一种扩增短串联重复序列的方法、引物组及试剂盒

摘要

本发明提供了一种扩增短串联重复序列的方法、引物组及试剂盒，属于基因检测与鉴定技术领域，所述方法包括以下步骤：1)将待检测DNA、STR前引物、STR后引物、STR外围引物和扩增缓冲液混合获得PCDR反应体系；2)将所述PCDR反应体系进行热循环扩增获得扩增产物，所述热循环扩增的程序包括依次进行的初始变性阶段、touch‑down扩增阶段、常规扩增阶段和终延伸阶段；所述STR外围引物的数量≥1；所述外围引物位于STR前引物或STR后引物5’端上游。本发明所述方法能够实现微量DNA中短串联重复序列的高效扩增，减少扩增过程中等位基因丢失，减少影子峰的产生，降低干扰，提高检测的准确性。

说明书

技术领域

本发明属于基因检测与鉴定技术领域，尤其涉及一种扩增短串联重复序列的方法、引物组及试剂盒。

背景技术

利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)复合扩增人类基因组短串联重复序列(Short Tandem Repeats，STR)结合毛细管电泳技术进行DNA分型是现代法医遗传学进行个人识别和亲子鉴定的常用手段。传统上将基因组DNA低于100pg的样本称为微量DNA或低模板DNA(Low template DNA，LTDNA)样本。对于LTDNA样本，PCR反应的随机效应(Stochastic Effect)可能导致DNA模板扩增失败，出现等位基因峰高降低，等位基因或基因座丢失(dropout)、扩增平衡性降低、影子峰(stutter峰)增高等不良后果，这些不良后果削弱了微量DNA图谱的准确性和可靠性。

随机效应与PCR反应的效率有直接关系，提高PCR反应效率有助于降低随机效应对LTDNA分型的影响，获得更加完整的DNA图谱证据。普通PCR采用1对引物扩增目的DNA片段，每经过1次PCR循环反应理论上产物片段增加1倍。但由于反应内部的竞争效应和底物消耗等因素的影响，PCR实际反应效率约在0.82-0.85之间。之前的研究表明，提高引物与模板的结合效率，如延长PCR过程中引物退火时间或使用稳定性更强的锁核酸引物等能够改善LTDNA的检测效果。

巢式PCR采用两步扩增法，使用嵌套的内外引物分步扩增DNA模板，具有比普通PCR更高的扩增效率。在反应过程中，先用1对引物(外引物)扩增目的片段，产物经(或不经)纯化、稀释后作为第二步PCR的模板，用另1对引物(内引物)进行扩增。两次扩增能够极大地提高PCR的检测灵敏度。同时由于引入了内、外两对引物，第一步PCR中的非特异性产物不能作为第二步PCR的模板，进一步保证了巢式PCR的特异性。然而，由于Taq酶本身并无链置换活性，如果引物结合位置下游存在与模板互补结合的核酸片段，扩增子的延伸过程通常会被中断。因此，巢式PCR的两对引物不能同时对模板进行扩增。此外，两步PCR的引入增加了体系污染的风险，在面对LTDNA样本时也可能进一步加剧等位基因间的扩增不平衡。同时，巢式PCR一般不能复合扩增多个基因座。等温链置换扩增反应是另一类高效的扩增方法。这类反应由具有强链置换活性的DNA聚合酶(如Phi29，Bst等)介导，利用上游引物的延伸反应置换下游模板链上的引物延伸链，从而实现一次反应多次扩增模板链，显著提高DNA模板的扩增效率。由于Phi29和Bst等聚合酶不耐高温，因此链置换扩增反应一般在较温和的等温条件下进行。以多重置换反应(Multiple Displacement Reaction,MDA)为代表的等温链置换反应有助于法医LTDNA的扩增和检测。由于MDA使用随机引物扩增DNA模板，引物与模板的随机结合可能引入额外的扩增偏差，增加扩增过程中等位基因丢失的风险。同时，等温链置换扩增反应的扩增产物片段长度范围很大，不能直接用于毛细管电泳检测，与现有检测平台的兼容性差。

聚合酶链式置换反应(Polymerase Chain Displacement Reaction,PCDR)结合了巢式PCR和链置换扩增反应的特点。该反应由SD DNA聚合酶催化完成。SD DNA聚合酶是Taq酶的基因改造产物，具有与Taq酶相当的热稳定性(93℃下稳定)和极强的链置换活性，无5’→3’核酸外切酶活性，能够同时用于PCR和链置换等温扩增反应。基于SD DNA聚合酶的独特性质，PCDR能够同时发挥PCR和链置换扩增的优势。与巢式PCR类似，PCDR也采用2对或多对引物扩增模板序列，但多对引物的扩增反应在同一管中同时进行。其基本原理如图1所示：针对模板DNA的目的片段设计特异性引物，并在特异性引物的外围额外设计一条或多条引物。在引物退火过程中，内外引物同时结合到目的片段的侧翼，在SD DNA聚合酶的作用下内、外引物同时延伸。当外引物向下延伸至内引物结合位置时，SD DNA聚合酶发挥链置换活性，使内引物的延伸产物与模板分离，外引物再次扩增目的片段。通过设置不同数量的内、外引物，一次延伸反应可两次或多次扩增目的片段，因此PCDR的扩增效率显著高于普通PCR。同时，由于针对特定基因座引入了2条以上的特异性引物，提高了引物与模板DNA成功结合的概率，使模板DNA在反应的起始阶段更容易被扩增，有助于降低PCR随机效应对微量DNA分型的影响。

PCDR结合聚合酶链式反应和链置换反应的优势，能够显著提高目的片段的扩增效能。目前已有文献报导将PCDR用于动、植物病原体的检测(B.Lou,Y.Song,M.RoyChowdhury,C.Deng,Y.Niu,Q.Fan,Y.Tang,C.Zhou,Development of a tandem repeat-basedpolymerase chain displacement reaction method for highly sensitive detectionof“Candidatus liberibacter asiaticus,”Phytopathology.108(2018)292–298.https://doi.org/10.1094/PHYTO-06-17-0210-R.；J.Wang,H.Li,T.Li,J.Zhang,L.Ling,An efficient template-independent polymerase chain displacementreaction for the detection of Salmonella typhimurium,Anal.Methods.10(2018)4229–4232.https://doi.org/10.1039/c8ay01625a.)。但目前尚没有将PCDR这一技术应用于STR的扩增和检测。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种扩增短串联重复序列的方法、引物组和试剂盒；所述方法能够实现微量DNA中短串联重复序列的高效扩增，减少扩增过程中等位基因丢失，减少影子峰的产生，降低干扰，提高检测的准确性。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种扩增短串联重复序列的方法，包括以下步骤：

1)将待检测DNA、STR前引物、STR后引物、STR外围引物和扩增缓冲液混合获得PCDR反应体系；

2)将所述PCDR反应体系进行热循环扩增获得扩增产物，所述热循环扩增的程序包括依次进行的初始变性阶段、touch-down扩增阶段、常规扩增阶段和终延伸阶段；

所述STR外围引物的数量≥1；

所述外围引物位于STR前引物5’端上游或STR后引物5’端上游，所述STR外围引物3’端模板结合位点与STR前引物或STR后引物5’端模板结合位点的物理距离为5～200bp。

优选的，所述短串联重复序列的数量为2～30个，每一个短串联重复序列分别设计STR前引物、STR后引物和STR外围引物；所述STR前引物的5’端或STR后引物的5’端标记荧光基团。

优选的，所述短串联重复序列包括法医STR基因座和/或性别鉴定基因座。

优选的，所述法医STR基因座包括TPOX，TH01，D13S317，FGA，D3S1358，D7S820，D16S539，D18S51，D2S441，CSF1PO，D5S818，D21S11，D8S1179，VWA和D10S1248中的一种或几种，所述性别鉴定基因座包括Amelogenin。

优选的，所述热循环扩增的程序包括：

初始变性阶段：92℃，2min，1个循环；

Touch-down扩增阶段：92℃，30s，65～60℃(-0.5℃/循环)，1min；68℃，1min；10个循环；

常规扩增阶段：92℃，30s；60℃，1min；68℃，1min；20个循环；

终延伸阶段：68℃，30min；1个循环。

优选的，所述PCDR扩增缓冲液包括SD聚合酶反应缓冲液、MgCl

本发明提供了一种基于所述方法进行人类基因组短串联重复序列扩增的引物组，所述人类基因组短串联重复序列包括法医STR基因座和/或性别鉴定基因座，所述法医STR基因座包括D13S317，TPOX，TH01，FGA，D3S1358，D7S820，D16S539，D18S51，D2S441，CSF1PO，D5S818，D21S11，D8S1179，VWA和D10S1248，所述性别鉴定基因座包括Amelogenin。

扩增Amelogenin的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.1～3所示；

扩增D13S317的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.4～6所示；

扩增TPOX的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.7～9所示；

扩增TH01的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.10～12所示；

扩增FGA的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.13～15所示；

扩增D3S1358的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.16～18所示；

扩增D7S820的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.19～21所示；

扩增D16S539的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.22～24所示；

扩增D18S51的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.25～27所示；

扩增D2S441的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.28～30所示；

扩增CSF1PO的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.31～33所示；

扩增D5S818的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.34～36所示；

扩增D21S11的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.37～39所示；

扩增D8S1179的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.40～42所示；

扩增VWA的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.43～45所示；

扩增D10S1248的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.46～48所示。

优选的，所述D18S51的外围引物还包括SEQ ID NO.49所示的引物。

优选的，所述FGA的外围引物还包括SEQ ID NO.50所示的引物。

本发明还提供了一种基于所述方法进行人类基因组短串联重复序列扩增的试剂盒，包括所述的引物组和扩增缓冲液。

传统PCR方法利用一对特异性引物扩增模板DNA，每次反应循环扩增产物增加倍数<1。本发明提供的方法针对STR分别设计特异性扩增的前引物、后引物和位于前引物或后引物外侧的外围引物；在反应过程中前引物、后引物与外围引物同时与模板DNA链结合并延伸，外围引物的延伸链可以置换内引物的延伸链，因此，每次反应循环中产物增加倍数>1，从而实现更高的微量DNA扩增效率。

本方法能够减少微量DNA扩增过程中等位基因丢失。引物与模板成功结合并延伸是DNA模板复制的关键步骤。对于微量DNA模板，引物与模板的结合效率能够显著影响扩增结果。相较于传统PCR方法，本发明针对每个STR使用3条以上引物同时进行扩增，提高了引物与模板的结合效率，从而减少微量DNA扩增过程中的等位基因丢失，获得更加完整的分型结果。

本方法能够降低影子峰(stutter峰)对DNA图谱的干扰。由于STR的特殊结构，在聚合酶复制过程中模板链与引物延伸链可能发生相对滑动，在DNA图谱上产生stutter峰。当DNA模板量很低时，stutter峰相对等位基峰的比例增高，从而对微量DNA图谱的解释产生干扰。本发明在聚合酶链式反应的基础上同时引入了链置换反应，并用内外引物同时扩增DNA模板链。在引物延伸过程中，内引物延伸链可暂时封闭DNA模板，增强DNA模板的稳定性，减少模板链与外引物延伸链的相对滑动，从而减少stutter产物的形成。

进一步的，本发明提供的方法能够进行单管复合扩增反应，无需额外操作，且与现有法医DNA分析方法完全兼容。本发明使用的DNA聚合酶具有强烈的链置换活性和热稳定性，因此聚合反应与链置换反应能够在单管反应中完成，无需额外的产物转移、纯化等操作。本发明提供的引物组，能够实现不同STR位点的复合PCDR扩增。同时，本发明所提供的试剂盒使用的反应体系能够耐受与PCR反应相当的热循环条件，通过对前引物或后引物进行荧光标记，扩增产物能够直接通过毛细管电泳进行检测，与现有DNA分析方法完全兼容。

本发明提供的扩增短串联重复序列的方法、引物组和试剂盒在等位基因峰高、等位基因检出率和stutter比率方面均优于以EX22试剂盒为代表的现有技术。

附图说明

图1为PCDR反应原理图，FW为前引物，RV为后引物，OP为外围引物；

图2a为100pg模板复合PCDR反应产物毛细管电泳图谱；

图2b为100pg模板复合PCR反应产物毛细管电泳图谱；

图3为单外围引物复合PCDR和双外围引物复合PCDR反应中D18S51和FGA基因座等位基因峰高均值对比结果；

具体实施方式

本发明提供了一种扩增短串联重复序列的方法，包括以下步骤：1)将待检测DNA、STR前引物、STR后引物、STR外围引物和扩增缓冲液混合获得PCDR反应体系；2)将所述PCDR反应体系进行热循环扩增获得扩增产物，所述热循环扩增的程序包括依次进行的初始变性阶段、touch-down扩增阶段、常规扩增阶段和终延伸阶段；所述STR外围引物的数量≥1；所述外围引物位于STR前引物5’端上游或STR后引物5’端上游，所述STR外围引物3’端模板结合位点与STR前引物或STR后引物5’端模板结合位点的物理距离为5～200bp。

在本发明中，将待检测DNA、STR前引物、STR后引物、STR外围引物和扩增缓冲液混合获得PCDR反应体系。本发明对所述待检测DNA的来源没有特殊限定，任意待检测DNA均可；在本发明中，所述待检测DNA优选为微量DNA，所述待检测基因组DNA的模板量优选为100pg～12.5pg，当所述待检测DNA在上述模板量范围时，本发明提供的方法具有更显著的优势。

在本发明中，所述短串联重复序列的数量优选为2～30个；本发明针对每一个短串联重复序列分别设计STR前引物、STR后引物和STR外围引物；所述STR前引物的5’端或STR后引物的5’端标记荧光基团；本发明对所述荧光基团的种类没有特殊限定，采用本领域常规的荧光基团即可，在本发明具体实施过程中，所述荧光基团包括6FAM、HEX、TAMRA和ROX中的一种。

本发明对所述短串联重复序列的具体种类没有特殊限定，任意短串联重复序列即可。在本发明具体实施过程中，所述短串联重复序列优选的包括法医STR基因座和/或性别鉴定基因座；所述法医STR基因座优选的包括TPOX，TH01，D13S317，FGA，D3S1358，D7S820，D16S539，D18S51，D2S441，CSF1PO，D5S818，D21S11，D8S1179，VWA和D10S1248中的一种或几种，所述性别鉴定基因座优选的包括Amelogenin。

在本发明中，所述STR前引物和STR后引物为扩增所述短串联重复序列的特异性引物对，本发明对所述STR前引物和STR后引物的具体序列没有特殊限定，采用本领域常规的引物设计规则设计即可。在本发明中，所述STR外围引物的数量≥1；在本发明中，增加外围引物的数量能够进一步提高单个或多个STR的扩增效率；在本发明中，所述STR外围引物与模板结合的区域优选的不与前引物、后引物模板结合区域重叠；所述STR外围引物3’端模板结合位点与STR前引物或STR后引物5’端模板结合位点的物理距离优选为5～200bp。

在本发明中，所述PCDR扩增缓冲液包括SD聚合酶反应缓冲液、MgCl

表1 PCDR反应体系组成

在本发明中，表1中的混合引物包括STR前引物、STR后引物、STR外围引物；所述STR前引物、STR后引物、STR外围引物的浓度独立为1～10μM；当所述STR为多个时，所述混合引物包括针对多个STR的前引物、后引物和外围引物。

在本发明中，所述热循环扩增的程序优选的包括：

初始变性阶段：92℃，2min，1个循环；

Touch-down扩增阶段：92℃，30s，65～60℃(-0.5℃/循环)，1min；68℃，1min；10个循环；

常规扩增阶段：92℃，30s；60℃，1min；68℃，1min；20个循环；

终延伸阶段：68℃，30min；1个循环。

在本发明中，所述终延伸阶段后，优选的立即进行扩增产物分析，如果不立即进行扩增产物分析，所述终延伸阶段后还包括维持阶段，所述维持阶段的温度优选为2～10℃，更优选为4℃。

在本发明中，热循环扩增优选的在热循环仪中进行，本发明对所述热循环仪的来源和规格没有特殊限定，采用本领域常规的热循环仪即可。

本发明在获得所述扩增产物后，优选的对扩增产物进行分析，所述分析优选的在基因分析仪上进行；在本发明中，所述分析优选的将扩增产物、去离子甲酰胺和AGCUMarker SIZ-500分子量内标混合后，用基因分析仪进行荧光检测。在本发明中，所述扩增产物、去离子甲酰胺和AGCU Marker SIZ-500分子量内标混合的体积比优选为1.0:8.9:0.1；在本发明具体实施过程中，所述基因分析仪优选的为ABI 3500 Genetic Analyzer(购自Applied Biosystems，美国)。

在本发明中，优选的还包括等位基因峰和stutter峰的判别，所述判别优选的利用基因分析软件GeneMapper ID-X 1.5(Applied Biosystems，美国)对上述基因分析仪收集的数据进行分析获得DNA图谱。在本发明具体实施过程中，优选的使用50相对荧光单位(Relative Fluorescence Units，RFU)作为阈值对DNA图谱进行峰高过滤；Stutter峰定义为DNA图谱上等位基因峰前少1个STR重复单位处的峰；Stutter比率(Stutter Ratio,SR)定义为stutter峰高与相应等位基因峰高的比值。

本发明提供了一种基于所述方法进行人类基因组短串联重复序列和/或性别基因座扩增的引物组，所述人类基因组短串联重复序列包括D13S317，TPOX，TH01，FGA，D3S1358，D7S820，D16S539，D18S51，D2S441，CSF1PO，D5S818，D21S11，D8S1179，VWA和D10S1248；所述性别鉴定基因座包括Amelogenin。

扩增Amelogenin的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.1～3所示；

扩增D13S317的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.4～6所示；

扩增TPOX的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.7～9所示；

扩增TH01的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.10～12所示；

扩增FGA的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.13～15所示；

扩增D3S1358的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.16～18所示；

扩增D7S820的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.19～21所示；

扩增D16S539的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.22～24所示；

扩增D18S51的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.25～27所示；

扩增D2S441的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.28～30所示；

扩增CSF1PO的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.31～33所示；

扩增D5S818的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.34～36所示；

扩增D21S11的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.37～39所示；

扩增D8S1179的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.40～42所示；

扩增VWA的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.43～45所示；

扩增D10S1248的前引物、后引物和外围引物分别如SEQ ID NO.46～48所示。

在本发明中，所述Amelogenin，D13S317，TPOX，TH01，FGA，D3S1358，D7S820，D16S539，D18S51，D2S441，CSF1PO，D5S818，D21S11，D8S1179，VWA和D10S1248的前引物、后引物、外围引物的具体序列、浓度和荧光基团标记优选的如表2所示。

表2前引物、后引物、外围引物的具体序列、其在引物混合物中的浓度和荧光基团标记

其中，FW为前引物，RV为后引物，OP为外围引物。

在本发明中，所述D18S51的外围引物优选的还包括SEQ ID NO.49所示的引物；所述FGA的外围引物优选的还包括SEQ ID NO.50所示的引物。

本发明首次将PCDR引入法医DNA检测领域，尤其是法医微量DNA(<100pg的DNA样本)的检测。本发明主要针对的遗传标记是法医学广泛应用的STR遗传标记，并在单管反应中实现了15个STR基因座和性别鉴定基因座Amelogenin的复合扩增。随着复合扩增位点数的增加，引物之间的相互作用变得更加复杂，导致引物二聚体形成、非特异扩增产物增加等。这种引物相互作用常常对单个或多个位点的扩增效能产生不利影响。采用本发明提供的上述引物组能够将复合PCDR体系中引物的相互作用降到尽可能低的程度，与普通PCR引物和方法比较，本发明提供的引物组能够实现全部15个STR基因座和Amelogenin基因座扩增效能的显著提升。

本发明还提供了一种基于所述方法进行人类基因组短串联重复序列扩增的试剂盒，包括所述的引物组和扩增缓冲液。在本发明中，所述扩增缓冲液所述PCDR扩增缓冲液包括SD聚合酶反应缓冲液、MgCl

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

STR基因座和引物设计

涉及的法医STR基因座包括：D13S317，TPOX，TH01，FGA，D3S1358，D7S820，D16S539，D18S51，D2S441，CSF1PO，D5S818，D21S11，D8S1179，VWA和D10S1248。性别鉴定基因座为Amelogenin。每个基因座均使用1条前引物(FW)，1条后引物(RV)及1条位于前引物或后引物5’端上游的外围引物(OP)进行扩增。其中，前、后引物用于特异性扩增STR基因座，外围引物用于特异性启动链置换反应。荧光基团标记在前引物或者后引物的5’端。本实施例所涉及的16个基因座对应的引物序列、引物浓度及荧光标记如表2所示，在此不再赘述。

10个DNA样品的提取

DNA提取和定量

本实验所用全血样本由志愿者提供。采血后加入EDTA-Na

1.取300μL全血置于灭菌的1.5mL离心管中，加入600μL H

DNA定量使用Quantiplex Kit PCR Assay(Qiagen，德国)试剂盒。DNA定量过程在7500实时荧光定量系统(Applied Biosystems，美国)上完成。DNA定量操作按试剂盒和仪器制造商提供的说明书进行。根据定量结果，将DNA样本分别稀释至1ng/μL，100pg/μL，50pg/μL，25pg/μL和12.5pg/μL，-20℃保存备用。DNA定量也可选用同类其他定量试剂盒。

复合扩增体系构建

使用表2中所述基因座引物构建复合PCDR体系和复合PCR体系。其中，复合PCDR体系为实施本发明的实验体系，复合PCR体系为对照体系，用于对比，以说明本实施例的优势。二者区别在于：复合PCDR体系包括表2中所述16个基因座的FW、RV和OP引物；复合PCR体系仅包括表2中所述16个基因座的FW和RV引物。按表3所述FW、RV、和OP引物及对应浓度配置复合PCDR引物混合物，按表3所述FW、RV引物及对应浓度配置复合PCR引物混合物。

复合扩增反应体系所用试剂包括：1.SD聚合酶(10U/μL)(Bioron，德国)；2.SD聚合酶反应缓冲液(10×)(Bioron，德国)；3.MgCl

表3复合扩增反应体系

其中复合PCDR体系中的混合引物包括表2所示的序列、浓度、荧光基团标记的所有引物，复合PCR体系包括表2所述的前引物和后引物，不包括外围引物。

热循环扩增

复合PCDR反应和复合PCR反应在热循环仪中进行。热循环仪扩增程序如表4所示。

表4热循环扩增体系

扩增完成后产物4℃避光保存。

扩增产物在基因分析仪上进行检测

将1.0μL扩增产物与8.9μL去离子甲酰胺(购自Applied Biosystems，美国)和0.1μL AGCU Marker SIZ-500分子量内标(购自无锡中德美联生物技术有限公司，中国)混合，用ABI 3500 Genetic Analyzer(购自Applied Biosystems，美国)基因分析仪进行荧光检测。

等位基因峰和stutter峰的判别

利用基因分析软件GeneMapper ID-X 1.5(Applied Biosystems，美国)对上述基因分析仪收集的数据进行分析获得DNA图谱。使用50相对荧光单位(RelativeFluorescence Units，RFU)作为阈值对DNA图谱进行峰高过滤。Stutter峰定义为DNA图谱上等位基因峰前少1个STR重复单位处的峰。Stutter比率(Stutter Ratio)定义为stutter峰高与相应等位基因峰高的比值。

实验结果

DNA图谱平均峰高

在本实施例中，当DNA模板为100pg时，本发明实验组(复合PCDR组)整体峰高均值为对照组(复合PCR组)的3.7倍；各基因座平均峰高提升在50％至630％之间，且组间差异均有统计学显著性(p<0.05)。100pg模板时各基因座平均峰高见表5。100pg模板复合PCDR反应产物毛细管电泳图谱如图2a所示；同一模板复合PCR反应产物毛细管电泳图谱如图2b所示。PCDR产物与PCR产物具有一致的基因分型结果；PCDR产物图谱峰高较PCR明显提升，且并未引入额外的杂峰，也不影响等位基因间的扩增平衡性。当模板为50pg，25pg和12.5pg时，本发明实验组(复合PCDR组)整体峰高均值为对照组(复合PCR组)的3.8～4.7倍，且组间差异均有统计学显著性(p<0.05)。100pg至12.5pg模板时图谱平均峰高见表6。

表5 100pg DNA模板复合PCDR反应和复合PCR反应等位基因峰高均值(10样本，每样本4次技术重复)

表6 100pg，50pg，25pg，12.5pg DNA模板时复合PCDR反应和复合PCR反应样本峰高均值(10样本，每样本3技术重复)

等位基因检出率

在本实施例中，本发明实验组(复合PCDR组)等位基因检出率在不同模板量下均高于对照组(复合PCR组)，且在DNA模板为100pg、25pg和12.5pg时组间差异有统计学意义(p<0.05)，具体结果如表7所示。

表7 100pg，50pg，25pg，12.5pg DNA模板时复合PCDR反应和复合PCR反应等位基因检出率均值(10样本，每样本3技术重复)。

Stutter比率

Stutter比率反映stutter峰与真实等位基因峰的相对关系。在本实施例中，本发明实验组(复合PCDR组)stutter比率在不同模板量下均低于对照组(复合PCR组)，且组间差异有统计学意义(p<0.05)，具体结果如表8所示。

表8 100pg，50pg，25pg，12.5pgDNA模板时复合PCDR反应和复合PCR反应样本stutter比率均值(10样本，每样本3技术重复)

由上述实施例可知，本发明提供的基于PCDR复合扩增STR基因座的方法能够显著提高STR扩增效率，降低等位基因丢失率，同时减少stutter干扰峰对DNA图谱分析的影响。

对比例1

采用现有的EX22试剂盒(无锡中德美联生物技术有限公司，中国)与本发明提供的引物组、试剂盒进行对比。EX22试剂盒基于常规PCR反应，在法医DNA分析领域被广泛使用，且包含本发明所测试的所有16个遗传标记。

EX22试剂盒在比较例中的使用方法为：

DNA提取和定量

按实施例1中记载的“DNA提取和定量”提取DNA并对DNA进行定量和稀释。

扩增体系配置如表9所示。

表9 EX22试剂盒扩增体系

热循环扩增反应

将配置好的扩增体系转移到热循环仪上，按表10所示扩增程序进行热循环扩增。

表10 EX22试剂盒扩增程序

扩增产物检测、等位基因峰和stutter峰的判别方法参照实施例1记载的进行。图谱分析只针对EX22试剂盒与本发明中共有的基因座。

实验结果

DNA图谱平均峰高

不同DNA模板量下EX22图谱平均峰高见表11。在本例中，不同模板量下EX22图谱平均峰高均低于本发明实验组(复合PCDR组)。

表11 100pg，50pg，25pg，12.5pg DNA模板时EX22图谱峰高均值(7样本，每样本3次技术重复)

等位基因检出率

不同DNA模板量下，EX22图谱等位基因检出率见表12。本对比例中，在不同模板量下EX22图谱平均等位基因检出率均低于本发明实验组(复合PCDR组)。

表12 100pg，50pg，25pg，12.5pg DNA模板时EX22图谱等位基因检出率均值(7样本，每样本3次技术重复)

Stutter比率

本对比例中，当DNA模板为1ng时，EX22图谱平均stutter比率为8.5±2.7％，高于本发明实施例1中的实验组(复合PCDR组)在100pg和50pg时的平均stutter比率。当DNA模板为500pg、250pg和100pg时，EX22图谱平均stutter比率分别为9.4±2.7％，10.5±2.4％和11.8±1.9％，均高于本发明实施例1中的实验组(复合PCDR组)在100pg，50pg，25pg和12.5pg时的平均stutter比率。当模板量低于100pg时，EX22图谱整体峰高过低，未检测到可供分析的stutter峰。

实施例2

单外围引物和双外围引物扩增效果对比

引物设计、试验方法参见实施例1记载，不同之处在于，复合PCDR反应体系中额外加入D18S51基因座第二条外围引物，具体序列为5’-GCTCCTACTATGGACTAATATTAGTTTGGT(SEQ ID NO.49)，在复合PCDR反应体系中的浓度为0.1μM；以及FGA基因座第二条外围引物，具体序列为5’-CAGCCACATACTTACCTCCAGT(SEQ ID NO.50)，其在复合PCDR反应体系中的浓度为0.1μM。

对比结果如图3所示，使用单外围引物进行复合PCDR扩增时，复合PCDR反应中D18S51和FGA的等位基因峰高均值均高于复合PCR反应。在此基础上，针对D18S51和FGA加入第二条外围引物可进一步提高等位基因峰高。对于D18S51基因座，使用双外围引物进行复合PCDR反应时，其等位基因峰高均值为使用单外围引物进行PCDR反应时的2.7倍；对于FGA基因座，使用双外围引物进行复合PCDR反应时，其等位基因峰高均值为使用单外围引物进行PCDR反应时的3.7倍。

可见，通过增加复合PCDR反应体系中基因座外围引物的数量进一步提高基因座的扩增效率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 四川大学

<120> 一种扩增短串联重复序列的方法、引物组及试剂盒

<160> 50

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ccctgggctc tgtaaagaat agtg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

atcagagctt aaactgggaa gctg 24

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

taccacctca tcctgggca 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

tgggttgctg gacatggtat 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

atctcctcct tcaacttggg tt 22

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

tggtaattct gcctacagcc aat 23

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

actggcacag aacaggca 18

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

ctggtcttac tcctgttccc tt 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

cccccataga tcgtaagccc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

aagctcccga ttatccagcc 20

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

gggcaaaatt caaagggtat ctg 23

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ggcaccgaag acccctcct 19

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

tctatgactt tgcgcttcag ga 22

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

aatgccccat aggttttgaa ctc 23

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

tctgcagaag ctggatatgc t 21

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gaaatcaaca gaggcttgca tgt 23

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gtttcttcag agcaagaccc tgtctcatag a 31

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gctggccata ttcacttgcc 20

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

tatcctcatt gacagaattg cacc 24

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

agaacacttg tcatagttta gaacg 25

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

tgtgaggtct taaaatctga ggt 23

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

agtgccagat gctcgttgtg 20

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gtgtgcatct gtaagcatgt atct 24

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

ccactctcag tcctgccga 19

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

gctgaggcag gaggagtt 18

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

acccgactac cagcaacaa 19

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

ccagaagaaa tccttgtgcg tat 23

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

gaactgtggc tcatctatga aaact 25

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

gagctaagtg gctgtggt 18

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

tgtaacaagg gctacaggaa tca 23

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

actatctcct ggtgcacact 20

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

aacagtaact gccttcatag ataga 25

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

gccatcttca gcccattctc ca 22

<210> 34

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

tctctcagag gaatgcttta gtgc 24

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

atagcaagta tgtgacaagg gtga 24

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

agtcttcttt ttctaaacct ctccc 25

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

ctaagggctt cagacttgga cag 23

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

gatgttgtat tagtcaatgt tctcc 25

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

ggcctttgga ctttgggact 20

<210> 40

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

acggcctggc aacttatatg t 21

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

ctgtagatta ttttcactgt gggga 25

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

gccagaaacc tctgtagcca 20

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

ggttagatag agataggaca gatgat 26

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

agttgacttg gctgagatgt ga 22

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

cacaggttag atagattaga cagac 25

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

aagcaaacct gagcattagc c 21

<210> 47

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

ctcaggaata agtgcagtgc ttg 23

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 48

ttgctttaaa ggtagctagg attctt 26

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 49

gctcctacta tggactaata ttagtttggt 30

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 50

cagccacata cttacctcca gt 22