公开/公告号CN113025761A
专利类型发明专利
公开/公告日2021-06-25
原文格式PDF
申请/专利权人 广州赛哲生物科技股份有限公司;
申请/专利号CN202110582010.0
申请日2021-05-27
分类号C12Q1/70(20060101);C12Q1/689(20180101);C12Q1/6895(20180101);C12Q1/686(20180101);C12Q1/6869(20180101);
代理机构44486 深圳智趣知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人崔艳峥
地址 510320 广东省广州市国际生物岛螺旋四路9号标准产业单元二期4栋C区301
入库时间 2023-06-19 11:37:30
技术领域
本发明涉及感染性疾病临床检测技术领域，特别涉及一种病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法及试剂盒。
背景技术
能够感染人的病原微生物种类很多，绝大多数是病毒、细菌、真菌、寄生虫、支原体、衣原体等，它们广泛存在于人体中。通过呼吸道进行感染是最常见的一种方式，且具有很高的病死率。根据世界卫生组织（WHO）2018年公布的2016年统计数据，全球前十位死亡原因中下呼吸道感染高居第四位，在传染性疾病中位列第一，共导致约300万人死亡。
感染病原的筛查主要依靠分离培养法及自动化的微生物鉴定系统，虽然具有操作简便、成本低等优点，但也存在通量低、耗时长、分离过程易受主观因素影响等缺陷，整个过程通常包括病原体培养、鉴定和抗菌药物敏感性试验，需要2~4天甚至更长时间。环介导等温扩增是一种基于有链置换活性的DNA聚合酶的等温快速核酸扩增方法，已经应用于病原体检测，具有灵敏度高、特异性强、反应速度快、不需要特殊仪器等优点，但是该方法对引物的设计有特殊要求，因此在多重PCR及通量检测方面存在一定的缺陷。微流控技术具有小型化、集成化与自动化的优势，且试剂用量少、能耗低、污染少，但该方法技术成本高，不利于临床大规模的病原微生物筛查及在中小医院推广。除此以外还有荧光qPCR和免疫荧光法等临床常用病原检测手段，这些方法虽然都是临床广泛认可，但存在通量低，应用病谱窄等缺陷。传统的病原微生物临床诊断认为的金标准依然是培养法，但培养阳性率差异非常大，比如血液培养的阳性率只有10%。
近几年随着二代测序技术的成熟和临床应用，基于Illumina Nextseq550测序平台的宏基因组二代测序法（mNGS）也逐渐被临床接受并用于多个系统感染疾病检测，包括上下呼吸道感染、血液感染或脓毒症、感染性脑炎或脑膜炎、胸腹腔、骨关节、口腔等感染。mNGS方法是一种对样本核酸进行二代测序检测的技术，属于无差别的检测，因此对病原检测种类覆盖很广泛，可以用于检测真菌、细菌、病毒、寄生虫等，该技术对于新发或罕见的感染有较强的检测能力，2019年底的全球爆发的新冠病毒就是最先通过mNGS技术检测出来的。虽然mNGS技术拥有众多优点，但也有几个缺陷和硬伤：1.灵敏度低，由于受到测序法本身的限制mNGS检测灵敏度一直饱受诟病，虽然检测的种类很多，对于拷贝数低的病原比如胞内菌和RNA病毒等会出现漏检情况发生。2.宿主影响，mNGS是临床样本所有核酸的检测，因此大量的人源宿主核酸对方法干扰影响较大，需要使用去宿主技术对人源核酸进行去除，但往往去除宿主的同时也会对病原核酸产生影响，最终影响检出准确性。3.操作时间长且繁琐，mNGS宏基因组测序前需要对样本进行破壁、提取、去宿主、打断、末端修复、接头连接，以及多次纯化等操作环节的处理才能上机测序，不仅增加TAT周期，操作繁琐，而且每增加一个实验环节致病病原核酸就会损失一部分，最终直接影响检出率。4.成本高，mNGS需要基本20M reads的测序数据量才能保证检测结果准确性，所以测序成本占总成本比重较大，再加上前面提到的多个实验环节的成本。成本高也直接导致市场上的检测服务费用高，增加患者医疗支出，也影响技术的大规模普及和使用。因此目前需要开发出一种既兼顾检测病原种类或通量、又保证检测灵敏度高，而且快速简单、成本相对较低的病原微生物鉴定方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法及试剂盒。本发明两步扩增的方法，第一步扩增使用上游长引物池进行单端扩增；第二步扩增在反应体系中加入下游长引物池，还有接头序列P1和P2，一共三种引物组成第二步扩增的引物，随后进行质控、纯化、高通量测序和数据分析。
本发明提供一种病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法，包括如下步骤：
S1：引物池制作；
将所需要鉴定的多种病原特异的上游长引物和下游长引物分别按照等摩尔比例进行混合，得到上游长引物池和下游长引物池；所述上游长引物的结构依次为：接头序列P1、index序列、测序引物1、靶向病原序列上游扩增引物；所述下游长引物的结构依次为：接头序列P2、测序引物2、分子标签UMI序列、linker序列、靶向病原序列下游扩增引物；所述接头序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示，所述接头序列P2的核苷酸序列如SEQ IDNO.82所示；其中index序列的作用是区分不同样本，一个样本对应一种index序列，如果一次性做多个样本需要多种index序列。UMI序列的作用是用于去除扩增引入干扰。靶向病原序列上游扩增引物和靶向病原序列下游扩增引物为针对目标扩增序列，利用生物信息学方法进行设计的一段特异序列，其符合常规引物序列的要求。
S2：两步法扩增；
（1）第一步扩增使用所述上游长引物池进行单端扩增；
（2）第二步扩增在所述步骤（1）的反应体系中加入所述下游长引物池，还有引物P1和引物P2，所述引物P1和所述引物P2的核苷酸序列分别与所述接头序列P1和所述接头序列P2相同，作为独立的引物形式存在；一共三种引物组成第二步扩增的引物；
S3：质控；
两步法扩增后的产物进行电泳检测；
S4：纯化；
两次扩增后的产物用磁珠进行纯化，得到纯化的测序文库；纯化后的测序文库进行精确定量和片段大小分析；
S5：测序；
按照测序平台要求稀释文库，以所述步骤S4定量的结果为标准并根据数据量需要进行混样，采用Illumina Miniseq SE150进行测序；
S6：数据分析；
对测序原始数据进行过滤、合并，然后进行数据库比对，确定病原的种属区分和定量分析。
进一步的，所述S1步骤之前还包括收集临床样本、样本前处理和核酸提取的步骤。
进一步的，所述上游长引物的总长度为80~90 bp，所述index序列长度为8~10 bp。
进一步的，所述下游长引物的总长度为90~100 bp，所述分子标签UMI序列由8~15个随机碱基组成，所述linker序列的长度为2~5bp，碱基组成可变；
进一步的，所述第二步扩增后的产物的长度为100~150 bp。
本发明还提供一种引物池，所述引物池包括上游长引物和下游长引物；
所述上游长引物的结构依次为：接头序列P1、index序列、测序引物1、靶向病原序列上游扩增引物，所述上游长引物的总长度为80~90 bp，所述index序列长度为8~10 bp；所述接头序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示；
所述下游长引物的结构依次为：接头序列P2、测序引物2、分子标签UMI序列、linker序列、靶向病原序列下游扩增引物，所述下游长引物的总长度为90~100 bp，所述分子标签UMI序列由8~15个随机碱基组成，所述linker序列的长度为2~5 bp；所述接头序列P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。
进一步的，所述上游长引物的结构还可以依次为：接头序列P1、index序列、测序引物1、index序列、靶向病原序列上游扩增引物，所述上游长引物的总长度为80~90 bp，所述index序列长度为8~10 bp；所述接头序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示。
进一步的，所述下游长引物的结构还可以依次为：接头序列P2、分子标签UMI序列、linker序列、测序引物2、分子标签UMI序列、linker序列、靶向病原序列下游扩增引物，所述下游长引物的总长度为90~100 bp，所述分子标签UMI序列由8~15个随机碱基组成，所述linker序列的长度为2~5 bp；所述接头序列P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。
本发明还提供一种病原微生物检测试剂盒，包括如下成份：
DNA聚合酶、dNTP、上游长引物混合物、下游长引物混合物、引物P1、引物P2、水；所述上游长引物的结构依次为：接头序列P1、index序列、测序引物1、靶向病原序列上游扩增引物；所述下游长引物的结构依次为：接头序列P2、测序引物2、分子标签UMI序列、linker序列、靶向病原序列下游扩增引物；所述引物P1和所述引物P2的核苷酸序列分别与所述接头序列P1和所述接头序列P2相同，作为独立的引物形式存在；所述上游长引物混合物包括SEQID NO.1~40的40条引物，所述下游长引物混合物包括SEQ ID NO.41~80的40条引物，所述引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示，所述引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明独特的两步法扩增方法，第一步上游长引物单向扩增，保证每条扩增单链产物都是以投入的核酸作为扩增模板，不会产生以扩增产物为模板的扩增；第二步扩增添加UMI序列确保在后续的P1和P2指数扩增后可以通过合并相同标签的序列去除PCR偏好性，可以更准确的分析定量得出待测病原的丰度和比例。
2.本发明的独特引物结构设计，通过简单的扩增就可以完成建库环节，避免传统的核酸打断、末端修复、加A和接头连接等步骤，大大提高了建库效率，简化操作流程。
3.本发明的方法实现了与illumina Miniseq测序平台的配套开发，Miniseq通量低测序时间短，可以在5个小时完成测序，缩短了病原感染检测周期。
4.本发明由于是靶向扩增配合二代测序的方法学，所以测序数据量少，因此检测的成本也比同类方法学低。
5.本发明由于是高度特异靶向扩增病原微生物的基因组的核酸片段，所以无需对临床样本进行去人源操作，也不受人源DNA或者RNA的影响，减少操作的同时也避免了使用去人源宿主技术对病原比例的影响。
6.本发明虽然只开发了20种病原检测，但基于多重扩增技术实际可以增加到100种甚至更多病原种类，提高病原种类通量可以提供更多的信息给临床进行判断。
7.本发明由于采用了PCR扩增技术可以特异的对微弱信号进行放大，和宏基因组测序方法相比，对于低拷贝的或者难检测的真菌、胞内菌或者RNA病毒等病原检出效果显著。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的上游长引物和下游长引物的结构示意图和具体序列举例。
图2为本发明的两步扩增法的流程示意图。
图3为本发明实施例2的扩增磁珠纯化后的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图4为本发明的测序数据分析的流程示意图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的微生物鉴定方法具体包括如下步骤：
1.样本处理：
（1）采集运输：收集病人临床样本。
（2）前处理：按照样本类型要求进行提取前处理，如果是肺泡灌洗液样本需要进行破壁处理，如果是血液样本需要进行血浆分离处理。
（3）核酸提取：提取DNA/RNA。提取后的核酸检测浓度和纯度。
2.扩增前：
（1）引物池制作：将所需要鉴定的多种病原特异上游长引物和下游长引物分别按照等摩尔比例进行混合，得到上游和下游长引物池。
（2）RNA反转录：根据试剂盒说明书操作进行随机引物反转录生成cDNA第一条链。
3.扩增：
本发明用两步扩增完成文库构建，如图2所示，第一步扩增后不用进行磁珠纯化，扩增产物直接进行二次扩增，也不用切胶回收避免了操作过程中污染的可能。
（1）第一步的扩增使用上游长引物池进行单端扩增。上游长引物结构：接头序列P1、index序列（作用是区分不同样本）、测序引物1、靶向病原序列上游扩增引物。
（2）第二步扩增加入下游长引物在同一个反应里面扩增，还有两端引物P1和P2，一共三种引物组成二次扩增的引物（引物序列见序列表，P1和P2的核苷酸序列分别为SEQ IDNO.81和SEQ ID NO.82）。下游长引物的结构是：接头序列P2、测序引物2、8~15个随机碱基组成的分子标签UMI序列（作用是用于去除扩增引入干扰）、linker序列（2~5bp）、靶向病原序列下游扩增引物。上游长引物和下游长引物序列的结构如图1所示。
本发明长引物结构设计还包括单端或两端加分子标签（UMI），单端或双端加index序列和linker序列。
上游长引物还可以为如下结构：接头序列P1、index序列、测序引物1、index序列、靶向病原序列上游扩增引物，所述长引物的总长度为80~90 bp，所述index序列长度为8~10bp；所述接头序列P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示。
下游长引物还可以为如下结构：接头序列P2、分子标签UMI序列、linker序列、测序引物2、分子标签UMI序列、linker序列、靶向病原序列下游扩增引物，所述下游长引物的总长度为90~100 bp，所述分子标签UMI序列由8~15个随机碱基组成，所述linker序列的长度为2~5bp，碱基组成可变；所述接头序列P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。
4.质控QC
两步法扩增后的产物进行电泳检测。
5.纯化
（1）两次扩增后的产物用磁珠进行纯化，得到纯化文库。
（2）纯化后的测序文库进行精确定量和片段大小分析。
6.Pooling测序
按照测序平台要求稀释文库，以步骤5定量的结果为标准并根据数据量需要进行混样，采用IlluminaMiniseq SE150进行测序。
7.数据分析
对测序原始数据进行过滤，合并所有UMI重复而且序列重复的reads。然后进行数据库比对，确定检测的reads种属区分和定量分析。
实施例1本发明的病原微生物鉴定的流程
本发明的方法具体包括如下步骤：
1.样本处理：
（1）采集运输：收集病人临床样本，根据不同样本类型采用不同的采集和运输方式。
（2）前处理：按照样本类型要求进行提取前处理，如果是肺泡灌洗液样本需要进行破壁处理，如果是血液样本需要进行血浆分离处理。
（3）核酸提取：采用赛哲开发的DNA和RNA共提取试剂盒（粤穗械备20200771），按照说明书的步骤提取DNA/RNA。提取后的核酸使用nanodrop2000/qubit3.0检测样本的浓度和纯度。
2.扩增前：
（1）引物池制作：将所需要鉴定的20种病原特异上游长引物和下游长引物分别按照等摩尔比例进行混合，制作得到上游和下游长引物池。
（2）RNA反转录：根据试剂盒说明书操作进行随机引物反转录生成cDNA第一条链。
3.扩增：
本发明用两步扩增完成文库构建，流程如图2所示，第一步扩增后不用进行磁珠纯化，扩增产物直接进行二次扩增，也不用切胶回收避免了操作过程中污染的可能。
（1）第一步的扩增使用40条上游长引物池（引物的核苷酸序列见SEQ ID NO.1~40）进行单端扩增。上游长引物结构：接头序列P1、index序列（作用是区分不同样本）、测序引物1、靶向病原序列上游扩增引物。上游长引物总长度为80~90 bp，其中index序列是8~10 bp，本实施例采用8 bp。
第一步扩增PCR反应体系（22 μl）：
第一步扩增设定如下反应程序：
（2）第二步扩增加入40条下游长引物（引物的核苷酸序列见SEQ ID NO.41~80）在同一个反应里面扩增，还有两端引物P1和P2，一共三种引物组成二次扩增的引物。下游长引物的结构是：接头序列P2、测序引物2、8~15个随机碱基组成的分子标签UMI序列（作用是用于去除扩增引入干扰，本实施例采用10 bp）、linker序列（2~5bp均可，本实施例采用3 bp），靶向病原序列下游扩增引物。下游长引物总长度为90~100 bp，长引物和两端短引物扩增产物长度100~150bp之间。
第二步扩增PCR反应体系（50 μl）：
第二步扩增设定如下反应程序：
4.质控QC
两步法扩增后的产物取5-10 μl进行琼脂糖凝胶电泳检测。电泳图显示样本扩增条带大小与预期相符，而且条带明亮无非特异性扩增条带。
5.纯化
（1）两次扩增后产物用Beckman&Coulter公司的AMPureXP磁珠进行纯化，向反应体系中加入75 μl磁珠悬液，充分吹打混匀，室温放置5 min。吸取上清废弃，使用80%的乙醇洗两次，室温放置5min晾干磁珠，加入20 μl的lowTE洗脱磁珠得到纯化文库。
（2）纯化后的测序文库用Qubit3.0和Agilent2100进行精确定量和片段大小分析。
6.Pooling测序
按照测序平台要求稀释文库，以Qubit定量的结果为标准并根据数据量需要进行混样，采用IlluminaMiniseq SE150进行测序。
7.数据分析
对测序原始数据进行过滤，合并所有UMI重复而且序列重复的reads。然后进行数据库比对，确定检测的reads种属区分和定量分析。
实施例2多重扩增参考菌株研究
1.病原组成：本发明根据之前积累的数据以及一些公开的文献或研究报道，选择了20种呼吸道和血液感染常见的病原微生物作为研究对象，种类见下表：
2.参考菌株核酸制备：20种病原微生物的标准参考菌株全部购自广东省菌种保藏中心，在超净台里分别接种相应菌株于对应培养皿上,在各自适宜温度下培养12-24 h。挑取单个菌落，接种于5 ml液体培养基，过夜培养。取1ml菌液使用QIAamp DNA MicrobiomeKit按照说明书步骤进行提取核酸，提取好的核酸使用Qubit3.0和Agilent2100进行浓度和纯度测定，-20℃保存备用。
3.引物设计和验证：从公共数据库下载20种病原的全基因组参考序列，通过序列比对等生物信息学分析，筛选得到分散在基因组上的多个同源保守区域作为引物设计靶标，使用自主开发软件进行多重引物设计，每个病原分析得到2个特异代表该病原的靶标区域，每个靶标区域设计2对引物，一共40对特异引物，如下表所示：
扩增子长度保持在100 bp左右。设计好的40对引物，以参考菌株核酸为模板每种病原特异的两条引物进行单独扩增。
反应体系如下：
PCR反应程序如下：
结果所有菌株都能扩增出目的大小，明亮的单一条带产物，无非特异性扩增，并将扩增产物送Sanger测序确认。为了进一步验证引物的特异性将20种病原核酸进行混合作为扩增模板，进行单对引物扩增结果显示无非特异性扩增条带。
4.检出限研究
（1）长引物池：把测试过的引物序列加上接头序列形成长引物，然后进行合成。将合成好的40条上游长引物（40条上游长引物的核苷酸序列见SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.40）和40条下游长引物（40条下游长引物的核苷酸序列见SEQ ID NO.41~ SEQ ID NO.80）分别按照等摩尔比例混合，得到上游和下游长引物池，引物池要在震荡仪上充分混合。
（2）定量和稀释：对4株目标菌株金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、白色念珠菌的核酸进行绝对定量，然后依次梯度稀释到10
（3）扩增：使用两步扩增法进行扩增，扩增条件和步骤如下：
第一步扩增PCR反应体系（22 μl）：
第一步扩增设定如下反应程序：
第二步扩增PCR反应体系（50 μl）：
第二步扩增设定如下反应程序：
稀释梯度为10
（4）测序数据分析：下机数据的分析流程如图4所示：
使用Fastp软件将对测序下机数据进行过滤和质控，过滤后的reads和病原数据库进行比对，并用samtools软件输出比对结果。使用BWA分别和细菌和真菌的病原数据库比对，输出所有比对结果。然后再使用Fastp软件对相同UMI相同序列的reads进行合并，最后将合并后的比对结果进行注释，并统计每个病原菌的reads数。统计结果如下表：
从上表中可以看出本发明方法学检出极限是每毫升50个病原基因组拷贝，检出限很低，所以本方法可以达到较高的灵敏度。
实施例3多重扩增临床样本研究
为了说明本发明的方法比传统临床方法的灵敏度更高，进行了以下对比实验。
1.临床样本收集：
从合作医院ICU分别收集10例重症患者的肺泡灌洗液（BALF）和10例重症患者的血液样本，患者年龄35~80岁之间，男女各10例，SOFA评分1~13分之间。
2.样本处理：
所有20例样本都使用传统临床方法学鉴定：送检BALF和血液培养，抗体检测和qPCR检测。同一患者的另外一份标本进行本发明方法学前处理：
1）肺泡灌洗液：取0.5 ml样本先通过震荡仪+玻璃珠破壁处理30 min，然后采用赛哲核酸提取试剂盒（粤穗械备20200771）按照操作说明书进行提取。
2）血液：新鲜8 ml血液标本首先进行高速两步离心分离血浆，取3 ml血浆按照QiagencfDNAextractionkit的操作说明进行cfDNA提取。
3.扩增测序分析：同实施例1。
4.病原鉴定对比：
（B：肺泡灌洗液；P：血浆）
通过对比结果可以看出，临床常用方法检出的病原菌，本发明方法学全部检出（见B2、B4、B7、B10、P2、P3、P7、P9），其中B2和B10样本使用本发明的方法能检测到两种病原菌的混合感染，而临床常用方法只成功检出一种；临床常用方法没有检出的病原菌，本发明的方法也可以检出（见B1、B3、B6、B8、P4、P5）。此外由于培养失败或者检测种类有限漏掉的病原微生物，通过多重扩增测序可以也可以检出。因此本发明的方法是临床检测的有效补充。
实施例4本发明的方法制备的病原微生物检测试剂盒
试剂盒包括如下成份：DNA聚合酶、dNTP、上游长引物混合物、下游长引物混合物、引物P1、引物P2、水；所述上游长引物混合物包括SEQ ID NO.1~40的40条引物，所述下游长引物混合物包括SEQ ID NO.41~80的40条引物，所述引物P1的核苷酸序列如SEQ ID NO.81所示，所述引物P2的核苷酸序列如SEQ ID NO.82所示。
其中DNA聚合和dNTP为了节省加样步骤也可以作为混合物（Mix）存在于试剂盒中。首先提取临床样本，进行相应的前处理，之后提取核酸进行浓度和纯度测定，测定后的核酸作为模板。然后进行两步扩增。第一步扩增使用所述上游长引物混合物进行单端扩增；第二步扩增在第一步扩增的反应体系中加入所述下游长引物混合物，还有所述引物P1和P2，一共三种引物组成第二步扩增的引物；随后进行质控、纯化、高通量测序和数据分析，两步扩增后的步骤详见实施例1。本发明的试剂盒针对本发明实施例2的表格中提到的编号1~20的20种病微生物的检测，但是根据本发明的方法，可以针对其他病原微生物（如RNA病毒）设计特异的上游长引物和下游长引物来拓宽检测的范围。
综上所述，本发明两步扩增的方法，第一步上游长引物单向扩增，保证每条扩增单链产物都是以投入的核酸作为扩增模板，不会产生以扩增产物为模板的扩增；第二步扩增添加UMI序列确保在后续的P1和P2指数扩增后可以通过合并相同标签的序列去除PCR偏好性。本发明首次使用两步法多重扩增配合二代测序的方法在人呼吸道肺泡灌洗液样本和血液或血浆样本中检测到传统临床方法中鉴定不出的病原微生物，灵敏度高，检出极限是每毫升50个病原基因组拷贝，相比现有技术，快速简单，仅需5个小时就能够得到结果。本发明是靶向扩增配合二代测序的方法学，所以测序数据量少，因此检测的成本也比同类方法学低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO.1
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATCAAAGCGGATACCCAGT
SEQ ID NO.2
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTTGAGATGACCTGAGGACGA
SEQ ID NO.3
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGAGTCGCTTTTTCGGGACATC
SEQ ID NO.4
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCGAAATGGCGGTGGCGGTA
SEQ ID NO.5
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAATCGGGATATCCTTCGGTAA
SEQ ID NO.6
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTGCACTTCCACTCGAACTTG
SEQ ID NO.7
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTATGAGCACGTTGAGAGTTT
SEQ ID NO.8
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACTCTATCTCGAATGCGAACC
SEQ ID NO.9
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTAGCAGCACCTTAGCATCCT
SEQ ID NO.10
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTCTCTACCGGTCTAGTTGT
SEQ ID NO.11
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAAGACACCGAGACAGGG
SEQ ID NO.12
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCGACACTCGTTTCGCAGG
SEQ ID NO.13
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGAGTACCATGAGGCGCT
SEQ ID NO.14
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTATCTGTTGATCTTACGGAT
SEQ ID NO.15
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTCCCATACCACGCTCCACG
SEQ ID NO.16
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGATCCGGGATTGGGGAT
SEQ ID NO.17
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTACGTTCTCGTTGTAGGC
SEQ ID NO.18
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCAAACGACGCAACGTT
SEQ ID NO.19
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGACTTCCTCATAATCGT
SEQ ID NO.20
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAATTCGCACCTTCGAACG
SEQ ID NO.21
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGCTGTACGCGCGCTATTA
SEQ ID NO.22
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACAAGGCCTGAGCATGGC
SEQ ID NO.23
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCATGCGCAGGTTCTCGT
SEQ ID NO.24
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGTTCAGCTGGATCGGCAG
SEQ ID NO.25
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGTCTGACCTGATCTTGCGTA
SEQ ID NO.26
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTCATGCGACTACATGCACC
SEQ ID NO.27
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTGCCGGAGATGGTGAG
SEQ ID NO.28
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCAACACCATCTTATTGCTCCTTG
SEQ ID NO.29
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCTGTCGACACAAGCTCTTAATCA
SEQ ID NO.30
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACATTAAGTTATTGATGTCGGTTTCT
SEQ ID NO.31
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACGCTTCTGGTTGAACTCCAT
SEQ ID NO.32
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAACAAGGGGGTTTTGGCTG
SEQ ID NO.33
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTAGACTGCTTCTCGAACC
SEQ ID NO.34
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAAGGGCCGACGAACTCG
SEQ ID NO.35
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTCCGACTACGTCACCCCG
SEQ ID NO.36
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCATTTCAGCCAAATTTGCC
SEQ ID NO.37
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTTGGAAATGCACGCAGACT
SEQ ID NO.38
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAAAGCTGGCTACGTAAGGGA
SEQ ID NO.39
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGTAGCTGTTTTTATCGCGCT
SEQ ID NO.40
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGCACGGCGTATCCTATCG
SEQ ID NO.41
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGGGGATAACACCTTCAGGC
SEQ ID NO.42
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGCCTCCATCACCTCTAACCC
SEQ ID NO.43
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAACCATGGATGCTCAGCACGGA
SEQ ID NO.44
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGTGACGGCGAGATGTTCCT
SEQ ID NO.45
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGCCAATCACAGGCGGTGATG
SEQ ID NO.46
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACAAGCACTGGGTCAGAAGGT
SEQ ID NO.47
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAACTTTCCATTGCCTCGCGGTT
SEQ ID NO.48
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGGCGAAACCTTCGAGTTTAACG
SEQ ID NO.49
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGTGTCTCGTTTCCAACAGCTTT
SEQ ID NO.50
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGGACCACCAACTATGGCCG
SEQ ID NO.51
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACAGCAAGGACCTTAACAATG
SEQ ID NO.52
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGATGTGGCTCATCTCCAAGAGG
SEQ ID NO.53
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACTCATCTGCACCAGAATGAC
SEQ ID NO.54
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAAATACCACGGTACCGAGAT
SEQ ID NO.55
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGTTGCACGTGGCCTTTGC
SEQ ID NO.56
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAACTACGTATCGAGCCTTTTGGGTT
SEQ ID NO.57
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGGCTGCTCCTTCGTGCATC
SEQ ID NO.58
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGCGGTACTTGATTATGTCTACATCA
SEQ ID NO.59
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACGAGTGAATTGTAAGCTGTGCC
SEQ ID NO.60
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACTTAAGTCGTGGCCTACCAT
SEQ ID NO.61
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACATGACCAGCTGGATCAGGT
SEQ ID NO.62
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAACCTTGGTCAGCTGGTCCA
SEQ ID NO.63
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACATCGAAGGCCGCGACAT
SEQ ID NO.64
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGGCGAAAACTCGTAGTGCG
SEQ ID NO.65
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACATGACCAGCTGGATCAGGT
SEQ ID NO.66
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGGAAAATCTTCATTGGCTTTGGC
SEQ ID NO.67
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACCAACAGTGTAATAAGTAACTCGGC
SEQ ID NO.68
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGCGGTACTTGATTATGTCTATTCATC
SEQ ID NO.69
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACGGGGCAGAAGAGATAGAATCA
SEQ ID NO.70
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGATGCTGATAGGAGATAGGTTGGGTA
SEQ ID NO.71
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACCGACGGTCAGAAACTGGTC
SEQ ID NO.72
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACCGCACGCCATAAATCCCTTCACC
SEQ ID NO.73
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAATCAGTCGACAAATTAGACCCAAAA
SEQ ID NO.74
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAAGACGATGTCACCGGCGAAG
SEQ ID NO.75
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAGTGGTCAATATCGAATGCGTTTAAA
SEQ ID NO.76
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACACGCCATAAATCCCTTCACC
SEQ ID NO.77
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAACCGCTACAGCAAAGAAAGTTT
SEQ ID NO.78
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACGATATGATCGCGGTCGGAT
SEQ ID NO.79
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGAACAACTTATCGCACGTCTCCT
SEQ ID NO.80
AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNCGACAAAATCGTCATAAAAATCCAACCG
SEQ ID NO.81
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
SEQ ID NO.82
AATGATACGGCGACCACCGAGATC
SEQUENCE LISTING
<110> 广州赛哲生物科技股份有限公司
<120> 病原微生物鉴定的多重扩增配合高通量测序方法及试剂盒
<130> 2021.05.20
<160> 82
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 1
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctcatc aaagcggata cccagt 86
<210> 2
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 2
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctcctt gagatgacct gaggacga 88
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<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 3
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctagag tcgctttttc gggacatc 88
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<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttcga aatggcggtg gcggta 86
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 5
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctaatc gggatatcct tcggtaa 87
<210> 6
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctttgc acttccactc gaacttg 87
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 7
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttatg agcacgttga gagttt 86
<210> 8
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 8
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctactc tatctcgaat gcgaacc 87
<210> 9
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 9
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttagc agcaccttag catcct 86
<210> 10
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 10
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgtct ctaccggtct agttgt 86
<210> 11
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 11
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgaag acaccgagac aggg 84
<210> 12
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 12
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctctcg acactcgttt cgcagg 86
<210> 13
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 13
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttgag taccatgagg cgct 84
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<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttatc tgttgatctt acggat 86
<210> 15
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 15
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctttcc cataccacgc tccacg 86
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 16
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctggat ccgggattgg ggat 84
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 17
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctctac gttctcgttg taggc 85
<210> 18
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAAGTCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC
TCTCAAACGACGCAACGTT
<400> 18
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctctca aacgacgcaa cgtt 84
<210> 19
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 19
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctcgac ttcctcataa tcgt 84
<210> 20
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 20
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctaatt cgcaccttcg aacg 84
<210> 21
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 21
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttgct gtacgcgcgc tatta 85
<210> 22
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 22
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctacaa ggcctgagca tggc 84
<210> 23
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 23
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctccat gcgcaggttc tcgt 84
<210> 24
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 24
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttgtt cagctggatc ggcag 85
<210> 25
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 25
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctaagt ctgacctgat cttgcgta 88
<210> 26
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 26
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctattc atgcgactac atgcacc 87
<210> 27
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 27
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgctg ccggagatgg tgag 84
<210> 28
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 28
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttcaa caccatctta ttgctccttg 90
<210> 29
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 29
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttctg tcgacacaag ctcttaatca 90
<210> 30
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 30
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctacat taagttattg atgtcggttt ct 92
<210> 31
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 31
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgacg cttctggttg aactccat 88
<210> 32
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 32
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctaaac aagggggttt tggctg 86
<210> 33
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 33
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctccct agactgcttc tcgaacc 87
<210> 34
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 34
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctgaag ggccgacgaa ctcg 84
<210> 35
<211> 84
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 35
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatcttccg actacgtcac cccg 84
<210> 36
<211> 88
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 36
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctcagc atttcagcca aatttgcc 88
<210> 37
<211> 86
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 37
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctcttg gaaatgcacg cagact 86
<210> 38
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 38
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctcaaa gctggctacg taaggga 87
<210> 39
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 39
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctcgta gctgttttta tcgcgct 87
<210> 40
<211> 85
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 40
caagcagaag acggcatacg agatctaagt cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60
cgatctggca cggcgtatcc tatcg 85
<210> 41
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 41
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aggggataac accttcaggc 90
<210> 42
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 42
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg agcctccatc acctctaacc c 91
<210> 43
<211> 92
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 43
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aaccatggat gctcagcacg ga 92
<210> 44
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 44
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg agtgacggcg agatgttcct 90
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
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<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg agccaatcac aggcggtgat g 91
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<211> 91
<212> DNA
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<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 46
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acaagcactg ggtcagaagg t 91
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
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<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 47
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aactttccat tgcctcgcgg tt 92
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
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<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aggcgaaacc ttcgagttta acg 93
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<220>
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<222> (59)..(68)
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nnnnnnnncg agtgtctcgt ttccaacagc ttt 93
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<220>
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<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
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<220>
<223> Artificial sequence
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<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acagcaagga ccttaacaat g 91
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<220>
<223> Artificial sequence
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<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg atgtggctca tctccaagag g 91
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<220>
<223> Artificial sequence
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<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
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<220>
<223> Artificial sequence
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<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
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<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg agttgcacgt ggcctttgc 89
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
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<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 56
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aactacgtat cgagcctttt gggtt 95
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aggctgctcc ttcgtgcatc 90
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg agcggtactt gattatgtct acatca 96
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<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
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nnnnnnnncg acgagtgaat tgtaagctgt gcc 93
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<212> DNA
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<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 60
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acttaagtcg tggcctacca t 91
<210> 61
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 61
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acatgaccag ctggatcagg t 91
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<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 62
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aaccttggtc agctggtcca 90
<210> 63
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 63
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acatcgaagg ccgcgacat 89
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<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 64
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aggcgaaaac tcgtagtgcg 90
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<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 65
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acatgaccag ctggatcagg t 91
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<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 66
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aggaaaatct tcattggctt tggc 94
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<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 67
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg accaacagtg taataagtaa ctcggc 96
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 68
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg agcggtactt gattatgtct attcatc 97
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 69
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acggggcaga agagatagaa tca 93
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<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 70
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg atgctgatag gagataggtt gggta 95
<210> 71
<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 71
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg accgacggtc agaaactggt c 91
<210> 72
<211> 95
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 72
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg accgcacgcc ataaatccct tcacc 95
<210> 73
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 73
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aatcagtcga caaattagac ccaaaa 96
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<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 74
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aagacgatgt caccggcgaa g 91
<210> 75
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 75
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg agtggtcaat atcgaatgcg tttaaa 96
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<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 76
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acacgccata aatcccttca cc 92
<210> 77
<211> 93
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 77
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aaccgctaca gcaaagaaag ttt 93
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<211> 91
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 78
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acgatatgat cgcggtcgga t 91
<210> 79
<211> 92
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 79
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg aacaacttat cgcacgtctc ct 92
<210> 80
<211> 96
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (59)..(68)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 80
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatctnn 60
nnnnnnnncg acaaaatcgt cataaaaatc caaccg 96
<210> 81
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 81
caagcagaag acggcatacg agat 24
<210> 82
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Artificial sequence
<400> 82
aatgatacgg cgaccaccga gatc 24
机译： 用于高通量测序的CDNA代表性和类库的制备和扩增方法，使用其，试剂盒和自动化试剂盒的试剂盒
机译： 用于高通量测序的CDNA代表性和类库的制备和扩增方法，使用其，试剂盒和自动化试剂盒的试剂盒
机译： 用于高通量测序的CDNA代表性和类库的制备和扩增方法，使用其，试剂盒和自动化试剂盒的试剂盒
