一种创制抗粗缩病玉米种质的方法

摘要

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种创制抗粗缩病玉米种质的方法。本发明首先提供了用于创制抗粗缩病玉米种质的sgRNA，其包括：序列如SEQ ID NO.1所示的特异性靶向玉米基因Zm00001d010255的sgRNA。本发明所提供的sgRNA和CRISPR/Cas9敲除载体可以显著提高CRISPR/Cas9敲除载体的特异打靶效率，进而有利于提高玉米基因Zm00001d010255的敲除效率。按照本发明的方法可以快速创制抗粗缩病的玉米种质，其可以明显改善粗缩病所引起的各项症状。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种创制抗粗缩病玉米种质的方法。

背景技术

基因组编辑是一种对基因组进行定向精确修饰的技术，主要包括锌指核酸酶(Zinc-Finger Nucleases，ZFNs)，类转录激活因子效应物核酸酶(TranscriptionActivator-Like Effector Nucleases，TALENs)和规律成簇的间隔短回文重复系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatednuclease，CRISPR/Cas)。CRISPR/Cas系统大致分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型3类，其中II型系统的组成比较简单，只需要Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA 3种成分即可发挥作用，且具有高效性和易操作性，成为目前应用最广泛的基因组编辑系统。II型CRISPR/Cas系统的特征蛋白为Cas9，Cas9蛋白具有RuvC和HNH两个核酸酶结构域,该结构域负责切割靶DNA的两条链，从而造成靶DNA双链断裂。其中HNH结构域负责切割与crRNA互补的DNA链，切割位点位于原型间隔序列毗邻基序(Protospacer adjacent motif，PAM)上游3bp处，RuvC结构域则负责切割非互补链，切割位点位于PAM上游3–8bp处。Cas9蛋白同时具有加工产生crRNA以及切割外源核酸的功能。crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成tracrRNA/crRNA复合物，研究者可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA(gRNA)或者将两者融合在一起形成单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)。sgRNA能够与Cas9核酸内切酶结合并将Cas9引导至基因组上对靶位点进行切割。CRISPR/Cas9系统使目标基因DNA产生双链断裂，激活细胞内的DNA损伤修复机制，进而产生缺失、敲入等变异。目前，CRISPR/Cas9系统已被迅速地用于拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得了较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。

玉米(Zea mays L.)是重要的粮食和饲料作物，也是现代食品和化学工业的原料，在我国农业生产和经济发展中占有重要地位。玉米粗缩病是全球玉米种植区广泛发生的病毒性病害，玉米感病后呈现系统侵染，生长发育受阻。1949年，玉米粗缩病首次在意大利被发现。随后，阿根廷、捷克、法国、挪威、西班牙等国家均有该病害发生的报道。1954年，在我国新疆南部、甘肃西部首次报道了玉米粗缩病。20世纪70年代中期，河北、北京实行小麦套种玉米的耕作制度，玉米粗缩病大流行，导致玉米大面积减产。近年来，玉米粗缩病已成为我国黄淮海玉米产区的重要病害之一。玉米出苗后即可被带毒灰飞虱传染病毒，感病初期肉眼观察不到任何症状，5叶或者6叶时开始出现明显症状。该病初期症状是在幼叶背面出现成排透明的虚线亮点，随后亮点逐渐增多，叶脉上逐渐呈现白色蜡状突起，粗糙明显。在发病后期，与正常植株相比，病株严重矮化，节间缩短；叶色浓绿，叶片变宽变短，叶表面常有皱褶，叶夹角较小、僵直，根系不发达且较浅；发病较轻的植株可以抽穗，但雄穗发育不良或败育，雌穗较小，结实少或不结实；发病严重的植株多数前期枯死，导致绝产。目前，已报道有3种病毒可以引起玉米粗缩病的发生，分别为玉米粗缩病毒(Maize Rough DwarfVirus，MRDV)、Mal de Rio Cuarto virus(MRCV)和水稻黑条矮缩病毒(Rice Black-Streaked Dwarf Virus，RBSDV)。引起玉米粗缩病的病毒主要由灰飞虱(Laodelphaxstriatellus Fallen)以持久性方式传播，不能经土壤、种子、汁液摩擦、嫁接传播。灰飞虱获毒后，可以终身带毒并传毒。玉米粗缩病的发生受品种抗病性、介体灰飞虱数量、田间杂草数量、耕作制度以及气候条件等诸多因素影响，所以此病害防治难度较大。目前，生产上主要采取以农业措施如调整播期、加强田间管理等为主，药剂防治为辅的综合防治措施。但是，上述防治措施存在费工费时、易造成环境污染且防治效果差等不足，培育和种植抗病品种是防治玉米粗缩病的有效途径。

现有技术中，虽然CN108441571A中提到了一种玉米分子标记在鉴定和调控玉米粗缩病抗性性状中的应用，但其缺陷在于，只能利用自然界已经存在的该基因突变类型，无法产生新的抗病基因，而且利用分子标记辅助选择在玉米种质改良过程中存在连锁累赘和周期长的问题。

发明内容

本发明利用基因编辑技术，提供了用于创制抗粗缩病玉米种质的基因敲除载体及方法，可以敲除玉米感粗缩病的基因Zm00001d010255，快速创制抗粗缩病的玉米种质。

具体而言，本发明首先提供用于创制抗粗缩病玉米种质的sgRNA，包括：

序列如SEQ ID NO.1所示的特异性靶向玉米基因Zm00001d010255的sgRNA。

具体的，所述sgRNA的序列为：

5’-CGACGTGATCGTTCTGGGCA-3’

本发明进一步提供含有所述的sgRNA的CRISPR/Cas9基因敲除载体。

作为优选，所述CRISPR/Cas9基因敲除载体为连接有所述的sgRNA的CPB-Ubi-hspcas9载体。

本发明进一步提供用于创制抗粗缩病玉米种质的试剂盒，包括如下任一种：

1)所述的sgRNA；

2)所述sgRNA的编码DNA分子；

3)所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体。

本发明进一步提供所述的sgRNA或所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体或所述的试剂盒在敲除玉米基因Zm00001d010255中的应用。

本发明进一步提供所述的sgRNA或所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体或所述的试剂盒在创制抗粗缩病玉米种质中的应用。

本发明还提供一种创制抗粗缩病玉米种质的方法，包括：

将所述的CRISPR/Cas9基因敲除载体导入BMEHA105农杆菌感受态细胞，得到重组农杆菌；用所述重组农杆菌侵染玉米的愈伤组织；而后将得到的阳性愈伤组织诱导培养获得再生植株。

本发明进一步提供用于检测与抗粗缩病玉米种质相关的基因的突变效果的引物组合，包括：序列如SEQ ID NO.2-3所示的引物。

基于上述技术方案，本发明的有益效果如下：

本发明所提供的sgRNA和CRISPR/Cas9敲除载体可以显著提高CRISPR/Cas9敲除载体的打靶效率，进而有利于提高玉米基因Zm00001d010255的敲除效率。

按照本发明的方法可以快速创制抗粗缩病的玉米种质，其可以明显改善粗缩病所引起的各项症状，使玉米种质的株高、节间距有明显提升，根系更为发达，且蜡白色突起明显减少。

附图说明

图1为本发明实施例的基因编辑载体及突变鉴定；其中，A图和B图为基因编辑载体；C图为sgRNA结合的区域所发生的突变。

图2为人工接种后的玉米粗缩病症状。

图3为人工接种后的株高变异情况。

图4为人工接种后的病级差异情况。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例

1材料与方法

1.1受体材料

遗传转化受体为玉米自交系KN5585。

1.2载体、菌株和主要试剂

基因编辑基础载体为CPB-Ubi-hspcas9。

1.3CRISPR/Cas9敲除载体的构建

CRISPR/Cas9敲除载体如图1中A图。玉米内源性U6-2启动子用于启动sgRNA表达。参考基因组序列B73_RefGen_v4中Zm00001d010255基因设计gRNA，其序列如SEQ ID NO.1所示。gRNA序列在KN5585受体中经Sanger测序验证。

1.4玉米遗传转化

(1)构建CRISPR/Cas9敲除载体并导入BMEHA105农杆菌感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司，货号：BC303-01)，得到重组菌。

(2)采用N6液体培养基培养步骤1得到的重组农杆菌，得到菌液OD

(3)将玉米自交系KN5585长势良好的愈伤组织在侵染buffer中浸泡1h，然后转移至步骤2制备的侵染液中浸泡15min，晾干。其中，En0和Em0单独侵染，其余12个载体的侵染液等量混合后侵染。

(4)将步骤3侵染后的愈伤组织放至共培养基(1L共培养基是将4g含N6vitamin的N6盐，2mg2,4-D，30g蔗糖，8g琼脂，1mL AgNO

(5)将步骤4得到的阳性愈伤组织转至诱导胚状体培养基(1L诱导胚状体培养基是将4.43g含MS vitamin(含肌醇)的MS盐，0.25mg2,4-D，30g蔗糖，5mg6-BA，4g植物凝胶，1mLCefo(250mg/mL)和水混匀得到的，pH5.8)，暗培养2周，然后转至分化培养基(1L分化培养基是将4.43g含MS vitamin(含肌醇)的MS盐，30g蔗糖，4g植物凝胶，1mL Cefo(250mg/mL)和水混匀得到的，pH5.8)待长出绿苗后转移至生根培养基(1L生根培养基是将2.215g1/2MS，30g蔗糖，51.55mg MSvitamin，4g植物凝胶和水混匀得到的，pH5.8)生根，长到一定高度，暴露在空气中培养3天，移苗。

(6)取植株叶片3厘米左右，放入管中研磨充分，加入500μl的buffer(来自bar基因检测试纸条)，插入bar基因检测试纸条(北京奥创金标生物技术有限公司，货号：A07-13-413)，出现阳性条带的植株就为T

1.5转基因成分验证

利用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen，China)提取和纯化DNA。通过Bar试纸条(Agdia，Cat.#STX14200/0012，US)和SpCas9基因的PCR检测T-DNA。SpCas9 PCR扩增使用5'-CAACCGGAAAGTGACCGTGA-3'(SEQ ID NO.4)的正向引物和5'-CACCACCTTCACTGTCTGCA-3'(SEQ ID NO.5)的反向引物。PCR程序包括94℃3min；95℃30s，58℃30s，68℃20s的35个循环；最后68℃延伸10min。

1.6突变检测

根据敲除载体的靶标位置设计引物5'-GCACCGCCTGATCTACTACC-3'(SEQ ID NO.2)和5'-CAGTCTAGGGAAGCCCTCGC-3'(SEQ ID NO.3)，通过PCR对相应的植株进行靶基因扩增，测序后用DSDecode软件分析突变类型。PCR反应体系及反应程序同转基因成分验证。

1.7抗病性鉴定

玉米敲除突变的材料与野生型材料按1：1的比例混合，然后用于人工接种鉴定。人工接种参考张爱红等的方法，即取2-3龄无毒灰飞虱若虫，在小麦毒源上取食3天；取出，在环境温度23±2℃、相对湿度为(70±5)％、14小时光照的条件下，健康小麦苗上度过25天循回期获得带毒灰飞虱；将带毒灰飞虱接种于芽鞘期至2叶1心期待鉴定的玉米植株；接种强度为7-10头虫/苗，接种72小时；移栽至防虫网室调查发病情况。

在玉米成熟期调查抗病性，病害严重度分级标准为：0级，健康植株；1级，株高为健株株高的4/5左右，仅上部几个叶片有蜡白色突起，整个植株与健康植株的差异不大；2级，为健株株高的2/3左右，大部分叶片有明显的蜡白色突起；3级，为健株株高的1/2左右，植株变粗，所有叶片有明显的蜡白色突起；4级，为健株株高的1/3以下，不能抽雄，叶色浓绿，整株显症或提早枯死。

利用R软件，采用成组的T测验，检测突变与野生型之间的抗病性差异。

2结果与分析

2.1 CRISPR/Cas9敲除载体构建及遗传转化

本发明成功构建了敲除玉米感粗缩病基因Zm00001d010255的敲除载体(图1中A图，B图)。通过农杆菌介导的遗传转化，获得了18个转化事件。以sgRNA结合的位置为中心，设计该位点的上游和下游引物。通过PCR扩增和Sanger测序，发现在sgRNA结合的区域发生了突变(图1中C图)，并且获得了移码突变。突变的类型包括插入一个鸟嘌呤，减少一个鸟嘌呤，插入一个腺嘌呤，减少三个碱基和减少5个碱基等类型。其中，两个等位基因都发生移码突变的材料用于玉米粗缩病的抗性鉴定。

2.2抗病性鉴定

该病初期症状是在幼叶背面出现成排透明的虚线亮点，随后亮点逐渐增多，叶脉上逐渐呈现白色蜡状突起，粗糙明显。

通过人工接种鉴定后，野生型植株与敲除突变植株相比，病株严重矮化，节间缩短，根系不发达且较浅(图2，图3)。野生型植株叶背面出现成排透明的虚线亮点，后期亮点逐渐增多，叶脉上逐渐呈现白色蜡状突起，粗糙明显(图2)，呈现明显的粗缩病症状。事件1的平均株高为119.52cm，与其混合的野生型的株高为58.21cm。通过T测验发现，突变植株(事件1)与野生型相比差异极显著(P<0.001)(图3)。事件2的平均株高为159.71cm，与其混合的野生型的株高为64.88cm。通过T测验发现，突变植株(事件2)与野生型相比差异极显著(P<0.001)(图3)。

通过人工接种鉴定后，按照0-4级的标准评定每个植株的病级。事件1植株的平均病级为0.2，与其混合的野生型的平均病级为3.45cm。通过T测验发现，突变植株(事件1)与野生型相比病级差异极显著(P<0.001)(图4)。事件2植株的平均病级为0.12，与其混合的野生型的平均病级为3.12cm。通过T测验发现，突变植株(事件2)与野生型相比病级差异极显著(P<0.001)(图4)。

以上试验结果表明，通过基因编辑手段，敲除玉米感粗缩病的基因Zm00001d010255，可以快速创制抗粗缩病的玉米种质。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种创制抗粗缩病玉米种质的方法

<130> KHP211112284.2

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgacgtgatc gttctgggca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcaccgcctg atctactacc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagtctaggg aagccctcgc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caaccggaaa gtgaccgtga 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccaccttc actgtctgca 20