水蛭纤溶活性蛋白的分离纯化与性质研究

摘要

水蛭(Hirude nipponica Whitman)属于环节动物门，蛭纲，颚蛭目，水蛭科，在内陆淡水水域内生长繁殖，是我国传统的特种药用水生动物。其性平苦咸，有小毒，作用始载于《神农本草经》，具有逐血化瘀，通经活血之功效。通常以单味水蛭或配伍复方的形式在现代中医中使用，采用煎剂、胶囊剂、片剂、丸剂、口服液等多种剂型，通过内服外敷和局部注射等多种途径给药，广泛治疗不同系统、病位的血瘀症，适应症包括心脑血管、肝、肾、血液等疾病，还包括一些外伤疼痛等疾病。但是中医传统炮制工艺存在较多的局限性，使得阐明水蛭的药效机制及确切的药效成分具有一定的困难性，在很长一段时间内都未能得到明确的研究进展，而现代医药需求的快速发展给药用水蛭的开发带来了更高的要求，近年来水蛭的医用研究越来越广泛，药用水蛭的研究方向主要集中在研发出药用效果较高，成分明确，药效机制清楚的水蛭药物等方面。
　　本课题采用国内市场上最常见的非吸血类水蛭-宽体金线蛭为实验原材料，采用仿生酶解技术得到水蛭粗提物，进一步采用离子交换层析色谱，凝胶色谱等分离纯化技术对水蛭粗提物分离纯化，得到具有纤溶活性的水蛭活性蛋白，并对其进行质谱分析和部分性质的检测与鉴定，以用于后续的药理研究。论文的主要内容如下:
　　1.水蛭纤溶活性粗提物的提取分离:在水蛭纤溶活性粗提物的提取分离过程中，参考药典及相关文献的报道，确定了以纤维蛋白平板溶圈法作为筛选纤溶活性物质的方法。通过鲜品水蛭和干品水蛭的活性对比，最后选用了便于储存，方便处理的干品水蛭作为实验的药材原材料。确定了通过利用胰蛋白酶50℃下水浴酶解，经过醇沉之后得到水蛭活性粗提物，采用调整酸碱度至pH9.5的方法终止酶解反应的进行，以消除胰蛋白酶和粗酶对活性筛选的影响。得到的粗提物冻干品，粗提物的得率为2.97％，经双缩脲法测定粗提物中蛋白质含量为0.685％。
　　2.水蛭纤溶活性粗提物的分离纯化:在粗提物的分离纯化过程中，优化和筛选方法分别采用了Q-SepHroseFF离子层析、SepHadexG-10凝胶层析和SepHacryls200凝胶层析等方法。得到了具有纤溶活性的单一蛋白质物质，通过计算得知蛋白质的得率为0.0049％。
　　3.水蛭纤溶活性蛋白的性质分析和鉴定:利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，得到了单一的蛋白质条带，证明了分离纯化得到的纤溶活性物质为单一蛋白。之后将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验得到的单一条带进行了MALDI-TOF质谱分析，推测其为一种新蛋白。

目录

声明

摘要

缩略语词汇表

第一章 文献综述

1．医用水蛭概述

1．1 水蛭简介

1．2．水蛭生药学特征及资源分布情况

1．3 水蛭药理作用

1．4 水蛭活性物质研究进展

2．血栓及纤溶药物简介

2．1 血栓

2．2 纤溶药物

3．蛋白质分离纯化技术简介

3．1 离子交换层析

3．2 凝胶过滤层析

3．3 电泳

4．课题的目的与创新性

第二章 水蛭活性物质粗提物的制备

1 实验材料

1．1 实验器材

1．2 实验试剂及材料

2．实验方法

2．1 水蛭纤溶活性筛选方法

2．2 水蛭原材料的筛选与确定

2．3 排除蛋白酶对活性测定的干扰的探索

2．4 水蛭纤溶粗提物的提取与含量鉴定

3．实验结果

3．1 水蛭原材料的筛选

3．2 排除蛋白酶对活性测定的干扰的探索

3．3 水蛭活性粗提物的得率计算

4 讨论

4．1 水蛭原材料的筛选

4．2 活性筛选方法的确定

5 本章小结

第三章：水蛭纤溶蛋白质的分离纯化

1 实验材料

1．1 实验耗材

1．2 实验试剂

2．实验方法

2．1 Q-SepHrose FF离子交换柱层析

2．2 SepHadex G10凝胶柱层析

2．3 SepHadex G10脱盐后各组分鉴定

2．4 SepHacryl s200凝胶柱层析

2．5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

3 试验结果

3．1 Q-SepHrose FF离子交换柱层析分离

3．2 G 10脱盐后纤溶活性测定

3．3 SepHadex G10脱盐后性质鉴定

3．4 SepHacryl s200凝胶柱层析

3．5 SepHacryl s200凝胶柱层析各组分活性检测

3．6 SepHacryl s200凝胶柱层析后具有纤溶活性组分性质鉴定及蛋白含量测定

3．7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

4 讨论

4．1 CbSepHrose FF离子交换柱层析

4．2 SepHadex G-10凝胶层析

4．3 SepHacryl s200凝胶层析

4．4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

5 本章小结

第四章 水蛭纤溶活性蛋白的性质检测

1 实验材料

1．1 实验耗材

1．2 实验试剂

2 实验方法

2．1 MALDI-TOF质谱分析

3 实验结果

4 讨论

5 本章小结

第五章 论文总结

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文