一种治疗肾病的中药组合物中丹酚酸B的检测方法

摘要

本发明涉及一种治疗肾病的中药组合物中丹酚酸B的检测方法，其通过高效液相色谱法测定中药组合物中丹酚酸B的含量。该检测方法能够简便高效地定性和定量检测出治疗肾病的中药组合物中丹参的有效成分含量，从而实现客观、全面、准确的评价治疗肾病的中药组合物的质量，对控制肾病的中药组合物的质量和保证疗效具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及药物检测领域，特别涉及一种治疗肾病的中药组合物中丹酚酸B的检测方法。

背景技术

肾功能衰竭等肾脏疾病是临床常见重病，通常采用透析和肾移植治疗，但医疗费用过高，一般家庭经济无法负担，且透析治疗过程中易引发并发症。肾移植手术后还普遍存在排斥反应，对此，患者及其家属普遍较难承受。应用传统中药如肾衰宁胶囊等，则能够有效避免上述情况的发生，其能够有效缓解症状，减少患者痛苦，但为保障临床疗效更显著，还需进行改进。为保障以高质量的中药，如肾衰宁胶囊治疗这些治疗肾病，使其在临床中充分发挥功效，使患者尽早恢复健康，此类药物的质量控制至关重要，而现有的治疗肾病的中药—肾衰宁胶囊的质量控制方法未纳入臣药丹参有效成分丹酚酸B的定量检测，不能很好的反应制剂的质量，导致其有效成份未得以充分利用和监控。因此，为了维护患者利益，很有必要在现有的技术基础之上研究和设计出能测定治疗肾病的中药组合物中丹参的有效成分丹酚酸B的检测方法。

在防病治病方面，中药及其提取制剂占据着重要的位置，其质量控制方法主要是显微鉴别、薄层鉴别与含量测定。所以寻找简便、快捷、全方位控制质量的检测方法，例如治疗肾病的中药组合物中丹参的有效成分丹酚酸B的检测方法成为该中药质量控制必须突破的难关。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于治疗肾病的中药组合物中丹酚酸B含量的检测方法，其中所述检测方法采用高效液相色谱法进行测定，所述高效液相色谱法的条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以体积比为0.095-0.105％磷酸水溶液为流动相B，按流动相A与流动相B的体积比为(22-24)：(76-78)进行洗脱。

可选地，所述检测方法包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，加甲醇制成丹酚酸B的对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取中药组合物，加入体积比为65％-100％甲醇水溶液，超声处理，滤过，取续滤液；

(3)测定方法：取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述高效液相色谱法条件测定供试品溶液和对照品溶液的色谱。

优选地，所述检测方法包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成丹酚酸B的对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：取中药组合物，精密称定，精密加入体积比为65％-75％甲醇，优选为75％的甲醇水溶液，称定重量，超声处理10-60分钟，优选30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液；

(3)测定方法：分别精密吸取步骤(1)制备的对照品溶液与步骤(2)制备的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述高效液相色谱法条件测定供试品溶液和对照品溶液的色谱。

优选地，在所述检测方法中，按0-40分钟内流动相A与流动相B的体积比为22：78进行洗脱。

优选地，在所述检测方法中，所述中药组合物包含丹参、大黄、太子参、黄连、牛膝、半夏、红花、茯苓、陈皮、甘草。

更优选地，在所述检测方法中，按重量份数计，所述中药组合物包含：太子参20-30份，半夏20-30份，茯苓16-24份，丹参56-84份，红花8-12份，黄连8-12份，陈皮8-12份，大黄32-48份，牛膝16-24份和甘草8-12份；

进一步优选地，按重量份数计，所述中药组合物包含：太子参25份，半夏25份，茯苓20份，丹参70份，红花10份，黄连10份，陈皮10份，大黄40份，牛膝20份和甘草10份；

最优选地，在所述检测方法中，所述中药组合物是肾衰宁胶囊。

优选地，在所述检测方法中，所述磷酸水溶液为体积比为0.1％的磷酸水溶液。

可选地，在所述检测方法中，所述高效液相色谱条件还包括柱温为25-40℃；流速为每分钟0.9-1.1ml；紫外检测波长为280-290nm；理论板数按丹酚酸B峰计算不低于5000。

优选地，在所述检测方法中，所述高效液相色谱条件还包括柱温为30℃；流速为每分钟1.0ml；紫外检测波长为286nm；理论板数按丹酚酸B峰计算不低于7000。

根据本发明的一个具体实施方案，所述用于治疗肾病的中药组合物中丹酚酸B含量的检测方法包括如下步骤：

(1)高效液相色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水溶液(体积比22：78)为流动相，紫外检测波长286nm；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于7000。

(2)对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含丹酚酸B 60μg的溶液，即得。

(3)供试品溶液的制备取装量差异项下的所述中药组合物0.2g，精密称定，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，功率为250W且频率为50kHz的超声处理30分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(4)测定方法：分别精密吸取步骤(1)所得对照品溶液与步骤(2)所得供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照所述高效液相色谱法条件测定供试品溶液和对照品溶液的色谱。

本发明依据国家确保制剂安全有效的政策，利用高效液相色谱技术，制定了治疗肾病的中药组合物(例如肾衰宁胶囊)的有效成分检测方法。实现了中药处方中的臣药—丹参的有效成分的定量测定，既保证了制剂的安全性，又保证了制剂的有效性。该检测方法与常规方法相比，无需浓缩、萃取和蒸发步骤，简便、快捷、效率高、成本低、无污染，有效提高了结果的准确性与重现性，可用于控制治疗肾病的中药组合物质量。本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种治疗肾病的中药组合物(例如肾衰宁胶囊)的检测方法，改进提高现有肾衰宁制剂的疗效，提高药效检测的准确度，并以新检测方法客观、全面、准确的评价肾衰宁制剂的质量，从而利于严格控制投入治疗使用的药量，进而保障用药患者获得预期的治疗效果。本发明建立了高效液相色谱法检测中药组合物中丹酚酸B含量测定方法，该方法专属性强，准确度高，可用于控制治疗肾病的中药组合物(例如肾衰宁胶囊)的质量。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为丹酚酸B的紫外吸收图；

图2为测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图3为测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图4为测定缺丹参空白样品的HPLC色谱图；

图5为丹酚酸B的标准曲线图；

图6为以0.095％磷酸测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图7为以0.095％磷酸测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图8为以0.10％磷酸测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图9为以0.10％磷酸测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图10为以0.105％磷酸测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图11为以0.105％磷酸测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图12为25℃下测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图13为25℃下测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图14为28℃下测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图15为28℃下测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图16为30℃下测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图17为30℃下测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图18为32℃下测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图19为32℃下测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图20为35℃下测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图21为35℃下测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图22为40℃下测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图23为40℃下测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图24为以0.9ml/min测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图25为以0.9ml/min测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图26为以1.0ml/min测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图27为以1.0ml/min测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图28为以1.1ml/min测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图29为以1.1ml/min测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图30为以280nm测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图31为以280nm测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图32为以286nm测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图33为以286nm测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图34为以290nm测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图35为以290nm测定丹酚酸B供试品的HPLC色谱图；

图36为对比例1测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图37为对比例1测定丹酚酸B供试品样品1的HPLC色谱图；

图38为对比例1测定缺丹参空白样品的HPLC色谱图；

图39为实施例2测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图40为实施例2测定丹酚酸B供试品样品1的HPLC色谱图；

图41为实施例2测定缺丹参空白样品的HPLC色谱图；

图42为实施例2丹酚酸B的标准曲线图。

图43为实施例3测定丹酚酸B对照品的HPLC色谱图；

图44为实施例3测定丹酚酸B供试品样品1的HPLC色谱图；

图45为实施例3测定缺丹参空白样品的HPLC色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的描述，根据下述实施例可以更好地理解本发明。然而，本领域技术人员应容易理解的是，以下实施例只是描述性的，不意味着将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该意识到，本发明涵盖了权利要求书范围内可能的包括所有改进方案、备选方案和等效方案。

实施例1

1.1仪器及试药

1.1.1仪器及试验条件

Agilent-1260液相色谱仪(HP-1260系列四元泵，DAD检测器，自动进样器)

AgilentSB-C18(4.6×250mm，5μm)

AgilentEC-C18(4.6×250mm，4μm)

紫外光谱测定用HP-1260液相色谱仪

乙腈(色谱纯，默克)、甲醇(色谱纯，默克)，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

天平：OHAUSAR224-N电子天平(万分之一)，EX125ZH电子分析天平(十万分之一)，奥豪斯仪器(常州)有限公司；

仪器：DK-98ⅡA电热恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；

超声仪：SB25-12DTD超声仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；

1.1.2试药及样品

丹酚酸B对照品：编号为111562-201716，中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，纯度为94.1％。

肾衰宁胶囊：均由云南雷允上理想药业有限公司提供(批号：20190303、20190403、20190404、20190507、20170703、20190520、20190523、20190524、20190605、20190615、20190812、20190414、20190419、20190421、20190705、20190708、20190711、20190714、20190716、20190720)。

制备阴性对照的药材：所使用药材均统一采购于昆明井田药业有限公司，按制法制备。

1.2测定方法：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％(体积比)磷酸水溶液按体积比＝22：78为流动相，检测波长286nm；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于7000。

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含丹酚酸B60μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的肾衰宁胶囊内容物约0.2g，精密称定，精密加入75％(体积比)甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

1.3色谱条件及系统适用性试验

1.3.1色谱条件选择

1.3.1.1流动相选择

丹酚酸B是丹参药材中主要药效成分，为水溶性成分。HPLC测定流动相通常为乙腈-0.1％(体积比)磷酸、乙腈-0.05％(体积比)磷酸和甲醇-水溶液。实验结果发现，甲醇-水系统各峰拖尾严重，影响峰的识别和定量；而乙腈-0.1％(体积比)磷酸，乙腈-0.05％(体积比)磷酸均显著改善各物质峰形。最终选择乙腈-0.1％磷酸作为流动相。

表1不同流动相比例分离效果的比较

1.3.1.2检测波长的选择

在190-800nm波长下对供试品溶液和对照品溶液中待测成分进行了全波长扫描，结果丹酚酸B在286nm波长附近有明显吸收峰，此波长条件下，色谱峰分离度良好，因此选择286nm作为检测波长(参见图1)。

在此条件下对丹酚酸B对照品溶液、供试品溶液进行测定，结果均较为理想，按同法制备的缺丹参阴性溶液测定结果为阴性，且对样品测定无干扰(参见图2)。

1.3.2系统适用性试验

1.3.2.1色谱柱的理论板数(n)

采用不同品牌、不同柱长的色谱柱，测定供试品溶液时，理论板数均在10000以上，考虑到柱子新旧程度的影响，在保证分离效果的前提下，规定理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于7000。

表2不同品牌色谱柱丹酚酸B的柱效

由上表结果表明，丹酚酸B在2项色谱条件下，流速为每分钟1.0ml，检测波长为286nm；柱温为30℃时，两种不同色谱柱的柱效基本一致，说明丹酚酸B对色谱柱的适用性良好。

1.3.2.2重复性

取混合对照溶液连续进样5次，丹酚酸B峰面积的RSD(n＝5)不大于2.0％(见表3)，表明仪器精密度良好。

表3对照品溶液的重复性试验结果

1.4供试品溶液制备方法：

1.4.1提取方法考察

采用回流提取60分钟及超声提取60分钟进行试验。

方法1：(参见《中国药典》2015年版一部丹参)：取肾衰宁胶囊内容物0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用75％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

方法2：取肾衰宁胶囊内容物0.2g，精密称定，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)1小时，放冷，用75％甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液，即得。

按本发明的液相色谱条件测定，结果见表4。

表4提取方法试验结果

实验结果表明，方法二略优于方法一，故选用方法二作为提取方法。

1.4.2提取溶剂的选择

取肾衰宁胶囊内容物0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入水、65％甲醇、75％甲醇、85％甲醇、甲醇各25ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)1小时，放冷，再称定重量，用提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按本发明的液相色谱条件测定，结果见下表5。

表5提取溶剂试验结果

试验结果表明，65％甲醇的提取率稍高，但考虑到对流动相的影响，故选用75％甲醇作为提取溶剂。

1.4.3提取时间的确定

取肾衰宁胶囊内容物(批号20180806)4份，每份0.2g，精密称定，精密加入溶剂25ml，称定重量，加热回流或者超声处理(功率250W，频率50kHz)提取不同的时间，分别为10、20、30、40、50、60分钟，放冷，用溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液，即得。按本发明的液相色谱条件测定，结果见下表6。

表6提取时间试验结果

由上表结果表明，样品超声处理(功率250W，频率50kHz)提取30分钟，已经提取完全，最终确定供试品溶液的制备方法为：精密称取样品0.2g，置于锥型瓶中，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，超声(功率250W，频率50kHz)处理30分钟，放冷，用甲醇补足损失的重量，滤过，取续滤液，即得。

1.5专属性

根据本处方和工艺制法制得缺丹参的阴性样品，再依照供试品溶液的制备方法制得阴性样品溶液，注入液相色谱仪，结果阴性样品无干扰(参见附图3和4)，说明此方法具有一定的专属性。

1.6线性关系考察

精密称取丹酚酸B对照品10.54mg，置25ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，配成质量浓度为0.3967mg/ml的丹酚酸B对照品贮备溶液；精密量取上述对照品贮备溶液5ml置25ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1ml中含丹酚酸B 0.07934mg)。

精密吸取对照品溶液1、2、3、5、10ml和对照品贮备溶液3、5、10ml，置10ml量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，测定峰面积，以对照品质量(X)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。用最小二乘法进行线性回归，得丹酚酸B的回归方程及线性范围：

丹酚酸B：Y＝1177X-63.502，r＝0.9998

表明丹酚酸B在0.079～3.97μg范围内与峰面积积分值线性关系良好。

测定数据见表7，标准曲线见图5。

表7丹酚酸B进样量与峰面积线性关系

1.7精密度试验

1.7.1重复性考察

取同一批肾衰宁胶囊(批号20190515)0.2g，平行6份，精密称定，按含量测定方法操作并测定，对照品溶液浓度为0.07934mg/ml，平均峰面积为828.10，结果见表8。

表8供试品溶液重复性测试结果

结果丹酚酸B平均值为9.22mg/g，RSD(n＝6)为0.29％，表明该方法的重复性良好。

1.7.2中间精密度考察

在同一实验室，不同操作人员于不同日期、不同色谱柱(A：2019年7月22日测定，Agilentl260液相色谱仪，AgilentEC-C18色谱柱；B：2019年7月29日测定，Agilentl260液相色谱仪，AgilentSB-C18色谱柱)对3批样品用本文含量测定方法操作，并且计算。实验结果显示，本文确定的方法中间精密度良好(见表9)。

表9中间精密度考察结果(n＝3)

1.8准确度的实验

采用加样回收法。精密量取丹酚酸B对照储备液(0.08182mg/ml)9份，按加入量0.5、1.0、1.5倍分成三组，每组5.0ml、10.0ml、15.0ml，分别置于锥形瓶中，低温挥干，取已知含量的肾衰宁胶囊(批号20190515)粉末0.1g，精密称定，分别加入上述9个锥形瓶中，照1.2项下方法制备供试品溶液，再按1.2项下色谱条件测定含量，同时取对照品溶液浓度为79.34μg/ml，平均峰面积为：904.062进行计算，得丹酚酸B的平均回收率(n＝9)为97.97％，结果见表10。结果表明该方法的准确度良好。

表10加标回收率实验结果

1.9含量限度的确定

对肾衰宁胶囊多批样品进行测定，结果见表11。

表11多批样品含量测定结果

根据多批样品的实际含量测定结果，平均值为2.20mg/粒，暂订本品含丹参以丹酚酸B计，每粒不得少于1.5mg。

1.10耐用性试验

1.10.1pH值的考察

为了考察此条件中流动相比例小的变化对试验结果的影响程度，我们采用以下比例进行试验：乙腈-0.095％磷酸水，乙腈-0.1％磷酸水，乙腈-0.105％磷酸水，试验结果表明其理论塔板数和分离度均达到要求(见图6至图11)。

表12不同pH值比较结果

1.10.2柱温考察

由于柱温的高低对分离效果的影响比较大，为了试验方法的稳定性，我们选择25℃、30℃、35℃和40℃进行试验，试验结果表明其理论塔板效和分离度均达到要求(见图12至图23)。

表13不同柱温比较结果

1.10.3流速的考察

为了考察不同流速对试验结果的影响程度，我们选择0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min进行试验，试验结果表明其理论塔扳数和分离度均达到要求(见图24至图29)。

表14不同流速比较结果

1.10.4检测波长的考察

为了考察不同的检测波长对试验结果的影响程度，我们选择280nm、286nm和290nm进行试验，试验结果表明其理论塔板数和分离度均达到要求(见图30至图35)。

表14不同波长比较结果

经试验，说明上述试验条件的微小变化变动对系统适用性试验影响不大，表明我们选择的方法可行。

1.10.5稳定性考察

取同一份供试品(批号20190515)按1.2项含量测定方法制备供试品溶液，放置于室温、不避光条件下，间隔不同时间进行多次测定，结果丹酚酸B平均峰面积为756.99，RSD(n＝13)为0.34％，说明供试品在48小时内稳定，结果见表15。

表15供试品溶液稳定性测试结果

对比例1：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱，检测波长286nm；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按丹参素峰计算应不低于3500。

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含丹酚酸B40μg的混合溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物约0.2g，精密称定，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

对肾衰宁胶囊多批样品进行测定，结果见表16和图36至图38。

表16多批样品含量测定结果

本发明测定结果与对比基本上一致，但对比例采用梯度洗脱条件，色谱条件复杂，对检验设备要求高，检验耗时长，增加检验成本等缺点。

而本发明采用等比例的色谱条件，就可以实现对比例中丹酚酸B的定量测定，对检验设备的要求较低，操作更简便，耗时短，节约检测时间，节约检验成本等优点。

实施例2

1.仪器及试剂：HP-1260液相色谱仪(HP-1260系列四元泵，DAD检测器，自动进样器)。

紫外光谱测定用HP-1260液相色谱仪。

丹酚酸B对照品：编号为111562-201716，中国药品生物制品检定院提供，供含量测定用，纯度分别为94.1％。

流动相配制用色谱纯溶剂，所用其他溶剂均为分析纯。

2.高效液相色谱测定方法：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水溶液(23：77)为流动相，检测波长286nm；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含丹酚酸B 40μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的肾衰宁胶囊内容物约0.2g，精密称定，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

对肾衰宁胶囊多批样品进行测定，结果见表17和图39至图42。

表17多批样品含量测定结果

实施例3

1.仪器及试剂：HP-1260液相色谱仪(HP-1260系列四元泵，DAD检测器，自动进样器)。

紫外光谱测定用HP-1260液相色谱仪。

丹酚酸B对照品：编号为111562-201716，中国药品生物制品检定院提供，供含量测定用，纯度分别为94.1％。

流动相配制用色谱纯溶剂，所用其他溶剂均为分析纯。

2.高效液相色谱测定方法：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水溶液(24：76)为流动相，检测波长286nm；柱温30℃；流速为每分钟1.0ml。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备：取丹酚酸B对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含丹酚酸B 40μg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取装量差异项下的肾衰宁胶囊内容物约0.2g，精密称定，精密加入75％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟(功率250W，频率50kHz)，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

对肾衰宁胶囊多批样品进行测定，结果见表18和图43至图45。

表18多批样品含量测定结果