富血小板血浆的提取方法和提取的富血小板血浆

摘要

本发明涉及富血小板血浆的提取方法和提取的富血小板血浆。具体地，本发明涉及从血液中提取富血小板血浆的方法，其包括以下步骤：(a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀；(b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液基本上分成三层；(c)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心；(d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血浆(Platelet Rich Plasma：PRP)。本发明方法操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高。

说明书

本申请是2012年7月30日提交的中国专利申请号201210267055X，发明名称为“富血小板血浆的提取方法和提取的富血小板血浆”案的分案申请，其全部内容引入本文作为参考。 

技术领域

本发明属临床医学技术领域，具体涉及一种提取富含血小板的血浆的方法，本发明方法在特定条件下获得的富血小板血浆具有血小板浓度高、血小板回收率高等至少一个方面的优点。 

背景技术

富含血小板的血浆，在本发明中可称为富血小板血浆(Platelet Rich Plasma，PRP)，其是是通过离心血液而得到的含高浓度的血小板血浆。人体的血小板除了可以在止血的时候提供凝聚作用外，血小板中还含有很多与创伤愈合和骨头再生有关的多种生长因子。如血小板衍生生长因子(Platelet Derived Growth Factor，PDGF)，转化生长因子(Transforming Growth Factor，TGF)，胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor，IGF)，表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)以及血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)等等，血小板来源的生长因子，对细胞的分化和增殖起着促进作用，这些生长因子相互之间具有协同响应，与其他促进细胞活性的因子相互作用和影响，共同维持着组织环境的平衡，对伤口愈合、修复和再生有着重要的作用。 

另外，由于PRP可以从患者自身血液中提取，经提取富集处理后，可用于相关疾病的治疗，因而来源丰富，取材方便，制备方法简单而且可以让身体吸收。自身PRP使用能避免病毒传播和免疫排斥的问题出现。因此PRP被广泛应用到不同的医学领域中。如骨科、口腔科、颌面外科、运动医学以及美容医学。 

PRP在目前为止还没有一个统一的制备方法，PRP的制备原理主要是利用血液中各种成分沉降速度不同，通过离心将血液分层。从而获取含血小板的血浆，并利用离心原理进一步的浓缩以获得高浓度的血小板血浆。人体全血中血小板的浓度一般为1～3×10⁵/ml。研究认为浓缩后的PRP血小板浓度应为全血血小板浓度的3-4倍。研究也发现PRP中血小板浓度的提高能有效提高干细胞的增殖和分化能力以及能够显著增加成纤维细胞的增殖和I型胶原蛋白的表达。 

因此有效的分离和提高PRP中血小板的浓度成为了整个PRP治疗方案的关键。 

林庶茹等(CN101402940A，中国专利申请号：200810228726.5，发明名称：一种小鼠血小板的提取方法)公开了一种小鼠血小板的提取方法，小鼠眶静脉取血，置于抗凝离心管中，静置30MIN后离心，800RPM离心10MIN，上清液即为富含血小板的血浆。吸出上清液置于干净试 管中，3500RPM离心10MIN，弃去上清液，管底沉淀物为血小板。向试管中滴加50～100ΜL质量浓度为1％草酸铵溶液，以玻璃棒轻轻搅拌，再加入质量浓度为1％草酸铵溶液2～3ML，静置5MIN，使红细胞溶解。3500RPM离心10MIN，弃去上清，加入血小板洗涤液并反复吹打，使成为血小板混悬液，3300RPM离心10MIN，弃去上清，加入少量血小板洗涤液并反复吹打使之成为混悬液。该血小板将作为抗原免疫豚鼠后，取豚鼠血清给小鼠注射，制备过敏性紫癜模型。此方法操作简单，可以得到高浓度的血小板，并很好地解决血小板纯度不佳的问题。这种针对小鼠血液进行血小板富集的方法虽然据信可以获得浓度达10¹⁰的血小板，然而该方法未公开其血小板的收率，并且方法在操作上比较繁杂，难以适用于人血的处理。 

此外，王悦等(CN 102078644 A，中国专利申请号201110053979.5，发明名称：一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法)中公开了一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法,所提取的自体富血小板血浆中含有多种复合生长因子,能够有效地促进组织的修复。由1个注射器、1个静脉输液器连接管、1个静脉留置针塑料卡片和1个静脉输液器针头组成；注射器用以抽取静脉血并充当离心管；静脉输液器针头通过静脉输液器连接管和注射器出口连接,静脉输液器针头用以皮肤血管穿刺、抽取抗凝剂和激活剂并向人体需要部位注射提取后的自体富血小板血浆；静脉输液器连接管可弯曲固定于静脉留置针塑料卡片中。据信这种装置在提升血小板提取的操作性方面是有益的。 

因此为了从血液中富集血小板而得到有临床治疗意义的富血小板血浆，探寻一种操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高的方法，是本领域技术人员迫切期待的。 

发明内容

本发明的目的是探索一种简单和高效地分离和浓缩血浆中血小板的方法；特别是本发明为了从血液中富集血小板而得到有临床治疗意义的富血小板血浆，探寻一种操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高的方法。本发明人发现利用梯度离心法进行血小板的浓缩和分离，在特定操作条件下可以以高收率地获得含浓度高血小板的血浆。 

为此，本发明第一方面提供了一种从血液中提取富血小板血浆的方法，其包括以下步骤： 

(a)使采集的全血置于含有抗凝剂的容器中，使血液和抗凝剂充分混匀； 

(b)使混有抗凝剂的血液置于离心管中，进行第一次离心，使血液基本上分成三层； 

(c)将最上层和大部分的中间层抽出并转移到新的离心管中，混合均匀，进行第二次离心； 

(d)弃掉离心管上层的血浆，利用剩余的血浆使沉淀的血小板重新悬浮，即得富血小板血浆(Platelet Rich Plasma：PRP)。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中所述全血是新鲜的全血。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中所述全血是受试个体例如患者的全血。由此，本发明获得的富血小板血浆可以方便地重新用于该患者以治疗相关疾病。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中抗凝剂选自乙二胺四乙酸(Ethylene Diamine Tetraacetic  Acid：EDTA)、乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸钙钠、枸橼酸葡萄糖(Acid Citrate Dextrose-Solution A：ACD-A)、或其组合。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中抗凝剂与全血的重量比为1：8～10，例如1：9。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中所述容器可以是离心管或是采血袋等。如果是离心管并且该离心管容量适合直接离心，则所述步骤(b)中不需要另置于离心管中，而可以直接进行离心。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(a)中还包括在使血液和抗凝剂后取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中血液中血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中经第一次离心后是达到使血液基本上分成三层的程度。在一个实施方案中，其中最上层是含血小板的血浆层，中间一层是血块黄层(Buffy Coat层，其中含有血小板和白细胞)，最底层的是红细胞层。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中离心的转速为2000rpm～3000rpm，例如2200rpm～2800rpm，例如2300rpm～2500rpm，例如约2400rpm。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中离心的时间为1-10min，例如2-8min，例如3-5min，例如约4min。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中离心的转速为2300rpm～2500rpm，时间为3-5min。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(b)中离心的转速为2400rpm，时间为4min。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中，所述大部分的中间层是指尽量将中间层全部吸出但避免抽取红细胞。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中离心的转速为1000rpm～2000rpm，例如1200rpm～1800rpm，例如1400rpm～1600rpm，例如约1500rpm。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中离心的时间为10-30min，例如15-25min，例如18-22min，例如约20min。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中离心的转速为1400rpm～1600rpm，时间为18-22min。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中离心的转速为1500rpm，时间为20min。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中所得上层和大部分中间层经混匀后，其中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的1-5倍，例如1.5～4倍，例如2～3倍。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(c)中还包括在使抽取的最上层和中间层混合均匀后，取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中的血小板的数量，以便用于后续的过程比照、监控。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，所述弃掉离心管上层的血浆是指弃掉离心管上层至少2/4的血浆。在一个实施方案中，在步骤(d)中，所述弃掉离心管上层的血浆是指弃掉离心管上层至少3/4的血浆。在此应当说明，上层血浆中仅含有低浓度的血小板。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中，弃掉离心管上层的血浆后，可以利用下部剩下的(约2/4，或者更优选的约1/4)血浆重新使沉淀下来的血小板悬浮，由此可以获取本发明所述富血小板血浆 (PRP)。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)所得富血小板血浆(PRP)中血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的5-10倍，例如6～8倍，例如6～7倍。 

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(d)中还包括在获得富血小板血浆(PRP)后，取适量(例如少于500ul，例如约100ul)用于测定其中的血小板的数量。 

本发明由此获得的富血小板血浆(PRP)具有浓度高的特点，并且血小板回收率高。 

本发明第二方面提供了一种富血小板血浆，其中包含0.5～3×10⁹/ml浓度的血小板。例如其中包含1～2×10⁹/ml浓度的血小板。 

根据本发明第二方面的富血小板血浆，其基本上是由本发明第一方面任一实施方案所述的方法获得的。 

下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。 

在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。 

在本发明一个实施方案中，所述的全血是人的全血。 

在本发明中，提供了一种采用特定处置条件进行血小板富集的方法。然而本领域技术人员理解，使用本发明的处置条件，其中所用的器具是可以作适当变动的，例如其中的离心装置。例如可以使用王悦等(CN 102078644 A，中国专利申请号201110053979.5，发明名称：一种简便高效的自体富血小板血浆提取装置及提取方法)中所用的由注射器、静脉输液器连接管、静脉留置针塑料卡片和静脉输液器针头组成的装置，该文献所记载的装置可以用于本发明方法，并使本发明方法在保持操作过程的洁净度中是有益的。 

出人意料地发现，本发明在研究梯度离心法进行血小板的浓缩和分离的过程中，获得了一种操作过程简单、收率高、富集的血浆中血小板浓度高的方法。 

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述,然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解,在不背离本发明的精神和范围的前提下,可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。 

以下提供了本发明操作方法的一般流程，在下文实施例中如未另外注明，使用下面一般流程的操作条件： 

(1)把患者的全血采集到含有抗凝剂的容器里，容器可以是离心管或是采血袋。抗凝剂可以使用乙二胺四乙酸。抗凝剂和全血的比例为1：9。 

(2)将血液和抗凝剂充分混匀，避免出现凝血。提取100微升以计算血小板数量。 

(3)把血液分配到离心管(15毫升)。 

(4)把离心管放进离心机，以转速2400rpm离心4分钟。 

(5)离心后的血液应分为三层：最底层的是红细胞，最上层的是含血小板血浆，中间一层是Buffy Coat，含有血小板和白细胞。 

(6)利用移液器把最上层的血浆和大部分的buffy coat抽出并转移到新的离心管中，尽量避免抽取红细胞。提取100微升以计算血小板数量。 

(7)把含有血浆和buffy coat混合物的离心管放进离心机，以转速1500rpm离心20分钟。 

(8)把3/4的低浓度血小板血浆(Platelet Poor Plasma：PPP)去掉，利用剩下的1/4血浆重悬沉淀下来的血小板，获得富血小板血浆(PRP)。 

(9)抽取100微升PRP以进行血小板计数。 

实施例1：提取富血小板血浆(PRP)

(1)分离前全血中血小板浓度：250×10⁶/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2.5×10⁹。 

(2)第一次离心后血浆中血小板浓度：570×10⁶/ml(浓缩2.28倍)，血浆体积为4ml。总血小板数量为2.28×10⁹。回收率为91.2％。 

(3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1685×10⁶/ml(浓缩6.74倍)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为2.02×10⁹。最终回收率为80.8％。 

实施例2：提取富血小板血浆(PRP)

使用乙二胺四乙酸二钠为抗凝剂，抗凝剂与全血的重量比为1：8。 

(1)分离前全血中血小板浓度：165×10⁶/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为1.65×10⁹。 

(2)第一次离心后血浆中血小板浓度：444×10⁶/ml(浓缩2.69倍)，血浆体积为3.5ml。总血小板数量为1.55×10⁹。回收率为93.9％。 

(3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1105×10⁶/ml(浓缩6.70倍)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为1.33×10⁹。最终回收率为80.6％。 

实施例3：提取富血小板血浆(PRP)

使用枸橼酸葡萄糖为抗凝剂。 

(1)分离前全血中血小板浓度：210×10⁶/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2.1×10⁹。 

(2)第一次离心后血浆中血小板浓度：542×10⁶/ml(浓缩2.58倍)，血浆体积为3.5ml。总血小板数量为1.90×10⁹。回收率为90.5％。 

(3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1370×10⁶/ml(浓缩6.52倍)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为1.64×10⁹。最终回收率为78.1％。 

实施例4：提取富血小板血浆(PRP)

抗凝剂与全血的重量比为1：10，第一次离心为2300rpm并5min，第二次离心为1600rpm并18 min。 

(1)分离前全血中血小板浓度：195×10⁶/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为1.95×10⁹。 

(2)第一次离心后血浆中血小板浓度：535×10⁶/ml(浓缩2.74倍)，血浆体积为3.5ml。总血小板数量为1.87×10⁹。回收率为95.9％。 

(3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1235×10⁶/ml(浓缩6.33倍)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为1.48×10⁹。最终回收率为75.9％。 

实施例5：提取富血小板血浆(PRP)

第一次离心为2500rpm并3min，第二次离心为1400rpm并20min。 

(1)分离前全血中血小板浓度：265×10⁶/ml，全血体积为10ml。总血小板数量为2.65×10⁹。 

(2)第一次离心后血浆中血小板浓度：612×10⁶/ml(浓缩2.31倍)，血浆体积为4ml。总血小板数量为2.45×10⁹。回收率为92.5％。 

(3)第二次离心后血浆中(PRP)血小板浓度：1839×10⁶/ml(浓缩6.94倍)，血浆体积为1.2ml，得到富血小板血浆。总血小板数量为2.21×10⁹。最终回收率为83.4％。 

比较例1：除了第一次离心转速改为2600rpm、3000rpm、3500rpm，并且这三种转速均安排3min、6min、10min时间外，其余操作条件均同实施例1。结果显示这样获得的9种富血小板血浆，它们的血小板最终回收率仅在47～63％之间，并且血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的1.8～3.7倍(在本发明中可称为最终富集倍数)。例如2600rpm并3min和2600rpm并6min两种情况下，血小板最终回收率分别为56％和61％，最终富集倍数分别为3.1和2.8。 

比较例2：除了第一次离心转速改为2100rpm、1700rpm、1400rpm，并且这三种转速均安排3min、6min、10min时间外，其余操作条件均同实施例1。结果显示这样获得的9种富血小板血浆，它们的血小板最终回收率仅在31～52％之间，并且血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的1.3～2.5倍。例如2100rpm并3min和2100rpm并6min两种情况下，血小板最终回收率分别为42％和47％，最终富集倍数分别为1.9和2.2。 

比较例3：除了第二次离心转速改为1800rpm、2200rpm、2600rpm，并且这三种转速均安排18min、20min、25min时间外，其余操作条件均同实施例1。结果显示这样获得的9种富血小板血浆，它们的血小板最终回收率仅在52～63％之间，并且血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的3.1～3.9倍。例如1800rpm并18min和1800rpm并20min两种情况下，血小板最终回收率分别为53％和57％，最终富集倍数分别为3.9和3.2。 

比较例4：除了第二次离心转速改为1300rpm、1000rpm、700rpm，并且这三种转速均安排18min、20min、25min时间外，其余操作条件均同实施例1。结果显示这样获得的9种富血小板血浆，它们的血小板最终回收率仅在33～46％之间，并且血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的1.9～3.1倍。例如1300rpm并18min和1300rpm并20min两种情况下，血小板最终回收率分别为43％和35％，最终富集倍数分别为2.9和2.4。 

比较例5：第一次离心改为2300rpm并4min、或者2500rpm并4min，并且第二次离心改为1400rpm并20min、或者1600rpm并20min，其余操作条件均同实施例1。结果显示这样获得的4种富血小板血浆，它们的血小板最终回收率仅在48～61％之间，并且血小板的浓度是分离前全血中血小板浓度的3.2～4.2倍。例如第一次离心为2300rpm并4min、第二次离心为1600rpm并20min，血小板最终回收率为51％，最终富集倍数分别为3.7。 

此外，参考CN 102078644 A实施例1的操作，血小板最终回收率为47％，最终富集倍数分别为3.45。 

然而，本发明以上结果显示，本发明方法在第一次和第二次离心后的平均血小板回收率分别为：92.8％和79.8％，分离后的PRP中血小板的浓度可以达到全血的6-7倍。表明本发明所用的离心的时间和转速的设定能有效分离和回收大部分全血中的血小板。