boc-gly.osu、三肽-1和三肽-1铜，及该三种物质的制备方法

摘要

本发明公开了boc‑gly.osu、三肽‑1和三肽‑1铜，及该三种物质的制备方法，三肽‑1铜的制备方法如下：方法A：将三肽‑1溶解，随后向其中加入醋酸铜，调节PH至7.8‑8.2，43‑45℃下反应1.8‑2.5小时，过滤机械杂质，64‑67℃下浓缩成油状，随后向其中加入无水乙醇搅拌后加入乙酸乙酯搅拌分散，过滤，得到附有液体的三肽‑1铜，干燥即得到固态的三肽‑1铜；方法B：将三肽‑1溶解，随后向其中加入碱式碳酸铜，63‑65℃水中搅拌反应3小时后，降温，析出晶体，该晶体为三肽‑1铜；收率高，成本低，周期短，产量大。

说明书

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及boc-gly.osu、三肽-1和三肽-1铜，及该三种物质的制备方法。

背景技术

变老的第一个迹象通常是反映在人体的皮肤上：干燥、细小的线纹和皱纹、老年斑，红斑，皮肤松弛和没有活力。迟钝和掉头发也是众所周知的征象。市场上有许多护肤和护发产品，可供消费者处理或防止这些由外因应力源造成的皮肤状况。这些外因源包括但不限于：大气污染、机械应力、与家居用品或其它化学药品接触、日晒(老化)和晒伤等。此外当然还包括内因应力引起的如粉刺，伙食影响和一般的进行性老化。

皮肤经常暴露于这些外因环境之中，结果便出现可见的皮肤老化和受损的迹象，例如皱纹和干燥、变薄和其它组织学变化。由于皮肤老化，蛋白质合成便减少，蛋白质水解便增加，导致皮肤屏障、连接组织和结合力的全面分裂。

现有的用于抗衰老的化妆品中均是添加了多肽类的物质用于抗衰老，而多肽类的物质中使用较多的是三肽，而现有的制备方式主要以固相合成为主，而固相合成的成本高，纯化周期长且使用的树脂价格昂贵，氨基酸用料比例翻倍，液相直接缩合采用Z-基保护氨基，最后氢解的方法物料价格昂贵，钯碳目前更是高达8万/公斤。

发明内容

针对现有的制备三肽的固相方法和液相直接合成法分别存在的上述问题。

本发明的技术方案为：一种boc-gly.osu，由以下摩尔份的组分制备而成：Boc-gly108-112份，lhosu 114-116份以及dcc 124-127份。

本发明的有益效果为：当dcc的摩尔份过大时时，会得到体积较大但极性小的杂质；boc-gly.osu作为制备三肽的一个中间体，而boc-gly.osu价格便宜，因此能够整体降低制备三肽的成本。

本发明还公开了一种boc-gly.osu的制备方法，具体包括如下步骤：

S1：向丙酮中依次加入Boc-gly、lhosu以及dcc，反应温度＜15℃，反应时间2.5～3.2小时；

S2：过滤且在45℃下浓缩滤液，浓缩过程中加入pet；

S3：过滤得到析出的boc-gly.osu，随后干燥。

本发明的有益效果为：通过原料的配比，溶剂的选择，溶剂的比例，温度的控制以及反应时间的长短使得制备得到的boc-gly.osu的收率能够达到95％。

进一步限定，步骤S1中用冰盐降温使得反应体系的温度＜15℃。

本发明还公开了一种三肽-1，由以下摩尔份的组分制备而成：boc-gly.osu104-106份，his(trt)99-102份，碳酸钠198-202份，1hosu 108-112份，dcc98-102份，LYS(BOC)98-102份以及氮甲基吗啉。

本发明还公开了一种三肽-1的制备方法，包括如下步骤：

A1：将his(trt)加入溶剂中，向其中加入水且搅拌，然后向其中加入碳酸钠搅拌，分多次向其中加入boc-gly.osu，最后再加入活化酯搅拌反应；

A2：浓缩步骤A1中得到的反应液且将其pH值调至3.8～4.3，随后向其中加入EA提取，留酯层，酯层用碳酸钠水纯化，用酸水纯化，再用碳酸钠水洗至中性，干燥酯层，浓缩酯层，浓缩成油，得到boc-gly.his(trt)；

A3：boc-gly.his(trt)溶于溶剂中，加入hosu和dcc在小于25℃下反应完成后依次加入LYS(BOC)溶液和氮甲基吗啉且反应过夜；

A4：过滤步骤A3得到的最后混合液，且将滤液的pH值调节至2.8～3.2，随后加入EA提取，酯层用酸水洗，用不加食盐的碳酸钠水洗至酯层PH于7-8，晶体析出，过滤得到固体，固体用甲基叔丁基醚泡洗，甩干后烘干；

A5：步骤A4中得到的固体用25％的TFA/DCM，58-60℃下裂解4小时后用45℃浓缩溶剂得到裂解液，缓慢加入提前降温冷冻的甲基叔丁基醚中且搅拌分散，将沉淀所得固体过滤，用甲基叔丁基醚再搅拌洗一次，用纯净水溶解固体，用离子交换树脂除掉盐即可得到三肽-1。

本发明的有益效果为：整个生产周期为12天，得到的三肽-1的质量(单位公斤)与his(trt)的摩尔份的数值之比为16-18:100，即制备得到的三肽-1收率高。步骤A2中不需要得到固体，boc-gly.his(trt)的收率大于95％，可以直接用于下一步，节约时间及溶剂成本；步骤A3得到的boc-gly.his(trt).OSU不需要纯化处理；步骤A4将步骤A3中为反应的二肽用不加食盐的碳酸钠调节PH值，通过晶体析出的方法达到纯化，该纯化方法简单，有效且省时。

由于LYS(BOC)溶解性不好，以及二肽活化酯的反应不完全，使得三肽反应结果有二肽没有反应完，但是纯化处理结晶二肽不能除去，过柱又耗时耗力不现实，用不加盐水的碳酸钠水洗酯层到产品的等电点时让产品析出来，产品的自然析出使得三肽-1的粗品就可以到达95％的纯度，很好的解决了之前用直接缩合方法采用价格昂贵的Lys(boc).ome.，该原料价格为LYS(boc)价格的十倍，也很好的解决了活化酯方法使用Lys(boc)原料反应不完全无法纯化的技术瓶颈。

本发明还公开了一种三肽-1铜，由三肽-1和醋酸铜制备而成，一公斤三肽-1对应290克醋酸铜。

本发明还公开了一种三肽-1铜，由三肽-1和碱式碳酸铜制备而成，一公斤三肽-1对应290克碱式碳酸铜。

本发明还公开了三肽-1铜的制备方法，具体如下：将三肽-1溶解，随后向其中加入醋酸铜，调节PH至7.8-8.2，43-45℃下反应1.8-2.5小时，过滤机械杂质，64-67℃下浓缩成油状，随后向其中加入无水乙醇搅拌后加入乙酸乙酯搅拌分散，过滤，得到附有液体的三肽-1铜，干燥即得到固态的三肽-1铜。

本发明的有益效果为：通过该方法制备得到的固态的三肽-1铜需要经过粉碎才能用于化妆品中，收率能够达到95％以上，含有5％左右的盐，溶解度好，用于提供给要求不高的企业使用。

本发明还公开了三肽-1铜的制备方法，具体如下：包括如下步骤：将三肽-1溶解，随后向其中加入碱式碳酸铜，63-65℃水中搅拌反应3小时后，降温，析出晶体，该晶体为三肽-1铜。

本发明的有益效果为：通过该方法制备得到的三肽-1铜收率为67-70％，但是不含有盐，肽含量高。

附图说明

图1是样品中测得的分子离子图；

图2是待测样品中序列结构匹配图；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明的实施例进行详细、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

本发明提供一种三肽-1铜的制备方法，包括以下步骤：

S1：向丙酮中依次加入Boc-gly、hosu以及dcc，反应温度＜15℃，优选冰盐降温维持反应温度，反应时间2.5～3.2小时；过滤且在45℃下浓缩滤液，浓缩过程中加入pet；过滤得到析出的boc-gly.osu，随后干燥；

S2：将his(trt)加入溶剂中，向其中加入水且搅拌，然后向其中加入碳酸钠搅拌，分多次向其中加入boc-gly.osu，最后再加入活化酯搅拌反应；

浓缩反应液且将其PH值调至3.8～4.3，随后向其中加入EA提取，留酯层，酯层用碳酸钠水纯化，用酸水纯化，再用碳酸钠水洗至中性，干燥酯层，浓缩酯层，浓缩成油，得到boc-gly.his(trt)；

S3：boc-gly.his(trt)溶于溶剂中，再一次加入hosu和dcc在小于25℃下反应完成后依次加入LYS(BOC)溶液和氮甲基吗啉且反应过夜；

S4：过滤反应过夜得到的混合液，且将滤液的PH值调节至2.8～3.2，随后加入EA提取，酯层用酸水洗，用不加食盐的碳酸钠水洗至酯层PH于7-8，晶体析出，过滤得到固体，固体用甲基叔丁基醚泡洗，甩干后烘干；

S5：步骤S5中得到的固体用25％的TFA/DCM，58-60℃下裂解4小时后用45℃浓缩溶剂得到裂解液，缓慢加入提前降温冷冻的甲基叔丁基醚中且搅拌分散，将沉淀所得固体过滤，用甲基叔丁基醚再搅拌洗一次，用纯净水溶解固体，用离子交换树脂除掉盐即可得到三肽-1；

S6：制备三肽-1铜

方法A：一公斤三肽，加入一升纯净水中，加入290克醋酸铜，调PH至7.8-8.2，优选分析纯氨水调节PH值，43-45℃下反应1.8-2.5小时，过滤机械杂质，优选用滤纸抽滤的方式除去机械杂质；64-67℃下浓缩成油状，随后向其中加入无水乙醇搅拌后加入乙酸乙酯搅拌分散，过滤，得到附有液体的三肽-1铜，干燥即得到固态的三肽-1铜，粉碎得到粉末状的三肽-1铜，收率高。

方法B：将三肽-1溶解，随后向其中加入碱式碳酸铜，63-65℃水中搅拌反应3小时后，降温，析出晶体，该晶体为三肽-1铜；晶形分散，无需要粉碎且不含盐。

上述技术方案的有益效果为：

第一：大大地提高了产品的产能，以前的固相或者液相工艺单次出产品较少，不超过2千克，不能在工厂1000升的反应釜进行生产，现在单次产能可以达到20-40公斤，足够整个市场的需求。

第二：采用价格低廉的保护氨基酸进行生产，大大的降低了生产成本，相比之前的氢解生产工艺，成本降低了至少50％；

第三：该制备方法得到的boc-gly.osu，三肽-1，三肽-1铜，都在目前化妆品市场应用广大，产能的大幅度提升，满足了国内和国外的市场需求。并且该工艺酪合铜的方法是最简单，成铜颜色最好的两种方法。

本申请中所涉及的所有英文简称以及中文名称如下：

Boc-gly：N-叔丁氧羰基-甘氨酸；Boc-gly.OSU：N-叔丁氧羰基-甘氨酸活化酯；DCC：二环己基碳二亚胺；his(trt)：L-组氨酸(三苯甲基)；LYS(BOC)：NΕ-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸；boc-gly.his(trt)：N-叔丁氧羰基-甘氨酰组氨酸(三苯甲基)；boc-gly.his(trt).Lys(boc)：N-叔丁氧羰基-甘氨酰组氨酰(三苯甲基)NΕ-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸；EA：乙酸乙酯；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；TFA：三氟乙酸；DCM：二氯甲烷；DCU：二环己基脲。

实施例1

三肽-1铜的制备

第一步：将110摩尔Boc-gly用115摩尔lhosu，126摩尔dcc，(DCC的用量在这步反应中很有讲究，不过量反应不完全，过量太多，会生成较大的极性小的杂质)，在220L丙酮做溶剂中，温度13℃反应3个小时即可，生成boc-gly.osu，过滤dcu，45℃浓缩反应液，加入少量pet结晶，得到105摩尔boc-gly.osu，收率95％，HPLC>95％，干燥待用；

第二步：将100摩尔his(trt)加入第一步回收150升丙酮中，再加入150升水搅拌30分钟，加入200摩尔的碳酸钠，搅拌15分钟，分两批次加入boc-gly.osu，每次52.5摩尔，加完boc-gly.osu搅拌反应1小时即可，浓缩丙酮，当浓缩到丙酮滴出缓慢，或者体积减半即可停止，用盐酸调PH于4，用200升EA提取产品，留酯层，酯层用碳酸钠水纯化4次后，用酸水纯化5次，再用碳酸钠水洗至中性，干燥酯层，浓缩酯层，浓缩成油，得到98摩尔boc-gly.his(trt).收率98％(此步不需要得到固体，产品HPLC>95％,可以直接用于下一步，节约时间及溶剂成本)；

第三步：98摩尔boc-gly.his(trt)溶于200升丙酮中，加入110摩尔的hosu,100摩尔的dcc，加dcc时控制温度为23℃反应4小时后，加入100摩尔的提前用70升DMF溶解的LYS(BOC)，再加入15升氮甲基吗啉反应过夜(该步骤反应的不需要做纯化处理，待三肽反应后一起处理)；

第四步：过滤dcu，用盐酸调PH于3，加入250升EA提取产品，酯层用酸水洗5次后，用不加食盐的碳酸钠水洗至酯层PH于7-8，产品析出；过滤固体，固体用甲基叔丁基醚泡洗2次，甩干；烘干得固体42公斤boc-gly.his(trt).Lys(boc)。(第三步反应二肽原料是反应不完的，纯化浓缩结晶也是无法除掉的，只有用该纯化方法让产品自然析出，最简单，最有效，最省时)；

第五步：将第四步得到的三肽分批次用25％的TFA/DCM，加热60℃裂解4小时后，45度浓缩溶剂，缓慢加入提前降温冷冻的甲基叔丁基醚中，搅拌分散，一升裂解液3升甲基叔丁基醚；将沉淀所得固体过滤，用甲基叔丁基醚再搅拌洗一次，有适量的纯净水溶清固体，用离子交换树脂除掉盐，可以得到无盐的三肽-1，最后得到无盐的三肽-1的质量为17千克(整个生产周期12天)；

第六步：三肽-1铜的合成：

方法A：一公斤三肽，加入一升纯净水中，加入290克醋酸铜，用分析纯氨水调PH于8，45度络合2个小时，垫滤纸抽滤两次过掉机械杂质。65℃浓缩滤液，浓缩成油状后，加入无水乙醇300毫升，搅拌3分钟，后加入2升乙酸乙酯搅拌分散，过滤，得到固体三肽-1铜，65℃真空干燥，干燥失重合格后粉碎，得到粉末状态三肽-1铜成品。

方法B：用碱式碳酸铜进行度络合，不需要调PH，温度65℃水中搅拌反应3小时后，降温，产品自己析出，晶形分散，无需要粉碎，该方法也是目前生产不含有盐的铜肽最佳方法。

上述两种方法，方法A收率为100％，但是含有5％的盐，方法B收率较低，产品损失较大，收率只有68％，但是方法B不含盐，肽含量高，但是溶解度没有方法A好，可以根据客户的要求进行生产。

对方法A和方法B制备得到的产物进行检测，具体检测方法如下：

1.材料：待测样品，乙腈，三氟乙酸(TFA)，水为Milli-Q级水；其中三氟乙酸(TFA)来自默克公司，乙腈来自Sigma公司。

2.样品处理方法

称取0.5mg样品，复溶于500μL含有质量分数0.1％TFA的50％乙腈水溶液。

3.质谱分析和谱图解析

仪器名称：5800 MALDI-TOF-TOF(AB SCIEX)

分析软件：T0F/TOF Explorer，Data Explorer

3.1 MALDI-TOF-TOF MS鉴定：

1).点样方式：点0.5μl的稀释原始样品于MALDI靶板上，自然干燥后，再点上0.5μl的0.5g/L CHCA溶液(溶剂：0.1％TFA+50％ACN)中，在室温下自然干燥。

2).样品用5800串联飞行时间质谱仪[5800MALDI-TOF-TOF]进行质谱分析，激光源为335nm波长的Nd:YAG激光器，加速电压为20kV，采用正离子模式和自动获取数据的模式采集数据。仪器先用myoglobin酶解肽段进行外标校正。基质和样品的质量扫描范围为200-1000Da。进行完MS后，直接选择目标肽段离子进行MS/MS分析。

3).MS采用Reflector Positive参数：CID(OFF)，mass rang(200－1000Da)FocusMass(500Da)Fixed laser intensity(5000)Digitizer：Bin Size(0.5ns)。

MS/MS采用1KV Positive参数：CID(ON)，Precursor Mass Windows(Relative50resolution(FWHM)Fixed laser intensity(6000)Digitizer：Bin Size(1ns)。

4).得到的MS/MS谱图后采用仪器软件TOF/TOF Explorer自带的分析工具：DeNovoExplorer进行从头测序。得到序列后，再采用软件Data Explorer将MS/MS图标上a,b,c,x,y,z等由母离子碎裂后得到的子离子。

3.2结果

3.2.1.待测样品的分子量测定

GHK-Cu的理论序列如下所示：(Gly-His-Lys)·Cu；

从图1可以看出，样品经过MALDI-TOF-TOF的MS分析后得到其分子离子峰值[M+H]+1为341.1919，与理论值是相符合的。

3.2.2.待测样品序列分析

为了进一步确证待测样品中存在GHK-Cu，我们对还原后的待测样品进行了MS/MS分析，选择母离子341.1919。采用仪器软件TOF/TOF Explorer自带的分析工具：De NovoExplorer进行从头测序，根据GHK-Cu结构我们得到了如图2的结构信息：

在进行从头测序的过程中，按照如下步骤进行分析：

1)为了对GHK-Cu实际序列进行确证，首先将完整氨基酸序列输入到DataExplorer软件中，得到完整氨基酸序列的理论b系列和y系列离子，结果如表1所示：

表1

2)首先考虑b系列离子，根据上面的b系列离子，b系列离子都检测到明显的峰，印证了GHK-Cu的序列。

3)考虑y系列离子，根据上面的y系列离子，大部分y系列离子基本上都检测到明显的峰，印证了GHK-Cu的序列。

4.结论

4.1通过5800型MALDI-TOF-TOF质谱分析GHK-Cu的分子量，可以发现与其理论结构序列的分子量相吻合。

4.2我们分析了DTT还原后GHK-Cu的串联质谱，通过软件分析氨基酸序列，我们从GHK-Cu内部序列角度印证了GHK-Cu的氨基酸序列就是：

(Gly-His-Lys)·Cu

对比例1

对比例中采用的为固相合成法，树脂不能回收利用，价格昂贵4000一公斤以上，氨基酸每一步的使用量是液相的2.5倍，氨基酸的价格也要贵一些，缩合剂HBTU也要贵3倍多，如果放大反应倍数出现问题风险太大，而且最后裂解，纯化，冻干时间很长，生产周期长。

对比例2

液相合成如果用氢解的方法，氨基酸LYS(BOC).OBZL价格昂贵8000/千克，钯碳的价格更是在7-8万每千克。

本发明公布的三肽-1铜的结晶方法，大大缩短生产周期。

本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。