一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法

摘要

本发明属于生物分析技术领域，公开了一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，包括：采用强酸对血浆进行酸化处理，使药物呈游离状态，在加入强酸的同时加入大黄酸作为内标物；再采用水饱和正丁醇‑乙酸乙酯溶液或依次采用水饱和正丁醇、乙酸乙酯进行液液萃取，取上清液，氮气挥干溶剂，甲醇复溶，进样，采用液相色谱串联质谱检测吡咯喹啉醌的浓度。本发明能够有效测定给予PQQ补充剂后大鼠体内的浓度，具有提取方法简单，检测时间短，线性好，准确度高，精密度好，重现性好等特点。

说明书

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，涉及一种血浆中吡咯喹啉醌(pyrroloquinolinequinone,PQQ)的液相色谱串联质谱检测方法。

背景技术

吡咯喹啉醌是细菌脱氢酶氧化还原的辅助因子，被归类为维生素B家族的成员，广泛存在于多种微生物、植物中。人体和哺乳动物自身不能合成，通过饮食补充在体内多个组织中广泛分布。PQQ在哺乳动物中起着重要作用，包括防止肝脏、心脏和脑损伤，增强人成纤维细胞DNA的合成，促进神经生长因子的产生等。此外，它对由氢化可的松诱导造成胚胎性白内障具有防御作用并作为自由基清除剂；它还抑制淀粉样蛋白原纤维的形成并保护由C截短的α-突触核蛋白变体的毒性的特性，使其成为预防帕金森氏病的有效药物。考虑到PQQ具有多种的生理作用，作为补充剂剂量设定，多个药效和毒理实验在给药后，只是从生化指标进行判断是否产生毒性，并未测定体内浓度，因此有必要开发一种测定体内PQQ浓度的简单高效检测方法。

Mizuho Fukuda采用以下方法测定人血浆中PQQ浓度：200μL血浆样品加200μL1MNaH

Takeshi Kumazawa采用以下方法测定人体和大鼠体内血浆和组织中PQQ浓度：在1g或1mL生物样品(血浆、组织)加入4mL 1M HCl、50μL2-巯基乙醇、100μL 10％铁氰化钾、10mL正丁醇混匀后离心取上清；加入20mL正庚烷、1mL吡啶、0.1g NaCl、1mL蒸馏水，充分混匀离心取上清后挥干，用10mL0.1M HCl复溶，加入到Sep-Pak C18 cartridge固相萃取柱中，用20mL 1mM HCl洗脱杂质，再用3mL 5％吡啶水溶液洗脱PQQ，挥干，用100μLPTMA氢氧化物复溶在100℃加热15min使其与PQQ充分甲基化，1μL进样到GC-MS；使用

以上对于PQQ血浆样品提取方法包括固相萃取、衍生化、多次液液萃取，存在操作麻烦，耗时长，有机溶剂消耗较多，成本高、检测器不常用、分析时间长等缺点。

发明内容

本发明的目的是提供一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，该方法通过前处理简单有效的提取血浆中的PQQ，再在较短的测定时间内准确的检测血浆样品中的PQQ。

本发明的技术方案如下：

一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，包括：采用强酸对血浆进行酸化处理，使药物呈游离状态，在加入强酸的同时加入大黄酸作为内标物；再采用水饱和正丁醇-乙酸乙酯溶液或依次采用水饱和正丁醇、乙酸乙酯进行液液萃取，取上清液，氮气挥干溶剂，甲醇复溶，进样，采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测吡咯喹啉醌的浓度。

所述的强酸为磷酸、硝酸、盐酸或硫酸，磷酸的浓度为4％(质量分数)，硝酸的浓度为0.8mol/L，盐酸的浓度为0.5mol/L，硫酸的浓度为0.25mol/L；优选为4％磷酸。

优选的，所述的酸化处理为：将大黄酸溶解在4％磷酸中作为内标物，采用与血浆等体积的4％磷酸酸化血浆，使血浆中大黄酸的终浓度范围为250-500ng/mL，但是每批中所有样品保持大黄酸浓度一致。大黄酸的极性和分子量均与PQQ相似，符合内标物选择标准；大黄酸与PQQ采用相同酸化形式，不影响大黄酸检测；大黄酸提前加入到酸化剂中，与酸化剂同时加入血浆，简化操作步骤及减少误差，并实现未用

采用水饱和正丁醇-乙酸乙酯溶液进行液液萃取为：将酸化处理后的血浆和水饱和正丁醇-乙酸乙酯溶液混合，震荡，离心，取上清液，挥干溶剂，甲醇复溶。其中，所述的水饱和正丁醇-乙酸乙酯溶液中水饱和正丁醇和乙酸乙酯的体积比为1:0.5-1:1.5v/v，优选为1:1；所述的水饱和正丁醇-乙酸乙酯溶液和血浆的体积比为20:1。

依次采用水饱和正丁醇、乙酸乙酯进行液液萃取为：将酸化处理后的血浆和水饱和正丁醇-乙酸乙酯溶液混合，震荡，离心，取上清液，挥干溶剂，甲醇复溶，再加入乙酸乙酯萃取，震荡，离心，取上清液，挥干溶剂，甲醇复溶。其中，所述的水饱和正丁醇和血浆的体积比为20:1；所述的乙酸乙酯和血浆的体积比为20:1。

本发明中，离心的转速为18000rpm，离心的时间为5min。

液相色谱的条件为：Waters

优选的，流动相A：3mM乙酸二丁基铵水溶液，流动相B：乙腈。

质谱的参数为：离子源：电喷雾离子源，离子模式：负离子模式，监测模式：多反应监测。质谱检测器通过灵敏度高，进样量少，分析速度快，具有对PQQ和内标物特征离子分离和鉴定同时进行等优点实现体内微量PQQ药物浓度定量。

具体的，一种血浆中吡咯喹啉醌的液相色谱串联质谱检测方法，包括：取50μL血浆，采用与血浆等体积的含内标物大黄酸的4％磷酸对血浆进行酸化处理，采用20倍血浆体积水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)液液萃取，取800μL上清液，氮气挥干，300μL甲醇复溶，5μL进样分析，采用液相色谱串联质谱，获得PQQ峰面积与内标物峰面积的比值，根据标准曲线计算血浆中PQQ的浓度。

标准曲线的制备方法，包括：通过加入5μL浓度为50、100、200、500、1000、2000、5000ng/mL PQQ工作液到45μL空白血浆，制备得到PQQ终浓度为5、10、20、50、100、200、500ng/mL的血浆样品，采用与血浆样品等体积的含内标物大黄酸的4％磷酸对血浆进行酸化处理，采用20倍血浆体积水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)液液萃取，取800μL上清液，氮气挥干，300μL甲醇复溶，5μL进样分析，采用液相色谱串联质谱检测吡咯喹啉醌，以血浆样品中PQQ和内标物大黄酸的峰面积比值(y)为因变量，血浆样品中PQQ的终浓度为自变量(x)，进行最小二乘法(权重系数为1/x)回归运算，得到PQQ的标准曲线。

本发明的有益效果：

(1)、本发明利用色谱-质谱联用技术建立了复杂生物基质血浆中微量目标化合物PQQ的定量检测方法，能够有效测定给予PQQ补充剂后大鼠体内PQQ的浓度。血浆样品中PQQ样本前处理过程简单，所用试剂常规且成本低，便于操作。测定分析时间短，单次进样检测仅需6min，提高检测效率。具有提取方法简单，检测时间短的优点。

(2)、本发明方法对生物体液样本的取样量少，只需50μL样本体积即可完成检测。

(3)、水饱和正丁醇-乙酸乙酯溶液液液萃取方法可降低血浆中基质效应的干扰。流动相水相添加乙酸二丁基铵增加PQQ在色谱柱中的保留。

(4)、本发明使用内标法制作标准曲线定量PQQ，内标物可以校正样品处理和剔除人为操作、进样过程仪器检测产生的误差，使待测药物定量更准确。生物样品分析方法测定结果，线性回归方程为：y＝0.0122x+0.01(r＝0.9987)，PQQ在5-500ng/mL浓度范围内呈线性；定量下线5ng(S/N>10)，批内精密度和准确度分别为1.27-4.66％和87.29％-110.15％，批间精密度和准确度分别为1.68％-9.46％和90.95％-108.04％。日内精密度和准确度、日间精密度和准确度、基质效应和提取回收率均符合药典中生物样品定量分析方法验证指导原则。具有线性好，准确度高，精密度好，重现性好等特点。

附图说明

图1是PQQ和大黄酸(IS)在Synergi

图2是PQQ和大黄酸在Waters

图3是PQQ和大黄酸在Synergi

图4是PQQ的碎片离子图。

图5是甲醇空白进样和不含PQQ工作液的6份空白血浆样品色谱图；其中，A代表PQQ；B代表内标物大黄酸。

图6定量下线5ng/mL色谱图。

图7标准曲线100ng/mL色谱图。

图8是PQQ内标法测定标准曲线。

具体实施方式

大鼠血浆来源：SPF级SD大鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证：20201225Aazz0619000379)，重量180-200g，饲养一周后，股动脉取血到预先添加肝素抗凝的10mL EP管中，8000rpm离心5min，取上清，获得大鼠空白血浆。

PQQ工作液的配制：精确称取对照品PQQ，用适量的二甲亚砜溶解，加甲醇配制成终浓度为1mg/mL的PQQ储备液，用甲醇梯度稀释成浓度为50、100、200、500、1000、2000、5000ng/mL的一系列标曲所用工作液；终浓度为1mg/mL的PQQ储备液用甲醇稀释成终浓度为50、80、600、4500ng/mL工作液，用于精密度和准确度测定；终浓度为1mg/mL的PQQ储备液用甲醇稀释成终浓度为80、4500ng/mL工作液，用于考察提取回收率和基质效应；终浓度为1mg/mL的PQQ储备液用甲醇稀释成终浓度为8000ng/mL工作液，用于考察稀释稳定性。

大黄酸储备液配制：精确称取大黄酸粉末，用二甲亚砜溶解配制成终浓度为1mg/mL的大黄酸储备液。

4％磷酸溶液配制：取一定体积85％磷酸(分析纯)用超纯水稀释至终浓度为4％磷酸溶液。

4％磷酸(含500ng/mL内标大黄酸)配制：加入一定量的1mg/mL大黄酸储备液至一定体积4％磷酸溶液中稀释至终浓度为含500ng/mL大黄酸的4％磷酸溶液。

0.8mol/L硝酸(含500ng/mL内标大黄酸)配制：取一定体积16mol/L浓硝酸(分析纯)用超纯水稀释至终浓度为0.8mol/L硝酸溶液，加入一定量的1mg/mL大黄酸储备液至一定体积0.8mol/L硝酸溶液中稀释至终浓度为含500ng/mL大黄酸的0.8mol/L硝酸溶液。

0.25mol/L硫酸(含500ng/mL内标大黄酸)配制：取一定体积2.5mol/L硫酸(分析纯)用超纯水稀释至终浓度为0.25mol/L硫酸溶液，加入一定量的1mg/mL大黄酸储备液至一定体积0.25mol/L硫酸中稀释至终浓度为含500ng/mL大黄酸的0.25mol/L硫酸。

0.5mol/L盐酸(含500ng/mL内标大黄酸)配制：取一定体积11.5mol/L盐酸(分析纯)用超纯水稀释至终浓度为0.5mol/L盐酸溶液，加入一定量的1mg/mL大黄酸储备液至一定体积0.5mol/L盐酸中稀释至终浓度为含500ng/mL大黄酸的0.5mol/L盐酸。

水相配制：加一定量的0.5M乙酸二丁基铵溶液到一定体积的超纯水中配制为终浓度为含3mM乙酸二丁基铵超纯水作为水相。同样方式分别配制含2mM、5mM、10mM乙酸二丁基铵水相。

液相色谱仪型号：日本岛津高效液相色谱系统(LC-20A)。

质谱仪型号：AB SCIEX4000。质谱仪参数设定为：离子源：电喷雾离子源，离子模式：负离子模式，监测模式：多反应监测。设定源参数分别为：喷雾电压(IS)-4500V，辅助气氮气，辅助气1(GS 1)65Arb，辅助气2(GS 2)60Arb，辅助气加热温度(TEM)550℃，气帘气(CUR)35Arb，碰撞气(CAD)10Pa。PQQ的碎片离子见图4，PQQ(Q1：329.1、Q3：241.0；DP:-30V、CE：-20eV)，大黄酸(Q1：283.0、Q3：239.0；DP:-60V、CE：-19eV)。

实施例1酸化剂选择

采用Waters

基质效应和提取回收率考察方法：取六份不同大鼠的空白血浆样品。第一组：分别加入5μL80ng/mL、4500ng/mLPQQ工作液到45μL空白血浆中，配制成PQQ终浓度分别为8、450ng/mL的大鼠血浆样本，每个浓度同时平行制备六份，加50μL酸化剂(含500ng/mL大黄酸)酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，震荡5min，18000rpm离心5min，取上清，5μL进样分析。第二组：45μL空白血浆加入50μL酸化剂(含500ng/mL大黄酸)酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，分别加入5μL 80ng/mL、4500ng/mL PQQ工作液，震荡5min，每个浓度同时平行制备六份，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，震荡5min，18000rpm离心5min，取上清，5μL进样分析。第三组，以45μL超纯水代替45μL空白血浆，超纯水中加入50μL酸化剂(含500ng/mL大黄酸)，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，分别加入5μL 80ng/mL、4500ng/mL PQQ工作液，震荡5min，每个浓度同时平行制备六份，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，震荡5min，18000rpm离心5min，取上清，5μL进样分析。将第一组处理后所测得的PQQ平均峰面积，与第二组处理后所测得的平均峰面积相比，求算不同生物基质中PQQ的提取回收率；同时，将第二组处理后测得的PQQ平均峰面积，与第三组处理后测得的平均峰面积相比，求算不同生物基质中PQQ的基质效应。其中，色谱条件：色谱柱：Waters

采用0.8mol/L硝酸为酸化剂时，梯度洗脱：0–1.5min，5％B；1.5–2min，5–50％B；2–4.5min，50％B；4.5–5min，50-5％B；5–7min，5％B，PQQ保留时间3.29min，测得基质效应和提取回收率分别为76％和83％。

采用0.25mol/L硫酸为酸化剂时，梯度洗脱：0–1.5min，10％B；1.5–2min，10–50％B；2–3.5min，50％B；3.5–4min，50-10％B；4–6min，10％B，PQQ保留时间3.24min。测得基质效应和提取回收率分别为77％和93％。

采用0.5mol/L盐酸为酸化剂时，梯度洗脱：0–1.5min，5％B；1.5–2min，5–50％B；2–3.5min，50％B；3.5–4min，50-5％B；4–6min，5％B，PQQ保留时间3.28min。测得基质效应和提取回收率分别为100％和102％，但是PQQ响应低，且PQQ在色谱中有残留。

采用0.7mol/L磷酸为酸化剂时，梯度洗脱：0–2min，20％B；2–2.5min，20–50％B；2.5–4min，50％B；4–4.5min，50-20％B；4.5–6min，20％B。测得基质效应和提取回收率分别为88％和107％。

综合考虑基质效应和提取回收率，优选采用血浆样品(血浆样品体积为空白血浆和PQQ工作液体积之和)等体积4％磷酸(含500μg/mL大黄酸作为内标物)酸化血浆。

实施例2萃取试剂选择

采用血浆样品等体积4％磷酸(含500μg/mL大黄酸作为内标物)酸化血浆，酸化血浆后，考察不同样品前处理方式对PQQ在血浆中基质效应和提取回收率(基质效应和提取回收率考察方法同实施例1)的影响。采用Waters

前处理方式1：往血浆样品中加入300μL甲醇，18000rpm×5min离心两次，取150μL上清，5μL进样分析，测得基质效应和提取回收率约为35.01±5.21％和101.00±14.63％。

前处理方式2：往血浆样品中加入1mL乙酸乙酯(即血浆样品和乙酸乙酯的体积比为1:20)萃取PQQ，18000rpm离心5min，取800μL上清，氮气挥干，300μL甲醇复溶，18000rpm离心5min，取上清，5μL进样分析，测得基质效应和提取回收率分别为77.32±5.42％和92.60±18.04％。

前处理方式3：往血浆样品中加入1mL水饱和正丁醇(即血浆样品和水饱和正丁醇的体积比为1:20)萃取PQQ，18000rpm离心5min，取800μL上清，真空挥干仪挥干，甲醇300μL复溶，5μL进样分析，测得基质效应和提取回收率分别为77.43±5.42％和75.20±3.70％。

前处理方式4：往血浆样品中加入1mL水饱和正丁醇(即血浆样品和水饱和正丁醇的体积比为1:20)萃取，18000rpm离心5min，取800μL上清，真空挥干仪挥干，甲醇100μL复溶，再加入乙酸乙酯(即血浆样品和乙酸乙酯的体积比为1:20)萃取，18000rpm离心5min，取800μL上清，氮气挥干，300μL甲醇复溶，18000rpm离心5min，5μL进样分析，测得基质效应和提取回收率分别为98.26±4.34％和93.65±15.82％。

前处理方式5：往血浆样品中加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(水饱和正丁醇和乙酸乙酯的体积比＝1:1)液液萃取，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪吹干，18000rpm离心5min，300μL甲醇复溶，18000rpm离心5min，5μL进样分析，测得基质效应和提取回收率分别为84.40±4.58％和105.70±6.40％。

根据提取回收率和基质效应结果，依次采用水饱和正丁醇、乙酸乙酯萃取或者采用水饱和正丁醇-乙酸乙酯一次萃取，都能获得较好的效果。择优选择采用血浆样品20倍体积的水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)进行液液萃取，操作步骤相对简单，一次即可从酸化后的血浆样品中萃取出PQQ，且提取回收率高，基质效应干扰小。复溶体积选择300μL，既保证PQQ进样检测有高的信号响应强度，同时，可以多次取样进行测定。

实施例3不同色谱柱和流动相调节

加入5μL500 ng/mLPQQ工作液到45μL空白血浆中，加入50μL4％磷酸(含500ng/mL大黄酸内标物)酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，18000rpm离心5min，取上清，5μL进样分析。考察不同色谱柱和流动相变化对检测结果的影响。

Synergi

固定梯度洗脱程序为：0–2min，20％B；2–2.5min，20–50％B；2.5–4min，50％B；4–4.5min，50-20％B；4.5–6min，20％B，有机相为乙腈，考察水相添加不同浓度乙酸二丁基铵离子对试剂时，PQQ在Waters

综上，采用Waters

实施例4

采用与大鼠血浆等体积的4％磷酸酸化血浆，20倍体积水饱和正丁醇-乙酸乙(1:1v/v)混合萃取PQQ，室温氮吹仪吹干，300μL甲醇复溶，18000rpm离心5min，进样体积5μL，采用实施例3确定的色谱条件和质谱参数，对以上所建样品提取和检测方法进行方法学验证。

(1)、检测离子对：精密称定PQQ标准品，用适量二甲亚砜溶解后，加入甲醇配制成终浓度为1mg/mL储备液。1mg/mL储备液用甲醇稀释至PQQ浓度为1μg/ml的溶液，通过质谱全扫描和满足实际样品选择性要求选择性离子分别：PQQ(Q1:329.1，Q3:241.0)，去簇电压(DP)值为-30V、碰撞电压(CE)值为-20eV；大黄酸(Q1:283.0,Q3:239.0)，去簇电压(DP)值为-60V、碰撞电压(CE)值为-19eV。

(2)、专属性考察：用5μL甲醇代替PQQ工作液，取6份不同大鼠来源的45μL空白血浆，加入5μL甲醇，震荡混匀，加入50μL 4％磷酸酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，震荡5min，18000rpm离心5min，取上清，，5μL进样分析，得到色谱图(见图5)。结果表明，空白血浆中PQQ和内标检测响应值均较低，证明所建色谱串联质谱检测方法能够排除血浆基质中其它内源性组分对目标分析物PQQ和内标物大黄酸检测的干扰。本发明对于测定PQQ和内标物大黄酸专属性良好。

(3)、检测线性范围和检测线测定：精确称取一定量的对照品PQQ，用适量的二甲亚砜溶解，加甲醇配制成终浓度为1mg/mL的PQQ储备液，用甲醇稀释成50、100、200、500、1000、2000、5000ng/mL系列工作液，分别取上述工作液5μL，加入到45μL空白血浆中，采用50μL4％磷酸(含500ng/mL大黄酸内标物)酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，震荡5min，18000rpm离心5min，取上清，5μL进样分析。测得线性方程y＝0.0122x+0.018(r＝0.9987)，在5-500ng/mL浓度范围内呈线性，标准曲线见图8；其中定量下线5ng/mL浓度信号响应(S/N>10)见图6、标准曲线100ng/mL色谱图见图7。

(4)、准确度和精密度实验：选取定量下线(5ng/mL)，低(8ng/mL)、中(60ng/mL)、高(450ng/mL)4个浓度质控样品验证所建分析方法的精密度和准确度。分别加入5μL 50ng/mL、80ng/mL、600ng/mL、4500ng/mLPQQ工作液到45μL空白血浆中，配制成血浆终浓度为5ng/mL、80ng/mL、60ng/mL、4500ng/mL PQQ血浆样品，每个浓度平行测定6个样品，加50μL4％磷酸(含500ng/mL大黄酸内标物)酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，18000rpm离心5min，取上清，5μL进样分析。连续进3个分析批，根据每批随行标准曲线，回算每批每份质控血浆样品中PQQ的实测浓度，根据PQQ实测浓度与加入已知标准浓度相比，计算精密度和准确度。检测结果见表1，批内和批间精密度均小于10.0％(n＝6)，准确度在87.29％-110.15％。

表1.PQQ在大鼠血浆中日内和日间精密度准确度(n＝6)

(5)、基质效应和提取回收率：取六份不同大鼠的空白血浆样品。第一组：分别加入5μL80ng/mL、4500ng/mLPQQ工作液到45μL空白血浆中，配制成终浓度分别为8、450ng/mL大鼠血浆样本，每个浓度同时平行制备六份，加50μL 4％磷酸水溶液酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，18000rpm离心5min，取上清，5μL进样分析。第二组：45μL空白血浆加入50μL 4％磷酸水溶液酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，分别加入5μL 80ng/mL、4500ng/mL PQQ工作液，震荡5min,每个浓度同时平行制备六份，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，18000rpm离心5min，取上清，5μL进样分析。第三组，以45μL超纯水代替45μL空白血浆，超纯水中加入50μL 4％磷酸水溶液酸化，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，分别加入5μL 80ng/mL、4500ng/mL PQQ工作液，震荡5min。每个浓度同时平行制备六份，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，震荡5min，18000rpm×5min离心，取上清，5μL进样分析。将第一组处理后所测得的PQQ平均峰面积，与第二组处理后所测得的平均峰面积相比，求算不同生物基质中PQQ的提取回收率；同时，将第二组处理后测得的PQQ平均峰面积，与第三组处理后测得的平均峰面积相比，求算不同生物基质中PQQ的基质效应，结果见表2，基质效应值在95％-115％之间，符合生物样品定量分析方法验证指导原则所规定±15％范围，可认为血浆中内源性物质在本发明的样品前处理过程和色谱分离过程中不干扰PQQ测定。

表2.提取回收率和基质效应(n＝6)

(6)稀释稳定性：取5μL 8000ng/mLPQQ工作液，加入到45μL空白血浆中，配制成终浓度分别为800ng/mL大鼠血浆样本，同时平行制备六份，加50μL 4％磷酸(含500ng/mL大黄酸内标物)酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶；空白稀释液制备：取5μL甲醇加入到45μL空白血浆中，加50μL 4％磷酸(含500ng/mL大黄酸内标物)酸化血浆，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶。取100μL PQQ复溶样品，加入100μL空白稀释液，稀释1倍后，震荡5min，18000rpm离心5min，5μL进样分析，测定PQQ峰面积与内标峰面积比值为y值，代入标曲y＝0.0122x+0.01(r＝0.9987)，回测PQQ浓度392.01±20.46ng/mL，与标准的800ng/mL稀释1倍后理论值400ng/mL相比，其准确度为98.00±5.11％，结果符合生物样品定量分析方法验证指导原则所规定±15％范围，认为超过线性范围定量上线500ng/mL浓度的样品稀释一倍仍可定量检测。

实施例5PQQ定量检测

标准曲线制备：通过加入5μL浓度为50、100、200、500、1000、2000、5000ng/mL一系列PQQ工作液到45μL空白血浆(血浆中PQQ终浓度分别为5、10、20、50、100、200、500ng/mL)，加入50μL 4％磷酸(含500ng/mL大黄酸)酸化，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，18000rpm离心5min，取上清，取5μL进样；以每一个浓度所测定血浆中PQQ和内标物大黄酸的峰面积比值(y)为因变量，对应的PQQ终浓度为自变量(x)，进行最小二乘法(权重系数为1/x)回归运算，得PQQ在血浆中的标准曲线。

灌胃或静脉给予大鼠PQQ后，在给药后不同时间点眼眶采血，获得给药后血浆样品。取50μL给药后血浆样品，加入50μL 4％磷酸(含500ng/mL大黄酸)酸化，震荡5min，加入1mL水饱和正丁醇-乙酸乙酯(1:1v/v)，震荡5min，18000rpm离心5min，取800μL上清，室温氮吹仪挥干，300μL甲醇复溶，震荡5min，18000rpm离心5min，取上清，取5μL进样，采用液相色谱串联质谱，获得PQQ峰面积与内标物峰面积的比值，根据标准曲线计算血浆中PQQ的浓度。

液相色谱仪型号：日本岛津高效液相色谱系统(LC-20A)，Waters

质谱仪型号：AB SCIEX4000。质谱仪参数设定为：离子源：电喷雾离子源，离子模式：负离子模式，监测模式：多反应监测。设定源参数分别为：喷雾电压(IS)-4500V，辅助气氮气，辅助气1(GS 1)65Arb，辅助气2(GS 2)60Arb，辅助气加热温度(TEM)550℃，气帘气(CUR)35Arb，碰撞气(CAD)10Pa。

本实施例方法能够准确定量5-500ng/mL浓度，且高浓度样品按照实施例4(6)稀释一倍后测定范围在5-500ng/mL浓度范围内仍可准确定量，稀释后实测浓度乘以2为样品最终浓度。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。