一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法

摘要

本发明公开了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，其包括：根据血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质的初测浓度，在血浆样本中添加内标物，以使在血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质与内标物的质量比为(0.25～2.5)：1；然后将血浆样本用于液相色谱串联质谱分析；本发明建立了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，为血浆甲氧基肾上腺素类物质的检测提供一种高效、准确、精密和简便的标准比对方法或参考方法，可用于有证参考物质、室间质量评价物质和厂家主校准品等物质赋值，促进血浆甲氧基肾上腺素类物质检测的标准化。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体而言，涉及一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法。

背景技术

嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(pheochromocytoma and paraganglioma,PPGL)是分别起源于肾上腺髓质和肾上腺外交感神经链的肿瘤，主要合成和分泌大量儿茶酚胺。PPGL临床症状及体征主要有高血压、头痛、心悸、高代谢状态、高血糖和多汗等。PPGL患者长期高血压易导致严重的心、脑、肾损害或因突发严重高血压而导致危象，危及生命。有研究报道PPGL患病率为30万分之一，其中20％诊断为儿童和青少年。在这些诊断中，嗜铬细胞瘤约占80-85％，患病率为百万分之2-百万分之8，副神经节瘤约占15％，患病率为百万分之0.5。在普通门诊的成人高血压患者中PPGL的患病率为0.2％-0.6％，在儿童高血压患者中估计为1.7％，在肾上腺意外瘤中约占5％，尸检研究估计未诊断的PPGL患病率为0.05-0.1％。PPGL在高血压人群发病率高，未及时治疗可能会危及生命，在早期进行诊断治疗，预后良好，因此早期诊断和治疗PPGL是十分必要的。

PPGL的常规诊疗程序是先通过生化检查来定性诊断，再通过CT、磁共振成像等进行定位诊断，然后进行手术治疗。PPGL通过测定血、尿儿茶酚胺及其代谢物进行定性诊断，根据内分泌学会的指导方针，推荐诊断PPGLs的首选生化检验为血浆游离或尿分馏甲氧基肾上腺素类物质测量。有文献报道血浆游离甲氧基肾上腺素类物质诊断PPGL的敏感度及特异度优于尿分馏甲氧基肾上腺素类物质。血浆游离甲氧基肾上腺素类物质测定为临床诊断PPGL的一线筛查指标，术后血浆游离MNs水平可反映手术效果和早期发现肿瘤转移或复发，因此血浆游离甲氧基肾上腺素类物质检测在PPGL的筛查和诊断中具有重要的临床意义。

目前，甲氧基肾上腺素类物质的检测方法分为免疫分析法和高效液相色谱法两大类，免疫分析法包括放射免疫法(RIA)和酶联免疫法(ELISA)，其中RIA方法存在放射性污染，易受抗原抗体交叉反应影响；ELISA方法存在抗体纯度、非特异性结合和交叉反应等问题；高效液相色谱法、高效液相色谱与电化学法(HPLC-ECD)和液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)，其中HPLC-ECD方法需要耗时的样本准备和长时间的色谱运行，存在众多干扰；LC-MS/MS方法仪器设备昂贵，人员技术要求高，但其分辨率、选择性和灵敏度高。

现有调查计划结果显示血浆甲氧基肾上腺素类物质质谱法检测结果之间存在很大差异，未达到标准化和一致化，需要建立参考系统来推动其检测的标准化进程。目前JCTLM(Joint Committee for traceability in Laboratory Medicine)列表上没有甲氧基肾上腺素类物质检测的参考方法及有证参考物质，甲氧基肾上腺素类物质的参考系统处于空白阶段。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，可作为常规检测方法的标准比对方法或参考方法。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，其包括：根据血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质的初测浓度，在血浆样本中加入内标物，以使在血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质与内标物的质量为(0.25～2.5)：1；然后将血浆样本用于液相色谱串联质谱分析。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，其包括根据血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质的初测浓度，在血浆样本中添加内标物，以使在血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质与内标物的质量比为(0.25～2.5)：1；然后将血浆样本用于液相色谱串联质谱分析。本发明建立了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质测定方法，为血浆甲氧基肾上腺素类物质的检测提供一种高效、准确、精密、简便的标准比对方法或参考方法，可用于有证参考物质、室间质量评价物质和厂家主校准品等物质赋值，促进血浆甲氧基肾上腺素类物质检测的标准化。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为验证例4中甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的液相质谱色谱图；

图2为验证例6中人血浆样本中甲氧基肾上腺素的色谱图；

图3为验证例6中人血浆样本中甲氧基去甲肾上腺素的色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明实施例提供了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，其包括：根据血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质的初测浓度，在血浆样本中加入内标物，以使在血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质与内标物的质量比为(0.25～2.5)：1；然后将血浆样本(添加有内标物)用于液相色谱串联质谱分析。

本文中的“根据血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质的初测浓度”是指通过“现有的检测技术”检测血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质的浓度，获得一个粗略的初测浓度。

在一些实施例中，所述甲氧基肾上腺素类物质的初测浓度通过免疫分析法和高效液相色谱法中的任意一种方法获得；

所述免疫分析法包括：放射免疫法和酶联免疫法；

所述高效液相色谱法包括：高效液相色谱法、高效液相色谱与电化学法，以及液相色谱串联质谱法。

优选地，在进行液相色谱串联质谱分析时，所述测定方法还包括采用标准曲线法进行定量，所述标准曲线按照标准溶液与内标溶液的峰面积比为(0.20～0.30)、(0.45～0.55)、(0.70～0.80)、(0.95～1.05)、(1.4～1.6)、(1.9～2.1)和(2.4～2.6)进行制备。在一些实施例中，该峰面积比可以按照0.25、0.5、0.75、1、1.5、2和2.5进行制备。需要说明的是，上述“峰面积比”同质量比，可按照质量比进行操作。

在一些实施例中，对甲氧基肾上腺素类物质的初测浓度的精准度无特殊限制，由于血浆样本中甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的浓度差异不定，因此很难精准实现两个分析物与其相应内标的质量比例均为1：1，在一些实施例中，可以根据实际浓度，适当调整分析物质与其内标物的质量比，使质量比为(0.25～2.5)：1即可；该质量比优选为(0.5～2)：1，更优选为1:1。具体地，甲氧基肾上腺素类物质与内标物的质量比可以为0.25：1、0.5：1、0.75：1、1：1、1.25：1、1.5：1、1.75：1、2.0：1、2.25：1和2.5：1中的任意数值。

本文中的“标准溶液”同“标准品溶液”，在本发明实施例中，用于鉴别、检测、含量测定的标准物质。

本文中的“内标物”是指：将一个已知质量，样品中不含有的纯物质加入至待测样品溶液中，以此纯物质的量为参比，对比测定待测组分的含量，该纯物质称为内标物。

优选地，所述测定方法还包括标准溶液的制备和内标溶液的制备；在制备过程中，所述标准溶液和内标溶液均通过称量配制法进行配制。

本文中的“称量配制法”为通过天平准确称量物质的质量，来进行溶液的配制。发明人研究发现，相对于依照体积来配制的测定方法而言，采用“称量配制法”进行溶液的配制后，能够显著提高测定结果的精准度，具有意料不到的技术效果。

优选地，进行所述液相色谱串联质谱分析前，所述测定方法还包括：将添加有内标物的血浆样本经固相萃取后获得洗脱液，吹干复溶后，获得用于液相色谱串联质谱分析的待测样本。

优选地，在进行所述固相萃取前，所述测定方法还包括：将添加有内标物的血浆样本进行蛋白沉淀，将蛋白沉淀后的产物进行离心，将离心后的上清液进行所述固相萃取。在测定甲氧基去甲肾上腺素的过程中，增加蛋白沉淀步骤能够降低其固相萃取时存在的基质效应。

优选地，所述蛋白沉淀后的产物的离心条件为：10000～20000r·min

优选地，所述血浆样本与蛋白沉淀采用的沉淀剂的添加体积比为1：(2～20)。在一些实施例中，该添加体积比可以为1:20、1:19、1:18、1:17、1:16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3和1:2中的任意比例。具体地，在一些实施例中，沉淀剂的添加体积可以为0.8mL。

优选地，沉淀剂可选自：50％甲醇七水硫酸锌、乙腈和甲醇中的任意一种。优选地，所述沉淀剂为甲醇。当沉淀剂为甲醇时，可更有效地降低基质效应，且提取率更高。

优选地，所述固相萃取包括以下步骤：将所述上清液转移至固相萃取柱中，进行淋洗和洗脱。

优选地，所述淋洗时采用的淋洗液选自：水、乙腈、异丙醇以及15～25mmol/L乙酸铵中的至少一种。

优选地，所述淋洗包括：采用淋洗液1和淋洗液2依次进行淋洗。

其中，所述淋洗液1选自：水和15～25mmol/L乙酸铵中的任意一种；所述淋洗液2选自：乙腈和异丙醇中的任意一种。

优选地，所述淋洗液1为15～25mmol/L乙酸铵，所述淋洗液2为异丙醇。在这种设置下进行的淋洗，甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的信噪比较高。

优选地，所述洗脱时采用的洗脱液选自：乙腈和异丙醇的混合溶液、含1％～3％甲酸的甲醇、含1％～3％甲酸的甲醇-水(95:5)溶液、含1％～3％甲酸的乙腈，以及含1％～3％甲酸的乙腈-水(95:5)中的至少一种。需要说明的是，上述“含1％～3％甲酸的甲醇-水(95:5)溶液”中“(95:5)”为甲醇与水的体积比，可简写为1％～3％甲酸甲醇水，依次类推，“含1％～3％甲酸的乙腈-水(95:5)”中“(95:5)”为乙腈-水的体积比，可简写为1％～3％甲酸的乙腈水。

优选地，所述洗脱液为含1～3％甲酸的乙腈-水(95:5)溶液。选择该洗脱液进行洗脱时，甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的信噪比较高。

优选地，使用的分析色谱柱为苯基柱或酰胺基柱中的一种。

优选地，所述分析色谱柱为五氟苯基柱，具体可以选自岛津shim-pack PFPP色谱柱、飞诺美Kinetex F5色谱柱和Waters的X-bridge系列色谱柱中的任意一种。

优选地，所述五氟苯基柱为岛津shim-pack PFPP色谱柱，柱温为25～35℃，进样量为10～30μL；在一些实施例中，柱温可以为25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、35℃中的任意温度，进样量可以为10μL、15μL、20μL、25μL和30μL中的任意体积。

优选地，分析色谱柱采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱的条件为：

0～2.9min，流动相A的体积占比为98％→70％，流动相B的体积占比为2％→30％，流速为0.1～0.5mL/min；

2.9～4.8min，流动相A的体积占比为70％→5％，流动相B的体积占比为30％→95％，流速为0.1～0.5mL/min；

4.8～7.0min，流动相A的体积占比为5％→98％，流动相B的体积占比为95％→2％，流速为0.1～0.5mL/min。

流动相A和流动相B的体积占比随洗脱时间的改变而改变，上述“→”代表流动相的体积占比随时间的变化而变化。例如，“0～2.9min，流动相A的体积占比为98％→70％”代表0～2.9min的洗脱时间段内，流动相A的体积占比从98％变化至70％，流动相B的体积占比从2％变化至30％，流动相A和流动相B的总和为100％。

优选地，梯度洗脱的条件为：

0～2.0min，流动相A的体积占比为98％，流动相B的体积占比为2％，流速为0.2～0.4mL/min，流速优选为0.3mL/min；

2.0～2.9min，流动相A的体积占比为98％→70％，流动相B的体积占比为2％→30％，流速为0.2～0.4mL/min，流速优选为0.3mL/min。

2.9～3.8min，流动相A的体积占比为70％→5％，流动相B的体积占比为30％→95％，流速为0.2～0.4mL/min，流速优选为0.3mL/min；

3.8～3.9min，流动相A的体积占比为5％，流动相B的体积占比为95％，流速为0.2～0.4mL/min，流速优选为0.4mL/min；

3.9～4.8min，流动相A的体积占比为5％，流动相B的体积占比为95％，流速为0.2～0.4mL/min，流速优选为0.4mL/min；

4.8～4.9min，流动相A的体积占比为5％→98％，流动相B的体积占比为95％→2％，流速为0.2～0.4mL/min，流速优选为0.3mL/min；

4.9～7.0min，流动相A的体积占比为98％，流动相B的体积占比为2％，流速为0.2～0.4mL/min，流速优选为0.3mL/min；

优选地，所述流动相A为含有甲酸和甲酸铵的水溶液，在所述流动相A中，所述甲酸的终浓度为0.05％～0.15％，所述甲酸铵的终浓度为1～3mmol/L；所述流动相B为甲醇。该设置情况能进一步提高检测结果的信噪比。在一些实施例中，甲酸的终浓度为体积浓度，可选自0.05％、0.07％、0.09％、0.11％、0.13％和0.15％中的任意百分比。甲酸铵的终浓度可以选自1mmol/L、1.5mmol/L、2mmol/L、2.5mmol/L和3mmol/L中的任意浓度。

优选地，进行质谱分析时，质谱条件如下：雾化气：50～70psi，辅助气：50～70psi，气帘气：20～35psi，碰撞气：5～9psi，离子源温度为500～700℃，离子喷雾电压为4000～5000V；检测方式：正离子检测。

在一些实施例中，雾化气(Gas1)的压力可设为50psi、51psi、52psi、53psi、54psi、55psi、56psi、57psi、58psi、59psi、60psi、61psi、62psi、63psi、64psi、65psi、66psi、67psi、68psi、69psi和70psi中的任意数值；辅助气(Gas2)的压力可设为50psi、51psi、52psi、53psi、54psi、55psi、56psi、57psi、58psi、59psi、60psi、61psi、62psi、63psi、64psi、65psi、66psi、67psi、68psi、69psi和70psi中的任意数值；气帘气(CUR)的压力可设为20psi、21psi、22psi、23psi、24psi、25psi、26psi、27psi、28psi、29psi、30psi、31psi、32psi、33psi、34psi和35psi中的任意数值；碰撞气(CAD)的压力可设为5psi、6psi、7psi、8psi、9psi中的任意数值；离子源温度可设为500℃、550℃、600℃、650℃、700℃中的任意数值；离子喷雾电压可设为4000V、4100V、4200V、4300V、4400V、4500V、4600V、4700V、4800V、4900V和5000V中的任意数值。

优选地，所述质谱条件还包括：采用电喷雾离子源和多反应监测扫描模式，分析物定量离子对和定性离子对包括：甲氧基肾上腺素定量离子对为180.1/148.2；甲氧基肾上腺素定性离子对为180.1/165.3；甲氧基去甲肾上腺素定量离子对为166.0/134.1；甲氧基去甲肾上腺素定性离子对为166.0/121.1。

优选地，所述甲氧基肾上腺素类物质包括：甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素。

优选地，所述内标物选自3个及以上碳13标记或氘代的甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素同位素内标物。

优选地，所述内标物选自：甲氧基肾上腺素-d3和甲氧基去甲肾上腺素-d3中的至少一种。具体地，甲氧基肾上腺素的内标物为甲氧基肾上腺素-d3；所述甲氧基去甲肾上腺素的内标物为甲氧基去甲肾上腺素-d3。甲氧基肾上腺素-d3定量离子对为183.2/151.3；甲氧基肾上腺素-d3定性离子对为183.2/168.3；甲氧基去甲肾上腺素-d3定量离子对为169.1/137.1；甲氧基去甲肾上腺素-d3定性离子对为169.1/124.1。

使用本发明提供的检测方法检测甲氧基肾上腺素不存在明显的基质效应，能够有效避免多种潜在干扰物(如L-多巴、肾上腺素、L-酪氨酸、伪麻黄碱、麻黄碱、可可碱和咖啡因)对于检测结果的影响，提高甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的检测结果的精准性；甲氧基肾上腺素的检测限及定量限分别为0.38pg/g、1.55pg/g，甲氧基去甲肾上腺素的检测限及定量限分别为1.08pg/g、3.54pg/g，且检测的可重复性高，稳定性好，适于推广。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，使用同位素稀释液相色谱串联质谱法(ID-LC/MS/MS)检测人血浆甲氧基肾上腺素类物质，其包括以下步骤：

(一)、标准溶液的配制

(a)、标准储备液和工作液的配制

采用重量法进行配制。准确称取浓度为1mg/mL的标准溶液，加入稳定剂稀释成储备液；

采用同样的方式制备工作液；

储备液和工作液的浓度根据各步称量结果算得，本实施例中配制的储备液和工作液的浓度分别为1.6798μg/g和804.3055pg/g。

(b)、内标储备液和工作液的配制

准确称取内标粉末，加入稳定剂配制而成的内标母液浓度为20.61μg/g。采用与标准配制相同的方式制备内标储备液和工作液。本实施例中配制的内标储备液和工作液的浓度分别为193.21ng/g和898.54pg/g。

(二)校准曲线的配制

将上述配制的标准工作液与内标工作液按照标准与内标峰面积比为0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5设计取样量，在十万分之一天平上称取其精确质量。

(三)生物样本的处理

正式分析测定前，使用常规分析方法测定样本，得到所含甲氧基肾上腺素类物质大概的初测浓度。根据初测浓度，使用天平称量法称取0.02～0.4mL血浆和一定量的内标溶液至样本瓶中，并记录其精确质量，使血浆中甲氧基肾上腺素类物质与其相应内标的质量比为1：1(接近1:1)，在其他实施例中，可在0.25～2.5的范围内选择。

血浆样本与内标溶液充分混匀后加入800μL甲醇(沉淀剂)沉淀，震荡，15000r·min

(四)液相色谱条件

分析使用的色谱柱为岛津shim-pack PFPP(2.1×100mm,1.8μm)；流动相A为0.1％甲酸、2mmol/L甲酸铵水溶液，流动相B为甲醇；梯度洗脱条件见表1，整个分析时间为7min，进样体积为20μL，柱温为30℃，自动进样器温度为7℃。

表1液相梯度

(五)质谱条件

质谱检测采用电喷雾离子源和多反应监测扫描模式，质谱条件如下：雾化气：60psi，辅助气：65psi，气帘气：30psi，碰撞气：7psi，离子源温度为600℃，离子喷雾电压为4500V；检测方式：正离子检测。

分析物定量离子对和定性离子对包括：甲氧基肾上腺素和甲氧基肾上腺素-d3的定量离子对为180.1/148.2和183.2/151.3，去簇电压(DP)、入口电压(EP)、碰撞能量(CE)和出口电压(CXP)分别为70V、10V、24V和7V；甲氧基肾上腺素和甲氧基肾上腺素-d3的定性离子对为180.1/165.3和183.2/168.3，DP、EP、CE、CXP分别为70V、10V、22V和8V；甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素-d3的定量离子对为166.0/134.1和169.1/137.1，DP、EP、CE、CXP分别为40V、10V、23V和15V；甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素-d3的定性离子对为166.0/121.1和169.1/124.1，DP、EP、CE、CXP分别为40V、10V、24V和13V。

(六)数据处理

将标准与内标溶液的峰面积比对相应标准与内标的质量比做线性回归，求得标准曲线方程。将样本峰面积比代入标准曲线方程，根据样本及内标的质量，计算血浆样本中甲氧基肾上腺素类物质的浓度。

实施例2

本实施例提供了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，测定方法的步骤大致与实施例1提供的测定方法相同，区别在于步骤(三)中的设置参数，具体如下：

(三)生物样本的处理

正式分析测定前，使用常规分析方法测定样本，得到所含甲氧基肾上腺素类物质大概的初测浓度。根据初测浓度，使用称量配制法取0.2mL血浆和一定量的内标溶液至样本瓶中，并记录其精确质量，使血浆中甲氧基肾上腺素类物质与其相应内标的质量比为0.5：1。

实施例3

本实施例提供了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，测定方法的步骤大致与实施例1提供的测定方法相同，区别在于步骤(三)中的设置参数，具体如下：

(三)生物样本的处理

正式分析测定前，使用常规分析方法测定样本，得到所含甲氧基肾上腺素类物质大概的初测浓度。根据初测浓度，使用称量配制法取0.2mL血浆和一定量的内标溶液至样本瓶中，并记录其精确质量，使血浆中甲氧基肾上腺素类物质与其相应内标的质量比为1.5：1。

实施例4

本实施例提供了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，测定方法的步骤大致与实施例1提供的测定方法相同，区别在于步骤(三)中的设置参数，具体如下：

(三)生物样本的处理

正式分析测定前，使用常规分析方法测定样本，得到所含甲氧基肾上腺素类物质大概的初测浓度。根据初测浓度，使用称量配制法取0.2mL血浆和一定量的内标溶液至样本瓶中，并记录其精确质量，使血浆中甲氧基肾上腺素类物质与其相应内标的质量比为2:1。

对比例1

本对比例提供了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，测定方法的步骤大致与实施例1提供的测定方法相同，区别在于无内标加入。

对比例2

本对比例提供了一种血浆甲氧基肾上腺素类物质的测定方法，测定方法的步骤大致与实施例1提供的测定方法相同，区别在于非天平称量的方法配制标准溶液和取样，步骤(二)中校准曲线的配制方法和步骤(三)生物样本的处理中样本和内标的取样方法，具体如下：

(二)校准曲线的配制

将上述实施例1中配制的1.6798μg/g的储备液用移液器取样进行稀释配制，使用移液器精密量取30μL标准储备液加970μL稀释液(0.1％甲酸水)配制成浓度为50000pg/ml的工作液0，取200μL工作液0加800μL稀释液配制成浓度为10000pg/ml的工作液1，取500μL工作液1加500μL稀释液配制成浓度为5000pg/ml的工作液2，取200μL工作液2加800μL稀释液配制成浓度为1000pg/ml的工作液3，取200μL工作液3加800μL稀释液配制成浓度为200pg/ml的工作液4，取500μL工作液4加500μL稀释液配制成浓度为100pg/ml的工作液5，取500μL工作液5加500μL稀释液配制成浓度为50pg/ml的工作液6，取400μL工作液6加600μL稀释液配制成浓度为20pg/ml的工作液7。将工作液1-7作为校准曲线进行样本测定。

(三)生物样本的处理

使用移液器精密量取0.2mL血浆和0.2mL内标溶液至样本瓶中。其它操作步骤同实施例1。

验证例1

验证不同的蛋白沉淀剂对基质效应和提取率的影响。

设置一个参比对象组(标准组)，将甲氧基去甲肾上腺素类物质标准溶液及对应的内标溶液混合后直接进行质谱分析，内标在质谱中响应的绝对峰面积为A

通过实施例1提供的测定方法，根据C62-A设计实验，探究不同蛋白沉淀剂对基质效应和提取率的影响。采用同一种血浆样本，将沉淀剂作为变量设置4组试验组，试验组1不加蛋白沉淀剂，试验组2～4分别采用50％甲醇七水硫酸锌、乙腈和甲醇作为蛋白沉淀剂。每个试验组包括两种处理方式a和b。其中，a：样本进行前处理后加入与标准组等量的内标溶液进行质谱分析，内标的绝对峰面积为A

根据各组不同处理方式下内标的绝对峰面积，计算每组试验组的基质效应以及待测物质的提取率(蛋白沉淀效率)，具体请参照表2记载。

基质效应和提取率的计算公式分别为：

基质效应计算公式为：(A

提取率计算公式为：(A

表2不同蛋白沉淀剂对应的基质效应及提取率

由表2可知，当蛋白沉淀剂为甲醇时，可显著降低基质效应，提高甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素的提取率。

验证例2

淋洗液和洗脱液对信噪比的影响。

根据实施例1提供的测定方法，将淋洗液和洗脱液分别作为单一变量，设置多组试验组，对已知浓度样本中的甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素进行测定，具体参照表3。然后，对多组试验组的信噪比进行测定。

表3不同淋洗和洗脱溶液对应的信噪比

备注：表3中的括号中的比例均为体积比，乙腈：异丙醇(1：1)代表乙腈与异丙醇的体积比为1：1；2％甲酸甲醇水(95：5)是指2％甲酸甲醇与水的体积比为95:5，2％甲酸乙腈水(95：5)是指2％甲酸乙腈与水的体积比为95：5。

由表3可知，实施例1提供的淋洗液(1mL 20mmol/L乙酸铵和异丙醇)和洗脱液(1mL2％甲酸的乙腈-水(95：5)溶液)获得的信噪比较高。

验证例3

验证流动相A中的添加剂的浓度对信噪比的影响。

根据实施例1提供的测定方法，以流动相A中，甲酸以及甲酸铵的添加浓度作为单一变量设置多组试验组。然后，对已知浓度样本中的甲氧基肾上腺素和甲氧基去甲肾上腺素进行测定，计算多组试验组的信噪比。具体请参照表4。

表4不同添加剂浓度对应的信噪比

备注：MN为甲氧基肾上腺素的缩写；NMN为甲氧基去甲肾上腺素的缩写。

由表4可知，采用实施例1提供的流动相A能显著提高检测结果的信噪比。

验证例4

验证质谱系统对于检测结果的影响。

采用实施例1提供的测定方法，比较待测物在不同液相质谱系统(AB sciex6500plus三重四级杆质谱仪及Waters Acqiuty I class液相、AB sciex6500plus Qtrap质谱仪及Exion液相)上的响应。检测结果请参照图1。

图1中A为AB sciex 6500plus三重四级杆质谱仪及Waters Acqiuty I class液相的响应结果，图1中B为AB sciex 6500plus Qtrap质谱仪及Exion液相的响应结果。

图1中，出峰时间由前往后为甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素。由图1可知，AB sciex 6500plus三重四级杆质谱仪及Waters Acqiuty I class液相的相应结果明显高于AB sciex 6500plus Qtrap质谱仪及Exion液相的响应结果。

验证例5

验证潜在干扰物对实施例提供的测定方法的影响。

采用实施例1提供的测定方法对含有各潜在干扰物及甲氧基肾上腺素类物质的混合溶液进行分析，其中各潜在干扰物及甲氧基肾上腺素类物质的浓度均为2.5ng/mL。潜在干扰物分别为：L-多巴、肾上腺素、L-酪氨酸、伪麻黄碱、麻黄碱、可可碱和咖啡因。L-多巴、肾上腺素、L-酪氨酸、伪麻黄碱、麻黄碱、可可碱和咖啡因的保留时间依次为1.14min、1.18min、1.34min、3.86min、3.99min、4.03min、4.31min；检测的离子对m/z依次为198.1/152.1、166.1/107.0、182.1/165.1、166.1/133.1、166.1/133.1、181.0/138.1、195.1/138.1。

而甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的保留时间分别为1.31min、1.98min，检测的离子对为166.1/134.1、181.1/148.2。

由结果可知，上述七种潜在干扰物均不会影响甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素的准确测定。

验证例6

分别采用实施例1和对比例1的测定方法测定P1-P3血浆样本。

甲氧基肾上腺素的色谱结果请参照附图2。图2中A为实施例1的血浆样本中甲氧基肾上腺素的色谱结果，图2中B为实施例1的血浆样本中添加的甲氧基肾上腺素-d3的色谱结果。

采用对比例1的测定方法测定P1-P3血浆样本甲氧基肾上腺素的绝对基质效应分别为6％、23％和1％。采用实施例1的测定方法测定P1-P3血浆样本甲氧基肾上腺素的基质效应分别为-0.54％、-0.09％、-0.70％。

说明实施例1提供的测定方法经内标校正后血浆中甲氧基肾上腺素测定结果不存在明显的基质效应。

甲氧基去甲肾上腺素的色谱结果请参照附图3。图3中A为实施例1的血浆样本中甲氧基去甲肾上腺素的色谱结果，图3中B为实施例1的血浆样本中添加的甲氧基去甲肾上腺素-d3的色谱结果。对比例1测定P1-P3血浆样本甲氧基去甲肾上腺素的绝对基质效应分别为35％、26％和18％，实施例1的基质效应分别为-0.05％、-0.83％、-0.06％。

上述结果表明，虽然测定甲氧基去甲肾上腺素存在明显的绝对基质抑制效应，但采用本发明实施例1的方法(加入内标)可校正该基质效应。

验证例7

验证甲氧基肾上腺素类物质与加入内标的质量比例对加标回收率的影响。

按照实施例1的测定方法进行实验，以一种空白血浆(去激素血浆，经验证不含甲氧基肾上腺素类物质)为加样回收实验样本，分别向样本中加入甲氧基肾上腺素类物质的标准溶液和内标溶液，并记录其精确质量。设计3种加样回收样本，分别加入内标和相当于内标浓度50％、100％和200％的标准物质，使血浆中加入的甲氧基肾上腺素类物质与加入内标的质量比例分别为0.5：1、1：1和2:1。通过计算不同加标浓度的加样回收率来验证实施例1提供的测定方法的正确度。

加标回收率是指在没有被测物质的空白样品基质中加入一定量的标准物质，按样品的处理步骤分析，得到的结果与理论值的比值。

加标回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100％。不同加标量的测定结果请参照表5。

表5加标回收率(n＝6)

由结果可知，不同加标浓度的甲氧基肾上腺素加标回收率在98.3～101.7％之间，不同加标浓度的甲氧基去甲肾上腺素加标回收率在98.5～101.9％之间，见表5。

验证例8

验证甲氧基肾上腺素类物质与加入内标的质量比例对加标回收率的影响。

按照对比例2进行实验，以一种空白血浆为加标回收实验样本，采用移液器向样本中精密加入甲氧基肾上腺素类物质的标准溶液和内标溶液。设计3种加样回收样本，分别加入内标和相当于内标浓度50％、100％和200％的标准物质，使血浆中加入的甲氧基肾上腺素类物质与加入内标的质量比例分别为0.5：1、1：1和2:1。通过计算不同加标浓度的加标回收率来验证对比例1提供的测定方法的正确度。

加标回收率＝(加标试样测定值－试样测定值)÷加标量×100％。不同加标量的测定结果请参照表6。

表6加标回收率(n＝6)

由结果可知，不同加标浓度的甲氧基肾上腺素加标回收率在93.68～98.91％之间，不同加标浓度的甲氧基去甲肾上腺素加标回收率在93.09～107.05％之间，见表6，说明对比例2的方法正确度不如实施例1的方法正确度高。

验证例9

对实施例1提供的检测方法的检测限和定量限进行检测。

采用实施例1提供的测定方法，对甲氧基肾上腺素类物质标准溶液进行分析，其中甲氧基肾上腺素的浓度为3.20pg/g、甲氧基去甲肾上腺素的浓度为8.99pg/g；

由检测结果可知，当进样量为20μL时，甲氧基肾上腺素的信噪比为20.7：1，甲氧基去甲肾上腺素的信噪比为25.4：1，因此可推算出信噪比分别为3：1和10：1时的检测限和定量限，甲氧基肾上腺素的检测限及定量限分别为0.38pg/g、1.55pg/g，甲氧基去甲肾上腺素的检测限及定量限分别为1.08pg/g、3.54pg/g。

验证例10

验证测定方法的精密度。

采用实施例1提供的测定方法，对四种不同浓度水平的血浆样本(P1、P2、202013以及202014)中甲氧基肾上腺素以及甲氧基去甲肾上腺素进行检测。检测的精密度(以变异系数CV)如表7所示。

表7批内CV和批总CV(n＝9)

由结果可知，实施例1提供的测定方法测定四种不同浓度水平血浆样本甲氧基肾上腺素的批内CV为0.66％～1.05％，批总CV为0.71％～1.13％，甲氧基去甲肾上腺素的批内CV为0.43％～1.10％，批总CV为0.61％～1.42％。

验证例11

验证测定方法的精密度和正确度。

采用对比例2提供的测定方法，对四种不同浓度水平的血浆样本(P1、P2、202013以及202014)进行甲氧基肾上腺素以及甲氧基去甲肾上腺素进行检测。检测的精密度(以变异系数CV)和测定结果同验证例10结果的偏差，如表8所示。

表8批内CV和批总CV(n＝9)

由结果可知，对比例2提供的测定方法测定四种不同浓度水平血浆样本甲氧基肾上腺素的批内CV为4.27％～10.79％，批总CV为4.41％～9.62％，甲氧基去甲肾上腺素的批内CV为2.29％～3.78％，批总CV为2.84％～7.23％，甲氧基肾上腺素测定结果同验证例10的偏差为-0.45％～12.81％，甲氧基去甲肾上腺素测定结果同验证例10的偏差为3.27％～14.65％。结果说明对比例2方法的精密度和正确度均不及实施例1。

验证例12

验证实施例1提供的测定方法的相对扩展不确定度。

根据国际和国内的不确定度评估指南，本研究将测定不确定度分为两类：A类不确定度和B类不确定度。A类不确定度主要是对重复测定的不确定度分量进行评定。其他测定过程中如标准物质的纯度、称量配制法配制校准溶液的过程等引起的不确定度采用B类评估，根据A类与B类不确定度计算合成测量不确定度，扩展因子k取值2，计算扩展不确定度。

根据各不确定度分量，计算合成相对标准不确定度：

相对扩展不确定度的计算公式为：U(95％)＝2×U

采用实施例1对4种血浆样本(P1、P2、202013和202014)进行检测，具体不确定来源见表9和表10。

表9 ID LC/MS/MS方法测定血浆样本甲氧基肾上腺素的不确定度来源

表10 ID LC/MS/MS方法测定血浆样本甲氧基去甲肾上腺素的不确定度来源

计算获得甲氧基肾上腺素的相对扩展不确定度分别为2.56％，2.25％，1.88％，1.89％，甲氧基去甲肾上腺素的相对扩展不确定度分别为3.10％，2.34％，2.16％和1.73％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。