一种水蛭纤溶活性蛋白及其制备方法

摘要

本发明属于医药领域，具体涉及一种水蛭纤溶活性蛋白及其制备方法。本发明将水蛭干品粉碎后加丙酮与水的混合溶液提取，然后通过乙醇沉淀，获得水蛭纤溶活性蛋白。本发明操作步骤简单，在保证获得纤溶活性蛋白的同时，最大限度降低了提取组分中色素、杂蛋白含量，所述的水蛭纤溶活性蛋白活性强，对纤维蛋白有明显的溶解作用，溶栓率大大提高，在制备溶栓药物中有很大的开发应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一种水蛭纤溶活性蛋白及其制备方法。

背景技术

血栓性疾病具有发病率、致残率、致死率高的特点，严重威胁着人类健康。随着人口老龄化加剧及人们生活方式的改变，血栓性疾病将更加严重。纤维蛋白不具可溶性，可网络血细胞等形成血栓，是血栓的主要成分，通过纤溶酶溶解血栓中的纤维蛋白是临床上治疗血栓性疾病安全而有效的手段。目前，临床上常用的溶栓药物主要包括尿激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)及其变异体等纤溶酶，存在半衰期较短、价格昂贵等缺点，从而限制了其在临床中的应用。因此，充分利用丰富的中药资源，开发、研制新的溶栓药物仍然十分必要，并有着广阔的应用前景。

水蛭作为传统中药，始载于《神农本草经》，是活血作用最显著的10种中药材之一，具有破血逐瘀、通经等功效。随着水蛭药材资源的深入开发研究，其单味或复方制剂已广泛用于血栓性疾病的治疗，且效果显著。现今，水蛭中的多种活性蛋白多肽类成分一般通过水提取或酶解法获得，但所提取组分杂质占比较大，活性较差。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种水蛭纤溶活性蛋白及其制备方法，本发明获得的水蛭纤溶活性蛋白组分含有杂质少，活性强，对纤维蛋白有明显的溶解作用；对大鼠体外血栓有溶解作用。

本发明所述的一种水蛭纤溶活性蛋白，通过以下方法制备得到，其具体步骤为：

(1)将水蛭干品粉碎后加丙酮与水的混合溶液，于4-8℃冷浸24h，提取，合并提取液，过滤，得滤液；

(2)将滤液浓缩，得料液I；

(3)向步骤(2)所得料液I中滴加乙醇，使体系中乙醇体积百分数至65％，于4-8℃冷浸过夜，得料液II；

(4)去除料液II中上清液，收集沉淀，加纯水溶解并于4-5℃放置2-3h，离心，取上清液冷冻干燥，即可得到水蛭中纤溶活性蛋白。

由于水蛭中纤溶活性成分具有一定的疏水性，只有在一定极性的有机溶剂中才能被有效提取出来，且极性太大提取出来的大多为可溶性色素，而极性太小纤溶活性成分经沉淀后随杂质除去，发明人通过多次实验发现当采用丙酮与水的混合溶液且所述丙酮与水的混合溶液中丙酮的体积分数为40％时，可有效避免水蛭中大量色素等杂质被提取出来，步骤(1)中获得的滤液主要成分为蛋白质。丙酮与水的混合溶液要提前经过预冷至4℃。步骤(1)中，以质量比计，混合溶液：水蛭干品＝5-6:1。

步骤(2)中滤液浓缩后，料液比为1:2。

步骤(3)中加入乙醇的目的是沉淀活性蛋白，除去杂蛋白和其他脂溶性成分。发明人经过多次试验发现，当体系中乙醇体积百分数至65％时可使活性蛋白沉淀完全，并能最大限度除去杂质。

步骤(4)所述的上清液中含有蛋白和脂溶性成分，沉淀中主要是蛋白质，加入纯水溶解的目的是使活性蛋白溶解，并能除去部分不溶性杂质。

所述离心转速大于10000rpm。

与现有的纤溶活性蛋白相比，本发明操作步骤简单，在保证获得纤溶活性蛋白的同时，最大限度降低了提取组分中色素、杂蛋白含量，所述的水蛭纤溶活性蛋白活性强，对纤维蛋白有明显的溶解作用，溶栓率大大提高，在制备溶栓药物中有很大的开发应用前景。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1从干水蛭中提取水蛭纤溶活性蛋白

一种从水蛭中提取纤溶活性蛋白的方法，其具体步骤为：

(1)将水蛭干品粉碎，过20目筛，加入5倍重量4℃预冷的丙酮与水的混合溶液，于4℃冷浸24h，重复提取三次，合并提取液，过滤，得滤液；所述丙酮与水的混合溶液中丙酮的体积分数为40％；

(2)滤液放入旋转蒸发器中，将丙酮蒸发；并浓缩至料液比1:2，得料液I；

(3)向步骤(2)所得料液I中滴加预冷的乙醇，使体系中乙醇体积百分数至65％，于4℃冷浸过夜，得料液II；

(4)去除料液II中上清液，收集沉淀，加超纯水溶解并于4℃放置2h，高速离心机离心，取上清液冷冻干燥，即可得到水蛭中纤溶活性蛋白；离心转速为13000rpm。

实施例2从干水蛭中提取水蛭纤溶活性蛋白

一种从水蛭中提取纤溶活性蛋白的方法，其具体步骤为：

(1)将水蛭干品粉碎，过20目筛，加入6倍重量8℃预冷的丙酮与水的混合溶液，于8℃冷浸24h，重复提取三次，合并提取液，过滤，得滤液；所述丙酮与水的混合溶液中丙酮的体积分数为40％；

(2)滤液放入旋转蒸发器中，将丙酮蒸发；并浓缩至料液比1:2，得料液I；

(3)向步骤(2)所得料液I中滴加预冷的乙醇，使体系中乙醇体积百分数至65％，于8℃冷浸过夜，得料液II；

(4)去除料液II中上清液，收集沉淀，加超纯水溶解并于4℃放置2h，高速离心机离心，取上清液冷冻干燥，即可得到水蛭中纤溶活性蛋白；离心转速为12000rpm。

实施例3从干水蛭中提取水蛭纤溶活性蛋白

一种从水蛭中提取纤溶活性蛋白的方法，其具体步骤为：

(1)将水蛭干品粉碎，过20目筛，加入5倍重量6℃预冷的丙酮与水的混合溶液，于6℃冷浸24h，重复提取三次，合并提取液，过滤，得滤液；所述丙酮与水的混合溶液中丙酮的体积分数为40％；

(2)滤液放入旋转蒸发器中，将丙酮蒸发；并浓缩至料液比1:2，得料液I；

(3)向步骤(2)所得料液I中滴加预冷的乙醇，使体系中乙醇体积百分数至65％，于6℃冷浸过夜，得料液II；

(4)去除料液II中上清液，收集沉淀，加超纯水溶解并于4℃放置2h，高速离心机离心，取上清液冷冻干燥，即可得到水蛭中纤溶活性蛋白；离心转速为15000rpm。

实施例4水蛭纤溶活性蛋白提取物对纤维蛋白的溶解作用

称取400mg琼脂糖粉置于小烧杯中，加入15mLPBS缓冲液混匀，加热使其完全融化；待冷却至40℃左右，取0.2mL凝血酶与琼脂糖溶液混合均匀，再取10mL纤维蛋白原溶液加入小烧杯中，混匀，立即倒入直径为9cm的培养皿中，振摇均匀，水平放置1h使其凝固，备用；凝固后用打孔器打出直径为2mm的小孔，备用。

分别取提取物溶液(相当于原药材0.2g/mL)10μL，点于制备好的纤维蛋白平板上，盖上培养皿盖子，37℃下培养18h。培养结束，测量纤维蛋白平板上溶圈相互垂直的两个直径，并计算溶圏面积。同时，以生理盐水、氯仿/甲醇溶液提取作为对照，纤溶结果表明，40％丙酮溶液提取，65％乙醇沉淀所得提取物纤溶活性最强，结果如表1所示。

实施例5水蛭纤溶活性蛋白提取物对大鼠体外血栓的溶解作用

取雄性大鼠，称重，腹腔注射2％苯巴比妥钠(0.4mg/kg)进行麻醉，于腹腔主动脉取血，所取血液迅速注入10mL圆形玻璃试管，37℃静置3h；待血液凝固，取出，生理盐水洗去血细胞，切成大小均一的小块，再用生理盐水冲洗一次，最后用滤纸吸干其表面水分，称重，分别放入各个反应试管中。取提取物溶液(相当于原药材0.5g/mL)1mL，加入到放有血块的EP管中，置100r/min摇床中，37℃震摇6h。震摇结束，取出血栓，吸干其表面水分，称重，计算栓溶百分率。

表1不同提取物对大鼠体外血栓溶解作用结果(n＝3)

表2不同提取物纤维蛋白平板上的溶圈面积(n＝3)

由于水蛭中纤溶活性成分具有一定的疏水性，只有在一定极性的有机溶剂中才能被有效提取出来，且极性太大提取出来的大多为可溶性色素，而极性太小纤溶活性成分经沉淀后会随杂质除去，采用本发明可以有效地将纤溶活性成分提取出来，所述的提取物对血块溶解重量以及溶栓率和溶圈面积要明显好于其他组别。