双环醇和小檗碱联合用于预防和治疗非酒精性脂肪性肝病的用途

摘要

本发明公开了双环醇和小檗碱联合用于预防和治疗非酒精性脂肪性肝病的用途，属于生物医药技术领域。在本发明中，所述的双环醇和小檗碱均为安全性好、适于长期服用的已上市药物。实验表明，双环醇和小檗碱联合应用比各自单药应用能更显著的预防和治疗非酒精性(或代谢相关)脂肪性肝病，两者组合应用具有协同作用。因此，双环醇和小檗碱的药物组合在防治非酒精性(或代谢相关)脂肪性肝病方面将具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及双环醇和小檗碱联合用于预防和治疗非酒精性脂肪性肝病中的用途。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种常见的代谢应激性慢性肝病，疾病谱包括非酒精性肝脂肪变(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，前者仅肝组织脂质堆积，后者还伴有炎症和/或纤维化、甚至肝硬化。(注：2020年以来国际专家组建议将该类疾病更名为代谢相关脂肪性肝病(MAFLD))。随着肥胖和代谢综合征的流行，NAFLD患病率逐年上升，目前全球NAFLD患病率约为25％(14％～32％)，中国的患病率亦高达15％以上，已成为全球第一大慢性肝病和健康体检肝生化指标异常的首要原因。NAFLD不仅可以导致肝病恶化进而危及患者生命，还与代谢综合征、2型糖尿病、动脉硬化性心血管疾病以及结直肠肿瘤等的高发密切相关，严重影响国民健康。且随着生活方式和节奏的改变，代谢异常的发生还趋于年轻化，脂肪肝病在较年轻的人口中也普遍存在，严重影响我国未来社会进步和经济发展。

然而，目前尚无防治NAFLD的特效药，主要是对症治疗，但效果欠佳。因此，NAFLD防治药物的研发已成为各国研究的热点和焦点。国内外有若干药物处于临床研究的不同阶段，许多新药甚至被美国食品和药品管理局(FDA)授予了快速审评资格，但由于临床试验中出现了与预期不一致的结局或在随机对照试验中缺乏治疗效益，临床试验相继宣告失败，至今尚无批准公认的药物用于临床防治NAFLD。

非酒精性脂肪性肝病的发病机制与进展过程复杂。“二次打击”理论被广泛认同，即多种遗传和代谢等因素的联合作用诱发胰岛素抵抗(IR)，其可增加脂肪分解和游离脂肪酸转运至肝脏，大量脂质堆积在肝脏，导致肝脏第一次打击，脂肪肝形成。同时，肝脏对代谢产物及炎性因子的敏感性增强，体内氧化产物和炎性因子释放增多，进一步加重IR，如此形成恶性循环，加重肝细胞的损伤，导致肝细胞变性，即第二次打击。随着研究的深入，包括神经内分泌免疫炎症网络在内的“多重打击”学说已逐渐替代了经典的“二次打击”学说，胰岛素抵抗、脂肪组织功能障碍、线粒体功能障碍、内质网应激、炎症激活、脂肪酸、肠道菌群、铁超载、饮食因素以及遗传和表观遗传因素等均参与NAFLD的疾病进展。针对这些发病机理的某一环节进行的药物干预和新药研发仍在进行之中，但由于NAFLD病理生理的复杂性，单一靶点药物很难从根本上防治NAFLD，甚至由于对靶点的作用认识不全面，靶向药物防治甚至会引起安全性方面的弊端，这将是今后抗NAFLD药物研发所要面临的巨大挑战。因此，不同作用机制的药物联合应用或许受益更大，而寻找具有潜在防治NAFLD作用的已上市药物进行联合用药可能会缩短药物研发进程，对NAFLD的防治或有突破性的进展。

小檗碱(Berberine)，又称黄连素，是临床在用的非处方类药物，用于治疗肠道感染及腹泻。近来研究发现小檗碱具有多种药理学作用，包括抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤、心脏保护、降血糖、调节脂质代谢以及免疫抑制等，其临床应用潜力不断被开发，已报道其对心血管系统疾病、代谢综合征及其并发症、肿瘤、腹腔黏连和沙眼衣原体感染等均具有较好的效果。其中，小檗碱治疗NAFLD的药理学研究及临床病例报道提示其用于治疗NAFLD的潜能，具体机制与其直接触发胰岛素分泌、激活AMPK、调节肠道菌群及增加低密度脂蛋白受体表达等有关。

双环醇(Bicyclol，商品名：百赛诺)是我国于2004年上市的国家一类新药。临床上，双环醇片已在许多国家用于治疗伴有血清氨基转移酶异常的轻、中度慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎以及各种类型的非病毒性肝炎。临床前药理学实验也表明，双环醇在化学性、免疫性、脂肪性、药物诱导及手术损伤导致的肝损伤模型中具有很好的肝保护和抗炎作用，并且能够抑制由四氯化碳、牛血清白蛋白及胆管结扎等引起的肝纤维化。其中，双环醇对脂肪性肝损伤的保护作用与抑制氧化应激和炎症因子的过表达、抗纤维化、保护线粒体等有关。尽管各类保肝抗炎药物用于治疗NAFLD的应用未在临床上得以充分证实，但《非酒精性脂肪性肝病防治指南》中推荐保肝药物可作为辅助治疗用于NASH伴氨基转移酶升高或肝损伤的患者。《双环醇片临床应用专家建议》中也提出双环醇片用于脂肪性肝病能有效改善肝功能异常的NAFLD患者的肝功能及肝组织学炎症病变。

在寻找联合用药预防和治疗NAFLD的研究中，本发明证实：在游离脂肪酸FFA诱导的肝细胞脂质堆积细胞模型中给予双环醇和小檗碱处理，可显著降低细胞脂质沉积，特别是联合给药组；在模拟人类疾病进展的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中，双环醇及小檗碱各自单药应用对NAFLD均有一定的预防和治疗效果，而两者组合用药效果显著增加。本发明因此提出了双环醇和小檗碱联合用于预防和治疗非酒精性(或代谢相关)脂肪性肝病的用途，迄今为止未见国内外这一药物组合应用的相关文献报道，此种联合用药组合方案能够为临床防治NAFLD提供便捷的用药参考，同时也有望开发用于防治非酒精性(或代谢相关)脂肪性肝病的双环醇和小檗碱的组合药物。

发明内容

本发明的目的在于提供双环醇和小檗碱联合用于预防和治疗非酒精性(或代谢相关)脂肪性肝病的用途。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段，具体的：

(1)双环醇和小檗碱联合应用预防非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)细胞模型的作用：采用0.1mM游离脂肪酸FFA(OA：PA＝2：1)诱导HepG2细胞，同时设置双环醇(0.5、2μM)干预组、小檗碱(0.5、2μM)干预组、双环醇和小檗碱不同剂量联合组。诱导同时给药24h，用NileRed染色法检测药物对脂滴的作用。结果发现，双环醇和小檗碱单独用药可降低脂滴堆积，而联合用药作用显著优于单独用药。

(2)双环醇和小檗碱联合应用预防非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)作用：采用西方饮食诱导雄性C57BL/6J小鼠，同时设置小檗碱(50或200mg/kg/day)干预组、双环醇(50或200mg/kg/day)干预组、双环醇和小檗碱不同剂量联合组，诱导同时给药16周。结果发现：双环醇和小檗碱联合应用是安全的，各剂量双环醇和小檗碱联用较其单药应用可以更明显的改善肝脏大体脂质沉积土黄色外观，组织病理上更明显的降低NAFLD活动度评分(NASScore)。同时，双环醇和小檗碱联用能更明显改善NAFLD小鼠肝功(血清ALT、AST)，并更显著降低肝脏甘油三脂(TG)、胆固醇(CHO)积累，整体效果优于单独用药。

(3)双环醇和小檗碱联合应用治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)作用：采用西方饮食+四氯化碳(CCl

因此，本发明所述的双环醇和小檗碱的药物组合有望在临床作为预防和治疗NAFLD(MAFLD)的联合用药方案或开发用于防治NAFLD(MAFLD)的组合药物。

在上述研究的基础上，本发明提出了含有双环醇和小檗碱的药物组合物在制备用于预防和治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的药物中的用途，其中，所述的双环醇或小檗碱为其原药、药用盐或基于双环醇或小檗碱骨架结构的药用衍生物形式。

其中，优选的，所述的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)包括非酒精性肝脂肪变(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

其中，优选的，所述的药物组合物的有效成分由双环醇及小檗碱组成，其中，所述的双环醇或小檗碱为其原药、药用盐或基于双环醇或小檗碱骨架结构的药用衍生物形式。

其中，优选的，双环醇和小檗碱的用药剂量比为1:4～4:1，其中，所述的双环醇或小檗碱为其原药、药用盐或基于双环醇或小檗碱骨架结构的药用衍生物形式。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

NAFLD(MAFLD)作为一种发病机制与进展过程复杂的慢性肝病，应用不同作用机制且适合长期服用的临床已知药物联用或许能起到意想不到的治疗效果。双环醇和小檗碱作为两种传统药物，目前并没有将其联合应用来预防和治疗NAFLD(MAFLD)的先例，本发明将两种药物联合应用，最终发现二者剂量配比在1:4～4:1时较单药应用具有更好的预防和治疗NAFLD的效果，是一项具有巨大临床应用前景的联合用药发现。

附图说明

图1为双环醇和小檗碱联合用于预防HepG2细胞脂滴堆积的光镜观察(每组代表性图)；

图2为双环醇和小檗碱联合用于预防HepG2细胞脂滴堆积的定量结果；

图3为双环醇和小檗碱联合用于预防NAFLD对小鼠进食量及体重的影响；

其中，A为小鼠进食量变化，B为小鼠体重变化；

图4A和4B为双环醇和小檗碱联合用于预防NAFLD肝脏大体观察及肝脏病理的光镜定性观察(每组代表性图)；

图5为双环醇和小檗碱联合用于预防NAFLD肝脏病理NAS Score的定量结果；

图6为双环醇和小檗碱联合用于预防NAFLD对肝损伤指标及肝脏脂质含量指标的影响。

图7为双环醇和小檗碱联合用于治疗NAFLD对小鼠体重的影响；

图8A和8B为双环醇和小檗碱联合用于治疗NAFLD肝脏大体观察及肝脏病理的光镜定性观察(每组代表性图)；

图9为双环醇和小檗碱联合用于治疗NAFLD肝脏病理NAS Score及纤维化的定量结果；

图10为双环醇和小檗碱联合用于治疗NAFLD对肝损伤指标及肝脏脂质含量指标的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅用于例证目的，绝不对本发明的范围构成任何限制。

本发明中细胞实验所用的OA、PA分别与氢氧化钠皂化后再与25％BSA等体积混合得OA、PA母液，以OA：PA＝2：1配置含0.1mM FFA的细胞培养液。双环醇和小檗碱均用DMSO溶解，并用0.1mM FFA溶液稀释为0.5、2μM，模型组、对照组、给药组涉及的OA(货号O1008)、PA(货号P0500)、BSA(货号B2064)、DMSO(货号D8418)均购自美国sigma公司。动物实验所用双环醇(Bic)及小檗碱(BBR)均掺入高脂饲料中(相当于口服50mg/kg/day或200mg/kg/day体重剂量)饲喂，高脂高胆固醇西方饮食饲料(货号TP26300122)及对照低脂饲料(货号LAD0011)购自南通特洛菲饲料科技有限公司；高糖饮水中D-果糖(Sigma,F0127)浓度为23.1g/L，D-葡糖糖(Sigma,G8270)浓度为18.9g/L；四氯化碳(CCl

所用的SPF级雄性C57BL/6J小鼠购自斯贝福(北京)生物技术公司。

C57BL/6J小鼠饲养条件：环境温度为22±0.5℃，12小时/12小时明暗交替。

实验数据用均值±标准差及代表性图呈现。双环醇与小檗碱单独用药组与模型组对比、联用组与各自的单独用药组或模型组对比，采用One-wayANOVA进行组间均值比较，采用Kruskal-Wallis H检验及Mann-Whitney U检验进行非参数检验，*P<0.05或**P<0.01表示有统计学差异。

将细胞专用爬片置于24孔板，胶原包被后将对数期HepG2细胞按10

实验结果如下：

0.1mM FFA及所用剂量的小檗碱和双环醇均对细胞没有明显毒性。光镜观察(图1)及脂滴定量结果(图2)显示：在FFA作用下细胞内脂滴显著增加，给予药物干预后脂滴显著降低，双环醇和小檗碱联合降脂滴效果较单药作用更明显。

9～10周龄雄性C57BL/6J小鼠(25-27g)适应3天后进行实验，共设置10组，每组5只。对照组饲喂低脂对照饲料并正常饮水，模型组采用西方饮食(高脂、高胆固醇饮食+高糖饮水)诱导(即，WD饮食)，给药组饲喂含低(L)、高(H)剂量小檗碱(BBR)或双环醇(Bic)的西方饮食饲料(相当于口服50mg/kg/day或200mg/kg/day体重剂量)，共计16周。分组标记如下：Control、WD、WD+BBR(L)、WD+BBR(H)、WD+Bic(L)、WD+Bic(H)、WD+BBR(H)+Bic(L)、WD+BBR(L)+Bic(H)、WD+BBR(H)+Bic(H)、WD+BBR(L)+Bic(L)。实验过程中记录小鼠进食量、体重及死亡情况。实验结束时称取小鼠体重，取血分离血清检测肝损伤指标(AST、AST)，取肝右叶部分组织液氮冻存用于肝内脂质含量指标(TG、CHO)检测。另取肝右叶部分肝组织甲醛固定后用于组织病理HE染色及油红染色，评价肝脏脂肪变性、气球样变及炎症情况并进行NAFLD活动度评分(NAS Score)的定量评价。

实验结果如下：

实验过程中未见小鼠死亡，且给药组与模型组相比小鼠进食量无明显差异(图3A)。实验结束时与模型组相比，给药组小鼠体重有所下降，提示给药能降低WD饮食诱导的小鼠体重增加(图3B)。因此，双环醇及小檗碱单药及联合用药均是安全的。肝脏大体观察可见对照组肝脏颜色鲜红，模型组呈土黄色脂肪肝样变，双环醇及小檗碱单独用药组土黄色颜色有所减轻，而各联合给药剂量组改善更为明显(图4A、4B)。肝组织病理光镜观察可见模型组小鼠肝脏出现较重的脂肪变性、气球样变、炎症坏死病理特征，单独给药处理后以上病变有一定程度改善，而各联合用药剂量组改善更为明显(图4A、4B)。肝组织病理的NAS评分定量结果进一步证明各联合用药剂量组的效果明显优于单独用药组(图5)。血清ALT、AST及肝脏TG、CHO定量结果也显示各联合用药剂量组合方案较单独用药组整体改善效果更为显著(图6)。以上结果表明：双环醇与小檗碱组合应用预防非酒精性脂肪性肝病具有良好的安全性且效果优于其单独用药的效果，是一项具有药物开发及临床应用价值的发现。

9～10周龄雄性C57BL/6J小鼠(25-27g)适应3天后进行实验。共设置10组，对照组饲喂低脂对照饲料并正常饮水，其余为造模组采用西方饮食(高脂、高胆固醇饮食+高糖饮水)+CCl

实验结果如下：

实验过程中未见小鼠死亡，且由于CCl

以上对本发明的具体实施进行了描述，对于本发明而言仅是说明性的，而绝非限制性的。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但都将落入本发明的保护范围内。