一种脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法

摘要

本发明公开了一种脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法，包括标本前处理、去除红细胞、收集脐带血血浆、制备富血小板血浆、富血小板血浆的鉴定及造血干细胞鉴定。本发明的有益效果是：在不影响脐带血造血干细胞制备提取的基础上，将血浆中的血小板浓缩，分离得到的富血小板血浆，对提取的造血干细胞和富血小板血浆的鉴定，不影响造血干细胞提取质量，且富血小板血浆的提取率达60%。

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取富含血小板血浆的方法，具体为一种脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法，属于生物技术领域。

背景技术

富血小板血浆 （platelet—rich plasma，PRP）是通过对自体外周血离体处理，借助不同的离心力制备分离得到的含高浓度血小板的血浆。PRP来源于血小板，内含丰富的各类生长因子及蛋白质，如血小板源性生长因子，转化生长因子β，血管内皮细胞生长因子，表皮生长因子和类胰岛素生长因子等；这些生长因子在促进细胞增殖、再分化、趋化和刺激血管再生、修复等多方面发挥重要的作用。

脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，通常作为医疗废弃物处理。近十几年的研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植，治疗80多种疾病，特别是作为一种非常重要的人类生物资源越来越受到国家重视。一般脐带血中提取完造血干细胞的血浆，血浆和红细胞作为医疗垃圾处理，脐带血作为重要的遗传资源、发育尚幼稚、免疫原性低、来源丰富，血小板的提取和利用价值高，基于此本申请提出一种脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法。

发明内容

本发明的目的就在于为了解决问题而提供一种脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法，从提取过脐带血造血干细胞的血浆中，分离得到富血小板血浆。对获得的脐带血源富血小板血浆通过流式细胞术进行血小板表面标志物（CD41a）的检测，血球计数仪血小板计数，通过双平台获得血小板的浓度是原血的3倍以上，提取率达60%以上。

本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法，包括以下步骤：

步骤一、标本前处理，标本表面的消毒处理，目的是去除表面污渍，和可能的细菌进入血液中；

步骤二、去除红细胞，脐带血标本中加入羟乙基淀粉，羟乙基淀粉（HES）可与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞凹面相贴而使得沉降速度加快，利用红细胞和白细胞的沉降速度的差异来实现去除红细胞；

步骤三、收集脐带血血浆，将上步骤去除红细胞的转移袋再次离心，上清液转移至新袋中，即收集血浆；造血干细胞按照脐带血冻存工艺规程进行冻存；

步骤四、制备富血小板血浆，上步骤得到的血浆离心去除红细胞，收集上清液再次离心，留取沉淀，即得脐带血富血小板血浆；

步骤五、富血小板血浆的鉴定及造血干细胞鉴定，步骤四获得的富血小板血浆进行表面标志物的流式检测和计数。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，脐带血标本按照脐带血量：羟乙基淀粉=5：1加入所需羟乙基淀粉量。离心500rpm、7min，分为三层，上层血浆，中层干细胞，下层红细胞。夹紧150ml转移袋的止血夹，缓慢的将干细胞及血浆挤压至另外一个250ml转移袋。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中，将上步骤250ml转移袋离心1800rpm，5min，分为清晰的三层，上层血浆，中层干细胞，下层少许的红细胞。打开150ml转移袋的止血夹，缓慢的将250ml转移袋上层血浆挤压排出至150ml转移袋中。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，将收集的血浆离心1500prm 5min，此步骤再次去除红细胞；收集的血浆再次离心2500prm，10min。将沉淀上层2-3cm以上的黄色澄清上清液弃去，下层即为富血小板血浆。

作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，分离得到的脐带血富血小板血浆和造血干细胞进行细胞活率、全自动血球计数仪分析、流式细胞术分析，用于鉴定脐带血富血小板血浆和造血干细胞。

本发明的有益效果是：该脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法设计合理，利用生物技术手段能够获得脐带血全血3倍以上的富血小板血浆，内含高浓度的生长因子，可替代传统间充质干细胞培养中的补充试剂胎牛血清。该富血小板血浆具有以下优势：

1）具有原材料丰富，操作方法简单，设备需求少；

2）脐带血源富血小板血浆免疫原性低；

3）脐带血富血小板血浆内含有多种高浓度的生长因子，能够支持包括间充质干细胞成骨分化，成脂分化，以及诱导性多能干细胞的生长；

4）在脐带血造血干细胞提取完成后，不改变原有制备工艺的基础上，对收集到的血浆进一步提取富血小板血浆，是对余料的再一次利用，是对脐带血这种遗传资源的二次利用，即一种原料可获得两种生物制品。

附图说明

图1为本发明流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一

请参阅图1，一种脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法，包括以下步骤：

步骤一、标本前处理，标本表面的消毒处理，目的是去除表面污渍，和可能的细菌进入血液中；

步骤二、去除红细胞，脐带血标本中加入羟乙基淀粉，羟乙基淀粉（HES）可与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞凹面相贴而使得沉降速度加快，利用红细胞和白细胞的沉降速度的差异来实现去除红细胞；

步骤三、收集脐带血血浆，将上步骤去除红细胞的转移袋再次离心，上清液转移至新袋中，即收集血浆；造血干细胞按照脐带血冻存工艺规程进行冻存；

步骤四、制备富血小板血浆，上步骤得到的血浆离心去除红细胞，收集上清液再次离心，留取沉淀，即得脐带血富血小板血浆；

步骤五、富血小板血浆的鉴定及造血干细胞鉴定，步骤四获得的富血小板血浆进行表面标志物的流式检测和计数。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤五中，分离得到的脐带血富血小板血浆和造血干细胞进行细胞活率、全自动血球计数仪分析、流式细胞术分析，用于鉴定脐带血富血小板血浆和造血干细胞。

实施例二

请参阅图1，一种脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法，包括以下步骤：

步骤一、标本前处理，标本表面的消毒处理，目的是去除表面污渍，和可能的细菌进入血液中；

步骤二、去除红细胞，脐带血标本中加入羟乙基淀粉，羟乙基淀粉（HES）可与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞凹面相贴而使得沉降速度加快，利用红细胞和白细胞的沉降速度的差异来实现去除红细胞；

步骤三、收集脐带血血浆，将上步骤去除红细胞的转移袋再次离心，上清液转移至新袋中，即收集血浆；造血干细胞按照脐带血冻存工艺规程进行冻存；

步骤四、制备富血小板血浆，上步骤得到的血浆离心去除红细胞，收集上清液再次离心，留取沉淀，即得脐带血富血小板血浆；

步骤五、富血小板血浆的鉴定及造血干细胞鉴定，步骤四获得的富血小板血浆进行表面标志物的流式检测和计数。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，脐带血标本按照脐带血量：羟乙基淀粉=5：1加入所需羟乙基淀粉量。离心500rpm、7min，分为三层，上层血浆，中层干细胞，下层红细胞。夹紧150ml转移袋的止血夹，缓慢的将干细胞及血浆挤压至另外一个250ml转移袋。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤三中，将上步骤250ml转移袋离心1800rpm，5min，分为清晰的三层，上层血浆，中层干细胞，下层少许的红细胞。打开150ml转移袋的止血夹，缓慢的将250ml转移袋上层血浆挤压排出至150ml转移袋中。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤四中，将收集的血浆离心1500prm 5min，此步骤再次去除红细胞；收集的血浆再次离心2500prm，10min。将沉淀上层3cm以上的黄色澄清上清液弃去，下层即为富血小板血浆。

实施例三

请参阅图1，一种脐带血造血干细胞制备基础上提取富血小板血浆的方法，包括以下步骤：

步骤一、标本前处理，标本表面的消毒处理，目的是去除表面污渍，和可能的细菌进入血液中；

步骤二、去除红细胞，脐带血标本中加入羟乙基淀粉，羟乙基淀粉（HES）可与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞凹面相贴而使得沉降速度加快，利用红细胞和白细胞的沉降速度的差异来实现去除红细胞；

步骤三、收集脐带血血浆，将上步骤去除红细胞的转移袋再次离心，上清液转移至新袋中，即收集血浆；造血干细胞按照脐带血冻存工艺规程进行冻存；

步骤四、制备富血小板血浆，上步骤得到的血浆离心去除红细胞，收集上清液再次离心，留取沉淀，即得脐带血富血小板血浆；

步骤五、富血小板血浆的鉴定及造血干细胞鉴定，步骤四获得的富血小板血浆进行表面标志物的流式检测和计数。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤二中，脐带血标本按照脐带血量：羟乙基淀粉=5：1加入所需羟乙基淀粉量。离心500rpm、7min，分为三层，上层血浆，中层干细胞，下层红细胞。夹紧150ml转移袋的止血夹，缓慢的将干细胞及血浆挤压至另外一个250ml转移袋。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤三中，将上步骤250ml转移袋离心1800rpm，5min，分为清晰的三层，上层血浆，中层干细胞，下层少许的红细胞。打开150ml转移袋的止血夹，缓慢的将250ml转移袋上层血浆挤压排出至150ml转移袋中。

进一步的，在本发明实施例中，所述步骤四中，将收集的血浆离心1500prm 5min，此步骤再次去除红细胞；收集的血浆再次离心2500prm，10min。将沉淀上层2cm以上的黄色澄清上清液弃去，下层即为富血小板血浆。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。