甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2及其应用

摘要

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种甘蔗UDP‑糖基转移酶基因ShUGT2，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还公开了上述甘蔗UDP‑糖基转移酶基因ShUGT2的应用。本发明提供的甘蔗UDP‑糖基转移酶基因ShUGT2在甘蔗的根、茎、叶组织中均有表达，与甘蔗的生长发育密切相关。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2及其应用。

背景技术

糖基转移酶(glycosyltransferases,GT)普遍存在于自然界生物体内，是一个庞大的基因家族，作用是对糖基进行催化，将活性供体分子转移到激素、次级代谢物、蛋白等大小分子上，改变受体分子的生物活性、稳定性、水溶性、运输特性、亚细胞定位以及与受体的相互识别等特性。在植物体内最主要的糖基供体是尿核苷二磷酸糖基转移酶(UDP－glycosyltransferases，UGT)，又称作UDP-糖基转移酶，对于维持植物的生长发育具有重要作用。

甘蔗(Saccharum officinarum)作为重要的热带经济作物，同时也是最大的糖料作物，对中国乃至世界的食糖产业贡献巨大。甘蔗体内有着众多的糖基转移酶基因，但它们在植物生长发育中的作用，尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在甘蔗的根、茎、叶组织中均有表达，与甘蔗的生长发育密切相关的甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2及其应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码上述甘蔗UDP-糖基转移酶，以及包含上述甘蔗UDP-糖基转移酶基因或包含上述甘蔗UDP-糖基转移酶的表达载体。

本发明还提供了上述甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2在植物生长发育中的应用。

本发明的原理和有益效果：

本发明利用甘蔗转录组数据克隆出UDP-糖基转移酶基因ShUGT2，通过亚细胞定位分析发现， ShUGT2编码蛋白定位于线粒体，并且在甘蔗的根、茎、叶组织中，ShUGT2基因均有表达，与甘蔗的生长发育密切相关，能够为进一步分析ShUGT2基因功能提供了科学依据。

附图说明

图1为提取的总RNA琼脂糖凝胶电泳结果；

图2为甘蔗基因ShUGT2的PCR扩增产物；

图3为运用TMHMMServerv.2.0软件预测的跨膜区；

图4为结构域分析；

图5为二级结构预测；

图6为三级结构建模；

图7为菌液PCR鉴定阳性克隆电泳结果；

图8为ShUGT2蛋白的亚细胞定位；

图9为半定量RT-PCR结果；

图10为根据ShUGT2氨基酸序列构建的进化树。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例所用到的甘蔗材料来源于中国热带农业科学院甘蔗研究中心儋州综合试验站甘蔗基地；感受态细胞DH5α(货号CD201-01)购自全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒(货号 AP-MN-P-50G)、凝胶纯化回收试剂盒(货号AP-GX-50)购于Axygen公司；半定量RT-PCR试剂(货号RR420A)、Taq酶(货号RR02MA)、测序载体pMD19-T载体(货号6013)、cDNA合成试剂盒 (货号6110A)购于TaKaRa公司；RNA提取试剂盒(货号R6827-01)购于Omega公司； pCAMBIA1300-GFP载体购于NTCC典型培养物保藏中心，水稻品种由日本晴由武汉伯远生物公司提供。

实施例

(1)本实施例提供了一种甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2，核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

(2)本实施例还提供了编码上述甘蔗UDP-糖基转移酶，以及包含上述甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2的表达载体，以及根据甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2在植物生长发育中的应用。

(3)本实施例还提供了上述甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2的获得方法，具体包括以下步骤：

S1、以甘蔗品种ROC22为供试材料，提取成熟叶片总RNA反转录合成cDNA，PCR扩增获得 ShUGT2基因cDNA全长序列。

具体地，取生长成熟期甘蔗品种ROC22叶片，按RNA提取试剂盒说明书提取RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，如图1(泳道1-2为两个甘蔗叶片样品的总核酸提取物)所示，28S、18S和5S条带清晰无DNA污染，紫外分光光度计测定RNA浓度，RNA浓度为80ng/μL满足后续试验需要(要求浓度范围在1ng/μL-500ng/μL之间)。

cDNA第一链合成按TaKaRa公司cDNA合成试剂盒说明书进行操作。根据甘蔗转录组数据设计全长序列引物ShUGT2-F和ShUGT2-R(表1)，以cDNA为模板进行PCR扩增，以表2的反应体系(共25μL)进行扩增。扩增程序为：95℃7min；95℃1min，57℃1min，72℃2min，30个循环；72℃10min。

扩增出约1.8kb左右的目的基因片段如图2所示，图2中的“M”为DL2000 DNAmarker；“1”为 PCR产物。

将PCR产物凝胶回收，连接pMD19-T载体并转化，测序后获得1867bp长度的序列。16℃培养 12h。转入DH-5α感受态细胞，PCR验证菌液阳性克隆，将阳性单菌落送上海生工生物工程技术有限公司进行序列分析。

序列分析表明，ShUGT2含有1782bp的完整开放阅读框，编码593个氨基酸，氨基酸序列与高粱、玉米、谷子等单子叶植物的序列同源性都很高，推测为甘蔗UDP-糖基转移酶。

表1引物序列

表2 PCR反应体系

S2、生物信息学分析方法

具体地，本实施例通过NCBI数据库和DNAMAN软件进行序列多重比对，使用MEGA6.0软件构建系统发育进化树，构建的系统发育进化树如图10所示。

(1)运用ProtParam软件(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白质理化性质。

发现ShUGT2编码的蛋白的理论等电点(pI)为8.16，相对分子量为67.28kD，不稳定系数为48.68，是一种不稳定蛋白，疏水性指数为0.338，预测其为亲水性蛋白。富含精氨酸Arg(R)10.5％，丙氨酸 Ala(A)9.8％，缬氨酸Val(V)8.8％，亮氨酸Leu(L)8.4％，冬氨酸Asp(D)7.3％，甘氨酸Gly(G)7.1％等。

(2)运用TMHMMServerv.2.0软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测跨膜区。如图3 所示，发现该蛋白具有1个跨膜区，位于20～42氨基酸的位置。

(3)运用InterProScan软件(www.ebi.ac.uk/interPro/search/sequence-search)分析结构域。

如图4所示，氨基酸序列的保守结构域分析显示，ShUGT2编码的氨基酸具有UDP-糖基转移酶家族的特征结构域，位于309～514个氨基酸。

(4)运用SOPMA软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html) 进行蛋白二级结构分析。

如图5所示，二级结构分析显示该氨基酸存在α-螺旋、伸展链、β-转角和无规卷曲。其中有265 个氨基酸形成α-螺旋，占44.69％，84个氨基酸形成伸展链，占14.17％，30个氨基酸形成β-转角，占所5.06％，214个氨基酸形成无规卷曲，占36.09％。

(5)运用Swiss-Model软件(https://swissmodel.expasy.org/)进行蛋白三级结构建模，通过同源建模得到该氨基酸产物的三级结构图(图6)。

S3、ShUGT2蛋白的亚细胞定位。

具体地，本步骤实验以pMD19-T载体为模板，以ShUGT2-L-F和ShUGT2-L-R为同源引物，进行PCR扩增，切胶回收目的片段。用限制性内切酶KpnⅠ单酶切pCAMBIA1300-GFP载体，使其线性化。DNA回收试剂盒纯化酶切产物。将目的片段和线性克隆载体连接，37℃金属浴30min，立即冰水浴5min，转入DH5α感受态细胞，PCR验证菌液阳性克隆(实验结果如图7所示，图7中“M”为DL2000 DNA marker；“1”为PCR产物)，使用试剂盒提取质粒。

挑取成熟期水稻品种日本晴叶片，切割至0.2mm左右，置于10mL酶解液(1.25％Cellulose R10 和0.75％Macerozyme R10)中酶解，黑暗真空30min，50rpm酶解4h。加入等体积W5溶液，120目细胞筛过滤，200rpm离心3min，弃上清。加入1mL W5溶液洗涤原生质体，200rpm离心3min，弃上清，加入1mL MMG溶液重悬，暗保存。

吸10μL(2μg/μL)质粒DNA于2ml离心管，缓慢加入100μL原生质体悬浮液，并混匀；加入 110μL 40％PEG溶液，缓慢混匀，黑暗条件下转染15min；加入400μL W5溶液，终止转染，120rpm 离心2min；去上清，加入1mL WI溶液，暗培养12h。空白对照载体pCAMBIA1300-GFP操作同上。使用激光共聚焦显微镜观察定位结果。

对照pCAMBIA1300-GFP空载体在原生质体的每个部位都有表达(图8a)，pCAMBIA1300-ShUGT2-GFP融合载体在线粒体上观测到绿色荧光，具有明显的定位特征(图8b)，因此推论ShUGT2编码蛋白是一种线粒体蛋白。

S4、ShUGT2半定量RT-PCR表达分析。

取成熟期甘蔗ROC22的根、茎、叶组织，按Omega公司RNA提取试剂盒说明书提取RNA，反转录合成cDNA，根据目的基因的cDNA序列设引物ShUGT2-Y-F和ShUGT2-Y-R(表1)，以GAPDH(表 1)为内参基因，引物测序合成由上海生工生物工程技术有限公司完成。

以cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增程序为：95℃5min；95℃30S，64℃30S，72℃20S，28个循环；72℃10min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用全自动数码凝胶图像分析系统观察结果并拍照。

如图9所示，ShUGT2在甘蔗的叶片、茎和根部组织(分别是图9中泳道1-3)均有表达，但表达的特异性并不明显。

综上，本实施例以甘蔗品种ROC22为供试材料，提取成熟叶片总RNA反转录合成cDNA，PCR 扩增获得ShUGT2基因cDNA全长序列，并对其进行生物信息学、亚细胞定位和组织特异性表达分析。结果表明ShUGT2含有1782bp的完整开放阅读框，编码593个氨基酸，其编码蛋白与高粱UDP- 糖基转移酶同源性达到92.45％。ShUGT2编码蛋白不稳定系数48.68，疏水性指数0.338，是一种亲水性蛋白；在20～42个氨基酸的位置，有一个跨膜区，在309～514个氨基酸之间，存在UDP-糖基转移酶的家族特异保守结构域。通过亚细胞定位分析发现，ShUGT2编码蛋白定位于线粒体。在甘蔗的根、茎、叶组织中，ShUGT2基因均有表达，与甘蔗的生长发育密切相关，能够为进一步分析ShUGT2 基因功能提供了科学依据。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 甘蔗UDP-糖基转移酶基因ShUGT2及其应用

<160> 1

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 1866

<212> DNA

<213>甘蔗(Saccharum officinarum L)

<400>1

gaacgcccgc cacacataca catacggata cagtgcgcgc gcggcatggg ggtgaccacc 60

gccggggagg ccgtctgcaa gtccccggtg cgggcctcgg tcatcgtcaa gatgaacgcc 120

gcgttcctcg ccttcttcct cttcgcctac ctggcgctcc tcctccaccc caagtactcg 180

gacatcctcg accgcggcgc cacctccctc gtccgctgca ccttccgcga ctcctgtccg 240

ccaccgtcgt cgacgacgac ccagctctca cggaagctgg gaggcgtggc ggcgaacaag 300

gtggcggcgg cggagcgcat cgtgaacgcg ggccgcgcgc cggccatgtt cgaggagctc 360

cgtggccggc tgcggatggg cctggtgaac atcgggcgcg acgaggtgct ggcgctgggc 420

gtggagggcg acgcggtgcg cgtggacttc gagcgcgtct ccgagacgtt ccggtggtcg 480

gacctgttcc cggagtggat cgacgaggag gaggacgacg agggctcgtc ctgcccggag 540

ctccccatgc cggactggtc ccggtacgct gacggcggcg gcgacgtgga cgtggtggtg 600

gcgtcggtgc cgtgcaaccg cagcgcgccc gggtggaacc gcgacgtgtt caggctgcag 660

gtgcacctgg tggcggcgca cgtggcggcg cggaagggcc ggcgcgacgg gggcggggcc 720

gtgcgcgtgg tgctgcggag ccagtgcgag cccatgatgg acctgttccg ctgcgacgag 780

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aagctccgcc ttcccgtggg gtcatgcaat ctcgctatgc cgctctgggg agcaggaggg 900

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cagctgtccg actacgaccg cgtggtgttc gtggacgccg acatcctggt gctccgcaac 1260

ctggacgcgc tgttcgcgtt cccgcagctc acggcggtgg gcaacgacgg ctccctcttc 1320

aactccgggg tgatggtgat cgagccgtcg gcatgcacgt tcgacgcgct gatccgggac 1380

cgccggacca tccggtcgta caacggcggc gaccaggggt tcctgaacga ggtgttcgtg 1440

tggtggcacc ggctgccgcg gcgggtgaac tacctcaaga acttctgggc caacaccacc 1500

ggggagcacg cgctcaagga gcggatgttc cgggcggacc cggccgaggt gtggtccatc 1560

cactacctgg ggatgaagcc ctggacgtgc tacagggact acgactgcaa ctggaacgtg 1620

gcggaccagc gggtgtacgc cagcgacgag gcgcacaagc gctggtggca ggtgtacgac 1680

cagatggggg agaccatgcg cgggccatgc cgcctctcgg agcggaggaa ggtggagatc 1740

gcctgggaca ggcacgtcgc cgaggagatc gggtacgcgg accagcactg gaagatcaac 1800

atcacggacc caaggaaatg ggactgactt tccttctctc ctatgatcga ctacgtacgt 1860

acctcc 1866