggagatgg agagaacgcg ccgggcccgg tggtgtttga aagtgatgtg 1140

caggcgttgc taaataatgt ggtgttgcag gaagaaatct tcggtgcggc atcgctggtg 1200

gtgcgttatg attccccgga tcaactccac caagtagcca attcactcga gggacaatta 1260

acagccacga tccacgcatc ccaggatgat ttccaggaag tctcgaaact tatccccctc 1320

ttggaggatc tcgcgggccg tgttctttac ggcggctggc caacgggtgt ggaagttggg 1380

cacacggtta tccatggagg cccttatccg gcgacctcaa atgcgcagtc gacaagtgtt 1440

ggaaccctgg caatcgagag atttatgcgc ccggtttctt atcaaacttt cccggctgag 1500

ctgcttccag atccagtttc tgaggcgaat aaatgggctg tacctcggga aatagaccgt 1560

taa 1563

<210> 60

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl0463

<400> 60

gtgtctttga ccttcccagt aatcaacccc agcgatggct ccaccatcac cgagctagaa 60

aaccacgatt ccacccagtg gatgtccgcg ctctctgatg cagttgcagc tggtccttca 120

tgggctgcga aaactccccg cgaaagatcc gtggtactca ccgcaatctt cgaagcactg 180

accgaacgcg cccaagaact tgcagagatc atccacctgg aagctggaaa atccgttgca 240

gaagctcttg gtgaagtcgc ttatggtgca gaatacttcc gttggtttgc ggaagaagca 300

gtgcgcctgc ccggccgcta cggacagtca ccttccggaa tcggtcacat cgccgtcacc 360

cgcgcacccg tgggaccagt gctggcgatc accccatgga atttccccat cgccatggcc 420

acccgcaaaa tcgccccagc cctggccgct ggttgccccg tgttggtgaa acctgcttcc 480

gaaaccccac tgaccatggt caaagtgggg gagatcatcg cctccgtctt tgataccttt 540

aatatcccgc agggcttggt ctcaatcatc accaccactc gagatgcaga gctatcggca 600

gaactcatgg ctgatcctcg cttggctaaa gtcaccttca ctggatcaac caacgtggga 660

cgcatcctgg tccgccaatc cgcggaccga ctgctgcgca cctccatgga actcggcgga 720

aatgcagctt ttgttatcga cgaagccgca gacctcgacg aagccgtatc cggtgccatc 780

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accgacggcg cccgcctcat catcggtggg gaggtccccg acggctccgg cttcttctat 1020

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gcagcacctt ttggcggcat cggacaatcc ggcttcggca gagaaggcgg aaccgaagga 1320

atcgaagaat atctctccgt gcgttacctc gctttgccgt ga 1362

<210> 61

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl0521

<400> 61

ttggaaagtt ccaattctca ggcacaggga cgtgcggaca gaattctcga ttcagccttg 60

aaagaaggcg cttcaatagt tgttgatggc cgtacagctc gagaatttca gatggacatc 120

gaagtcggaa tggttggcat taacgtgcca atcccagtcc caattggcgc tttctcattt 180

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ttctataccc gaagcaaggt ggttaccact cgctggcctc ttccaaatga atcacagatt 300

gagcttggct tccccaccca ctaa 324

<210> 62

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl0523

<400> 62

atgaatgctg caaccaggcg tgcttctctg caactcccct atacccatgt cgatgatttc 60

tacatcaacg gttcctgggt taaagcagaa ggaacacaac gcaaccccgt agttgatcct 120

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gtgggagctg cacgtacagc gctaaagtcg tggagtgcac ttacaggtgc ggaacgaaca 240

ggctacctcc tgaaaatcgc gacggaaatt gaatcccgtt ctgaagctct agcacttact 300

aatacccgcg aaaatggttc ccccatttcc gagacccgtg gagctgcgtc caatgcagca 360

ggaattttcc gttactttgc cactctcgcg ccttggttag acggcgaaga catccgccca 420

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cggattattg cccctagctc acgctatgcg gaagtcgtac aaacagtggc aagcactatc 960

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gtggttgcag gtggaacccg gtcaatcagc ctttctgaag gtttagaatc aggcgagttt 1140

atccaaccaa ccgtgtttgc cgatgtcacc cccgacatgc ggatatcacg cgaagaaatc 1200

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gcactagcca acaacacgaa attcggtctc ggtggcttgg tatttggtgc ggatgaggaa 1320

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atcgaaggcc tcagtgctta cctgacatac aagagtattc accgaaccat ttag 1494

<210> 63

<211> 1443

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl0900

<400> 63

atgacgcaca accacaagga ctggaacgat cgcattgcag ttgcggagga aatggtgccg 60

ttgatcgggc gcctgcaccg caacaacaac gtggtggttt ccgtattcgg tcgtctcctt 120

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aacccaactg atatcgtgct gtacggtttc ggccgcatcg gtcgcctgct ggcccgcatc 420

ctggtttccc gcgaggcact gtatgacggt gctcgtctgc gcgccatcgt ggtccgcaaa 480

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aatgacgccg tcgtggtaga caacaccggc cgctggcgtg accgcgaagg cctgtcccag 720

cacctcaagt ccaagggcgt tgccaaggtt gtactcaccg cgccgggcaa gggcgatctg 780

aagaacatcg tgtacggcat caaccacacc gacatcaccg cagatgatca gatcgtttcc 840

gcagcatcat gcaccaccaa tgccattacc ccagtgctca aggtgatcaa tgatcgctac 900

ggcgtggaat tcggccacgt agaaaccgtt cactccttca ccaatgacca gaacctgatc 960

gacaacttcc acaagggttc tcgccgtggt cgcgcagcag gtctgaatat ggttctcacc 1020

gaaaccggcg ctgcaaaggc tgtatccaag gcgcttccag agctggaagg caagctcacc 1080

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gaggagatcg ccggcgtgcg tcctcgcgtg tacccggagc gcaggcagcc agccgtacta 1440

tag 1443

<210> 64

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl1526

<400> 64

atgaccattc gtgttggtat taacggattt ggccgtatcg gacgtaactt cttccgcgca 60

gttctggagc gcagcgacga tctcgaggta gttgcagtca acgacctcac cgacaacaag 120

accctttcca cccttctcaa gttcgactcc atcatgggcc gccttggcca ggaagttgaa 180

tacgacgatg actccatcac cgttggtggc aagcgcatcg ctgtttacgc agagcgcgat 240

ccaaagaacc tggactgggc tgcacacaac gttgacatcg tgatcgagtc caccggcttc 300

ttcaccgatg caaacgcggc taaggctcac atcgaagcag gtgccaagaa ggtcatcatc 360

tccgcaccag caagcaacga agacgcaacc ttcgtttacg gtgtgaacca cgagtcctac 420

gatcctgaga accacaacgt gatctccggc gcatcttgca ccaccaactg cctcgcacca 480

atggcaaagg tcctaaacga caagttcggc atcgagaacg gcctcatgac caccgttcac 540

gcatacactg gcgaccagcg cctgcacgat gcacctcacc gcgacctgcg tcgtgcacgt 600

gcagcagcag tcaacatcgt tcctacctcc accggtgcag ctaaggctgt tgctctggtt 660

ctcccagagc tcaagggcaa gcttgacggc tacgcacttc gcgttccagt tatcaccggt 720

tccgcaaccg acctgacctt caacaccaag tctgaggtca ccgttgagtc catcaacgct 780

gcaatcaagg aagctgcagt cggcgagttc ggcgagaccc tggcttactc cgaagagcca 840

ctggtttcca ccgacatcgt ccacgattcc cacggctcca tcttcgacgc tggcctgacc 900

aaggtctccg gcaacaccgt caaggttgtt tcctggtacg acaacgagtg gggctacacc 960

tgccagctcc tgcgtctgac cgagctcgta gcttccaagc tctaa 1005

<210> 65

<211> 1299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl2272

<400> 65

atgagttcaa cgaccctaac tgatgaccaa attcgcgaca atgagcggac cgaagttcta 60

gctaaagcaa ctgcagctaa gaacatcgtc ccggatattg cagtgttggg caccggaccg 120

aagaacgcaa tcctgcgtgc ggcggcagat gaactcgttg cacgcagcgc agaaatcatc 180

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gatcgccttg cccttgatga atctcgcatt gagggcatcg ctggcggttt gcgccaggtt 300

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aacgtcaccg tcgacgcctt cggcctggca ctcaagtccg gaaacgtagc tttgctgcgc 480

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ggactaatca acgcagtggt caccggtgcg accgtgccca ccattgaaac cggcaccggc 720

aactgccact tctacatcga tgccgaagcc aagcttgatc aggcaatcgc catggtcatc 780

aacggcaaga cccgccgctg cagcgtgtgc aacgctactg aaaccgcgct tctcgacgcc 840

gccctcagcg actcagacaa gcttgcagtc gtccaggcgc tccaggaagc aggagtcaca 900

attcatggac gggtggccga attggaagca ttcggtgcaa ccgacgtggt ggaagcaact 960

gaaactgact gggattctga gtacctgtcc ttcgatatcg ctgtcgctgt ggttgacggt 1020

gtggatggag ctctggcaca catcgctaag tacagcacca agcacaccga agcgatcgcc 1080

acccaaaaca ttgaaaccgc tcagcgcttt gcagatcgcg tcgatgcagc agcggtgatg 1140

ataaacgcat ccaccgccta caccgatggg gagcagtacg gcatgggcgc ggagatcggc 1200

atttccaccc agaaactgca tgcacgtgga ccaatggccc tgccagagct gacctccacc 1260

aagtggattc tgcagggcac aggacaaatt aggccttaa 1299

<210> 66

<211> 1455

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl2578

<400> 66

gtgactgcaa catttgctgg aatcgacgcc accaaacacc tcatcggagg tcagtgggtg 60

gagggaaact cggatcgaat ttccaccaat atcaatcctt acgacgattc cgtaatcgcc 120

gaaagcaaac aagcttccat tgctgatgtt gatgccgcgt atgaagccgc gaagaaggcc 180

caggctgagt gggcagctac gcccgctgcg gaacgatctg ccatcatcta ccgtgcggct 240

gaacttcttg aagagcaccg ggaggaaatc gtggaatggc tgatcaagga atccggctcg 300

acgcgttcca aggctaattt ggaaatcact ttggcaggaa acatcactaa agaatcggct 360

tcattccctg gtcgtgtgca tggtcgaatt tctccttcga atactccggg caaagaaaac 420

cgtgtgtacc gcgtagccaa gggcgttgtc ggagtgatta gtccatggaa tttcccactg 480

aacctctcga tccgctcggt tgctccggca ctagccgtgg gcaacgccgt agtgattaag 540

cctgcgagtg ataccccagt tactggtggt gtaattcctg cacgaatctt tgaggaggcc 600

ggagttcctg caggcgtgat cagcacggtt gcgggcgcag gatctgaaat cggtgatcac 660

tttgtcaccc acgccgtgcc aaagctgatt tctttcaccg gttcaacccc agtcggtcgt 720

cgtgtcggtg agctggcaat taatggtgga ccaatgaaaa ctgttgcact agagctcggt 780

ggcaacgcgc cgttcgttgt gcttgccgac gccgacatcg acgccgctgc ccaggctgcc 840

gcagttggcg ctttcctaca ccagggacag atttgtatgt caatcaaccg agtcattgtt 900

gatgctgcag ttcatgatga attcctagag aagttcgttg aagcagtgaa gaacattcca 960

accggcgatc caagcgcaga aggaaccctt gttggacctg tcattaatga cagtcagctc 1020

agtggtttga aggaaaagat cgagttggcc aaaaaggaag gcgcaaccgt ccaggttgaa 1080

gggccaattg aaggccgact ggttcatccg catgtgttct ctgatgtcac ctctgacatg 1140

gaaatcgctc gtgaggaaat cttcggacct ctcatcagcg tgctgaaggc cgatgatgag 1200

gcacacgcag cagagctggc caatgcttcc gactttggtt tgagcgcggc agtgtggtcg 1260

aaggatattg atcgtgcagc ccagtttgct ctgcagattg attccggcat ggttcacatc 1320

aatgacctca ccgtcaacga tgaaccacac gtgatgttcg gtggttcaaa gaactctggc 1380

ctcggccgct tcaacggcga ttgggcgatc gaggagttca ccacagatcg atggatcggc 1440

atcaagcgca gctaa 1455

<210> 67

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl2619

<400> 67

atgatcaaac gtcttccttt aggtccgctg cctaaagaac ttcatcagac tctgcttgat 60

ctgaccgcaa atgcccaaga tgcggcgaaa gtggaggtta tagcgccatt tactggcgag 120

accctcggat ttgtttttga tggtgatgag caagacgtcg agcatgcttt tgcactttca 180

agggcagccc agaaaaagtg ggtgcacacc acggcagtgg aacggaagaa gatcttcctg 240

aagtttcatg atctggtatt gaaaaaccgt gagctgctca tggacatcgt gcagttggaa 300

acaggcaaaa atcgagcatc ggctgccgat gaggtgttgg acgttgcgat caccacccgc 360

ttctacgcaa acaatgcagg aaagttttta aatgacaaga aacgccccgg cgcgcttccg 420

atcatcacga aaaacacaca acagtatgtg cccaagggag tggtcgggca gatcacgccg 480

tggaattacc ctttaacttt gggagtatct gatgctgttc cggcgctgct ggcaggaaac 540

gcagtggtgg ctaaacctga cctcgcgaca cctttctcct gcttgatcat ggtgcacctg 600

ctcattgaag ccggtctgcc gcgtgatttg atgcaggttg tcaccggccc tggcgatatt 660

gttggcggtg cgattgcagc tcagtgtgat ttcctcatgt tcactggatc cacggccacg 720

ggccggatct tgggtcggac aatgggtgag cgtttggtgg gtttctctgc ggaattaggc 780

ggaaagaacc ctcttattgt ggccaaggat gcagatctgg acaaggtgga agctgagctt 840

ccgcaggcgt gtttttccaa ctcggggcaa ttgtgtgtct ccactgaacg tatttatgtc 900

gaggaagacg tgtacgagga ggtgattgca cggtttagca aggcggcgaa agccatgtcc 960

attggtgccg gatttgagtg gaaatatgag atgggttcgt tgatcaatca ggcgcagctg 1020

gatcgggtga gcacctttgt tgatcaggct aaagctgcgg gcgccacggt gctgtgcggt 1080

ggcaagtcac gccctgatat tggtcccttc ttctatgagc ccacggtatt ggcggatgtc 1140

ccagagggca ccccactgct cacggaggaa gtcttcgggc cggtggtgtt catcgaaaag 1200

gtagccacac tggaagaagc cgtcgataag gcaaatggca cgccctacgg cctgaatgcg 1260

tccgtctttg ggtcgtcgga aaccggcaat cttgttgcag gccagctgga agctggcggt 1320

atcggtatta atgatggcta cgccgcgacg tgggcgagcg tgtccacgcc tctgggtggc 1380

atgaagcagt cggggctggg gcaccgccat ggtgcggagg gaattacaaa atatgcggag 1440

atccgaaaca tcgcggagca gcgctggatg tctatgcgtg ggccggccaa aatgccgcga 1500

aaggtgtact cagacaccgt ggccacagcg ctaaagctgg gcaaaatctt taaagttttg 1560

ccgtag 1566

<210> 68

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> NCgl2698

<400> 68

atgactgtct acgcaaatcc aggaaccgaa ggctcgatcg ttaactatga aaagcgctac 60

gagaactaca ttggtggcaa gtgggttcca ccggtagagg gccagtacct tgagaacatt 120

tcacctgtca ctggtgaagt tttctgtgag gtcgcacgtg gcaccgcagc ggacgtggag 180

cttgcactgg atgctgcaca tgcagccgct gatgcgtggg gcaagacttc tgtcgctgaa 240

cgtgctctga tcctgcaccg cattgcggac cgcatggaag agcacctgga agaaatcgca 300

gttgcagaaa cctgggagaa cggcaaggca gtccgtgaga ctcttgctgc agatatccca 360

ctggcaatcg accacttccg ctactttgct ggcgcgatcc gtgctcagga agatcgttcc 420

tcacagatcg accacaacac tgttgcttac cacttcaacg agccaatcgg tgttgttggt 480

cagatcattc cttggaactt cccaatcctc atggctacct ggaagctcgc accggcactt 540

gctgcaggta acgcgatcgt catgaagcca gctgagcaga ccccagcatc cattttgtat 600

ctgattaaca tcatcggcga tctcatccca gagggcgtcc tcaacatcgt caacggactc 660

ggcggtgaag caggcgctgc actgtccggc tctaatcgga ttggcaagat tgctttcacc 720

ggttccaccg aggtcggcaa gctgatcaac cgcgctgcat ccgacaagat cattcctgtc 780

accctggagc tcggcggtaa gtccccatcc atcttcttct ccgatgttct gtcacaggat 840

gacgccttcg cagagaaggc agttgaaggc ttcgcgatgt tcgccctcaa tcagggtgaa 900

gtttgtacct gtccttcccg tgcacttgtt catgagtcca tcgctgatga attcctcgag 960

cttggcgtga agcgagttca gaacatcaag ctgggtaacc cacttgatac tgaaaccatg 1020

atgggtgctc aggcgtccca ggagcagatg gacaagatct cctcctacct gaagatcggc 1080

ccagaagaag gcgctcaaac cctcactggt ggcaaggtca acaaggttga tggcatggag 1140

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