新型的圆红冬孢酵母菌株以及包括其菌株培养液的化妆品组合物

摘要

本发明涉及一种化妆品组合物，其包括新型的圆红冬孢酵母菌株以及其发酵液、破碎液、提取液或培养液。根据一方面，根据一种包括圆红冬孢酵母菌株或其发酵液、破碎液、提取液或培养液的组合物，其可以显着减少MMP‑1的表达量和抑制作为炎性细胞因子的IL‑6的表达，并且抑制NO的产生，同时可以增加丝聚合蛋白的表达，从而表现出皮炎改善效果、皱纹改善效果、皮肤刺激缓和效果以及皮肤屏障增强功能，因此可以在用于改善皮肤的化妆品组合物、用于皮肤外用剂的组合物、药物组合物和保健功能食品等中有效地使用。

说明书

本申请要求于2020年01月15日提交的韩国专利申请No.10-2020-0005607的优先权和权益，其通过引用合并于此用于所有目的，如同在此完全阐述一样。

技术领域

本发明涉及一种化妆品组合物、用于皮肤外用剂的组合物、用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物和保健功能食品组合物，其包括新型的圆红冬孢酵母菌株以及其发酵液、破碎液、提取液或培养液。

背景技术

皮肤老化受遗传、暴露于环境(紫外线、热)、荷尔蒙变化和代谢过程(反应性氧类、诸如糖和醛的高反应性化合物)影响。这些因素导致皮肤的结构、功能和外观的累积变化。人体皮肤的老化大致分为根据生物学过程随着时间过去而出现的内部老化和由诸如持续暴露于光、压力和吸烟等的环境引起的外部老化(光老化)。

在真皮细胞和组织中，胶原蛋白赋予皮肤强度和张力，从而由此从外部刺激和外力保护皮肤，并且占据真皮层的90％，因此胶原蛋白的减少与皮肤老化和皱纹形成密切相关。胶原蛋白的分解随着老化而进行，但是当暴露于紫外线等刺激下时，胶原蛋白裂合酶(MMPs)的生物合成增加，而胶原蛋白的合成减少，从而导致形成皱纹。因此，需要开发一种新型的改善皱纹材料，其对人体安全并且相比于现有的材料具有更好的胶原蛋白裂合酶(MMP-1)抑制和胶原蛋白合成的功能。

角质形成细胞(keratinocytes)主要形成皮肤表皮的基底层(stratum basal)，并且其主要功能为形成屏障以预防来自皮肤外部的损伤。在正常皮肤中，角质形成细胞通过分化过程表达对于维持皮肤屏障功能至关重要的结构蛋白(例如角蛋白(keratin)或丝聚合蛋白(filaggrin))，从而保护皮肤免受水分流失和各种环境侵害。保湿和皮肤屏障根据外部环境的变化和生活方式的变化而改变，原因包括温度的突然变化、由于环境污染的刺激、各种压力、过度的洗面和由于年龄增长导致的自然老化。作为改善这种损伤的皮肤屏障的努力，可以通过化妆品组合物改善皮肤屏障并赋予保湿感。迄今为止，尽管关于改善皮肤屏障的化妆品的研究活跃，但是仍然需要开发在涂上皮肤后即时并直接影响皮肤屏障改善和保湿的化妆品。

由于现时使用微生物的发酵物和生物转化技术被积极地用于化妆品材料领域，因此需要使用这种技术找到一种新的微生物菌株用作化妆品组合物，其具有良好的胶原蛋白裂合酶(MMP-1)抑制和胶原蛋白合成的功能，并且在涂上皮肤后即时并直接影响皮肤屏障改善和保湿。

发明内容

一方面提供一种圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)LAB-07(保藏号：KCCM12644P)菌株。

所述“圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)”为酵母的一种，其可以从韩国江原道洪川市的土壤中分离出来。所述菌株可以从食物、土壤、海洋等中分离出来。并且，来自通过添加所述菌株进行发酵而获得的发酵物的提取物可以显着减少由于紫外线和热照射的胶原蛋白裂合酶(MMP-1)的表达量，并且增加胶原前体的合成。此外，根据一方面的所述发酵提取物可以提高保湿因子在皮肤角质细胞或成纤维细胞中的表达水平，并且降低抗炎因子，从而可以抑制由热或紫外线引起的光老化、改善皮肤屏障，并且用于增进皮肤保湿和镇静用途。

另一方面提供一种来自圆红冬孢酵母LAB-07(保藏号：KCCM12644P)菌株的油。

所述来自菌株的油可以指，例如，来自通过发酵所述菌株而获得的发酵液、所述菌株的破碎液、从所述菌株中提取的提取液或通过培养所述菌株而获得的培养液的油，并且在本说明书中，在本说明书中所记载的来自圆红冬孢酵母的油可以与粉红色油(pink oil)互换使用。在本说明中的术语“发酵物或发酵液”是指通过添加并发酵所述酵母而制成的。所述来自菌株的油可以包括由所述圆红冬孢酵母酵母生成的脂肪酸。所述脂肪酸类似于人角质细胞中天然存在的脂肪酸成分，因此当涂上皮肤时，可以具有即时的屏障改善效果。

另一方面提供一种化妆品组合物、用于皮肤外用剂的组合物、用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物和保健功能食品组合物，其包括圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株、其发酵液、破碎液、提取液或培养液。

所述培养液可以为通过培养圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株而获得的培养液、从其除去菌株而获得的培养上清液或培养上清液的浓缩物，或冻结干燥物。

所述培养液可以通过将圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株在培养基中培养而获得的，其中，所述所述培养基包括：选自葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖、核糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、甘油和菊粉中的至少一种碳源；以及选自硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、草酸铵和磷酸氢二铵中的至少一种氮源。在所述培养基使用的碳源或氮源可以包括以下量，例如，约0.1w/v％至30w/v％、1w/v％至25w/v％、1w/v％至20w/v％、1w/v％至10w/v％、1w/v％至5w/v％，或1w/v％至1.5w/v％。所述培养基可以包括在菌株的培养基中常用的盐，所述盐包括，例如，选自硝酸钾、硫酸钾、碳酸镁、硫酸镁和硝酸镁中的至少一种的盐，并且所述盐可以包括以下量，例如，约0.01w/v％至10w/v％、0.1w/v％至7w/v％或0.5w/v％至5w/v％。

此外，所述培养基可以包括，例如，约0.01w/v％至10w/v％、0.05w/v％至5w/v％或0.1w/v％至2w/v％的酵母自溶产物，并且所述培养基可以具有2.0至7.0的pH，但不限于此。

另外，所述培养液可以通过将圆红冬孢酵母在例如约20℃至42℃、约25℃至35℃或约27℃至30℃的温度条件下培养例如约24小时至144小时、48小时至120小时或15小时至35小时而获得。并且，所述菌株的培养条件可以包括添加并发酵所述圆红冬孢酵母的步骤，并且发酵步骤可以使用常用的发酵方法，例如，所述方法可以使用分批补料式(fed-batch)发酵。

基于组合物的总重量，所述圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株、其发酵液、破碎液、提取液或培养液可以包括以下量，例如，1重量％至99.99重量％，例如，1.5重量％至99.99重量％或2重量％至99.99重量％。所述圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株、其发酵液、破碎液、提取液或培养液在显着减少基质金属蛋白酶-1(Matrix metalloproteinase-1；MMP-1)的表达量和抑制作为炎性细胞因子的白细胞介素-6(Interleukin-6；IL-6)的表达，并且抑制一氧化氮(Nitric oxide；NO)的产生，同时增加丝聚合蛋白的表达，从而表现出皮炎改善效果、皱纹改善效果、皮肤刺激缓和效果以及皮肤屏障增强功能的方面上，可以包括基于组合物总重量的等于或多于2％。

根据一实施例的组合物可以以有效量或作为有效成分包括所述圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株、其发酵液、破碎液、提取液或培养液。所述有效量可以根据个体而适当地选择。所述有效量可以根据包括以下项的因素以及在生理或医学领域中熟知的其他因素来决定：疾病或状态的严重程度、个体的年龄、体重、健康、性别、个体对酶剂的敏感度、施用时间、施用途径和排出比率、施用期间、与所述组合物混合或同时使用的其他组合物。

根据一实施例的组合物可以为化妆品组合物、用于皮肤外用剂的组合物、用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物或保健功能食品组合物。所述化妆品组合物可以特别地用于皮肤保湿、用于预防或改善皮肤损伤、用于增强皮肤屏障、用于预防或改善老化或用于改善皮肤状态。所述老化可以是由紫外线或热引起的老化。

因此，所述组合物可以进一步包括在化妆品学上、食品学或药学上可接受的赋形剂或载体。根据组合物的剂型，所述组合物可以进一步包括各种已知的添加剂，并且根据一实施例，可以进一步包括选自载体、乳化剂、保湿剂、表面活性剂、螯合剂、抗氧化剂、杀菌剂、稳定剂及其任意组合的添加剂。

所述载体可以包括，例如，动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石、氧化锌、乳糖、氢氧化铝、硅酸钙、聚酰胺粉末、水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁基乙二醇油、脂肪酸甘油酯、液相稀释剂、乙氧基化异硬脂醇、诸如聚氧乙烯山梨醇酯的悬浮剂、微晶纤维素、偏氢氧化铝、琼脂、脂肪醇硫酸钠、脂肪醇醚硫酸钠、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸、肌氨酸、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基硫酸钠、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

所述乳化剂可以包括，例如，液体石蜡、鲸蜡脂酸酯和硬脂酸等。

所述保湿剂可以包括选自甘油、丁二醇、丙二醇、双丙二醇、戊二醇、己二醇、聚乙二醇、山梨糖醇和其任意组合的多元醇。具体地，基于组合物的总重量，所述多元醇可以含有以下量：5重量％至50重量％、5重量％至30重量％、10重量％至30重量％或5重量％至10重量％。此时，就保持保湿持久力而言，可以包括等于或多于5重量％的多元醇，并且对于抑制由于粘性和潮湿感增加而引起的使用感下降的方面，可以包括等于或小于50重量％的多元醇。

所述螯合剂可以包括乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid；EDTA)、α-羟脂肪酸、乳铁蛋白、α-羟基酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸、胆红素和胆绿素(biliverdin)等。

所述抗氧化剂可以包括丁基羟基茴香醚、二丁基羟甲苯或没食子酸丙酯等。

在所述化妆品组合物中，圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株、其发酵液、破碎液、提取液或培养液可以制造成包括以下项的剂型：化妆水(润肤液)、柔肤水、爽肤水、收敛剂(Astringent)、乳液、牛奶乳液、保湿乳液、营养乳液、按摩霜、营养霜、保湿霜、护手霜、粉底、精华素、营养精华素、膜、肥皂、洁面泡沫、洁面乳液、洁面霜、身体乳液、身体清洁液、悬浮液、凝胶、粉末、粘膏(paste)、面膜或片装面膜或喷雾组合物。这类剂型的组合物可以根据本领域常规方法制造。本领域技术人员可以在不损害本发明的目的和效果的范围内容易地选择诸如所述保湿剂等的其他成分混合量，并且基于组合物的总重量，其混合量可以是0.001重量％至5重量％，具体地，可以是0.01重量％至3重量％。

本领域技术人员可以选择任意的额外成分和/或其量，以使根据本发明的组合物的有利特性不会受到预期添加的不利影响或基本不受其影响。本领域技术人员可以在不损害本发明的目的和效果的范围内容易地选择所述额外成分的混合量，并且基于组合物的总重量，其混合量可以是约0.001重量％至约30重量％，具体地，约0.01重量％至25重量％。

另外，在每种剂型的化妆品组合物中，可以根据化妆品的剂型或使用目的选择并混配合合适的成分。由于混合成分和方法可以根据常规技术，因此在此将省略其详细描述。

术语“治疗或改善”可以指或包括减轻疾病、障碍、状况或病状或其中一种症状以及抑制或预防其进展，并且“有效成分”或“药学上有效量”可以指在实施本申请提供的发明的过程中所使用的组合物的任意量，其足以减轻疾病、障碍、状况或病状或其中一种症状以及抑制或预防其进展。所述有效量(或施用量)可以是0.0001mg至10000mg、0.001mg至1000mg、1.0mg至100mg、0.01mg至1000mg、0.01mg至100mg、0.01mg至10mg或0.01mg至1mg。

所述皮肤状况或与皮肤相关的状况的实例可以包括皮肤老化、皮肤光老化、伤口、皮炎、特应性皮炎、瘙痒、湿疹皮肤病、干性湿疹、红斑、荨麻疹、牛皮癣、皮疹或痤疮、丘疹鳞屑性皮肤病、昆虫和寄生虫介导的疾病、皮肤浅表真菌病、细菌感染疾病、病毒性疾病、成人疾病、自身免疫性水疱病、结缔组织疾病、色素异常症、色素沉着硬皮病等。

所述皮肤损伤可以包括皮肤组织或细胞在临床上和美容观点上的损伤，其包括外部物理上损伤、由化学物质、细菌、真菌、病毒等的渗透、暴露于紫外线、皮肤水分流失、老化等引起的皱纹、由自由基(活性氧)等引起的氧化、皮肤色素沉着、皮炎、脂溢性皮炎、发红(红肿，红斑)、肿胀、苔藓化、湿疹、瘙痒(痒)和特应性皮炎等。

所述皮肤包括身体的所有皮肤部位，其包括面部、手、手臂、腿、脚、胸部、肚，背部，臀部和头皮。

所述组合物可以制剂成肠胃外施用剂型。肠胃外施用剂型可以为注射剂或皮肤外用剂。所述皮肤外用剂可以根据需要适当混合通常用于化妆品或药物等的皮肤外用剂的成分，例如，水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂以及各种皮肤营养剂等。

所述皮肤外用剂可以适当混合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属螯合剂、咖啡因、单宁、戊脉安、甘草提取物、光甘草定、大蓟果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸、氨甲环酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等的糖类。

在本说明书中，所述皮肤外用剂可以是乳膏、凝胶、软膏、皮肤乳化剂、皮肤悬浮液、经皮传递性贴片、含药绷带、乳液或其组合。所述皮肤外用剂可以制造成软膏剂、乳液剂、喷雾剂、贴剂、乳霜剂、散剂、悬浮剂、凝胶剂或凝胶的状态。所述皮肤外用剂可以根据需要适当混合通常用于化妆品或药物等的皮肤外用剂的成分，例如，水性成分、油性成分、粉末成分、醇类、保湿剂、增稠剂、紫外线吸收剂、美白剂、防腐剂、抗氧化剂、表面活性剂、香料、着色剂以及各种皮肤营养剂或其组合。所述皮肤外用剂可以适当混合乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡萄糖酸等的金属螯合剂、咖啡因、单宁、戊脉安、甘草提取物、光甘草定、大蓟果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸、氨甲环酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素C、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等的糖类。

此外，所述组合物是医药外品组合物。

术语“医药外品”是指用于治疗、减轻、处理或预防人类或动物疾病的纤维、橡胶制品或类似其的物品、对人体的作用小或对人体没有直接作用，并且与非工具或机械类似的物品、作为与在为防止感染而杀菌、杀虫以及类似其的用途中使用的一种制剂相对应的物品中的用于诊断、治疗、减轻、处理或预防人或动物状况或疾病的物品中的非工具、机械或设备的物品，以及用于对人或动物的结构和对功能产生药理学上影响的物品中的非工具、机械或设备的物品以外的物品，并且可以包括皮肤外用剂和个人卫生用品。

在所述用于预防或治疗皮肤疾病的药物组合物中，皮肤疾病包括例如皮肤损伤，并且具体地，可以包括例如皮肤老化、皮肤光老化、伤口、皮炎、特应性皮炎、瘙痒、湿疹皮肤病、干性湿疹、红斑、荨麻疹、牛皮癣、皮疹或痤疮、丘疹鳞屑性皮肤病、昆虫和寄生虫介导的疾病、皮肤浅表真菌病、细菌感染疾病、病毒性疾病、成人疾病、自身免疫性水疱病、结缔组织疾病、色素异常症、色素沉着硬皮病，但不限于此。

所述药物组合物可以进一步包括药学上可接受的稀释剂或载体。所述稀释剂可以是乳糖、玉米淀粉、大豆油、微晶纤维素或甘露糖醇，润滑剂可以是硬脂酸镁，滑石或其组合。所述载体可以是赋形剂、崩解剂、结合剂、润滑剂或其组合。所述赋形剂可以是微晶纤维素、乳糖、低取代羟基纤维素或其组合。所述崩解剂可以是羟甲基纤维素钙、淀粉乙醇酸钠、无水磷酸氢钙或其组合。所述结合剂可以是聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙基纤维素、羟丙基纤维素或其组合。所述润滑剂可以是硬脂酸镁、二氧化硅、滑石或其组合。

所述药物组合物可以制剂成口服或肠胃外施用剂型。口服施用剂型可以是颗粒剂、散剂、液剂、片剂、胶囊剂、干糖浆剂或其组合。肠胃外施用剂型可以是注射剂。

所述保健功能食品组合物可以是单独使用圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株、其发酵液、破碎液、提取液或培养液或与其他食品或食品成分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。有效成分的混合量可以根据使用目的(预防、健康或治疗上的处理)适当地确定。通常，当制造食品或饮料时，本说明书的组合物可以以基于原料的等于或小于15重量份的量添加。对所述保健功能食品的种类没有特别限制。在保健功能食品的种类中，饮料组合物可以含有各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。所述天然碳水化合物可以是诸如葡萄糖和果糖的单糖、诸如麦芽糖和蔗糖的二糖、诸如糊精和环式糊精的多糖以及木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇。作为甜味剂，可以使用诸如奇异果甜蛋白(Thaumatin)和甜叶菊提取物的天然甜味剂或诸如糖精和阿斯巴甜的合成甜味剂等。所述保健功能食品组合物还可以含有营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用于碳酸饮料的碳酸化剂或其组合。所述保健功能食品组合物还可以含有用于制造天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉或其组合。

另一方面提供一种从圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株中获得油的方法，其包括从圆红冬孢酵母KCCM12644P菌株中获得发酵物，以及从所获得的发酵物中提取油。

获得所述发酵物的步骤可以包括将圆红冬孢酵母KCCM12644P在培养基中培养，其中，所述培养基包括：选自葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖、核糖、麦芽糖、蔗糖、糊精、甘油和菊粉中的至少一种碳源；以及选自硝酸钾、硝酸铵、硫酸铵、草酸铵和磷酸氢二铵中的至少一种氮源。在所述培养基使用的碳源或氮源可以包括以下量，例如，约0.1w/v％至30w/v％、1w/v％至25w/v％、1w/v％至20w/v％、1w/v％至10w/v％、1w/v％至5w/v％，或1w/v％至1.5w/v％。所述培养基可以包括在菌株的培养基中常用的盐，所述盐包括，例如，选自硝酸钾、硫酸钾、碳酸镁、硫酸镁和硝酸镁中的至少一种的盐，并且所述盐可以包括以下量，例如，约0.01w/v％至10w/v％、0.1w/v％至7w/v％或0.5w/v％至5w/v％。

此外，所述培养基可以包括，例如，约0.01w/v％至10w/v％、0.05w/v％至5w/v％或0.1w/v％至2w/v％的酵母自溶产物，并且所述培养基可以具有2.0至7.0的pH，但不限于此。

另外，所述培养液可以通过将圆红冬孢酵母在例如约20℃至42℃、约25℃至35℃或约27℃至30℃的温度条件下培养例如约24小时至144小时、48小时至120小时或15小时至35小时而获得。并且，培养所述酵母的步骤可以使用常用的发酵方法，例如，所述方法可以使用分批补料式(fed-batch)发酵。

在从所获得的发酵物中提取油时使用的提取溶剂可以是己烷、乙酸乙酯、十二烷、正癸烷、柴油、醇和其组合，所述提取方法可以是例如超声波提取、微波提取、搅拌提取和加热提取中的一种，并且可以以整个发酵过程中获得的提取油的约5倍至30倍重量比的量使用所述提取溶剂，以提取油成分。

附图说明

被包括以提供对本发明的进一步理解并且被并入且构成本说明书的一部分的附图例示本发明的示例性实施例，并且与说明书一起用于解释本发明构思。

图1为示出确认来自圆红冬孢酵母的提取油中的脂肪酸组成的结果的图。

图2为当在成纤维细胞细胞株上照射紫外线后将来自圆红冬孢酵母的提取油与细胞接触时确认成纤维细胞中的MMP-1的表达量的图。

图3为当在HaCaT角质细胞细胞株上照射热后将来自圆红冬孢酵母的提取油与细胞接触时确认角质细胞中的MMP-1的表达量的图。

图4为当在HaCaT角质细胞细胞株上照射热后将来自圆红冬孢酵母的提取油与细胞接触时确认角质细胞中的IL-6的表达量的图。

图5为当在小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)上处理炎症诱发物质后将来自圆红冬孢酵母的提取油与细胞接触时确认一氧化氮的表达量的图。

图6为当在HaCat角质细胞细胞株上将来自圆红冬孢酵母的提取油与细胞接触时确认丝聚合蛋白的表达量的图。

本发明的圆红冬孢酵母LAB-07，已于2019年12月19日保藏在韩国微生物培养中心(KCCM)，保藏地址：大韩民国首尔120-861，西大门-区，弘济洞2街路，柳林大厦45，保藏编号为：KCCM12644P，培养物名称是圆红冬孢酵母，分类命名是Rhodosporidium toruloides。

具体实施方式

在下文中，将详细描述实施例和试验例以具体描述本公开。但是，根据本发明的实施例和试验例具有各种修改和变化，本发明的的范围不应解释为限于下述实施例和试验例。提供本发明的实施例和试验例以向本领域普通技术人员更完整地描述本发明。

将来自韩国江原道洪川市的土壤破碎并进行均质化后，从其中取1.0g来悬浮于9.0ml的灭菌的生理盐水(0.9％氯化钠(NaCl))中并逐步稀释来分别塗抹在YM增殖培养基上。在30℃下培养24小时至48小时后，选择具有彼此不同的群体的状态的菌株，并通过数次纯培养(pure culture)来进行纯粹分离。将纯粹分离的菌株塗抹在YM增殖培养基上并在30℃下培养24小时，将纯粹分离的群体在YM液体培养基中培养，并以1：1的比例与40％(v/v)甘油(glycerol)混合，并保存在-80℃超低温冰箱中。

为了鉴定分离的菌株，在进行内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer；ITS)碱基序列和26S rRNA的碱基序列的分析后，通过搜索NCBI基本的局部比对搜索工具(BLAST)以鉴定该菌株。根据碱基序列的分析结果，该菌株被鉴定为圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)。因此，以上分离出的鉴定菌命名为圆红冬孢酵母LAB-07，并且其于2019年12月19日保藏在韩国微生物保藏中心，并且保藏号为KCCM12644P。

所述新鉴定的酵母的合适培养条件确认为在30℃下以200rpm培养24小时。另外，为了寻找可以通过所述酵母提取的油的最佳生产条件，在培养基中以不同比例的碳源，氮源和无机盐进行培养，并测定出在最佳培养条件下，来自酵母的油中的脂肪酸含量最高为34.5％。

由于所述新鉴定的酵母可以通过发酵产生细胞内油，因此将所述酵母培养并获得从其中提取的包括脂肪酸的油。此后，为了分析提取物的效能，将所述酵母在实施例1中确认的培养基组合物中进行培养，并且将所生成的发酵物以乙醇的20体积比(20ml的溶剂混合物中的1g)来进行均质化。分散后，将整个混合物通过超声波提取(sonication)进行提取3小时。将提取物在4000rpm(10分钟)下离心以仅回收上清液。使用0.2μm过滤器过滤上清液后，在真空下在旋转蒸发仪中蒸发含脂质的上清液，然后以适当的浓度溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide；DMSO)以制造最终的发酵提取物，并且进行用于确认所制造的提取物的具体脂肪酸组成的分析，分析结果在表1和图1中示出。此后，在以下实施例中使用最所述终的发酵提取物。

【表1】

将来自所述实施例2的发酵提取物的人永生化角质形成细胞(HaCaT)细胞株在含有10％胎牛血清(FBS)和1X青霉素/链霉素(P/S)的DMEM培养基中培养，在计数细胞后，在6cm

将作为另一细胞的成纤维细胞细胞株在含有10％FBS和1X青霉素/链霉素(P/S)的FBM培养基中培养，在计数细胞后，在24孔的板上稀释至3×10

除去培养的HaCaT细胞的上清液，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，然后加入1ml的PBS，并用15mJ/cm

除去培养的细胞成纤维细胞的上清液。使用HaCaT上清液制造的样品在培养的细胞成纤维细胞上根据浓度进行处理，然后在5％二氧化碳和37℃的培养器中培养24小时。将培养的细胞成纤维细胞的上清液以每150μl加入96孔板中。使用人基质金属蛋白酶-1检测试剂盒(Human Total MMP-1ELISA kit)(DY901)定量存在于成纤维细胞上清液中的MMP-1的量。

为了确认来自发酵提取物的油的皱纹改善效果，通过对样品根据浓度进行处理，确认了作为胶原蛋白裂合酶的MMP-1的表达量是否减少，结果于图2中示出。

如图2所示，根据测定MMP-1活性的结果，确认了当将来自圆红冬孢酵母的油加入细胞中时，与处理浓度成比例地抑制了MMP-1活性。确认了与阴性对照组相比，从等于或大于75ppm浓度可以明显抑制MMP-1活性，特别地，确认了在150ppm的浓度下抑制约85％的MMP-1活性，从而可以确认来自圆红冬孢酵母的油能够有效地抑制光老化。

实施例4.来自圆红冬孢酵母的油的热老化抑制细胞评估

将所述实施例2的来自发酵提取物的油在培养基中稀释至1、10和100μg/ml的浓度，并且在以下试验中使用。

具体地，在以下条件下在人角质形成细胞(HaCaT keratinocytes(p19))中进行试验。首先，将角质形成细胞以3×10

之后，使用三唑(RNA iso，DAKARA，日本)从每个样品的细胞中分离出RNA，然后用紫外分光光度计(nanodrop)在260nm处定量RNA，并使用2μg的每种RNA在放大器中合成cDNA(C1000热循环仪，Bio-Rad，美国)。对合成的cDNA通过使用添加了作为目标蛋白质的MMP-1引物和作为花青染料的赛博格林(SYBR Green supermix，应用生物系统(AppliedBiosystems)，美国)的混合物，在实时(real-time)PCR仪进行实时聚合酶链反应，以最终确认MMP-1基因的表达程度。通过补正β-肌动蛋白(β-actin)基因来最终分析基因的表达量，并且所述分析结果在图3中示出。另外，用于确认基因表达的引物示于表2。

【表2】

如图3所示，与阴性对照组中的热红外线组中的MMP-1表达的增加相反，确认了来自发酵提取物的油的处理组在1、10和100μg/ml的处理浓度下均显着减少MMP-1基因的表达量。

因此，可以得知，来自发酵提取物的油通过减少由于热而增加的MMP-1的表达，从而表现出皱纹改善效果和防止老化效果。

为了确认来自发酵提取物的油的IL-6抑制效果，使用与所述实施例4中所述的相同的细胞在相同条件下进行试验。然而，在最终进行实时聚合酶链反应的过程中，使用IL-6引物代替MMP-1引物。通过补正β-肌动蛋白基因来最终分析基因的表达量，并且分析结果在图4中示出。另外，用于确认基因表达的引物示于表3。

【表3】

如图4所示，确认了来自发酵提取物的油的处理组在1、10和100μg/ml的处理浓度下均显着减少IL-6基因表达量。总体上，确认了来自发酵提取物的油的处理组以浓度依赖性显着和有效地减少IL-6基因表达量。因此，可以得知，来自发酵提取物的油通过减少作为炎性细胞因子的IL-6的表达，从而表现出皮炎改善效果、皱纹改善效果和皮肤刺激缓和效果。

计数RAW264.7细胞后，稀释至2.5×105细胞/孔，将2.5×105细胞/孔接种到48孔板中，并在5％二氧化碳和37℃的培养器中培养24小时。培养后，替换为无血清培养基，然后进行饥饿步骤，并且将来自圆红冬孢酵母的油样品稀释至每个浓度并处理。将用作阳性对照组的地塞米松用1ppm处理后在5％二氧化碳和37℃的培养器中培养24小时，并且进行处理使LPS成为1μg/ml，然后在5％二氧化碳和37℃的培养器中培养24小时。将100μl的包括合成的一氧化氮(NO)的培养基转移到96孔板中，并且使用500μM的NaNO2作为标准以根据每个浓度在96孔板中处理，然后在室温下反应20分钟。为了测量吸光度，在执行multiskan GO程序之后，将吸光度设置为540nm，在板上选择测量区域，并测量吸光度。使用标准曲线算出各合成的一氧化氮的值，从其平均值求出结果值，从而通过确认测定NO的产生量的抗炎效果，结果在图5中示出。

如图5所示，确认了在处理来自圆红冬孢酵母的油时，NO的产生量以浓度依赖性减少，并且与阴性对照组相比，在所有处理浓度下均显着减少了NO的产生量，从而确认了直接的抗炎效果。特别地，确认了当提取物为150ppm时，与阴性对照组相比，抑制约58％的NO表达，这以与阳性对照组相似的水平有效地减少NO的产生量。因此，可以得知，来自发酵提取物的油通过有效地减少NO的表达，从而表现出皮炎改善效果、皱纹改善效果和皮肤刺激缓和效果。

为了评估所述实施例2的来自发酵提取物的油的皮肤保湿效果，进行如下试验。将人角质形成细胞HaCaT细胞(购自韩国细胞株银行(Korea Cell Line Bank))以3×10

【表4】

如图6所示，确认了在来自发酵提取物的油的处理组中，丝聚合蛋白基因表达量以浓度依赖性和显着地增加。因此，特别确认了来自发酵提取物的油可以通过增加丝聚合蛋白的表达而表现出通过屏障改善效果的保湿效果。

【保藏号】

保藏机构名：韩国微生物保藏中心(国外)

保藏号:KCCM12644P

保藏日期:20191219

根据一方面，根据一种包括圆红冬孢酵母菌株以及其发酵液、破碎液、提取液或培养液的组合物，其可以显着减少基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达量和抑制作为炎性细胞因子的白细胞介素-6(IL-6)的表达，并且抑制一氧化氮(NO)的产生率，同时可以增加丝聚合蛋白的表达，从而表现出皮炎改善效果、皱纹改善效果、皮肤刺激缓和效果以及皮肤屏障增强功能，因此可以在用于改善皮肤的化妆品组合物、用于皮肤外用剂的组合物、药物组合物和保健功能食品等中有效地使用。

虽然已在此描述了某些示例性实施例和实施方式，但是根据该描述，其它实施例和修改将是明显的。因此，本发明构思不限于这些实施例，而是限于所附权利要求的更宽范围，并且对于本领域普通技术人员来说，各种显而易见的修改和等同布置将是明显的。

序列表

<110> 科丝美诗株式会社

<120> 新型的圆红冬孢酵母菌株以及包括其菌株培养液的化妆品组合物

<130> P21131434W

<150> 10-2020-0005607

<151> 2020-01-15

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MMP-1正向引物序列

<400> 1

cgaatttgcc gacagagatg a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MMP-1反向引物序列

<400> 2

gtccctgaac agcccagtac tt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> beta-肌动蛋白正向引物序列

<400> 3

ggccatctct tgctcgaagt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> beta-肌动蛋白反向引物序列

<400> 4

gacaccttca acaccccagc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6正向引物序列

<400> 5

tacccccagg agaagattcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6反向向引物序列

<400> 6

ttttctgcca gtgcctcttt 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 丝聚合蛋白正向引物序列

<400> 7

agtgcactca gggggctcac a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 丝聚合蛋白反向引物序列

<400> 8

ccggcttggc cgtaatgtgt 20