一种糠酸莫米松凝胶中糠酸莫米松的提取和检测方法

摘要

本发明公开了一种糠酸莫米松凝胶中糠酸莫米松的提取和检测方法，属于分析化学技术领域。提取方法包括：将糠酸莫米松凝胶和内标溶液、乙腈混合，得混合液1；所述内标溶液为丙酸倍氯米松的乙腈溶液；混合液1通过振摇或超声处理进行提取得混合液2；混合液2冷却，离心，得上清液。检测时将所得上清液用稀释剂A稀释，摇匀，微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，用内标法在高效液相色谱仪上进行含量测定。本发明使糠酸莫米松凝胶中的糠酸莫米松被充分提取，方法学验证中专属性与系统适用性、准确度、精密度、线性与范围、耐用性等均良好，供试品溶液稳定。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种糠酸莫米松凝胶中糠酸莫米松的提取和检测方法。

背景技术

糠酸莫米松是一种人工合成的糖皮质激素药，化学名为9,21-二氯-11b,17-二羟基-16a-甲基孕甾-1,4-二烯-3,20-二酮17-(2-糠酸酯)，局部使用具有抗炎、止痒和血管收缩作用，可用于缓解牛皮癣、特应性皮炎(特应性湿疹)、其他皮肤病引起的发红、皮肤水肿(肿胀)、搔痒、皮肤变硬、剥落、起泡、裂开、渗出和不舒适感，其中，其他皮肤病包括接触性皮炎、脂溢性皮炎、干性湿疹、盘状湿疹、静脉性湿疹、疱疹样皮炎、神经性皮炎、自体湿疹化等，具有疗效强、肾上皮质功能抑制低的特点。

对于药品的含量检测，李蔚等人提出了一种用HPLC法测定糠酸莫米松乳膏含量的方法，该方法设定：色谱条件为Amethyst C8(5μm，150mm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(72:28)，定量环为10μL，运行时间为2倍主峰保留时间UV15检测器(检测波长254nm)，流速为1.0mL/min。在该方法下糠酸莫米松乳膏内标峰与主峰分离状况良好。在HPLC色谱中检测出糠酸莫米松含量在0.0142-0.0568g/L的浓度范围内相关性良好，F＝17.603×C－0.0026(R＝0.99998，n＝7)。重复性、回收率、精密度良好，RSD均小于2％，该色谱系统稳定，溶液在24h内稳定性良好。故所建立的方法快速正确，重现性好，专属性强。

蔡伟等人提出一种复方糠酸莫米松乳膏的研制及含量测定方法，含量测定方法为取本品适量(约相当于糠酸莫米松1.0mg，硝酸益康唑10.0mg，尿囊素5.0mg)，精密称定，置50mL量瓶中，加甲醇30.0mL，置80℃水浴中加热2min，振摇使溶，放冷至室温。用甲醇稀释至刻度，摇匀，置冰浴中冷却2h，取出迅速滤过，精密量取续滤液20μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取糠酸莫米松、硝酸益康唑和尿囊素对照品适量，加甲醇溶解并制成每1mL中含糠酸莫米松20μg、硝酸益康唑200μg和尿囊素100μg的对照品溶液，同法测定。按外标法以峰面积计算，测得3批样品中糠酸莫米松的含量分别为相当于标示量的101.6％，98.7％，100.3％；硝酸益康唑分别为100.2％，98.2％和97.4％；尿囊素分别为98.4％，100.2％和98.6％。该方法操作方便，结果准确，灵敏度高。

糠酸莫米松凝胶比糠酸莫米松乳膏具有更好的外观和吸收性能，但是由于性状的改变，提取方法对二者并不通用。目前缺少针对糠酸莫米松凝胶的提取和含量检测方法。依据现行的含量检测方法，所得液相色谱图中糠酸莫米松峰及其降解产物主峰前沿、分离度小，无法准确测定产品含量。

有鉴于此，本发明提供一种糠酸莫米松凝胶中糠酸莫米松的提取和检测方法，解决现行标准无法适应该类产品质量检测问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种糠酸莫米松凝胶中糠酸莫米松的提取和检测方法，该方法能够有效提取并检测糠酸莫米松凝胶中的糠酸莫米松，通用性广，能有效提取该化合物且不会对其产生破坏，同时不干扰后续检测。

为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种从糠酸莫米松凝胶中提取糠酸莫米松的方法，包括以下步骤：

(1)将糠酸莫米松凝胶和内标溶液、乙腈混合，得混合液1；所述内标溶液为丙酸倍氯米松的乙腈溶液。

(2)混合液1通过振摇或超声处理进行提取得混合液2；

(3)混合液2冷却，离心，得上清液。

优选的，步骤(1)中，所述内标溶液中丙酸倍氯米松含量为0.5mg/mL。

优选的，步骤(1)中，所述糠酸莫米松药物、内标溶液和乙腈的质量体积比为2:15-60:10-40(g:mL:mL)，进一步优选为2:15:10(g:mL:mL)。

优选的，步骤(2)中，所述提取的时间为2-10min，进一步优选为振摇2min。

优选的，步骤(2)中，所述超声的频率30-50KHz，进一步优选为40KHz。

优选的，步骤(2)中，所述振摇是人工振摇。

优选的，步骤(3)中，所述冷却为在冰浴中冷却10min。

优选的，步骤(3)中，所述离心转速为2500-5000r/min，离心时间为3-10min，进一步优选的，所述离心转速为3500r/min，离心时间为5min。

另一方面，本发明提供一种糠酸莫米松凝胶中糠酸莫米松的检测方法，将按照上述提取方法提取得到的上清液用稀释剂A稀释，摇匀，微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，用高效液相色谱法进行测定。

优选的，所述稀释剂A由甲醇、水、冰醋酸按照体积比65:35:0.2组成。

优选的，所述上清液和稀释剂的体积比为1:2.5。

优选的，所述稀释的温度为25-35℃，进一步优选为30℃。

优选的，所述高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱

检测波长：249-259nm；

流速：0.9-1.1mL/min；

柱温：20-30℃

进样量：15-25μL

系统适应性：主峰与降解产物峰分离度应符合药典规定

流动相：甲醇-水，甲醇和水体积比60-70:30-40

等度洗脱。

进一步优选的，所述高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱

检测波长：254nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：25℃

进样量：20μL

系统适应性：主峰与降解产物峰分离度应符合药典规定

流动相：甲醇-水，甲醇和水体积比65:35

等度洗脱。

优选的，所述检测方法具体包括以下步骤：

(1)制备对照品溶液：取糠酸莫米松对照品，加乙腈稀释为0.14mg/mL的溶液，加入内标溶液，然后用稀释剂A稀释，作为对照品溶液，对照品溶液中糠酸莫米松对照品的浓度为35μg/mL。

按照前述方法制备供试品溶液；

(2)精密量取对照品溶液、供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，即得。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供了糠酸莫米松凝胶中糠酸莫米松的提取和检测方法，该方法能够有效提取并检测糠酸莫米松凝胶中的糠酸莫米松，通用性广，解决现行标准无法适应该类产品质量检测问题。

(2)本发明的糠酸莫米松凝胶糠酸莫米松检测系统适用性良好，样品可被充分提取，回收率、拟合程度、耐用性、专属性等均良好，供试品溶液稳定。

附图说明

图1为系统适用性溶液色谱图；

图2为对照品溶液色谱图；

图3为供试品溶液色谱图；

图4为专属性试验色谱图，其中，虚线代表供试品溶液，实线代表阴性对照溶液，虚线峰1为糠酸莫米松峰，虚线峰2为丙酸倍氯米松峰；

图5为专属性试验色谱图，其中，虚线代表供试品溶液，实线代表空白溶剂，虚线峰1为糠酸莫米松峰，虚线峰2为丙酸倍氯米松峰；

图6为阴性对照色谱图，其中，1为丙酸倍氯米松峰；

图7为空白溶剂色谱图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。为了清楚，不描述实际实施例的全部特征。在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本发明由于不必要的细节而混乱。应当认为在任何实际实施例的开发中，必须做出大量实施细节以实现开发者的特定目标。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，

糠酸莫米松凝胶为自制，批号：1812202

制备方法具体为：(1)取5-12份水溶性基质分散于纯化水中溶胀，加入1-5份稠度调节剂，搅拌至透明凝胶状，得凝胶基质：(2)取30-50份助溶剂、80-120份保湿剂与50-90份溶剂混匀，再加入0.1-1份防腐剂与0.5-2份糠酸莫米松，搅拌溶解得主药溶液；(3)将0.2-0.55份酸与纯化水混合，配制成质量分数0.5-2％的酸溶液；(4)向步骤(1)得到的凝胶基质中加入步骤(3)所得的酸溶液，搅拌均匀，再加入步骤(2)得到的主药溶液，搅拌均匀，即得糠酸莫米松凝胶。

糠酸莫米松原料药：上海新华联制药有限公司，批号：C006-170701

糠酸莫米松对照品：中国食品药品检定研究院批号：100930-201201；510022-201301

丙酸倍氯米松对照品：中国食品药品检定研究院批号：100119-201504

所用仪器有：

岛津LC-20AT高效液相色谱仪

岛津SPD-20A紫外可见光检测器

UC7100S超声波清洗仪

HHS-65电子恒温水浴锅

Sartorius MA 110电子天平

Sartorius BT 25s电子天平

Thermo BDS Hyperil C8色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)SN：10676292

Thermo BDS Hyperil C8色谱柱(250mm*4.6mm，5μm)SN：10803822

Agilent Eclipse XDB-C8色谱柱(150mm*4.6mm，5μm)SN：USRK051091

1、糠酸莫米松的不同提取方法

内标溶液：取丙酸倍氯米松适量，加乙腈溶解并稀释制成每1mL中约含丙酸倍氯米松0.5mg的溶液，即得。

对照品溶液：取糠酸莫米松对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成每1mL中约含0.14mg的溶液，精密量取15mL，精密加入内标溶液15mL，摇匀，精密量取5mL，置10mL量瓶，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

所高效液相色谱法的色谱条件为：

色谱柱：Thermo BDS Hyperil C8色谱柱SN：10676292

检测波长：254nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：25℃

进样量：20μL

系统适应性：主峰与降解产物峰分离度应符合要求

流动相：甲醇-水，甲醇和水体积比65:35

等度洗脱。

含量测定法：精密量取对照品溶液、供试品溶液各20μl分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，即得。

实施例1.1不同提取方式

取糠酸莫米松凝胶适量(约2g，相当于糠酸莫米松2mg)，精密称定，置25mL容量瓶中，精密加入内标溶液15mL，加乙腈稀释至刻度，分别：

a、强力振摇2分钟；

b、超声(40KHz)处理5分钟，

置冰浴中冷却10分钟，迅速离心(离心转速为3500r/min，离心时间为5min)，得上清液。

将上清液放至室温，分别精密量取上清液4mL，置10mL量瓶中，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，分别作为供试品溶液。

结果如下：

表1.

实施例1.2不同提取时间

取糠酸莫米松凝胶适量(约2g，相当于糠酸莫米松2mg)，精密称定，置25mL容量瓶中，精密加入内标溶液15mL，加乙腈稀释至刻度，分别：

a、强力振摇2分钟，置冰浴中冷却10分钟，迅速离心；

b、强力振摇5分钟，置冰浴中冷却10分钟，迅速离心；

c、强力振摇10分钟，置冰浴中冷却10分钟，迅速离心，

将上清液放至室温，分别精密量取上清液4mL，置10mL量瓶中，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，分别作为供试品溶液。

结果如下：

表2.

实施例1.3不同离心转速

取糠酸莫米松凝胶适量(约2g，相当于糠酸莫米松2mg)，精密称定，置25mL容量瓶中，精密加入内标溶液15mL，加乙腈稀释至刻度，强力振摇2分钟，置冰浴中冷却10分钟，分别：

a、迅速离心(2500r/min，5min)；

b、迅速离心(3500r/min，5min)；

c、迅速离心(5000r/min，5min)，

上清液放至室温，分别精密量取上清液4mL，置10mL量瓶中，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，分别作为供试品溶液。

结果如下：

表3.

实施例1.4不同离心时间

取糠酸莫米松凝胶适量(约2g，相当于糠酸莫米松2mg)，精密称定，置25mL容量瓶中，精密加入内标溶液15mL，加乙腈稀释至刻度，强力振摇2分钟，置冰浴中冷却10分钟，

a、迅速离心(3500r/min，3min)；

b、迅速离心(3500r/min，5min)；

c、迅速离心(3500r/min，10min)，

上清液放至室温，分别精密量取上清液4mL，置10mL量瓶中，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，分别作为供试品溶液。

结果如下：

表4.

实施例1.5不同提取溶剂量

取糠酸莫米松凝胶(约2g，相当于糠酸莫米松2mg)，精密称定，

a、置25mL量瓶中，精密加入内标溶液15mL，加乙腈稀释至刻度；

b、置50mL量瓶中，精密加入内标溶液30mL，加乙腈稀释至刻度；

c、置100mL量瓶中，精密加入内标溶液60mL，加乙腈稀释至刻度，

强力振摇2分钟，置冰浴中冷却10分钟，迅速离心(3500r/min，5min)，上清液放至室温，分别精密量取上清液4mL，置10mL量瓶中，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，分别作为供试品溶液。

对比例1

与实施例1.5不同的是，称定糠酸莫米松凝胶后置20mL量瓶中，精密加入内标溶液10mL，加乙腈稀释至刻度；

结果如下：

表5.

实施例1.6不同稀释温度

取糠酸莫米松凝胶适量(约2g，相当于糠酸莫米松2mg)，精密称定，置25mL容量瓶中，精密加入内标溶液15mL，加乙腈稀释至刻度，强力振摇2分钟，置冰浴中冷却10分钟，迅速离心(3500r/min，5min)，上清液放至室温，分别精密量取上清液4mL，置10mL量瓶中，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，

a、置于25℃环境中2min；

b、置于30℃水浴中2min；

c、置于35℃水浴中2min，

摇匀，用微孔滤膜滤过，分别作为供试品溶液。

对比例2

与实施例1.6不同的是，

置于50℃水浴中2min；

结果如下：

表6.

2、测量方法

内标溶液：同1；

对照品溶液：同1；

若无特殊说明，供试品溶液为：取本品适量(约相当于糠酸莫米松2mg)，精密称定，置25mL具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液15mL，用乙腈稀释至刻度，强力振摇2分钟，置冰浴中冷却10分钟，迅速离心(3500r/min，5min)，上清液放至室温，精密量取上清液4mL，置10mL量瓶中，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，置于30℃水浴中2min，摇匀，微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

色谱条件：同1

含量测定法：同1。

2.1专属性试验

糠酸莫米松凝胶阴性对照制备：(1)取5-12份水溶性基质分散于纯化水中溶胀，加入1-5份稠度调节剂，搅拌至透明凝胶状，得凝胶基质：(2)取30-50份助溶剂、80-120份保湿剂与50-90份溶剂混匀，再加入0.1-1份防腐剂，搅拌溶解得空白主药溶液；(3)将0.2-0.55份酸与纯化水混合，配制成质量分数0.5-2％的酸溶液；(4)向步骤(1)得到的凝胶基质中加入步骤(3)所得的酸溶液，搅拌均匀，再加入步骤(2)得到的空白主药溶液，搅拌均匀，即得糠酸莫米松凝胶阴性对照样品。

按方法称取糠酸莫米松凝胶阴性对照(不含主药的处方凝胶)1.9985g，精密称定，置25mL具塞锥形瓶中，精密加入内标溶液15mL，用乙腈稀释至刻度，强力振摇2分钟，置冰浴中冷却10分钟，迅速离心，上清液放至室温，精密量取上清液4mL，置10mL量瓶中，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，作为阴性对照溶液。取阴性对照溶液、供试品溶液，按糠酸莫米松含量测定项下方法测定，记录色谱图，如附图4所示。结果表明：空白辅料(即阴性对照)对测定无干扰，方法专属。

2.2准确度(加样回收率)试验

取糠酸莫米松对照品适量(约28mg)，精密称定加乙腈稀释到100mL，制成每毫升含糠酸莫米松对照品280ug的溶液，作为糠酸莫米松凝胶回收率试验对照品储备液；取本品适量(约相当于糠酸莫米松1mg)9份，精密称定，再分别加入储备液液2.0mL、3.5mL、5mL各三份，置25mL量瓶中，精密加入内标溶液各15mL，用乙腈稀释至刻度，强力振摇2分钟，置冰浴中冷却10分钟，迅速离心(3500r/min，5min)，上清液放至室温，精密量取上清液4mL，置10mL量瓶中，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，置于30℃水浴中2min，摇匀，用微孔滤膜滤过，作为供试品溶液，检测，计算，如下表：

表7.

上述结果显示，所测得各组回收率数据均在99.4％-100.9％之间，RSD＝0.5％，该方法回收率良好。

2.3精密度试验

2.3.1重复性试验

取糠酸莫米松凝胶适量，按糠酸莫米松含量测定项下方法测定含量，重复测定6次，计算，既得，结果如下表：

表8.

该方法精密度良好。

2.3.2中间精密度试验

由不同人员，在不同实验室、不同时间按糠酸莫米松含量测定项下方法测定，结果如下表：

表9.

2.4线性与范围

精密称取糠酸莫米松对照品14mg，置于20mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，作为线性对照品储备液。

精密称取丙酸倍氯米松对照品50mg，置于100mL量瓶中，加乙腈稀释至刻度，作为线性内标物储备液。

分次量取线性对照品储备液1mL、2mL、3mL、4mL、6mL，分别置于50mL量瓶中，各精密加入内标溶液15mL，再分别加入乙腈14mL、13mL、12mL、11mL、9mL，摇匀，分别精密量取上述溶液5mL，各置10mL量瓶，用稀释剂[甲醇-水-冰醋酸(65:35:0.2)]稀释至刻度，摇匀，作为线性对照品溶液。精密量取线性对照品溶液各20μL分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算结果，列出回归方程、相关系数和线性范围，结果如下表所示。

表10.

由表10可知，线性方程为Y＝0.4041x，相关系数r＝0.99998，糠酸莫米松浓度在11.51ug/mL-69.03ug/mL范围内拟合良好。

2.5溶液稳定性实验

供试品溶液分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12小时，再按照测定方法测定。结果如下表：

表11.

结果表明：溶液稳定性良好。

2.6耐用性

取待测样品适量，按本申请方法测定含量，改变流速、色谱柱、柱温、流动相比例、检测波长，在不同条件下各测定两次，计算结果。

(1)不同流速

取供试品溶液，按流速0.9mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min，分别测定含量，记录色谱图，计算结果如表12-13所示。

表12.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同流速系统适用性试验分离度统计表

表13.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同流速含量测定结果统计表

由表12-13可知，本方法在流速变动范围0.9-1.1mL/s时，分离度＞1.5，含量测定结果RSD＝0.1％，符合要求。

(2)不同色谱柱

取上述供试品溶液，取不同色谱柱，分别测定含量，记录色谱图，计算结果如表14-15所示。

表14.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同色谱柱系统适用性试验分离度统计表

表15.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同色谱柱含量测定结果统计表

由表14-15可知，本方法在使用不同批次的Thermo BDS Hypersil C8色谱柱以及使用Agilent Eclipse XDB-C8(150mm)色谱柱时，分离度＞1.5，含量测定结果RSD＝0.8％，符合要求。

(3)不同柱温

取上述供试品溶液，按柱温分别为20℃、25℃、30℃，分别测定含量，结果如表16-17所示。

表16.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同柱温系统适用性试验分离度统计表

表17.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同柱温含量测定结果统计表

由表16-17可知，本方法在温度变动范围在20-30℃时，分离度＞1.5，含量测定结果RSD＝1.4％，符合要求。

(4)不同流动相比例

取上述供试品溶液，检查流动相分别为甲醇-水(60：40)、甲醇-水(65：35)、甲醇-水(70：30)时，分别测定含量，结果如表18、19所示。各条件下结果应符合要求：杂质峰与成分峰分离度≥1.5、各条件下含量数据RSD％≤2(n＝6)。

表18.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同流动相比例系统适用性试验分离度统计表

表19.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同流动相比例含量测定结果统计表

由表18-19可知，本方法在流动相分别为甲醇-水(60：40)、甲醇-水(65：35)、甲醇-水(70：30)时，分离度＞1.5，含量测定结果RSD＝0.6％，符合要求。

(5)不同检测波长

取上述供试品溶液，检查波长分别为249nm、254nm、259nm，分别测定含量，结果如表20-21所示。各条件下结果应符合要求：杂质峰与成分峰分离度≥1.5、各条件下含量数据RSD％≤2(n＝6)。

表20.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同检测波长系统适用性试验分离度统计表

表21.糠酸莫米松凝胶含量测定耐用性试验-不同检测波长含量测定结果统计表

由表20-21可知，本方法在检测波长249-259nm时，分离度＞1.5，含量测定结果RSD＝0.2％，符合要求。

3、结果分析

将各个验证项目结果统计如下：

表22.

对比例3

按照以上方法，对糠酸莫米松乳膏制品(自制，批号为200822)进行检测。结果分析如下：

表23.

可以看出，本发明的提取和检测方法，更适用于凝胶。

上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。