膜蛋白YcbM的表达载体及其表达纯化方法

摘要

本发明公开了一种膜蛋白YcbM的表达载体及其表达纯化方法。所述的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含了NcoI序列CCATGG、SEQ ID NO.1所示的大肠杆菌膜蛋白YcbM序列以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。本发明利用分子刚性的荧光蛋白作为筛选标记以及表达进程指示剂，该荧光蛋白由于具有分子水平刚性结构可以迅速折叠，能够帮助氮端膜蛋白YcbM稳定其构象。本发明构建的表达载体能够实现膜蛋白YcbM的大量表达，可用于后续新型抗生素的高通量筛选。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质生产技术领域，涉及一种脂肪族磺酸盐转运蛋白(YcbM)的表达载体及其表达纯化方法。

背景技术

细胞膜是细胞内部与外部的边界，担负着信息传递、能量传输和物质交换的重要功能，是最重要的细胞器。药物作用的靶点经常位于细胞膜上。目前已知50％以上药物作用的靶标是膜蛋白。因此，对于膜蛋白的研究具有非常重要的意义。

然而，膜蛋白由于其天然状态的含量稀少，具有多次跨膜结构，因而折叠容易出现错误，结构复杂，所以膜蛋白的大规模制备一直是难点和热点。在国内，基本没有生物公司可以做到12次以上的跨膜蛋白的表达，只有一两家公司可以做到四次跨膜蛋白的表达。

大肠杆菌作为常用的表达宿主一直是蛋白表达的首选，然而，即使是大肠杆菌自身蛋白都很难在大肠杆菌中大量表达。目前，由于抗生素的滥用，导致在今后的50年内面临无法对抗耐药菌的窘境。因此通过大量表达膜蛋白作为抗生素的作用靶点，为后续非变性质谱的高通量筛选提供先导性技术支持。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大量表达膜蛋白YcbM的表达载体及其表达纯化方法。本发明针对大肠杆菌膜蛋白YcbM，建立高效的融合表达系统，可以用于后续进一步的蛋白质非变性实时监控质谱研究。

实现本发明目的的技术方案如下：

本发明的膜蛋白YcbM的表达载体，以本实验室获得的用于莱茵衣藻蛋白质定位的超折叠维纳斯荧光蛋白(中国专利申请201910347575.3)作为起始蛋白质骨架，通过对序列表达所用的密码子组成进行进一步优化，获得分子刚性的荧光蛋白表达标签并且适用于大肠杆菌膜蛋白的大规模表达。本发明利用分子刚性的荧光蛋白作为筛选标记以及表达进程指示剂，并且该荧光蛋白由于具有分子水平刚性结构可以迅速折叠，并且帮助氮端膜蛋白YcbM稳定其构象。

本发明的膜蛋白YcbM的表达载体为表达质粒pLy077-YcbM(SEQ ID NO.2)，包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含NcoI序列CCATGG、大肠杆菌膜蛋白YcbM序列(SEQ ID NO.1)以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。

本发明还提供上述膜蛋白YcbM的表达载体的表达纯化方法，具体步骤如下：

步骤1，大肠杆菌膜蛋白YcbM表达载体突变株的制备：将膜蛋白YcbM的表达载体即表达质粒pLy077-YcbM转化到宿主大肠杆菌中，并涂布于含抗生素以及0.1mM IPTG琼脂平板，挑选黄绿色的阳性单克隆菌进行扩大培养和诱导表达；

步骤2，将挑选的突变菌株转化株接种至培养基中进行扩大培养，并用1mM IPTG大规模诱导表达膜蛋白YcbM。

优选地，步骤1中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21(DE3)。

优选地，步骤2中，所述的培养基为LB培养基或TB培养基。

本发明通过全合成表达载体，将目标基因和密码子优化过的具有分子刚性的超折叠维纳斯荧光蛋白引入表达载体中，并通过在核酸编码一级序列进行优化，大大提高了目标基因的转录和翻译效率。此外，通过控制羧基端刚性荧光蛋白的折叠速度，帮助目标膜蛋白正确折叠并插入膜中。刚性荧光蛋白不仅可以用于监测蛋白质的实时表达进程，还可以用于保护蛋白的羧基端，从而使得目标蛋白得到富集。本发明通过对大肠杆菌膜蛋白的大量表达，后期纯化以便实现对于新型抗生素的高通量筛选，具有重要的商业化前景。

附图说明

图1为YcbM蛋白编码序列的PCR琼脂糖凝胶电泳结果图。

图2为pLy077-YcbM质粒的结构示意图。

图3为pLy077-YcbM菌落PCR验证结果图。

图4为质粒pLy077-YcbM的NcoIⅠ和BamHIⅠ单酶切双酶切琼脂糖凝胶电泳结果图。

图5为转化琼脂平板上的菌落荧光图。

图6为以大肠杆菌BL21为表达菌株，在TB培养基中诱导后的荧光成像以及诱导前后全菌蛋白对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例中所用材料如下：

1.细胞来源

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)，C41(DE3)，C43(DE3)菌株购自武汉灵淼生物公司。

2.质粒来源

pLy077质粒和YcbM编码序列由上海生工生物有限公司合成，pLy077质粒包含：噬菌体T7启动子；大肠杆菌核糖体结合位点，其中包含了NcoI序列CCATGG以及BamHI位点GGATCC；烟草蚀纹病毒半胱氨酸蛋白酶切割位点GAGAACCTGTACTTCCAATCC；NdeI酶切位点CATATG；超折叠维纳斯荧光蛋白编码序列；XhoI酶切位点CTCGAG；6个组氨酸位点以及终止密码子TAG。pLy077质粒和YcbM编码序列见序列表。

3.引物来源

合成引物均来自北京擎科生物技术有限公司。

4.主要试剂

胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、Tris-baes均购自Sigma公司；限制性核酸内切酶、phusion酶购自Thermo Fisher公司；rTaq酶、T4连接酶购自Takara公司。质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。NTP、DEPC水、RNase inhibitor购自上海生物生工有限公司。

实施例1YcbM的基因克隆

1.YcbM的克隆

a)根据对比YcbM序列所用密码子与Kazusa在线数据库(http://www.kazusa.or.jp/codon/)下的Escherichia coli密码子使用频率，设计全新YcbM编码序列(SEQ ID NO.1)，并合成。之后通过PCR方法扩增。PCR反应体系配置如表1所示。

表1 PCR反应体系配制表

PCR结果如图1所示。目的片段长度为810bp，最佳退火温度为52℃。

b)回收目标DNA，用NcoⅠ和BamHI酶切目的片段和pLy077载体，后进行琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物；将回收的目的片段和pLy077载体片段，按摩尔比为5:1比例加入小离心管中，加入T4连接酶，在16℃下连接过夜。

c)以上连接产物取20μL用42℃热激法转化入80μL DH5α感受态细胞，加入700μLLB培养基后置于37℃摇床，在200转/分钟下培养45分钟。

d)上述菌液在4000转/分钟转速下离心1分钟后，吸去700μL上清；用移液器轻轻吹吸剩余培养基后涂布在含有氨苄青霉素的LB固体平板上，倒置于37℃培养箱中，培养12小时。

e)挑取上述平板中的单菌落，小量扩增后提取质粒，用NcoⅠ和BamHI单酶切双酶切所提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳鉴定，经测序鉴定正确，即得到膜蛋白YcbM的表达载体pLy077-YcbM，质粒的结构示意图如图2所示。图3为pLy077-YcbM菌落PCR验证结果图。图4为质粒pLy077-YcbM的NcoIⅠ和BamHIⅠ单酶切双酶切琼脂糖凝胶电泳结果图。

实施例2YcbM的表达

融合蛋白YcbM-超折叠荧光蛋白的诱导表达

将鉴定正确的pLy077-YcbM质粒转入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)以及DH5α，涂布在含有0.1mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)得到稳定转化的菌落；通过对于菌落荧光的检测，图5为转化琼脂平板上的菌落荧光图，由是否存在荧光可知菌落里是否含有重组质粒，含有重组质粒的菌落显示荧光，可以看出获得了大量表达目标蛋白的突变株。

分别接种单菌落到含有100μg/ml氨苄青霉素的LB以及TB液体培养基中，在200转/分钟、37℃下培养过夜，得到过夜菌。将过夜菌接种到750mL LB以及TB培养基中，接种比例为1:250，在230转/分钟，30℃下培养至OD

序列表

<110> 南京理工大学

<120> 膜蛋白YcbM的表达载体及其表达纯化方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggcgaccc cggtgaaaaa atggctgctg cgcgtggcgc cgtggtttct gccggtgggc 60

attgtggcgg tgtggcagct ggcgagcagc gtgggctggc tgagcacccg cattctgccg 120

agcccggaag gcgtggtgac cgcgttttgg accctgagcg cgagcggcga actgtggcag 180

catctggcga ttagcagctg gcgcgcgctg attggcttta gcattggcgg cagcctgggc 240

ctgattctgg gcctgattag cggcctgagc cgctggggcg aacgcctgct ggataccagc 300

attcagatgc tgcgcaacgt gccgcatctg gcgctgattc cgctggtgat tctgtggttt 360

ggcattgatg aaagcgcgaa aatttttctg gtggcgctgg gcaccctgtt tccgatttat 420

attaacacct ggcatggcat tcgcaacatt gatcgcggcc tggtggaaat ggcgcgcagc 480

tatggcctga gcggcattcc gctgtttatt catgtgattc tgccgggcgc gctgccgagc 540

attatggtgg gcgtgcgctt tgcgctgggc ctgatgtggc tgaccctgat tgtggcggaa 600

accattagcg cgaacagcgg cattggctat ctggcgatga acgcgcgcga atttctgcag 660

accgatgtgg tggtggtggc gattattctg tatgcgctgc tgggcaaact ggcggatgtg 720

agcgcgcagc tgctggaacg cctgtggctg cgctggaacc cggcgtatca tctgaaagaa 780

gcgaccgtg 789

<210> 2

<211> 6784

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60

cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120

ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180

gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240

acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300

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ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420

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tcatatcagg attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa 660

actcaccgag gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc 720

gtccaacatc aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga 780

aatcaccatg agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc 840

agacttgttc aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac 900

cgttattcat tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac 960

aattacaaac aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat 1020

tttcacctga atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgttttcccg gggatcgcag 1080

tggtgagtaa ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca 1140

taaattccgt cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac 1200

ctttgccatg tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg 1260

tcgcacctga ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca 1320

tgttggaatt taatcgcggc ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcataacac 1380

cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt tcatgaccaa aatcccttaa 1440

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1500

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1560

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1620

agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1680

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1740

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1800

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1860

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1920

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1980

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 2040

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 2100

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2160

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2220

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg 2280

tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc actctcagta 2340

caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg 2400

ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 2460

gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 2520

gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat cagcgtggtc 2580

gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga gtttctccag 2640

aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt tttcctgttt 2700

ggtcactgat gcctccgtgt aagggggatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa 2760

acgagagagg atgctcacga tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg 2820

ttgtgagggt aaacaactgg cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg 2880

tcaatgccag cgcttcgtta atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc 2940

tgcgatgcag atccggaaca taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta 3000

cgaaacacgg aaaccgaaga ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca 3060

gcagtcgctt cacgttcgct cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc 3120

ccgccagcct agccgggtcc tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggggccgc 3180

catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa 3240

ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc 3300

gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac 3360

gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca 3420

ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct caagggcatc ggtcgagatc ccggtgccta 3480

atgagtgagc taacttacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 3540

cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 3600

tgggcgccag ggtggttttt cttttcacca gtgagacggg caacagctga ttgcccttca 3660

ccgcctggcc ctgagagagt tgcagcaagc ggtccacgct ggtttgcccc agcaggcgaa 3720

aatcctgttt gatggtggtt aacggcggga tataacatga gctgtcttcg gtatcgtcgt 3780

atcccactac cgagatatcc gcaccaacgc gcagcccgga ctcggtaatg gcgcgcattg 3840

cgcccagcgc catctgatcg ttggcaacca gcatcgcagt gggaacgatg ccctcattca 3900

gcatttgcat ggtttgttga aaaccggaca tggcactcca gtcgccttcc cgttccgcta 3960

tcggctgaat ttgattgcga gtgagatatt tatgccagcc agccagacgc agacgcgccg 4020

agacagaact taatgggccc gctaacagcg cgatttgctg gtgacccaat gcgaccagat 4080

gctccacgcc cagtcgcgta ccgtcttcat gggagaaaat aatactgttg atgggtgtct 4140

ggtcagagac atcaagaaat aacgccggaa cattagtgca ggcagcttcc acagcaatgg 4200

catcctggtc atccagcgga tagttaatga tcagcccact gacgcgttgc gcgagaagat 4260

tgtgcaccgc cgctttacag gcttcgacgc cgcttcgttc taccatcgac accaccacgc 4320

tggcacccag ttgatcggcg cgagatttaa tcgccgcgac aatttgcgac ggcgcgtgca 4380

gggccagact ggaggtggca acgccaatca gcaacgactg tttgcccgcc agttgttgtg 4440

ccacgcggtt gggaatgtaa ttcagctccg ccatcgccgc ttccactttt tcccgcgttt 4500

tcgcagaaac gtggctggcc tggttcacca cgcgggaaac ggtctgataa gagacaccgg 4560

catactctgc gacatcgtat aacgttactg gtttcacatt caccaccctg aattgactct 4620

cttccgggcg ctatcatgcc ataccgcgaa aggttttgcg ccattcgatg gtgtccggga 4680

tctcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag taggttgagg 4740

ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 4800

ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 4860

cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg cgccagcaac cgcacctgtg 4920

gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga tcgagatctc gatcccgcga 4980

aattaatacg actcactata ggggaattgt gagcggataa caattcccct ctagaaataa 5040

ttttgtttaa ctttaagaag gagatatacc atgggcatgg cgaccccggt gaaaaaatgg 5100

ctgctgcgcg tggcgccgtg gtttctgccg gtgggcattg tggcggtgtg gcagctggcg 5160

agcagcgtgg gctggctgag cacccgcatt ctgccgagcc cggaaggcgt ggtgaccgcg 5220

ttttggaccc tgagcgcgag cggcgaactg tggcagcatc tggcgattag cagctggcgc 5280

gcgctgattg gctttagcat tggcggcagc ctgggcctga ttctgggcct gattagcggc 5340

ctgagccgct ggggcgaacg cctgctggat accagcattc agatgctgcg caacgtgccg 5400

catctggcgc tgattccgct ggtgattctg tggtttggca ttgatgaaag cgcgaaaatt 5460

tttctggtgg cgctgggcac cctgtttccg atttatatta acacctggca tggcattcgc 5520

aacattgatc gcggcctggt ggaaatggcg cgcagctatg gcctgagcgg cattccgctg 5580

tttattcatg tgattctgcc gggcgcgctg ccgagcatta tggtgggcgt gcgctttgcg 5640

ctgggcctga tgtggctgac cctgattgtg gcggaaacca ttagcgcgaa cagcggcatt 5700

ggctatctgg cgatgaacgc gcgcgaattt ctgcagaccg atgtggtggt ggtggcgatt 5760

attctgtatg cgctgctggg caaactggcg gatgtgagcg cgcagctgct ggaacgcctg 5820

tggctgcgct ggaacccggc gtatcatctg aaagaagcga ccgtgggatc cggactgcag 5880

gagaacctgt acttccaatc ccaccatatg tctaaaggtg aagaactgtt caccggtgtt 5940

gttccgatcc tggttgaact ggacggtgac gttaacggtc acaaattctc tgttcgtggt 6000

gaaggtgaag gtgacgctac caacggtaaa ctgaccctga aattcatctg caccaccggt 6060

aaactgccgg ttccgtggcc gaccctggtt accaccctga cctacggtgt tcagtgcttc 6120

tctcgttacc cggaccacat gaaacgtcac gacttcttca aatctgctat gccggaaggt 6180

tacgttcagg aacgtaccat ctctttcaaa gacgacggta cctacaaaac ccgtgctgaa 6240

gttaaattcg aaggtgacac cctggttaac cgtatcgaac tgaaaggtat cgacttcaaa 6300

gaagacggta acatcctggg tcacaaactg gaatacaact tcaactctca caacgtttac 6360

atcaccgctg acaaacagaa aaacggtatc aaagctaact tcaaaatccg tcacaacgtt 6420

gaagacggtt ctgttcagct ggctgaccac taccagcaga acaccccgat cggtgacggt 6480

ccggttctgc tgccggacaa ccactacctg tctacccagt ctgttctgtc taaagacccg 6540

aacgaaaaac gtgaccacat ggttctgctg gaattcgtta ccgctgctgg tatcacccac 6600

ggtatggacg aactgtacaa actcgagcac caccaccacc accactgaga tccggctgct 6660

aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa 6720

ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc 6780

ggat 6784