乳双歧杆菌Probio-M8及其制品用于制备治疗ASD药物的用途

摘要

本申请公开乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)Probio‑M8及其制品用于制备治疗孤独症谱系障碍药物的用途，所述乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)Probio‑M8的微生物保藏编号为CGMCC No.18610，本申请提供的乳双歧杆菌Probio‑M8及其菌剂对ASD具有治疗、缓解和改善作用，可用于制备治疗ASD药物，并且，本申请所用乳双歧杆菌Probio‑M8来源明确，兼具普通食品属性和微生态药物菌种潜力，推广成本较低，在制备缓解和治疗孤独症等ASD的产品中具有良好的前景。

说明书

技术领域

本申请属于生物技术领域，特别涉及乳双歧杆菌Probio-M8及其制品用于制备治疗ASD 药物的用途。

背景技术

自闭症(Autistic disorder)，也称孤独症，是一种神经发育障碍类疾病，其症状以社会交往障碍、言语发展障碍、语言沟通能力缺陷为主，并伴有刻板行为，较严重状况者，与其他的类型阿斯伯格综合征、儿童期分裂障碍等可称之为孤独症谱系障碍(Autismspectrum disorder，ASD)。研究表明，ASD存在遗传基础，并在一定的环境诱导下发病，包括母体免疫因素、自身免疫紊乱及自然环境因素等，并且存在脑发育的异常。但是，ASD的病因及发病机制尚不完全明确。

大多ASD患者都患有其他精神和躯体疾病，例如：多动症、情绪障碍、睡眠问题、消化道功能紊乱、免疫问题以及营养与代谢性问题等。研究表明，ASD患者的消化道问题显著，有些ASD患者的消化道问题具有明显表现，例如，表现为便秘、胃酸反流或腹泻，而有些 ASD患者的消化道问题无明显症状，但是对这些ASD患者进行胃镜或肠镜等检查，就会发现消化道有异常。

与胃肠道无明显症状的孤独症患者相比，胃肠道存在一定症状的孤独症患者表现出更严重的易怒、焦虑和社交回避等症状。通过基因组检测发现，与健康群体相比，ASD群体的肠道菌群组成，包括菌群种类和数量均存在较大差异。

随着现代研究的深入，特别是将肠道菌群作为研究热点以来，研究人员发现肠道菌群与精神类疾病的发生，发展有密切关系。相关研究证实，肠道菌群与脑之间的联系影响了免疫、代谢、神经及行为，肠道与脑之间的交流开始后，通过神经系统、神经内分泌及神经免疫的信号，进行相互调节。

发明内容

本申请的目的在于提供乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)Probio-M8用于制备治疗孤独症谱系障碍药物的用途，所述乳双歧杆菌Probio-M8的微生保藏号为CGMCCNo.18610。

在本申请中，所述乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)Probio-M8为革兰氏阳性菌，琼脂平板生成直径为1～2mm的凸圆形乳白色菌落，边缘完整，表面光滑，细胞形态呈哑铃状，两端规则，有许多明显节点，所述双歧杆菌Probio-M8为异型发酵，所述乳双歧杆菌Probio-M8 分离自母乳，该菌株已于2019年9月20日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，邮编：100101，分类命名为乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)，微生保藏号为CGMCCNo.18610。

本发明提供的乳双歧杆菌Probio-M8能够对胃肠道消化液和胆盐有良好的耐受性，因此，本申请提供的乳双歧杆菌Probio-M8属于益生菌。

本申请的目的还在于提供一种用于治疗孤独症谱系障碍的益生菌制剂，所述益生菌制剂包括所述乳双歧杆菌Probio-M8。

在一种可实现的方式中，基于所述益生菌制剂的总重量或者总体积，所述益生菌制剂中所述乳双歧杆菌Probio-M8的活菌数不低于1×10

可选地，所述益生菌制剂中还包括药物载体，所述药物载体包括微藻类、菊粉和蛋白水解物等。

进一步地，所述益生菌制剂可由包括以下步骤的方法制备：

取乳双歧杆菌Probio-M8菌体进行培养，获得乳双歧杆菌Probio-M8菌液；

分离所得乳双歧杆菌Probio-M8菌液中的乳双歧杆菌Probio-M8菌体；

将所得乳双歧杆菌Probio-M8菌体制备为益生菌固体制剂。

在本申请中，所述乳双歧杆菌Probio-M8菌体为湿菌体，可采用现有技术中任意一种培养益生菌的方法进行培养，例如，可以采用发酵方式进行培养。

可选地，分离菌体可采用现有技术中任意一种由菌液中分离固态菌体的方法，例如，离心等。

可选地，将所得乳双歧杆菌Probio-M8菌体制备为益生菌固体制剂的方法可采用现有技术中任意一种将活菌制备为固体菌剂的方法，例如，冻干、喷雾干燥或包埋等，进而达到延长保质期、降低运输成本的目的。

本申请的目的还在于提供所述乳双歧杆菌Probio-M8或者所述益生菌制剂用于制备以下制品中至少一种的用途：

(A)BTBR孤独症模型小鼠治疗药物；

(B)ASD治疗药物。

(C)肠道菌群调节剂；

(D)功能性保健品。

在本申请中，在上述四种制品中，包括所述乳双歧杆菌Probio-M8的活菌菌体。

进一步地，在上述制品中，基于所述益生菌制剂的总重量或者总体积，所述乳双歧杆菌 Probio-M8的活菌数量不低于1×10

进一步地，由所述乳双歧杆菌Probio-M8制备的调节肠道菌群平衡调节剂中还可以复配有其它可刺激有益菌生长的物质，例如，低聚果糖、低聚木糖、中草药及其提取物等。

进一步地，所述肠道菌群调节剂、功能性保健品可以为糖果压片、益生菌固体饮料等； BTBR孤独症模型小鼠治疗药物和ASD治疗药物的剂型可以为口服剂型，具体包括口服液、颗粒剂、丸剂或者胶囊剂等。

本申请的另一目的在于提供所述益生菌制剂用于制备以下制品中至少一种的用途：

(A)BTBR孤独症模型小鼠治疗药物；

(B)ASD治疗药物。

(C)肠道菌群调节剂；

(D)功能性保健品。

可选地，所述制品中还包括药物载体和/或药用辅料。

在本申请中，在上述四种制品中，基于制品的总重量，所述益生菌制剂重量百分数为 6％～10％。

进一步地，所述肠道菌群调节剂、功能性保健品可以为糖果压片、益生菌固体饮料等；所述BTBR孤独症模型小鼠治疗药物和ASD治疗药物的剂型可以为口服剂型，所述口服剂型包括口服液、颗粒剂、丸剂或者胶囊剂等。

与现有技术相比，通过BTBR孤独症小鼠模型研究发现，本申请提供的乳双歧杆菌Probio-M8及其菌剂对ASD具有治疗、缓解和改善作用，可用于制备治疗ASD药物，并且，本申请所用乳双歧杆菌Probio-M8来源明确，兼具普通食品属性和微生态药物菌种潜力，推广成本较低，在制备缓解和治疗孤独症等ASD的产品中具有良好的前景。

附图说明

图1A示出B6和BTBR在三箱社交试验中的社交行为；

图1B示出B6和BTBR在三箱社交试验中的新奇偏好；

图2A示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的社交行为(D22-23)；

图2B示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的新奇偏好(D22-23)；

图2C示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的社交行为(D40-41)；

图2D示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的新奇偏好(D40-41)；

图3A示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的社交行为指数(D22-23)；

图3B示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的新奇偏好指数(D22-23)；

图3C示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的社交行为指数(D40-41；

图3D示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的新奇偏好指数(D40-41)；

图4A示出B6和BTBR在理毛试验中的平均理毛时间；

图4B示出B6和BTBR在理毛试验中的错误梳理次数；

图5A示出B6、BTBR-vehicle和双歧杆菌Probio-M8对BTBR在理毛试验中的平均理毛时间(D22-23)；

图5B示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在理毛试验中的错误梳理次数(D22-23)；

图5C示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在理毛试验中的平均理毛时间(D39-40)；

图5D示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在理毛试验中的错误梳理次数(D39-40)；

图6A示出B6和BTBR在认知行为测试试验中在熟悉期对物体的探索时间；

图6B示出B6和BTBR在认知行为测试试验中在测试期的识别指数；

图7A示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在认知行为测试试验中在熟悉期对物体的探索时间(D28-31)；

图7B示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在认知行为测试试验中在测试期的识别指数(D28-31)；

图7C示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在认知行为测试试验中在熟悉期对物体的探索时间(D45-48)；

图7D示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在认知行为测试试验中在测试期的识别指数(D45-48)；

图8A示出B6和BTBR在旷场试验中旷场总区域运动路程；

图8B示出B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动路程；

图8C示出B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动时间；

图8D示出B6和BTBR在旷场试验中的站立次数；

图8E示出B6和BTBR在旷场试验中的站立时间；

图9Aa示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中旷场总区域运动路程(24D)；

图9Ab示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中旷场总区域运动路程(42D)；

图9Ba示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动路程(24D)；

图9Bb示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动路程(42D)；

图9Ca示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动时间(24D)；

图9Cb示出乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动时间(42D)；

图9Da示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中的站立次数(24D)；

图9Db示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中的站立次数(42D)；

图9Ea示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中的站立时间(24D)；

图9Eb示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中的站立时间(42D)。

具体实施方式

这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致方法的例子。

下面通过具体的实施例对本申请提供的乳双歧杆菌Probio-M8在制备治疗孤独症谱系障碍药物的用途进行详细阐述。

首先，对本方案使用的模型作简要介绍。

本申请以BTBR T～(+)tf/J(简称BTBR)小鼠模型进行研究，BTBR小鼠是研究自闭症的主要应用模型，BTBR小鼠是一种近交系小鼠，它不仅具有ASD的核心症状：社交减少、社交场合中发出的超声波少、重度的重复理毛行为；并且，还具备与ASD类似的脑发育异常以及免疫生化指标异常。

近年，对肠道菌群失调与中枢神经系统性疾病的相关研究揭示肠道菌群失衡与肠-脑轴异常密切相关，因此，本申请人以通过益生菌干预肠道菌群平衡作为缓减和/或治疗ASD的切入点进行研究。由于各益生菌菌株之间存在生理、代谢特性差异性，益生功效发挥具有菌株特异性，因此，经过大量研究后，本申请人筛选到乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR自闭症模型小鼠的社交行为、焦虑行为有改善作用，对起到了一定的缓减或治疗效果。

以下实验例记载验证过程，其余对BTBR自闭症模型小鼠的社交行为、焦虑行为未有改善的菌株所得实验结果未在本申请文件中进行记载。

具体地，本申请所得结论是基于比较不同组别小鼠肠道菌群差异并结合多组学关联分析的结果，综合评估乳双歧杆菌Probio-M8对ASD患者的影响。

实验例

(一)实验设计

动物模型：ASD小鼠-BTBR，正常发育小鼠-B6。

分为三组(13只小鼠/组)：

第一组为B6对照组：饲喂生理盐水；

第二组为BTBR-vehicle组：饲喂生理盐水；

第三组为M8治疗组：饲喂生理盐水+乳双歧杆菌Probio-M8，其中，给药剂量为乳双歧杆菌Probio-M8：5×10

行为学试验设计：三箱社交、理毛实验、新奇物体识别实验和旷场实验。

行为学试验时间点：分组前(D-4)，第21次给药后(D22-31)，实验结束前(D39-48)。

实验中采集的样本类型及采样时间如表1所示：

表1实验采集样本类型及采样时间信息

(二)试验内容

1.社交行为测试-三箱社交试验

试验方法：

(1)适应阶段：将受试小鼠放入观察装置中(40cm×60cm×22cm)，所述观察装置包括3个连通的箱室，任其在3个连通的箱室中自由活动10min，以适应环境。

(2)测试阶段：取出适应好的受试小鼠，并随机在左右两侧箱室中分别放入空笼子(记为“Empty”)和带有陌生小鼠的笼子(记为“Mouse1”)。轻轻将之前适应好的受试小鼠由中间的箱室中放入使其在内活动10min，记录受试小鼠在左右两个箱室内分别停留的次数(n

行为测试:

基线值测定阶段(B6和BTBR各15只)

测试阶段：试验早期测试B6对照组和BTBR；试验中期测试B6对照组、BTBR-vehicle组和BTBR-M8治疗组；试验末期测试B6对照组、BTBR-vehicle组和BTBR-M8治疗组。

结果如图1A至图3D所示，其中，

图1A示出B6和BTBR在三箱社交试验中的社交行为；

图1B示出B6和BTBR在三箱社交试验中的新奇偏好；

图2A示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的社交行为(D22-23)；

图2B示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的新奇偏好(D22-23)；

图2C示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的社交行为(D40-41)；

图2D示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的新奇偏好(D40-41)；

图3A示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的社交行为指数(D22-23)；

图3B示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的新奇偏好指数(D22-23)；

图3C示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的社交行为指数(D40-41；

图3D示出B6、BTBR-vehicle和BTBR-M8在三箱社交试验中的新奇偏好指数(D40-41)。

由图1A可知，给药前经试验发现B6社会交往行为正常，BTBR社会交往能力异常；B6对新奇事物偏好能力正常，有明显的社交新奇偏好，BTBR对新奇事物偏好障碍。结果表明B6有明显的社交新奇偏好，BTBR没有社交新奇偏好，进一步说明实验动物符合实验设计要求。

结合图2A至图3D可知，在D22-D23，给药后B6小鼠社会交往行为正常，有社交新奇偏好，BTBR-vehicle组小鼠在测试第二阶段对熟悉鼠(“Mouse1”)的偏好程度明显大于陌生鼠2(“Mouse2”)；

连续给药21d后乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR的社交行为具有一定的改善作用，但不具有统计学差异(P>0.05)。

在D40-D41，B6对照组小鼠社会交往行为正常，有社交新奇偏好，BTBR-vehicle组在测试第一阶段对空笼的接触时间明显多于陌生小鼠(P<0.05)，乳双歧杆菌Probio-M8对社交行为异常和新奇事物偏好障碍有一定改善作用，但没有统计学差异。

综上，乳双歧杆菌Probio-M8对社交行为异常和新奇事物偏好障碍有一定改善作用，但没有统计学差异。

2.刻板行为测试-理毛试验

试验方法：

(1)适应阶段：视频录制行为开始前1h将小鼠从动物房带到测试室，做1h环境适应，房间照亮约40Lux。每次测试时间为17:00～21:00。实验时将小鼠轻轻移入透明观察箱中(规格L×W×H：20cm×20cm×50cm)中并同时进行数据采集。

(2)测试阶段：将每只小鼠(B6和BTBR各15只)放入一个底部铺有垫料的干净观察箱中，摄像机放置在观察箱的正上方。在低光照条件(约40Lux)下，每次预先适应观察箱10min后，再测试记录小鼠行为10min，整个过程试验人员保持安静并远离测试小鼠，观察者保持标准一致并对组别未知，并对10min内的小鼠重复自我梳理行为进行评分。

具体地，用5min作为一个单元间隔，记录每个间隔内的累积理毛时间和正确/错误梳理行为次数(回合)，计算平均累积理毛时间(s)和平均错误梳理次数百分比(％)，其中，使用梳理分析算法分析梳理行为回合(一个回合由头至尾顺序：爪子、脸、身体、腿、尾巴/生殖器)；错误梳理次数百分比(％)＝不遵循正常头颅梳理顺序次数/梳理行为总次数。

测试阶段：试验早期测试B6对照组和BTBR；试验中期测试B6对照组、BTBR-vehicle组和BTBR-M8治疗组；试验末期测试B6对照组、BTBR-vehicle组和BTBR-M8治疗组。

结果如图4A、图4B、图5A、图5B、图5C和图5D所示，其中，

图4A示出B6和BTBR在理毛试验中的平均理毛时间；

图4B示出B6和BTBR在理毛试验中的错误梳理次数；

图5A示出B6、BTBR-vehicle和双歧杆菌Probio-M8对BTBR在理毛试验中的平均理毛时间(D22-23)；

图5B示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在理毛试验中的错误梳理次数(D22-23)；

图5C示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在理毛试验中的平均理毛时间(D39-40)；

图5D示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在理毛试验中的错误梳理次数(D39-40)。

由图4A和图4B可知，给药前，BTBR孤独症模型小鼠的平均理毛时间远大于B6小鼠(P<0.001)，但二者在错误梳理次数比例上不具有统计学差异(P>0.05)，进一步表明BTBR刻板行为达标，且实验动物符合实验设计要求。

由图5A至图5D可知，在给药后的D1-D21，乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR平均理毛时间以及错误梳理次数比例不具有明显改善作用。

3.认知行为测试—新物体识别

试验方法：

(1)适应期：第1天，小鼠(B6和BTBR各13只)适应测试房间1h，再将小鼠放入旷场箱(箱内无物体)内适应20min。

(2)熟悉期：第2天，受试小鼠适应测试房间1h，再将小鼠放入旷场箱内适应至少5min，然后将小鼠从旷场箱中取出，放置在干净的临时保持笼中约2min。再在旷场箱内同侧左右两端放置两个大小、颜色和质地完全相同的黄色柱形瓶作为熟悉物体，再将受试小鼠背朝物体放入箱内，记录5min内受试小鼠对物体探究的情况，计时标准为小鼠鼻或口距离物体2cm 范围内探究的时间。

(3)测试期：熟悉期2h后，先随机将旷场箱内的一个黄色柱形瓶换为大小相同的绿色锥形瓶作为新奇物体，再将小鼠背朝物体放入箱内，记录5min内小鼠对新奇物体的探索时间(Tn)和熟悉物体的探索时间(Tf)。以识别指数(RI)作为新奇物体识别能力检测指标，其按照RI＝Tn/(Tn+Tf)进行计算。

测试阶段：试验早期测试B6对照组和BTBR；试验中期测试B6对照组、BTBR-vehicle组和BTBR-M8治疗组；试验末期测试B6对照组、BTBR-vehicle组和BTBR-M8治疗组。

结果如图6A、图6B、图7A、图7B、图7C和图7D所示，其中，

图6A示出B6和BTBR在认知行为测试试验中在熟悉期对物体的探索时间；

图6B示出B6和BTBR在认知行为测试试验中在测试期的识别指数；

图7A示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在认知行为测试试验中在熟悉期对物体的探索时间(D28-31)；

图7B示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在认知行为测试试验中在测试期的识别指数(D28-31)；

图7C示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在认知行为测试试验中在熟悉期对物体的探索时间(D45-48)；

图7D示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在认知行为测试试验中在测试期的识别指数(D45-48)。

由图6A和图6B可知，给药前，BTBR小鼠在熟悉期对物体的探索时间显著小于B6小鼠(P<0.01)；BTBR小鼠在测试期的识别指数显著小于B6小鼠(P<0.05)，进一步说明BTBR 小鼠具有认知缺陷，且实验动物符合实验设计要求。

由图7A至图7D可知，给药后的D1-D21，乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR小鼠的认知行为不具有改善作用。

4.行为测试—旷场试验

试验方法：

在低光照条件(约40lux)下，将小鼠(B6和BTBR各15只)置于旷场分析箱适应2min后，用动物自发活动视频分析系统测定10min内旷场分析箱中小鼠站立次数、站立时间，总区域活动距离以及中央区活动距离和活动时间。

站立标准：前2肢均离地，并保持1s及以上。

测试阶段：试验早期测试B6对照组和BTBR；试验中期测试B6对照组、BTBR-vehicle组和BTBR-M8治疗组；试验末期测试B6对照组、BTBR-vehicle组和BTBR-M8治疗组。

测试数据包括：总路程、中央区域路程、中央区域时间、站立次数、站立时间。

实验结果如图8A、图8B、图8C、图8D、图8E、图9Aa、图9Ba、图9Ca、图9Da、图9Ea、图9Ab、图9Bb、图9Cb、图9Db、图9Eb所示，其中，

图8A示出B6和BTBR在旷场试验中旷场总区域运动路程；

图8B示出B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动路程；

图8C示出B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动时间；

图8D示出B6和BTBR在旷场试验中的站立次数；

图8E示出B6和BTBR在旷场试验中的站立时间；

图9Aa示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中旷场总区域运动路程(24D)；

图9Ba示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动路程(24D)；

图9Ca示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动时间(24D)；

图9Da示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中的站立次数(24D)；

图9Ea示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中的站立时间(24D)；

图9Ab示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中旷场总区域运动路程(42D)；

图9Bb示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动路程(42D)；

图9Cb示出乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中中央区域运动时间(42D)；

图9Db示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中的站立次数(42D)；

图9Eb示出B6、BTBR-vehicle和乳双歧杆菌Probio-M8对BTBR在旷场试验中B6和BTBR在旷场试验中的站立时间(42D)。

由图8A和图8B可知，给药前，B6与BTBR在旷场总区域运动路程、中央区域运动路程及时间、站立时间的指标上未见明显差异，但在站立次数指标上，B6小鼠显著多于BTBR 模型小鼠(P<0.05)。

由图9Aa至图9Eb可知，从站立时间的指标来看，B6小鼠显著多于BTBR-vehicle模型小鼠(P<0.05)。乳双歧杆菌Probio-M8在给药结束D24/D42，B6与BTBR-vehicle在旷场总区域运动路程、中央区域运动路程及时间指标上未见明显差异(P>0.05)；

综上所述，服用乳双歧杆菌Probio-M8安全性良好，可有效用于BTBR孤独症模型小鼠的治疗，进一步说明乳双歧杆菌Probio-M8对ADS患者症状具有一定的改善作用。

通过本申请的上述实验，进一步表明肠道菌群可通过肠-脑相关网络与精神类疾病产生互动，肠-脑相关网络，互相作用，相互影响，双向调节。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。