GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂用于促进CD8+T细胞功能的用途

摘要

本发明属于免疫治疗联合治疗研究领域，具体涉及GSH联合PD‑1/PD‑L1阻断剂用于促进CD8+T细胞功能的用途。具体为如下四种中的任一种：1)在制备用于促进CD8+T细胞增殖的产品中的用途；2)在制备用于抑制CD8+T细胞凋亡的产品中的用途；3)在制备用于促进CD8+T细胞能力的产品中的用途，所述功能具体为细胞分泌IFN‑γ的能力；4)在制备用于治疗与CD8+T细胞发展异常有关疾病中的用途。本发明为提高肿瘤患者体内、外抗原特异性T细胞的抗肿瘤功能提供了新思路。

说明书

技术领域

本发明属于免疫治疗联合治疗研究领域，具体涉及GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂用于促进CD8

背景技术

在肿瘤的免疫治疗领域，过继性细胞治疗和免疫检查点抑制剂已登上肿瘤治疗的舞台。其中，嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)作为一种新兴的过继免疫疗法，能够显著改善B细胞恶性肿瘤患者的预后，但在实体瘤中的治疗效果欠佳，以PD-1单克隆抗体为代表的免疫检查点抑制剂被批准应用于多种恶性肿瘤，但部分患者对治疗无反应性。究其原因，一方面是由于肿瘤微环境中存在影响T细胞的活化和功能的因素；另一方面是肿瘤抗原诱发的反应性抗原特异性T细胞的比例在肿瘤部位低，而反应性抗原特异性T细胞同肿瘤患者的生存期呈正相关。此外，肿瘤浸润性T细胞往往是低反应性的，如何提高患者体内反应性抗原特异性T细胞的比例和功能是免疫治疗研究领域的重要方向之一。

抗原诱导富集的MAGE-A3特异性CD8

发明内容

本发明的目的在于提供GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂用于促进CD8

GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂在制备用于促进CD8

进一步的，本发明还提供了一种利用所述GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂体外促进CD8

GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂在制备用于抑制CD8

进一步的，本发明还提供了利用所述GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂体外抑制CD8

GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂在制备用于促进CD8

进一步的，进一步的，本发明还提供了利用所述GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂体外促进CD8

GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂在制备用于治疗与CD8

进一步的，所述疾病包括所述疾病包括但不限于食管癌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明实验证明，本发明发现GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂(具体如

附图说明

图1为食管癌患者外周血MAGE-A3特异性CD8

图2为流式细胞法检测不同处理组下CD8

图3为流式细胞法检测不同处理组下CD8

图4为化疗前后化疗组和化疗+GSH组两组患者外周血中PD-1

图5为化疗前后化疗组和化疗+GSH组两组患者CD8

图6为化疗前后化疗组和化疗+GSH组两组患者CD8

图7为不同处理组MAGE-A3特异性CD8+T细胞的抑瘤作用比较，a：空白对照组，b：T细胞输注组，c：T细胞输注+

图8为荷瘤小鼠肿瘤组织中T细胞的浸润情况，图中，a：T细胞输注组，b：T细胞输注+

图9为荷瘤小鼠肿瘤组织中T细胞的功能情况图中，a：T细胞输注组，b：T细胞输注+

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

研究对象及标本获取

本发明已经郑州大学生命科学伦理审查委员会审查，符合医学伦理要求。

入选标准：选取郑州大学第一附属医院胸外科、肿瘤科和消化科的食管癌患者作为研究对象，患者年龄范围限制在40-70岁。

排除标准：合并免疫系统疾病者；病理诊断不明确者。

外周血标本采集：无菌条件下采集患者的外周血，肝素抗凝，于实验室分离PBMCs，用于流式细胞仪检测及淋巴细胞的分离和培养。

食管癌组织及正常组织标本的获取：活检或手术切除的食管癌组织，立即将肿瘤组织及正常组织一部分放入液氮中，然后置于超低温冰箱保存，用于逆转录PCR检测；另一部分新鲜的标本需要放入无菌培养基送回实验室制成单细胞悬液，用于流式细胞仪检测及细胞的分离和培养。

流式细胞术检测HLA-A2的表达：获得患者的PBMCs，避光标记流式抗体：抗人CD3抗体和抗人HLA-A2抗体，流式细胞术检测HLA-A2的表达。

RT-PCR检测MAGE-A3在肿瘤组织中的表达：提取新鲜肿瘤组织的RNA，逆转录为cDNA，采用RT-PCR方法检测MAGE-A3在肿瘤组织中的表达。

根据HLA-A2和MAGE-A3的表达，选取HLA-A2和MAGE-A3共阳性的标本作为研究对象。

实施例1、GSH联合PD-1/PD-L1阻断剂对CD8

1、外周血单个核细胞(PBMC)的分离

具体按照如下步骤：

1)标记5mL负压肝素抗凝管1-2个，抽取患者5-10mL外周静脉血，4℃短暂保存(<6小时)或直接下步操作。

2)离心机分离血清：将采血管置于离心机离心，离心条件：9ACC，9DEC，1500rpm/min，10min。

3)离心结束后，取出采血管，放入超净台，点燃酒精灯，正压通风，移液枪将采血管上层血清移入4mL无菌离心管-80℃冻存，移液枪将采血管下层血细胞移入50mL无菌离心管，生理盐水与血细胞体积比2:1稀释。

4)取15mL淋巴细胞分离液至50mL离心管中，离心管呈45℃倾斜，用无菌移液管吸取血液混合液，沿管壁缓慢叠加于分离液面上，注意勿扰界面。

5)将离心管放入离心机离心，离心：5ACC，5DEC，2500rpm/min，25min。离心完毕取出离心管，放入超净台，此时管内液体分为三层，上层为血浆和生理盐水，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

6)用移液管小心吸取上、中层界面处白色云雾层，移入另一50mL无菌离心管，加生理盐水至50mL，洗涤PBMC。

7)离心：9ACC，9DEC，1500rpm/min，10min，离心。离心完毕取出离心管，放入超净台，弃上清。加入50mL生理盐水二次洗涤，离心：9ACC，9DEC，1200rpm/min，8min。弃上清，得到PBMC。

8)PBMC计数(10mL细胞+10mL台酚蓝)，一部分进行冻存：冻存液(90％FBS+10％DMSO)，冻存数目2×106/管。

2、细胞培养及流式检测

(1)获得的MAGE-A3特异性CD8

筛选HLA-A2/MAGE-A3共阳性的患者，分离其外周血单个核细胞，用含10％人AB血清1640(Hyclone)培养液，IL2(50u/mL)，CD3/CD28 Dynabeads活化(10

(2)流式分析PD-1在MAGE-A3特异性CD8+T细胞表面的表达，并根据PD-1表达水平分为：PD-1

结果显示，GSH能够增加PD-1/PD-L1阻断剂对MAGE-A3特异性CD8

PD-1

实施例2

GSH对化疗患者体内CD8

1、实验方法：选择化疗、化疗+GSH(1.8g/qd,ivgtt)两组患者，抽取患者疗前后外周血，分离外周血单个核细胞(同实施例1)，应用流式细胞术检测外周血中PD-1

2、实验结果

如图4所示：同对照组相比，GSH明显降低患者化疗后体内CD8

图5-6：同对照组相比，GSH增强患者体内CD8

图7：谷胱甘肽联合

图8：荷瘤小鼠肿瘤组织中T细胞的浸润情况，T细胞输注+

图9：荷瘤小鼠肿瘤组织中T细胞的功能情况，T细胞输注+

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。