一种重组戊型肝炎口服疫苗及其制备方法

摘要

本发明公开了一种重组戊型肝炎口服纳米粒疫苗的制备方法和应用，所述疫苗抗原p146有良好的抗原性，在体内能够抵抗消化酶降解，在体外能够保持良好的热稳定性；所述p146的粘膜抗原递送系统是采用离子交联法制备的壳聚糖纳米颗粒(CSNPs)，该纳米粒制备方便、成本较低且无毒性，能够有效保护抗原、促进肠粘膜对抗原的摄取。本发明公开纳米粒疫苗(CSNPs/p146)粒径均一、体系稳定、有良好的生物相容性，并能够刺激小鼠产生高水平的体液、粘膜免疫应答以及Th2型细胞免疫应答，适合用于重组戊型肝炎口服疫苗领域。

说明书

技术领域

本发明涉及重组蛋白口服疫苗技术领域，具体涉及一种将戊型肝炎重组衣壳蛋白制备成口服纳米颗粒疫苗的方法，以及该疫苗在预防戊型肝炎病毒感染中的应用。

背景技术

戊型肝炎(Hepatitis E,HE)是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的急性传染性疾病，在发展中国家持续构成严重威胁，每年至少有2000万 HEV感染病例，有症状的病例超过300万例，死亡人数约6万人。孕妇在妊娠晚期感染可导致高达30％的死亡率，免疫功能低下的患者感染后会慢性化。到目前为止，仍没有有效的、非致畸的针对HEV感染的特殊治疗方法，因此如何有效预防和控制HEV的传播成为一个重要的公共卫生问题。虽然现有的HE 疫苗对健康成人具有很好的保护作用，但注射类疫苗由于不良反应较多而不利于推广。相比之下，重组HE口服疫苗的研制成本较低、免疫方式简单且安全性更高，并能够刺激肠粘膜产生有中和病毒能力的分泌型IgA(sIgA)，在一定程度上可弥补注射疫苗的不足。

然而，由于直接口服蛋白类抗原产生的抗原特异性免疫反应有限，该类抗原在口服疫苗应用中仍然面临着巨大挑战。采用能够负载蛋白类抗原的纳米材料作为抗原递送系统在一定程度上可以解决上述问题。壳聚糖纳米颗粒目前已经作为一种有效的纳米载体在一系列动物模型中进行了诸多实验，并已被证明可以促进实验动物产生有效的免疫反应。迄今为止，并未有任何报道涉及壳聚糖纳米颗粒封装戊型肝炎重组衣壳蛋白在口服疫苗方面的应用前景。

发明内容

发明目的：本发明目的在于提供一种重组戊型肝炎口服疫苗及其制备方法，进而克服现有技术缺陷，提高戊型肝炎重组衣壳蛋白的口服生物利用度，提高口服免疫原性。

技术方案：为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

为了实现上述目的，本发明对口服戊型肝炎重组疫苗抗原p146进行体内消化酶耐受实验和热稳定性实验。

为了提高p146的生物利用度及免疫原性，本发明公开了一种负载重组蛋白 p146的壳聚糖纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将p146水溶液与三聚磷酸钠溶液按照1:1的体积比例充分混合，得到p146-三聚磷酸钠混合液；

(2)将p146-三聚磷酸钠混合液逐滴加入壳聚糖冰醋酸溶液中，以3ml/min 的速度进行磁力搅拌，从而得到表面带正电荷的纳米颗粒。

优化地，所述p146-三聚磷酸钠混合液与壳聚糖冰醋酸溶液的体积比为2:1。

优化地，所述p146-三聚磷酸钠混合液中，p146浓度为0.25-1mg/ml(优选 1mg/ml)，三聚磷酸钠的浓度为0.5-2mg/ml(优选1mg/ml)。

优化地，所述壳聚糖冰醋酸溶液中壳聚糖浓度为0.5-2mg/ml(优选2mg/ml)

优化地，所述纳米颗粒制备体系的pH值为5.5-7.0(优选6.0)。

优选地，所述壳聚糖壳聚糖脱乙酰度≧95％，粘度为100-200mpa.s，所述负载p146的壳聚糖纳米颗粒的粒径为376.0±109.4nm，PDI为0.397±0.02，zeta电位为18.0±1.2mv，包封率为65.0±5.0％，载药量为67.5±7.5％。

技术效果：

(1)p146在体内不被消化酶降解，保证了其经过消化道后的完整性；

(2)p146在体外具有较好热稳定性，降低了运输和保存成本。

(3)采用生物可降解的壳聚糖纳米颗粒负载p146，制成的口服疫苗具有良好的生物相容性，在免疫过程中能够保证安全性；

(4)壳聚糖可以可逆瞬时地打开小肠上皮细胞间的紧密连接，故用壳聚糖纳米颗粒装载p146进行口服免疫，能够提高p146的吸收效率和生物利用度，进而提高其免疫原性。

附图说明

图1：检测p146灌胃后小鼠粪中的剩余蛋白。其中a图为SDS-PAGE，b图为Western-blot。1为纯化p146(灌胃前)，2为灌胃小鼠的粪悬液，3为空白粪悬液对照。

图2：间接ELISA检测p146的抗原性。横坐标为HEV中和性单抗1G10的稀释度，纵坐标为双波长450nm/630nm时测定各孔OD值。

图3：p146的热稳定性研究。图a和b分别为2w和4w时p146在不同温度环境下的降解程度。

图4：TEM下观察负载p146的壳聚糖纳米颗粒。图(1)(2)标尺均为100nm； (3)(4)为平均直径计算，采用Image-Pro Plus软件。

图5：FE-SEM观察负载p146的壳聚糖纳米颗粒形貌。图(a)标尺为1μm，图 (b)(c)为300nm，图(d)为100nm。

图6：DLS检测纳米颗粒的平均粒径。其中横坐标代表粒径范围。

图7：纳米颗粒的表征。图a(1)为包封率和载药量，a(2)为体外蛋白释放率；图b为MTT法细胞毒性检测。

图8：TEM检测酸处理前后CSNPs的结构。(a)为酸处理前，(b)为酸处理后。

图:9：口服免疫小鼠后血清抗体IgG滴度检测。(a)为空白对照，(b)为不载p146 的壳聚糖纳米颗粒，(c)纯化p146，(d)为载p146的壳聚糖纳米颗粒。血清从1:10 0开始做倍比稀释，共八个稀释度。

图10：不同免疫组小鼠的血清IgG和粪悬液sIgA的几何平均滴度(GMT)。统计学分析采用two-way-Anova，作图软件为GraphPad。*P<0.05，**P<0.01， ns P>0.05。

图11：口服免疫小鼠后粪悬液sIgA OD值检测。(a)为空白对照，(b)为不载 p146的壳聚糖纳米颗粒，(c)纯化p146，(d)为载p146的壳聚糖纳米颗粒。粪悬液从1:10开始做倍比稀释，共八个稀释度。

图12：初次免疫后11W不同免疫组小鼠肠粘膜灌洗液sIgA OD值比较。(a) 灌洗液从1:10开始做倍比稀释，共八个稀释度；(b)肠粘膜灌洗液稀释度为1:10 时sIgA OD值的统计学分析。统计学分析采用one-way-Anova，作图软件为 GraphPad。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns P>0.05。

图13：比较不同免疫组小鼠的血清IgG(1:100)和粪悬液sIgA(1:10)OD值的差异。统计学分析采用two-way-Anova，作图软件为GraphPad。*P<0.05，**P <0.01，***P<0.001，****P<0.0001，ns P>0.05。

图14：ELISA检测小鼠脾淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ的水平。检测前采用 p146刺激小鼠脾细胞，图(a)为IFN-γ，图(b)为IL-4。*P<0.05,**P<0.01,***P <0.001。

图15：qRT-PCR检测小鼠脾脏细胞因子表达量。其中(a)和(b)分别为IFN-γ和 IL-4的mRNA转录水平。*P<0.05，ns P>0.05。

图16：流式细胞术鉴定小鼠的特异性T细胞应答水平。(a)流式细胞术鉴定小鼠脾淋巴细胞中CD4+T细胞胞内细胞因子(IFN-γ和IL-4)的表达，小鼠采用 CSNPs/p146进行免疫；(b)(d)：统计学分析各个免疫组IFN-γ和IL-4细胞频数；(c)(e)：统计学分析各个免疫组IFN-γ和IL-4的平均荧光强度。*P<0.05， ns P>0.05。

图17：重组HE口服疫苗研制流程图。研发过程1-4步骤由红色箭头串联。1.运用软件预测HE抗原p146的3D结构及抗原表位，设计并表达蛋白，运用离子交联法合成壳聚糖纳米材料并封装抗原p146；2.采用扫描电子显微镜观察口服疫苗的直径与形貌；3.将合成的疫苗口服免疫小鼠；4.比较小鼠的体液免疫应答水平和细胞免疫应答水平。

具体实施方式

下面结合附图和具体实例，进一步阐明本发明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

本发明以下所使用的DEPC水购于南京凯基生物，蛋白分子量标准购于美国Fermentas公司，胰蛋白胨、酵母提取物购自英国COXOID公司，乙二醇.双氧水、氯化钙、氯化钠、琼脂粉、碳酸氢钠、氢氧化钾、三羟甲基氨基甲烷购自国药化学试剂有限公司，四甲基乙二胺、十二烷基硫酸钠、过硫酸铵、酪蛋白、甘氨酸、考马斯亮蓝R250购自美国Sigma公司，5，5一四甲基联苯胺、二氨基联苯胺盐酸盐购自美国Promega公司，EZ geneTMPlasmidMiniprep Kit购自美国 Biomiga公司，DNA分子量标准购自德国Roche公司，丙烯酰胺、N，N.亚甲双丙烯酰胺购自美国Pierce公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体购自美国KPL公司，NC膜(硝酸纤维素膜)购自BIO—RAD USA。

实施例一

一、重组蛋白消化道环境耐受实验

小鼠体内消化实验：将p146调节至1mg/ml，每只小鼠一次性灌胃500μl重组蛋白；灌胃后收集4h内每只小鼠的粪，称重后以PBS充分溶解(每1g粪采用2ml PBS溶解)，制成粪悬液；SDS-PAGE检测粪悬液中是否有目的蛋白残留， Western blot检测悬液中的蛋白是否能够和HEV中和性单克隆抗体1G10反应。结果表明p146完全不被消化道环境破坏，小鼠粪便中检测到剩余蛋白分子量并未改变，且剩余蛋白依然能够与HEVmAb 1G10反应。

二、重组蛋白的抗原性检测

间接ELISA法检测p146与HEV中和性单抗1G10的反应能力。将p146用 0.01mol/L尿素PBS稀释后包被微孔板，100μl/孔，37℃孵育2h后PBST洗涤3 次，拍干；将HEV中和性McAb1G10(用10％乙二醇从1:400开始倍比稀释)，而后加入酶标孔，每孔100μl，置于37℃孵育45min，PBST洗涤3次，拍干；用10％乙二醇以1：2500稀释HRP羊抗鼠IgG，每孔加100μl，置于37℃孵育 45min，PBST洗涤3次，拍干；加入TMB底物，底物A和底物B各50μl，37℃避光放置10min，之后每孔加入2M H2SO450μl终止反应；酶标仪以空白对照孔调零，双波长450nm/630nm测定各孔OD值。结果表明重组蛋白p146具有良好的抗原性。

三、重组蛋白的稳定性检测

热稳定性检测实验：将待测p146的浓度调整至0.5mg/ml；取100μl加入EP管，封口后放分别置于4℃、37℃环境中；在1w、2w和4w时间点取出部分蛋白， SDS-PAGE检测重组蛋白的降解程度。结果表明p146在不同温度环境下都能够保存稳定，具有良好的热稳定性。

实施例二 重新戊型肝炎口服疫苗的制备

一、离子交联法制备负载p146的壳聚糖纳米颗粒

1.配置0.5％冰醋酸水溶液，20mg/ml的TPP，将CS溶解于0.5％冰醋酸水溶液 (隔夜溶胀)，终浓度调整为2mg/ml；取壳聚糖溶液放入烧杯，在磁力搅拌下以 3ml/min的速度，将三聚磷酸钠调整至1mg/ml，逐滴加入壳聚糖溶液中，壳聚糖与三聚磷酸钠体积比为2:1；壳聚糖冰醋酸溶液可由澄清转变为淡蓝色乳光的胶体溶液体系，继续搅拌30min，3000rpm离心15min，沉淀由缓冲液清洗3次，冻干后即得壳聚糖纳米颗粒。

2.将重组蛋白p146(调整至1mg/ml)与三聚磷酸钠溶液(TPP终浓度调整至 1mg/ml)充分混合；取壳聚糖冰醋酸溶液放入烧杯，在磁力搅拌下以3ml/min 的速度，将p146-三聚磷酸钠混合液逐滴加入壳聚糖溶液中，p146-三聚磷酸钠混合液与壳聚糖冰醋酸溶液的体积比为2:1。

3.纳米颗粒的形貌观察与粒径检测

透射电镜和动态光散射检测负载p146的壳聚糖纳米颗粒的粒径；场发射扫描电镜观察纳米颗粒的形貌；动态光散射检测纳米材料的多分散系数和zeta电位。结果表明：负载p146的壳聚糖纳米颗粒的形貌为类圆形，DLS检测其粒径为376.0±109.4nm，PDI为0.397±0.02，zeta电位为18.0±1.2mv；透射电镜检测结果为38.94±7.42nm，小于DLS所得粒径结果；扫描电镜检测纳米颗粒为类球形，粒径为200-300nm，与DLS结果相似。

4.壳聚糖纳米颗粒的包封率、载药量测定

采用Bradford法检测包封率、载药量和体外蛋白释放率。包封率(EE％)＝蛋白总量-离心后上清中蛋白/蛋白总量×100％；载药量(LC％)＝蛋白总量-离心后上清蛋白总量/纳米材料重量×100％。壳聚糖纳米颗粒对p146的包封率为 65.0±5.0％，载药量为67.5±7.5％。

4.纳米颗粒蛋白释放率测定

用3mlPBS(PH＝5.5)溶解载p146的纳米颗粒，而后将样品放置于恒温摇床，100rpm，37℃振荡；分别于特定的时间(0、0.5h、1h、2h、4h、12h、24h、48h)，将样本放置超速低温冷冻离心机12000rpm离心30min，而后用PBS(PH＝5.5)替换上清液，达到与原来相同的体积；用Bradford法检测每个时间点上清液中释放出的蛋白浓度，GraphPad绘制抗原释放曲线。C壳聚糖包封的p146在12h内发生突然释放(释放率在40％-80％之间)，在 24h之后释放量显著减少，当p146初始投入浓度为1mg/ml时，更利于壳聚糖对其保持和容纳。

5.纳米颗粒的细胞毒性检测

采用MTT法和Live/dead染色评价纳米颗粒对L929细胞系的毒性。细胞存活率计算公式为：存活率(100％)＝(实验组/对照组OD)*100％(利用graphpad prism7软件制图(呈现方式为Mean+SD)；采用激光共聚焦显微镜检测结果并拍照。结果显示，当纳米材料的浓度增加到2mg/ml时，相对细胞存活率虽然将至89.56％，但仍然大于70％，高于国际上对细胞毒性的判定标准，因此壳聚糖纳米颗粒在使用浓度范围内对细胞无潜在毒性。

6.纳米颗粒对酸性环境的耐受性

采用透射电子显微镜检测壳聚糖纳米颗粒在经过酸(pH＝2)处理后，是否会发生崩解。结果显示，壳聚糖纳米材料在酸性环境下未发生崩解。

实施例三 重组戊型肝炎口服疫苗效力实验

小鼠口服免疫实验：准备6～8周龄雌性Balb/c小鼠共24只。实验共分四大组：①空白对照组②不载抗原纳米颗粒组③p146组④载p146纳米颗粒组，每组6 只小鼠，共4次免疫(0、14、28、56d)。在免疫前每只小鼠眼眶采血50μl，12000rpm 离心15min，分离血清作为阴性对照，保存于-20℃备用；初次免疫后3w开始眼眶采血、收取每只小鼠的粪，每隔2w采血/收粪1次直至9w；每只小鼠眼眶采血50μl， 12000rpm离心15min，保存于-20℃备用，每0.5g粪采用1mlPBS充分溶解，12000 rpm离心30min，留取上清-20℃冻存；末次免疫后两周，每组小鼠随机取3只，麻醉脱颈处死小鼠后取脾细胞，用于小鼠脾细胞相关细胞因子检测。

体液免疫：小鼠在口服负载p146的壳聚糖纳米颗粒后，从初次免疫3W开始产生特异性抗IgG，并且抗体滴度随免疫次数增加而不断升高，到11W时，小鼠血清中抗HEVIgG滴度一直呈上升趋势。

粘膜免疫：小鼠在口服负载p146的壳聚糖纳米颗粒后，从初次免疫5W开始，粪悬液sIgA水平高于其他各组，7W以后各组抗sIgA水平的差异不断缩小，由此可见小鼠肠粘膜sIgA产生和下降的时间均早于血清IgG，且sIgA的持续时间短于 IgG，纳米颗粒疫苗相比纯化蛋白口服更加具有优势。

细胞免疫：1.小鼠在口服负载p146的壳聚糖纳米颗粒后，有较高水平的IL-4分泌，而INF-γ的分泌与其他3组差异没有统计学意义；2.小鼠在口服负载p146 的壳聚糖纳米颗粒后，分泌IL-4的CD4+细胞百分比高于其他各组，IL-4的平均荧光强度(MFI)也高于其他各组，而分泌INF-γ的CD4+细胞百分比与其他各组差异没有统计学意义；3.小鼠在口服负载p146的壳聚糖纳米颗粒后，脾细胞中IL-4基因表达的倍数变化明显高于其它3组，IFN-γ表达量与其他各组并无显著性差异 (P>0.05)。与以上结果表明：采用负载p146的壳聚糖纳米颗粒免疫小鼠可以增强T 细胞活化并诱导特异性Th2型细胞免疫应答。