一种草鱼肠道菌群失调模型的建立方法

摘要

本发明一种草鱼肠道菌群失调模型的建立方法，特点是以草鱼为实验动物，饲喂混合抗生素28d，抗生素配方及其使用量为氟苯尼考2g/kg饲料、恩诺沙星2g/kg饲料、甲硝唑2g/kg饲料和万古霉素1g/kg饲料，优点是可诱导草鱼肠道菌群失调，为研究细菌性肠炎病的致病机理、筛选治疗肠炎病的有效药物与有益微生物提供了有效工具。

说明书

技术领域

本发明涉及动物实验模型的建立方法，尤其是涉及一种草鱼肠道菌群失调模型的建立方法。

背景技术

肠道微生物群在调节宿主免疫力和维持免疫稳态中起着关键作用，稳定的肠道菌群结构是保持鱼类健康的关键因素，这一点已被广泛接受。先前的研究表明，由于饮食中氧化的鱼油，高脂饮食，环境污染物，高盐胁迫，抗生素暴露和细菌，营养失调，生理变化和免疫功能低下均与肠道菌群组成和多样性的改变有关。这些不良因素已明确地与肠道营养不良有关，肠道营养不良的主要特征是肠道菌群的组成和多样性发生变化。在上述因素中，抗生素的使用被认为是破坏肠道菌群的主要外部因素。

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是一种典型的食草性鱼类，在中国水产养殖中具有重要的经济意义。在最近几年中已经进行了许多有关草鱼肠道菌群的研究。这些研究主要针对肠道菌群与多糖降解，饲料类型，益生菌给药，肠道疾病，脂质代谢，发育阶段和定植模式的关系。尽管抗生素经常用于该物种的水产养殖中，但是没有研究描述抗生素对草鱼肠道菌群的影响。

目前，尽管我们知道抗生素对肠道菌群和鱼类健康的影响，但关于病菌细菌群落中病原微生物与有益微生物之间的相互作用，肠道菌病与疾病之间的因果关系，鲜为人知。因此亟需制定适当的抗生素处理浓度和暴露时间，以建立肠道菌群失调的草鱼模型，并评估肠道菌群的变化，组织病理学变化，生长性能和免疫状况以及肠道基因表达谱。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可诱导草鱼肠道营养不良的草鱼肠道菌群失调模型的建立方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种草鱼肠道菌群失调模型的建立方法，以草鱼为实验动物，饲喂混合抗生素28天，抗生素配方及其使用量为氟苯尼考2g/kg饲料、恩诺沙星2g/kg饲料、甲硝唑2g/kg饲料和万古霉素1g/kg饲料。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种草鱼肠道菌群失调模型的建立方法，以浓度分别为1、2、2和2g/kg饲料的万古霉素，恩诺沙星，氟苯尼考和甲硝唑的混合物进行抗生素处理28天，足以诱导肠腔和粘膜微生物群结构的变化。Proteobacteria的显著增加和Fusobacteria的显著减少。用该方案处理可诱导肠中的caspase-8，MLCK，ZO-1，IL-17N和IL-23R显著下调，以及IL-1β和IL-6的上调，提示可能对肠上皮紧密连接产生影响，因而容易产生炎症。但是这种处理方法并没有产生实质性的组织病理学改变，也没有直接损害生长和健康，是建立一个可靠的草鱼肠道菌群失调模型的最佳选择。草鱼肠道菌群失调模型可为研究细菌性肠炎病的致病机理、筛选治疗肠炎病的有效药物与有益微生物提供了有效工具。

附图说明

图1为抗生素引起的肠腔微生物群组成变化。显示了前10个门(A)和前10个属(B)的相对丰度。Chao1和Shannon分别用作丰富度和多样性指数用于alpha多样性分析(C)，而PCoA和NMDS分别用于beta多样性分析(D)；

图2为抗生素引起的肠粘膜微生物群组成变化；

图3为与对照组相比，抗生素处理组的腔菌群(A)和粘膜菌群(B)中的KEGG途径显著富集或消失。用log2FC测量差异丰度，log2FC是处理组与对照组的倍数变化值的以2为底的对数。*，**和***分别表示p<0.05、0.01和0.001的统计学显著性；

图4为抗生素处理对草鱼生长性能和健康状况的影响。测量体重增加率(A)，条件因子(B)，肝体指数(C)和脾指数(D)。这些参数在组之间有显著差异(p<0.05)，用上方的不同字母表示；

图5为抗生素暴露后肠，肝胰腺和脾脏的组织学变化。显示了肠道(A)，肝胰脏(B)和脾脏(C)的代表性组织学。每个方框区域的放大视图显示在相应面板的下方。红色比例尺，300μm；黑色刻度尺，100μm；白色比例尺，20μm；

图6为抗生素处理对上皮细胞连接及炎症反应相关基因肠表达水平的影响。将对照样品中的表达水平设为1，并用水平线表示，而抗生素处理组中的表达水平显示为相对于对照的倍数变化。*，**和***分别表示p<0.05、0.01和0.001的显著差异。

图7为嗜水气单胞菌感染肠道菌群失调草鱼与正常草鱼的死亡率，a为正常草鱼组(Control)，b为正常草鱼浸泡嗜水气单胞菌组的鱼(Control-BI)，c为正常草鱼肛灌嗜水气单胞菌组的鱼(Control-AI)，d为肠道菌群失调组鱼(Dysbacteriosis)，e为肠道菌群失调草鱼浸泡嗜水气单胞菌组的鱼(Dysbacteriosis-BI)，f为肠道菌群失调草鱼肛灌嗜水气单胞菌组的鱼(Dysbacteriosis-AI)；

图8为致病性嗜水气单胞菌肛灌和浸泡感染正常鱼、菌群失调鱼后各组鱼血清中的嗜水气单胞菌的含量。Control为正常对照鱼，Dysbacteriosis为菌群失调鱼，AI为肛灌感染，BI为浸泡感染。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

一、具体实施例

1、实验鱼：实验中使用的两龄大草鱼购自未来水产养殖场(中国苏州)。研究之前，实验鱼未使用过任何抗生素。在苏州大学水产养殖系统中，在连续通气增氧条件下，将鱼放在18个培养槽(500L)中适应两周。每天于8:30和16:30两次喂鱼来自上海忠旺饲料有限公司(中国上海)的商业饲料，投饵量为体重的2％。在实验期间，水温和pH分别保持在27±2℃和7.2±0.4，水体溶氧大于6.0mg/L，每天约更新三分之一的水。

2、抗生素处理：适应后，将总共180条健康鱼(53±4g)随机分为6组(5个处理组和1个对照组)，每组在3个培养槽中容纳30尾鱼(每槽10尾)。为了在草鱼中引起肠道菌群失调，将含有万古霉素，恩诺沙星，氟苯尼考和甲硝唑(VEFM)的抗生素混合物与蔗糖(10g/kg饲料)拌入商业饲料中。在五个处理组(VEFM1～5)中，使鱼肠道暴露于抗生素混合物中，而对照鱼则未接触任何抗生素(表1)。VEFM5组中的鱼首先在不添加抗生素的饲料投喂23天，然后在补充抗生素的饲料投喂5天，而其他处理组的鱼则连续28天接触抗生素。

表1抗生素处理和暴露时间

*:VEFM5组中的鱼首先在不添加抗生素的饲料投喂23天，然后在补充抗生素的饲料中投喂5天。

3、取540尾实验鱼(56±4g)，养殖于18个养殖桶，随机选取9个养殖桶草鱼，以能使肠道菌群严重失调的抗生素处理方案，即以万古霉素1g、恩诺沙星2g、甲硝唑2g、氟苯尼考2g/kg饲料剂量干预28d，制备草鱼肠道菌失调草鱼，剩余9个养殖桶为对照组。造膜后分别以10

二、结果分析

1、抗生素暴露后对草鱼肠道菌群的影响

抗生素干预试验完成后，将鱼用MS-222(60mg/L)麻醉并处死，并取出整个肠以收获腔内物质。使用预冷的无菌PBS(0.01M，pH 7.4)将肠腔中的内容物冲洗掉，并用无菌滤纸干燥。然后用PBS彻底清洗肠。将肠粘膜和管腔内容物分别转移到冷冻管中，立即在液氮中冷冻，然后在-80℃下保存，用于分析在肠道中腔内微生物群和粘膜微生物群。

图1显示了在门类和属水平上的腔微生物群的前10个优势细菌类群。如图1A所示，在对照鱼的肠腔中，在门水平上微生物群主要由Fusobacteria(44.9％)、Proteobacteria(23.6％)、Bacteroidetes(13.0％)、Firmicutes(12.2％)、Chlamydiae(1.87％)、Tenericutes(1.41％)、Verrucomicrobia(1.40％)和Actinobacteria(1.11％)组成，所有其他门的相对丰度<1.0％。在所有抗生素处理组中，Bacteroidetes and Firmicutes的相对丰度急剧下降。除短期暴露(VEFM5)组外，所有抗生素处理组的Fusobacteria均明显减少，VEFM3和VEFM4组的相对丰度分别比对照水平降低了83.1％和89.9％。此外，Tenericutes在VEFM1组中无明显变化，但在VEFM2，VEFM3和VEFM4组中其相对丰度显著低于对照组(p<0.05)。相反，抗生素处理后，Proteobacteria、Verrucomicrobia和Planctomycetes的优势增加，VEFM3和VEFM4组的Proteobacteria与对照组相比显著提高了2.4倍(p<0.05)。但是VEFM4组与对照组和其他抗生素处理组相比，对照组微生物群中两个非优势菌群TM6和TM7的相对丰度显著更高(p<0.05)。与对照相比，在肠腔微生物群中，细菌群落结构在属水平上也发生了显著变化(图1B)。抗生素暴露28d后，检出了Cetobacterium,Bacteroides,Candidatus Protochlamydia,Anaerorhabdus,和unidentifiedErysipelotrichaceae的相对丰度显著下降。Cetobacterium的相对丰度下降幅度最大，从对照组的44.9％下降到VEFM4组的4.5％。Bacteroides的含量也从对照组的12.7％下降到VEFM4的4.0％以下，甚至在VEFM1和VEFM3组接近于零。Candidatus Protochlamydia从对照组的1.7％下降到低于VEFM4组的0.9％。对照组，Anaerorhabdus和unidentifiedErysipelotrichaceae分别达到3.8％和6.9％，但是在暴露于抗生素的28天的所有组中均未检出。相反，抗生素处理后，Rhodobacter,Luteolibacter,及非优势菌属的Citrobacter和Klebsiella的相对丰度增加。在肠腔微生物区系中，某些属显示出比其他属更显著的增加，例如VEFM4组中的Rhodobacter和Klebsiella，VEFM1组中的Luteolibacter和VEFM3组中的Citrobacter。此外，在VEMF5组中，最主要是Cetobacterium和Rhodobacter的两个属的菌，相对丰度分别为45.2％和13.3％，与对照组相比具有高度可比性。这种模式与其他抗生素处理组大致相似，尽管管腔和属水平的管腔微生物群发生了这些变化，但根据Chao1和Shannon的多样性指数，各组之间物种丰富度和多样性没有显著差异(p>0.05，图1C)。此外，使用PCoA和NMDS进行β多样性分析表明，VEFM3和VEFM4组与其余组完全分离(图1D)。

图2显示了在门和属水平上的肠粘膜微生物群的前10个优势细菌分类群。如图2A所示，对照鱼肠粘膜中的细菌群落在门水平上主要是由Proteobacteria(50.8％)、Fusobacteria(24.0％)、Bacteroidetes(14.1％)、Firmicutes(5.6％)和Tenericutes(4.5％)组成，而Actinobacteria、Chlamydiae、Verrucomicrobia和其他门的菌比例很小。在抗生素处理组中，Tenericutes、Bacteroidetes、Fusobacteria和Firmicutes的相对丰度总体上有所降低。相反，Actinobacteria、Proteobacteria、Thermi和Planctomycetes的增加程度不同，但是观察到在VEFM4组中Actinobacteria的增加幅度最大，其次是VEFM5组；在VEFM5组中还发现了Planctomycetes和Thermi，随后是VEFM4组。此外，TM6和TM7在两个最高剂量组中增加，与肠腔微生物群中观察到的变化一致。相比之下，VEFM5组的肠粘膜微生物群受抗生素的影响最大，其次是VEFM4组。在粘膜微生物群中，抗生素处理也显著影响属水平的微生物组成(图2B)。属于Desulfovibrionaceae、Erysipelotrichaceae和CK-1C4-19的三个未知属的相对丰度分别从对照组的27.9％，3.5％和4.5％急剧降低至不足1.8％组，Bacteroides的比率从13.3％下降到3.4％。同样，在所有抗生素处理组中，Cetobacterium的相对丰度均降低，但在VEFM3组中，观察到的相对丰度有所增加。此外，在高暴露鱼群中，Pseudoalteromonadaceae中的某些未定定名的菌明显减少。相反，抗生素处理后某些属在粘膜中富集。与对照组和5d暴露组相比，在28d暴露组中Plesiomonas和Citrobacter明显丰富(p<0.05)。此外在检测结果中我们还发现，非优势种属的Luteolibacter、Acinetobacter、Vibrio、Lactobacillus、Klebsiella和2个未归属类的菌在对照中的相对丰度低于0.1％。但是，在暴露于抗生素的组中，它们的丰度增加到3.7％以上，其中在VEFM5组中检测到了Luteolibacter、Acinetobacter、Lactobacillus和来自Comamonadaceae的未分类属的菌增量最大。此外，在VEFM1和VEFM4组中发现了Vibrionales中未分类的菌大量增加，而在VEFM3和VEFM4组中发现了在Shewanella和未鉴定的Aeromonadaceae。与肠腔菌群不同，在对照组和两个高暴露组之间的黏膜菌群中物种丰富度和多样性存在显著差异(p<0.05，图2C)。但是，就β多样性而言，除VEFM2组外，所有其他处理组均与对照组完全分离(图2D)。

综上所述，从抗生素暴露的浓度与时间对草鱼肠腔及肠粘膜中的微生物的种群结构与生物多样性影响程度分析，高剂量、长时间抗生素暴露处理的VEFM4组使鱼的肠道菌群的影响最显著，足以诱导肠腔和粘膜微生物群结构的变化，特别是Proteobacteria的显著增加和Fusobacteria的显著减少。

2、抗生素处理后粘膜和腔内微生物群KEGG途径丰度的变化

为了探讨是否由于微生物群的改变而损害了粘膜和腔内微生物群的微生物功能，我们确定了非抗生素对照组和抗生素处理组之间微生物群中KEGG途径的差异。与对照组相比，KEGG通路的差异明显，图3A显示，最低剂量(VEFM1组)处理，未发现明显改变，但抗生素处理导致粘膜和肠腔内微生物群通路丰度发生了显著变化。VEFM4处理组显著或极显著地影响了肠腔中的5条代谢通路，其中显著增强了蛋白酶体，视黄醇代谢，系统性红斑狼疮路径，减弱了果糖和甘露糖代谢与磷酸转移酶系统(PTS)途径。VEFM2组显著影响了2条途径，显著减弱了四环素的生物合成途径，增加了细菌上皮细胞的细菌入侵途径。图3B同样显示，最低剂量(VEFM1组)处理对肠粘膜的KEGG通路无显著影响，而其他4组均显著增强了细菌上皮细胞的细菌入侵途径；奇怪的是，当暴露于最高抗生素浓度时，与长期暴露(VEFM4组)相比，短期暴露(VEFM5组)影响粘膜微生物群的途径更多，大多数途径在最高抗生素浓度短期暴露后显著上调，包括抗原处理和递呈、花生四烯酸代谢、PPAR信号通路等22条通路，而只有致病性大肠杆菌感染与癌症通路这2种途径被减弱。因此，与微生物群相关的一些KEGG途径也受到抗生素处理的显著影响，这暗示着肠道微生物群功能的潜在改变。当鱼类暴露于抗生素混合物时，即使在较低剂量或短时间内，细菌感染上皮细胞(一种与传染病相关的KEGG途径)也很容易在粘膜微生物群中富集。

3、抗生素处理对草鱼生长性能的影响

在暴露抗生素之前和实验结束时，使用以下公式对每个培养池中的所有鱼进行组称重，以确定体重增加：增重率(％)＝100×[(Wf-Wi)/Wi]，其中Wf是最终总重量(g)，Wi是初始总重量(g)。使用以下公式计算实验结束时的肥满度，肝体指数和脾脏指数：肥满度＝100×(W/L

在整个观察期内，所有组中没有鱼类死亡。抗生素处理结束后，将暴露于抗生素和正常对照组鱼之间的生长和健康状况。如图4所示，VEFM1，VEFM2和VEFM3组的鱼体重增加显著高于对照组(p<0.05)；但无论暴露时间长短，对照鱼与暴露于高抗生素中的鱼体重之间没有发现显著差异。此外，在暴露于低剂量抗生素混合物的鱼中以及在短时间暴露于最高剂量的鱼中，均观察到肝体指数的显著降低。关于脾脏指数，在暴露于高剂量抗生素混合物的鱼中观察到显著增加。

4、抗生素处理后菌群失调对草鱼组织器官的影响

麻醉后，将鱼处死并解剖整个内脏肿块以收集肠，肝胰脏和脾脏组织。从肠道最后一个弯曲之前约1.5cm的区域收集肠组织，并切成约5mm长的段，将肝胰腺和脾脏组织切成约1立方厘米的小块，然后将这些组织在10％福尔马林溶液中固定24小时以上，在乙醇溶液中连续脱水，包埋在石蜡中，切成8μm的切片。将切片用苏木精-曙红染色，并在光学显微镜下观察。

与对照组相比，在所有暴露28d的组中，肠道在显微镜下均正常且绒毛结构完整，未观察到明显的病理变化或炎症迹象。但是，在VEFM5组的肠中可以看到绒毛粘连和白细胞浸润，这可能是由于从常规饲料转换为含药饲料引起的应激反应所致(图5A)。关于肝胰腺的组织学，尽管暴露于高暴露组(VEFM3和VEFM4)的肝索中可见轻度的紊乱，但抗生素暴露后未观察到明显的组织学改变(上图，图5B)。然而，通过在400×放大倍数下进一步观察，在VEFM2，VEFM3和VEFM4组中发现了空泡化和肿胀的肝细胞(下图，图5B)。在来自VEFM3和VEFM4组的肝胰腺中，一些肝细胞显示出收缩的细胞核和脂质滴(下图，图5B)。在所有组中，脾脏似乎都是正常(上图，图5C)，但是在所有暴露于抗生素的组中，尤其是在VEFM4组，均形成了黑色素巨噬细胞中心；抗生素暴露后也发生了纤维增生和炎性细胞浸润(下图，图5C)。因此，大剂量的抗生素可能会对脾脏免疫指数产生一定的不利影响，综上所述，脾脏发生免疫应答反应，未发生病理变化。

5、抗生素处理后的菌群失调对草鱼血液指标的影响

正常情况下，AST、ALT存在于肝脏中，当肝脏受损后，AST、ALT被释放到血液中，导致血清内两种酶活性升高，本研究发现，在抗生素暴露后，血清内AST及ALT活性升高，并且存在浓度依赖性，高剂量抗生素短时间暴露后与正常鱼差异不显著，伴随抗生素剂量减少，肝脏释放至血清中的AST、ALT逐渐减少，原因可能为不同剂量抗生素导致菌群失调程度不同，改变了机体代谢，增大肝脏代谢压力，其二可能为抗生素的毒性作用减小，导致肝脏受损程度减弱。

ALB浓度是鱼体健康状况的基本指标，本研究中VEFM2、VEFM3白蛋白含量均高于对照，不呈现显著，肝功能受损严重时，ALB产生减少，VEFM1、VEFM5白蛋白水平低于对照，原因为高剂量的抗生素严重影响肝脏功能，导致ALB的分泌减少。

如表2所示，无论暴露浓度或持续时间如何，抗生素暴露都会导致红细胞和白细胞数量显著降低，但所有抗生素接触组之间均无显著差异。暴露于28d抗生素生理组的鱼血清球蛋白(Glob)水平显著低于对照组(p<0.05)，但不同抗生素暴露组之间无显著差异(p>0.05)。在短期(5d)接触高水平抗生素的鱼中，血清球蛋白与对照组无显著差异。但是，所有组的血清白蛋白水平均无明显差异。此外，更长的抗生素暴露时间对血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性有显著影响，血清ALT和AST活性均随抗生素浓度的增加而显著增加，尽管某些抗生素暴露组之间无统计学差异。相反，短期接触导致ALT活性无明显增加，但AST活性显著增加(p<0.05)。但是，它们远低于长期暴露于相对较高浓度的鱼中的含量(p<0.05)。

表2在暴露于不同浓度的抗生素混合物的鱼中测得的血液参数

备注：所有值显示为平均值±SD(n＝3)。同一列不同字母的均值差异显著(P<0.05)。RBC，红细胞；WBC，白细胞；Alb，白蛋白；Glob，球蛋白；ALT，谷丙转氨酶；AST，谷草转氨酶。

综上所述，抗生素暴露引起的菌群失调后草鱼肝脏组织损害，造血功能异常，免疫球蛋白含量均下降，鱼体免疫力下降，鱼体健康状态遭到破坏。

6、抗生素处理后菌群失调对草鱼肠道上皮细胞连接及炎性相关基因的影响

为了确定参与上皮细胞连接或炎症反应的基因的表达水平，从中肠的后部收集约1.5cm长的肠组织。从肠道组织中分离出总RNA并将其反转录为单链cDNA。表3列出了所有特异性引物。β-肌动蛋白基因用作内部参考。使用具有Tip Green qPCR SuperMix(TransGenBiotech)的Bio-Rad CFX96实时系统(Bio-Rad，Hercules，加利福尼亚州，美国)进行qPCR反应。将表达水平标准化为β-作用基因的表达水平，并通过2-ΔΔCt方法定量。相对表达水平表示为对照的倍数变化。

表3用于qPCR分析的引物

抗生素暴露对肠道屏障的结构影响不显著，但增加了对病原菌的易感染性，组织水平未发现明显屏障破坏，因此需要从基因水平观察肠道屏障是否遭到破坏。如图6所示，抗生素暴露后草鱼肠道上皮细胞相关基因mRNA相关表达量，抗生素处理28d的草鱼肠道caspase-8mRNA相对表达量显著降低(p<0.05)，而短时间处理的VEFM5组草鱼相对表达量提高但差异不显著。与正常鱼相比，抗生素处理28d的草鱼肠道JNK mRNA相对表达量降低但差异不显著，短时间处理的VEFM5组则极显著增高(p<0.001)。与正常鱼相比，VEFM2、VEFM3、VEFM4组草鱼肠道MLCK mRNA相对表达量极显著降低(p<0.001)，VEFM1组并未发现显著变化，VEFM5组则极显著提高(p<0.01)。与正常鱼相比，抗生素处理28d的草鱼肠道ZO-1mRNA相对表达量除了VEFM1组差异不显著外其余各组均显著下降，VEFM5组草鱼肠道mRNA相对表达量极显著增高(p<0.01)。

如图6所示，抗生素暴露后草鱼肠道炎性相关基因mRNA相关表达量，与正草鱼相比，抗生素处理各组IL-1β与IL-6的mRNA均显著上调表达；抗生素处理28d的IL-17N与IL-23R mRNA相对表达量显著降低(p<0.05，p<0.01)，而适时间处理的VEFM5组则显著上调(p<0.05)。

上述观察结果表明，MLCK和ZO-1表达的明显降低所证明，抗生素可能会导致微生物群失调，从而增加机会细菌的数量，进而破坏肠上皮紧密连接。除了上皮紧密连接改变以外，抗生素引起的肠道菌群失调可能会引起肠道炎症。尽管在器官组织水平上肠道无明显异常，但在基因水平上，发生了明显的免疫抑制，肠道物理屏障与免疫屏障均遭到破坏，可能会易于病原体的入侵。

7、菌群失调对草鱼发病率的影响

如图7所示，观察草鱼发病情况发现，菌群失调草鱼浸泡感染后疾病指数最高，观察存活率发现，在浸泡与肛灌感染嗜水气单胞菌后，未感染的正常组、菌群失调鱼，以及正常鱼浸泡感染组的鱼均未出现死亡，成活率为100％，正常鱼肛灌嗜水气单胞菌的成活率为80％，菌群失调并肛灌嗜水气单胞菌的鱼成活率为90％，菌群失调后浸泡嗜水气单胞菌的草鱼存活率最低为60％。如图8所示，检查血液中的致病性嗜水气单胞菌发现，草鱼血液中菌的含量与死亡率成正相关，菌群失调草鱼血液内出现了115-130CFU/ml的致病菌，菌血症的发生导致40％的草鱼死亡，正常鱼肛灌组草鱼的血液中也出现了10-30CFU/ml的菌，这说明菌群失调草鱼的共生菌被破坏，难以阻止致病菌的定植。而菌群失调鱼肛灌嗜水气单胞菌后第3天才查出0-10CFU/ml的致病菌，第7d就没有检测到，说明抗生素暴露后肠道内可能残留部分抗生素，具有抑制病原菌的作用，因而菌群失调草鱼在肛灌感染后发病率、死亡率菌低于正常草鱼。

综上所述，抗生素暴露后，草鱼肠道菌群失调，α多样性增加，β多样性显示VEFM4菌群组成与正常鱼差异最大，血液指标指示草鱼健康状态遭到破坏，器官组织形态学显示器官并未发生明显病变，基因水平显示肠道屏障遭到破坏，浸泡病原菌感病率显著增加。VEFM4草鱼抗生素浓度为诱导肠道菌群失调最适浓度，即万古霉素1g、恩诺沙星2g、甲硝唑2g、氟苯尼考2g/kg饲料，连续暴露28d。

上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。