一种快速欧李组织培养的方法

摘要

本发明提供了一种快速欧李组织培养的方法，属于植物组织培养技术领域。本发明一种快速欧李组织培养的方法，包括以下步骤：将消毒的种子萌发，得到欧李幼苗切段，每个幼苗段至少保留一个腋芽；以幼苗段作为欧李外植体接种至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到欧李不定芽；将所述欧李不定芽接种至生根培养基上进行生根培养，得到长有不定根的欧李苗；将所述长有不定根的欧李苗炼苗移栽，得到完整的欧李植株。本发明将种子萌发获得的幼苗进行切断得到的带有腋芽的幼苗段为外植体进行组织培养，能大大提高不定芽诱导率，进而提高欧李植株的株数，满足市场对欧李植株的需求。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种快速欧李组织培养的方法。

背景技术

欧李又叫山梅子、小李仁、耨李儿等，主要分布在我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古河北、山东、山西等地。据了解，欧李成分中含有多种对人体有益的营养物质，尤其是其中的钙元素含量要比其他的水果要高很多。实际上欧李也是一种具有利水渗湿的中药材。现有技术中对欧李进行驯化栽培，有利于丰富市场果品种类。

现有技术中为了实现欧李的人工栽培，采用多种繁育技术，例如种子种植以及嫩枝扦插育苗。就种子种植而言，欧李种子的采集难度较大，就嫩枝扦插育苗而言，存在生根率较弱，移栽成活率也较低，这无疑给人工栽培欧李带来挑战。

为了不断探索欧李的人工栽培方法，现有技术开展了欧李组织培养工作，并初获成功，例如赵广德报报道了欧李组织培养的方法，其中公开了以一年生枝条为外植体进行组织培养的方法。但该方法对欧李组织培养的繁殖效率不理想，不能满足市场对大量欧李植株的需求。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速欧李组织培养的方法，有利于获得大量欧李组织苗。

本发明提供了一种快速欧李组织培养的方法，包括以下步骤：

1)将消毒的种子萌发，得到欧李幼苗切段，每个幼苗段至少保留一个腋芽；

2)以步骤1)中所述幼苗段作为欧李外植体接种至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到欧李不定芽；

3)将步骤2)中所述欧李不定芽接种至生根培养基上进行生根培养，得到长有不定根的欧李苗；

4)将步骤3)中所述带有不定根的欧李苗炼苗移栽，得到完整的欧李植株。

优选的，步骤2)中不定芽诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，还包括6-BA0.5～1.5mg/L、NAA 0.05～0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L。

优选的，所述不定芽诱导培养基还包括6-BA 0.5mg/L、NAA 0.05mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L。

优选的，步骤2)中所述不定芽诱导培养的温度为24～26℃；

所述不定芽诱导培养的湿度为40％～50％；

在所述不定芽诱导培养期间进行光照；所述光照的周期为光照16h/黑暗8h；光照强度为2000～3000Lx；

所述不定芽诱导培养的时间为28～32d。

优选的，步骤3)中在接种至生根培养基上进行生根培养前，将所述欧李不定芽进行继代培养；

所述继代培养用培养基是以MS培养基为基础培养基，还包括6-BA 0.3～0.7mg/L、NAA 0.05～0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L。

优选的，所述继代培养的温度为24～26℃；

所述继代培养的环境湿度为40％～50％；

在所述继代培养期间进行光照；所述光照的周期为光照16h/黑暗8h；光照强度为2000～3000Lx；

所述继代培养的时间为28～32d。

优选的，步骤3)中生根培养基是以1/2MS培养基为基础培养基，还包括NAA 0.5～0.7mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L。

优选的，步骤3)中所述生根培养的温度为24～26℃；

所述生根培养的环境湿度为40％～50％；

在所述生根培养期间进行光照；所述光照的周期为光照16h/黑暗8h；光照强度为2000～3000Lx；

所述生根培养的时间为28～32d。

优选的，步骤4)中所述炼苗移栽用基质为蛭石、泥炭土和珍珠岩的混合物；

所述蛭石、泥炭土和珍珠岩的体积比为3～2：2～1：1。

优选的，所述炼苗移栽的环境温度为28～32℃；所述炼苗移栽的环境湿度为80～90％。

本发明提供了一种快速欧李组织培养的方法，将灭菌的种子经培养萌发长成幼苗，将幼苗切段，每个幼苗段保留一个腋芽，作为外植体接种至不定芽诱导培养基上，由于幼苗的生长活力较为旺盛，作为外植体进行组织培养，分化得到无数不定芽，将不定芽切下接种至生根培养基上诱导生根，30d后得到大量生根欧李植株，经炼苗移栽，获得大量完整欧李植株。实验表明，不定芽诱导培养结束后，不定芽的诱导率为85％以上，为后续生根培养以及炼苗移栽提供充足的材料，有利于获得大量欧李植株。

本发明进一步限定了在不定芽生根培养前，还进行继代培养。所述继代培养有利于大大提高欧李不定芽的增殖数量。实验表明，每30天继代一次，不定芽的增值系数为20～30。

附图说明

图1为欧李继代增殖图；

图2为欧李生根结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种快速欧李组织培养的方法，包括以下步骤：

1)将消毒的种子萌发，得到欧李幼苗切段，每个幼苗段至少保留一个腋芽；

2)以步骤1)中所述幼苗段作为欧李外植体接种至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到欧李不定芽；

3)将步骤2)中所述欧李不定芽接种至生根培养基上进行生根培养，得到长有不定根的欧李苗；

4)将步骤3)中所述带有不定根的欧李苗炼苗移栽，得到完整的欧李植株。

本发明将消毒的种子萌发，得到欧李幼苗切段，每个幼苗段至少保留一个腋芽。

在本发明中，所述种子优选采用去外种皮的种子。本发明对所述消毒的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的消毒方法即可，例如采用70％～75％的酒精消毒10s，冲洗再用0.1％的升汞溶液消毒5min，冲洗。所述萌发用培养基优选以不含任何激素的MS培养基即可。所述萌发的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。所述萌发的环境湿度优选为40％～50％，更优选为42％～48％，最优选为45％。所述萌发的时间优选持续12～18h，待萌发至幼苗高度达到2cm时结束。所述切段优选使每个幼苗段的长度为0.8～1.2cm，更优选为1.0cm。

得到幼苗段后，本发明以所述幼苗段作为欧李外植体接种至不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导培养，得到欧李不定芽。

在本发明中，不定芽诱导培养基优选是以MS培养基为基础培养基，还包括6-BA0.5～1.5mg/L、NAA 0.05～0.2mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L；更优选还包括6-BA 0.5mg/L、NAA 0.05mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L。所述不定芽诱导培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。所述不定芽诱导培养的环境湿度优选为40％～50％，更优选为42％～48％，最优选为45％。在所述不定芽诱导培养期间优选进行光照；所述光照的周期优选为光照16h/黑暗8h。光照强度为2000～3000Lx，更优选为2500Lx。所述不定芽诱导培养的时间优选为28～32d，更优选为30d。经不定芽诱导培养，外植体上分化出大量的不定芽。经统计，不定芽的诱导率为85％～95％。

得到欧李不定芽后，本发明将所述欧李不定芽接种至生根培养基上进行生根培养，得到长有不定根的欧李苗。

在本发明中，在接种至生根培养基上进行生根培养前，优选将所述欧李不定芽进行继代培养。所述继代培养用培养基优选是以MS培养基为基础培养基，还包括6-BA 0.3～0.7mg/L、NAA 0.05～0.1mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L，更优选包括6-BA 0.5mg/L、NAA0.08mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L。所述继代培养的温度优选为24～26℃，更优选为25℃。所述继代培养的环境湿度优选为40％～50％，更优选为45％。在所述继代培养期间优选进行光照；所述光照的周期优选为光照16h/黑暗8h。光照强度为2000～3000Lx，更优选为2500Lx。所述继代培养的时间优选为28～32d，更优选为30d。继代培养利于使不定芽的数量进一步扩大。经统计，本发明所述方法进行继代培养，不定芽的增值系数达到20～30。

在本发明中，生根培养基优选是以1/2MS培养基为基础培养基，还包括NAA 0.5～0.7mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L，更优选为NAA 0.6mg/L、蔗糖30g/L和琼脂7.0g/L。所述生根培养的环境温度优选为24～26℃，更优选为25℃所述生根培养的环境湿度优选为40％～50％，更优选为42％～48％，最优选为45％。在所述生根培养期间进行光照；所述光照的周期优选为光照16h/黑暗8h。光照强度为2000～3000Lx，更优选为2500Lx。所述生根培养的时间优选为28～32d。所述生根培养接种10d左右开始长出不定根，培养30d后不定根长至2～3cm，可见本发明提供的生根方法能快速诱导生根。

在本发明中，所述炼苗移栽用基质优选为蛭石、泥炭土和珍珠岩的混合物。所述蛭石、泥炭土和珍珠岩的体积比优选为3～2：2～1：1，更优选为2：1：1。所述炼苗移栽的环境温度优选为28-32℃，更优选为30℃。所述炼苗移栽的环境湿度优选为80％～90％，更优选为90％。

本发明提供的欧李组织方法，以欧李种子为初始材料，在60～90天内获得大量完整欧李植株，实现快速欧李繁殖，满足市场对欧李苗的需求。

下面结合实施例对本发明提供的一种快速欧李组织培养的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种快速欧李组织培养方法

1、外植体的培养

将采集后的欧李种子拨开外种皮，在超净工作台上转移至灭过菌的容器内，用70％酒精消毒10s，无菌水漂洗3次；再用0.1％升汞溶液消毒5min，无菌水漂洗5次。将消过毒的种子接种预先配制好的MS培养基(不含任何激素)上，在13光照/11黑暗的条件下培养，光照强度为2500Lx，温度25℃，湿度为40％的条件下培养。15天后，待种子发芽，幼苗长至2cm左右时，将幼苗切成1.0cm左右的段，每段保留至少一个腋芽，作为外植体进行不定芽的增殖诱导。

2、不定芽的诱导

将获得幼苗段作为外植体进行不定芽的增殖诱导。将幼苗段接种在事先配制好的不定芽诱导培养基上，配方为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.08mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。将转接好的培养瓶置于光照16h/黑暗8h，光照强度为2500L，温度25℃，湿度40％的条件下培养。30天后，外植体会分化出无数的不定芽(见图1)。不定芽诱导率可达85％。

三、生根培养

当不定芽长至2～3cm时，切取生长健壮、半木质化的不定芽进行生根培养；生根培养基为1/2MS+NAA 0.5mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.2g/L。将接好的培养瓶置于光照16h/黑暗8h，温度25℃，湿度40％的条件下培养。接种10天左右，开始长出不定根，30天后，不定根可长至2～3cm，即可进行练苗移栽(见图2)。

四、炼苗移栽

将可以移栽的欧李组培苗从培养室转移至开放的室温条件下，打开封口膜炼苗3～4天，炼苗期间在培养基中加入少量清水并每天在植株表面喷洒清水以保持培养基和幼苗湿润，并在培养瓶上方罩一个透明玻璃或塑料罩子；在此期间将蛭石、泥炭土和珍珠岩按照表1中各组分的的比例混合后，装入营养钵中，用0.5％高锰酸钾溶液进行消毒，3～4天后即可进行移栽。移栽时将营养钵上层基质取出一部分，将组培苗上部用手固定在正中央，下部根系保持舒展置于营养钵中，然后将事先取出的基质均匀地覆盖在根系上并轻轻压实。移栽完成后，将营养钵转移至搭建好的塑料拱棚内(保持温度和水分)，用百菌清800倍液喷洒植株、基质表面及拱棚内部环境，必要时在拱棚上覆盖遮阴网避免高温灼伤幼苗。每日对移栽苗喷水以保持幼苗表面湿润，15天后，幼苗长出新叶即表明幼苗成活。移栽成活率统计结果见表1。比较3种基质的移栽成活率可知，蛭石、泥炭土和珍珠岩的体积比为2：1：1时移栽成活率最佳，可达93.3％。

表1不同基质中欧李组培苗移栽结果统计

实施例2

1、外植体的培养

将采集后的欧李种子拨开外种皮，在超净工作台上转移至灭过菌的容器内，用75％酒精消毒10s，无菌水漂洗3次；再用0.1％升汞溶液消毒5min，无菌水漂洗5次。将消过毒的种子接种在事先配制好的不含任何激素的MS培养基上，在13/11h光照条件下，光照强度为2500Lx，温度24℃，湿度为50％的条件下培养。15天后，待种子发芽，幼苗长至2cm左右时，将幼苗切成1.0cm左右的段，每段保留至少一个腋芽，作为外植体进行不定芽的增殖诱导。

2、不定芽的诱导

将幼苗段接种在事先配制好的增殖培养基上。培养基配方为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。将转接好的继代培养瓶置于光照16h/黑暗8h，光照强度为2500Lx，温度24℃，湿度50％的条件下培养。30天后，外植体会分化出无数的不定芽。初代诱导率可达87.5％。

二、继代增殖培养

将不定芽诱导培养后形成的不定芽剪下，转移在继代培养基中进行继代增殖培养导，继代培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.08mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。将转接好的培养瓶置于光照16h/黑暗8h，光照强度为2500Lx，温度24℃，湿度50％的条件下培养。每30天继代一次，增值系数28倍。

三、生根培养

待不定芽长至2～3cm时，切取生长健壮、半木质化的不定芽进行生根培养。不符合生根条件的不定芽，继续在继代培养基中培养。生根培养基为1/2MS+NAA 0.7mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.2g/L。将转接好的继代培养瓶置于光照16h/黑暗8h，光照强度为2500Lx，温度24℃，湿度50％的条件下培养。接种10天左右，开始长出不定根，30天后，不定根可长至2～3cm，即可进行练苗移栽。

四、炼苗移栽

将可以移栽的欧李组培苗从培养室转移至开放的室温条件下，打开封口膜炼苗3-4天，炼苗期间在培养基中加入少量清水并每天在植株表面喷洒清水以保持培养基和幼苗湿润，并在培养瓶上方罩一个透明玻璃或塑料罩子；在此期间将蛭石、泥炭土和珍珠岩按照体积比2:1:1的比例混合后，装入营养钵中，用0.5％高锰酸钾溶液进行消毒，3～4天后即可进行移栽。移栽时将营养钵上层基质取出一部分，将组培苗上部用手固定在正中央，下部根系保持舒展置于营养钵中，然后将事先取出的基质均匀地覆盖在根系上并轻轻压实。移栽完成后，将营养钵转移至搭建好的塑料拱棚内(保持温度和水分)，用百菌清800倍液喷洒植株、基质表面及拱棚内部环境，必要时在拱棚上覆盖遮阴网避免高温灼伤幼苗。每日对移栽苗喷水以保持幼苗表面湿润，15天后，幼苗长出新叶即表明幼苗成活。移栽成活率可达94.2％。

实施例3

1、外植体的培养

将采集后的欧李种子拨开外种皮，在超净工作台上转移至灭过菌的容器内，用75％酒精消毒10s，无菌水漂洗3次；再用0.1％升汞溶液消毒5min，无菌水漂洗5次。将消过毒的种子接种在事先配制好的不含任何激素的MS培养基上，在13/11h光照条件下，光照强度为2500Lx，温度26℃，湿度为45％的条件下培养。15天后，待种子发芽，幼苗长至2cm左右时，将幼苗切成1.0cm左右的段，每段保留至少一个腋芽，作为外植体进行不定芽的增殖诱导。

2、不定芽的诱导

将幼苗段接种在事先配制好的增殖培养基上。培养基配方为MS+6-BA0.7mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。将转接好的继代培养瓶置于光照16h/黑暗8h，光照强度为2500Lx，温度26℃，湿度45％的条件下培养。30天后，外植体会分化出无数的不定芽。初代诱导率可达84.7％。

二、继代增殖培养

将初代培养后形成的不定芽剪下，转移在继代培养基中进行继代增殖培养导，继代培养基为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7.0g/L。将转接好的继代培养瓶置于光照16h/黑暗8h，温度25±1℃，湿度45％的条件下培养。每30天继代一次，增值系数23倍。

三、生根培养

待不定芽长至2～3cm时，切取生长健壮、半木质化的不定芽进行生根培养。不符合生根条件的不定芽，继续在继代培养基中培养。生根培养基为1/2MS+NAA 0.6mg/L+蔗糖20g/L+琼脂7.2g/L。将转接好的继代培养瓶置于光照16h/黑暗8h，温度25±1℃，湿度45％的条件下培养。接种10天左右，开始长出不定根，30天后，不定根可长至2～3cm，即可进行练苗移栽。

四、炼苗移栽

将可以移栽的欧李组培苗从培养室转移至开放的室温条件下，打开封口膜炼苗3-4天，炼苗期间在培养基中加入少量清水并每天在植株表面喷洒清水以保持培养基和幼苗湿润，并在培养瓶上方罩一个透明玻璃或塑料罩子；在此期间将蛭石、泥炭土和珍珠岩按照2:1:1的比例混合后，装入营养钵中，用0.5％高锰酸钾溶液进行消毒，3～4天后即可进行移栽。移栽时将营养钵上层基质取出一部分，将组培苗上部用手固定在正中央，下部根系保持舒展置于营养钵中，然后将事先取出的基质均匀地覆盖在根系上并轻轻压实。移栽完成后，将营养钵转移至搭建好的塑料拱棚内(保持温度和水分)，用百菌清800倍液喷洒植株、基质表面及拱棚内部环境，必要时在拱棚上覆盖遮阴网避免高温灼伤幼苗。每日对移栽苗喷水以保持幼苗表面湿润，15天后，幼苗长出新叶即表明幼苗成活。移栽成活率可达93.7％。

实施例4

为了摸索欧李不定芽初代诱导最佳的激素浓度，按照表2中6-BA和NAA的浓度组合配制不定芽诱导培养基，按照实施例3的方法进行不定芽诱导培养。统计出芽数，按照公式I计算不定芽诱导率。

不定芽诱导率(％)＝出芽数/接种数×100％ 式I。

表2欧李不定芽初代诱导结果统计表

由表2可知，以含蔗糖30g/L、琼脂7.0g/L的MS为基本培养基，6-BA0.5mg/L+0.05～0.2mg/L的NAA的组合进行不定芽诱导，使欧李不定芽诱导率达到65％～85％，其中当6-BA浓度为0.5mg/L，NAA浓度为0.05mg/L时，不定芽诱导效果最佳。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。