高品质的培养肉、组合物及用于生产高品质的培养肉、组合物的方法

摘要

本发明涉及培养肉(cultured meat)(也被称为清洁肉(clean meat)或基于细胞的肉(cell‑based meat))的领域，具体涉及用于生产具有至少类似于全动物来源肉的感官特性(颜色、味道和香味)以及提高的营养价值的培养肉的细胞培养物。本发明还提供了用于生产细胞培养物和高品质的培养肉的培养基。

说明书

发明领域

本发明涉及培养肉(cultured meat)(也被称为清洁肉(clean meat)或基于细胞的肉(cell-based meat)或培植肉(cultivated meat))的领域，具体涉及用于生产具有至少类似于全动物来源的肉的感官特性(颜色、味道和香味)以及提高的营养价值的培养肉的细胞培养物。本发明还提供了用于生产细胞培养物和高品质的培养肉的培养基。

发明背景

许多消耗性资源被用来维持牲畜，特别是用于肉类生产的牛的生长，消耗性资源包括水、谷物、土地和能源。世界迅速增长的人口将导致所述无价资产的使用进一步增加。因此，以将缩小喂养整个人口所需要的非人类动物的生长的方式生产肉类和肉类产品是高度合意的。取代牛和家禽作为主要的肉类来源在伦理上也是有益的，因为它防止拥挤的居住者以及有时折磨牛和家禽对象的残酷条件。由于这些原因，出于人道主义原因而戒除肉的人也可能食用培养肉产品。培养肉也是控制消费食物含量的一种方式：如今，许多养殖动物被施用了生长激素和抗生素，它们最终出现在消费者的餐盘里。此外，通过控制蛋白质含量、脂肪量和组成，以及必需的微量元素和维生素，包括铁、维生素B12和锌，体外生产肉类能够提高肉类的营养价值并使其更健康。此外，食用在严格规定和受控条件下生产的肉类不太可能传播污染物，并且因此对于食用是更安全的。使培养的细胞在视觉上、营养上以及风味和香味上的特性至少类似于并潜在地提高肉类产品的特性，同时增加产品的安全性，是一项具有挑战性的任务。

来自类胡萝卜素家族的补充剂以其橙色/红色/棕色颜色而闻名。类胡萝卜素是由植物、藻类和光合细菌合成的超过600个天然存在的有机色素成员的家族。类胡萝卜素可以由所有这些生物体从脂肪和其他基本的有机代谢物组分(organic metabolic buildingblock)中产生。人类不能产生类胡萝卜素，但他们能够从其饮食中积累类胡萝卜素。

类胡萝卜素分为两类，叶黄素(其含有氧)和胡萝卜素(其是纯的碳氢化合物，并且不含有氧)。所有类胡萝卜素都是四萜类，意味着它们由8个异戊二烯分子产生，并且含有40个碳原子。含有未被取代的β-紫罗兰酮环的类胡萝卜素(包括β-胡萝卜素、α-胡萝卜素、β-隐黄质和γ-胡萝卜素)具有维生素A活性(意味着它们可以转化为视黄醇)。

非维生素A原(non-pro-vitamin-A)类胡萝卜素，包括来自胡萝卜素类的八氢番茄红素和六氢番茄红素类胡萝卜素，是目视有色的类胡萝卜素例如番茄红素的生物合成途径中的前体类胡萝卜素。类胡萝卜素长期被认为具有促进健康的特性，通常归因于其抗氧化和抗炎作用。番茄红素已经在用于培养干细胞的组合物中用作抗氧化剂(例如，美国专利申请公布第20160081917号和第20050260748号)。番茄红素也用作食品的外源着色剂。

维生素B12，也被称为钴胺素，包括多种形式，包括氰基钴胺素、甲基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素和羟基钴胺素。钴赋予这种水溶性维生素独特的红色。钴胺素是由牛和羊的瘤胃中的厌氧微生物合成的，并且人类通常食用来自动物产品的预先形成的钴胺素，这是饮食中B12的主要来源。钴胺素对于正常神经系统功能、同型半胱氨酸代谢和DNA合成至关重要(Truswell AS.Nutr Diet.2007.64(s4):S120–S125)。钴胺素不足可能导致血细胞的形态学改变以及血液学和神经学有害症状的发展。

铁是哺乳动物饮食中必需的微量营养素之一。它是红细胞(erythrocyte)(红细胞(red blood cell))中血红蛋白的组成部分，是在身体各处传输氧所必需的，并且以肌红蛋白的形式用于肌肉中氧的储存和使用(Geissler C等人-2011.Nutrients.3(3):283-316)。红肉中发现的铁的类型(血红素铁)比诸如坚果、种子和绿叶蔬菜的植物性食物中的铁(非血红素铁)更容易被身体吸收和利用。

铁补充剂是体内低水平铁的一种解决方案。补充剂中常用的铁形式包括亚铁盐和三价铁盐，诸如硫酸亚铁、葡萄糖酸亚铁、柠檬酸铁和硫酸铁。由于其较高的溶解度，膳食补充剂中的亚铁比三价铁更易被生物利用(Murray-Kolbe LE,Beard J.In:Coates PM,BetzJM,Blackman MR,等人,编辑.Encyclopedia of Dietary Supplements.第2版.London andNew York:Informa Healthcare；2010:432-438)。

甘氨酸亚铁是一种铁氨基酸螯合物。它是由亚铁和两分子的氨基酸甘氨酸通过共价键在称为螯合的过程中反应形成的。据称甘氨酸亚铁比常用的铁盐更好地改善铁吸收、储存和提高血红蛋白水平。(Bovell-Benjamin AC等人.2000.Am.J.Clin.Nutr.71:1563–1569；Layrisse M.等人.2000.J.Nutr.130(9):2195–2199&Erratum,12,3106)。甘氨酸亚铁已经在发展中国家的许多田间试验中用于食物的铁强化，提供在2mg/天和23mg/天之间的补充膳食铁，而没有任何不利作用的报告。此外，缺铁的幼儿、成年男性、妊娠女性和具有正常铁状态的非妊娠女性对使用甘氨酸亚铁的膳食铁补充剂(其提供约15mg铁/天至120mg铁/天)是良好耐受的。(The EFSA Journal(2006)299,1-17)。在强化或补充试验开始时缺铁的个体中，用甘氨酸亚铁治疗产生了血清血红蛋白和铁蛋白水平，以及总铁结合能力(TIBC)和铁储存的显著改善，而在铁充足的个体中没有铁过载的证据(Szarfarc S.C.等人.2001.Arch.Latinoam.Nutr.51:42–47)。

酵母提取物由酵母细胞的天然组分构成：蛋白质、氨基酸、碳水化合物、维生素和矿物质。为了生产酵母提取物，酵母细胞的内容物被酶分解，并且细胞壁被去除。酵母提取物是含有许多提供味道的组分(其中有谷氨酸及其衍生物)的一种食物成分。它提供了多种味觉增强特性。酵母提取物是一系列美味食品的受欢迎的风味来源，特别是当需要肉的香味时(Ames JM和Elmore JS.1992.Flavour Fragr J 7:89–103)。

瘤胃菌群提取物是多样的提取物的组，来源于构成牛瘤胃的菌群的确定或未确定的微生物。它们由酶促反应解聚。在牛中，瘤胃装载有负责将饲料消化成小的营养素以进一步吸收到牛的血流中的许多种类的细菌。细菌的高周转率使它们解聚的剩余物成为消化的饲料的一部分。培养畜群的瘤胃的特定菌群有助于其肉类产品的独特味道。

对培养肉产品的需求很大，培养肉产品可以替代肉类消费，而不会损害天然肉类的任何有益特性，并且提供接近实际食用肉类的食用体验。

发明概述

本发明提供了培养的非人类动物来源的细胞，其中所述细胞富集有外源性补充剂，该外源性补充剂为包含所述细胞的培养肉提供了“肉样”颜色和感官特性，并且提高了培养肉的营养价值。本发明还提供了用于生产培养的非人类动物来源的细胞的培养基、包含该培养基的培养肉以及包含该培养肉的产品。

本发明部分基于意外的发现，即在含有外源性补充剂类胡萝卜素(包括β-胡萝卜素、番茄红素、角黄素)和钴胺素(维生素B12)中的至少一种的培养基中培养牛来源的细胞导致补充剂在细胞中或在细胞上的摄取、积累和/或粘附，从而使细胞着色。此外，将包含至少一种类胡萝卜素和维生素B12的外源性补充剂的特定组合添加到牛来源的细胞的培养基中导致培养肉产品具有类似于屠宰肉的外观。进一步用铁和/或其盐、酵母提取物和矿物质(例如硒和锌及其盐)中的至少一种补充培养基进一步提供了肉样的风味和香味，以及丰富的营养价值。

应当明确理解，包含非人类动物来源的细胞的培养肉的基础成分不同于来自完整动物的肉的成分；本发明的教导提供了具有至少等同于、优选地优于全生物体来源的肉的营养品质的培养肉。

本发明的培养肉和包含培养肉的产品相比于目前使用的肉类是有利的，培养肉包含具有可控含量的外源性补充剂的非人类动物来源的细胞。本发明的产品是通过在细胞的培养期间施用所需量的补充剂，从而有效地控制补充剂在细胞中和/或在细胞上的摄取来实现的。此外，本发明的教导相比于先前已知的模拟肉类的产品是有利的，提供了包含非人类动物来源的细胞的培养肉，其中大部分细胞包含外源性补充剂，使得培养肉以及包含培养肉的产品具有添加到最终包含细胞的产品中的最少的食品级补充剂，并且可以满足“清洁标签”要求。

根据一个方面，本发明提供了一种非人类动物来源的细胞培养物，所述非人类动物来源的细胞培养物包含多于一个非人类动物来源的细胞，其中细胞的至少60％包含至少一种外源性补充剂，所述至少一种外源性补充剂选自由以下组成的组：至少一种天然着色剂、钴胺素(维生素B12)及其组合，其中细胞培养物的特征在于肉样颜色。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

应当明确理解，天然着色剂和维生素B12中的每一种可以有助于细胞的肉样颜色。

根据某些示例性实施方案，非人类动物来源的细胞包含至少一种天然着色剂和维生素B12的组合。

根据某些实施方案，细胞培养物的颜色类似于肌红蛋白的颜色。肌红蛋白的颜色取决于其氧化还原状态(AMSA Meat Color Measurement Guidelines,2012年12月修订)。

根据某些实施方案，细胞培养物的颜色是棕色。根据某些实施方案，细胞培养物的颜色是红色至亮红色。根据某些实施方案，细胞培养物的颜色是粉紫色。

根据某些示例性实施方案，细胞培养物的颜色在棕色至红色的范围内变化。根据这些实施方案，细胞培养物的细胞包含至少一种在从约300nm至约700nm的多于一个波长处具有吸光度的化合物。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含铁和/或其盐。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含至少一种另外的外源性补充剂，所述至少一种另外的外源性补充剂选自由以下组成的组：叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些示例性实施方案，非人类动物来源的细胞包含至少一种着色剂、维生素B12以及铁和/或其盐的组合。

根据某些实施方案，维生素D选自由维生素D

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约1mg/100g细胞至约500mg/100g细胞的维生素B12的量的多于一个细胞。根据一些实施方案，维生素B12是以从5mg/100g细胞至约100mg/100g细胞的量。

根据某些示例性实施方案，不饱和脂肪酸中的脂肪酸选自由以下组成的组：ω3[二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、α-亚麻酸(ALA)]；ω6[亚油酸(LA)；γ-亚麻酸(GLA)；十八碳三烯酸；花生四烯酸]；ω9[芥酸/顺式-13-二十二碳烯酸、油酸、反油酸]及其任何组合。根据某些实施方案，脂肪酸是饱和脂肪酸。根据某些示例性实施方案，饱和脂肪酸是硬脂酸(18:0)。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含至少两种或至少三种不饱和脂肪酸。

根据某些实施方案，天然着色剂是从至少一种非哺乳动物生物体获得的提取物。根据某些实施方案，非哺乳动物生物体选自由植物、真菌和藻类组成的组。

根据某些示例性实施方案，天然着色剂是类胡萝卜素。根据某些实施方案，类胡萝卜素选自由胡萝卜素和叶黄素组成的组。根据另外的实施方案，天然着色剂是花青苷。

根据一些实施方案，类胡萝卜素选自由α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、角黄素及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据一些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.1mg/100gr细胞至约100mg/100gr细胞的至少一种类胡萝卜素的量的多于一个细胞。

根据某些实施方案，类胡萝卜素选自由番茄红素、β-胡萝卜素、角黄素、胭脂素及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。根据某些示例性实施方案，类胡萝卜素是番茄红素。根据某些另外的示例性实施方案，类胡萝卜素是β-胡萝卜素。根据另外的某些示例性实施方案，类胡萝卜素是角黄素。根据另外的示例性实施方案，类胡萝卜素是胭脂素。根据另外的示例性实施方案，非人类动物来源的细胞包含番茄红素和角黄素的组合。

根据某些实施方案，培养物的非人类动物来源的细胞包含至少一种天然着色剂和维生素B12的组合。根据某些示例性实施方案，培养物的非人类动物来源的细胞包含至少一种类胡萝卜素和维生素B12的组合。根据某些目前示例性的实施方案，类胡萝卜素选自由β-胡萝卜素、番茄红素和角黄素组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据另外的示例性实施方案，非人类动物来源的细胞包含维生素B12、角黄素和番茄红素的组合。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约1mg/100g细胞至约100mg/100g细胞的β-胡萝卜素的量的多于一个细胞。根据一些实施方案，β-胡萝卜素是以从10mg/100g细胞至约50mg/100g细胞的量。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.1mg/100g细胞至约50mg/100g细胞的番茄红素的量的多于一个细胞。根据一些实施方案，番茄红素是以从1mg/100g细胞至约20mg/100g细胞的量。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约1mg/100g细胞至约100mg/100g细胞的角黄素的量的多于一个细胞。根据一些实施方案，角黄素是以从10mg/100g细胞至约50mg/100g细胞的量。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.01mg/100gr细胞至约50mg/100gr细胞的铁和/或其盐的量的多于一个细胞。根据某些实施方案，铁是以从约0.1mg/100gr细胞至约40mg/100gr细胞的量。根据某些实施方案，铁的量是从约0.5mg/100gr细胞至约5mg/100gr细胞。

根据某些实施方案，铁是选自由亚铁离子、三价铁离子、其盐和血红素组成的组的形式。根据某些示例性实施方案，铁是甘氨酸亚铁的形式。根据另外的示例性实施方案，铁是血红素的形式。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含锌和/或其盐。根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.1mg/100gr细胞至约10mg/100gr细胞的锌量的多于一个细胞。根据某些示例性实施方案，多于一个细胞提供从约0.5mg/100g细胞至约5mg/100g细胞的锌量。

根据本发明的教导，可以使用如本领域已知的测量非人类动物来源的细胞中外源性补充剂的量的任何方法。根据本发明的某些示例性实施方案，外源性补充剂是有色的，因此其从培养基中被摄取到细胞中和/或细胞上和/或其在细胞中或细胞上的量可以通过分光光度计在对于每种补充剂特定的波长处被测量。

应当明确理解，包含一定量的本发明的补充剂的一个细胞或多于一个细胞指的是在细胞内、细胞膜内、粘附到细胞膜或其他细胞部分及其任何组合处包含补充剂的细胞。

根据某些实施方案，本发明的外源性补充剂是食品级补充剂。外源性补充剂可以从天然来源分离，或者可以被合成。根据某些目前示例性的实施方案，外源性补充剂是食品级的，适合于人类食用。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞是多能干细胞(PSC)和/或由其分化的细胞。

根据另外的实施方案，PSC是从非人类动物体细胞重编程的诱导PSC(iPSC)和/或由其分化的细胞。

根据其他实施方案，PSC是非胚胎干细胞(ESC)。

根据其他实施方案，PSC是胚胎干细胞。

根据一些实施方案，非人类动物来源的细胞是分化为肌肉细胞的多能干细胞。根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞是分化为脂肪细胞(fat cell)(脂肪细胞(adipocyte))和/或其祖细胞的多能干细胞。根据一些实施方案，非人类动物来源的细胞是分化为基质细胞(结缔组织)和/或其祖细胞的多能干细胞。根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞是分化为内皮细胞(血管)和/或其祖细胞的多能干细胞。

根据一些实施方案，非人类动物来源的细胞是分化为肌肉细胞和/或其祖细胞的卫星细胞。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞选自由以下组成的组：肌肉细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞、周细胞、内皮细胞及其祖细胞。

根据某些实施方案，非人类动物选自由牛、羊、猪、家禽、贝类和鱼组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些示例性实施方案，非人类动物是牛。根据一些示例性实施方案，牛是物种牛(Bos Taurus)。

根据某些实施方案，上文描述的实施方案中的任一种的细胞培养物形成培养肉。培养肉可以由本发明的细胞培养物组成，或者它可以包含另外的化合物，包括但不限于支架。如本领域已知的用于培养肉的任何可食用支架都可以用于本发明的细胞培养物，包括可食用蛋白质支架、可食用水凝胶支架、可食用多糖支架等。根据一些实施方案，支架来源于植物、藻类或微生物。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，细胞培养物还包含至少一种另外的食品级补充剂。合适的另外的补充剂包括但不限于饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸；脂质；调味剂；着色剂；质地剂(texturant)；可食用纤维；等等。

根据某些示例性实施方案，培养肉包含非人类动物来源的细胞的组合，所述细胞包括肌肉细胞及其祖细胞；脂肪细胞及其祖细胞；基质细胞及其祖细胞；内皮细胞及其祖细胞。

根据另一个方面，本发明提供了非人类动物来源的细胞，其包含选自由至少一种天然着色剂、钴胺素(维生素B12)及其组合组成的组的至少一种外源性补充剂，其中牛来源的细胞的特征在于肉样颜色。

根据另外的方面，本发明提供了包含多于一个非人类动物来源的细胞的培养肉，其中细胞的至少60％包含选自由至少一种天然着色剂、钴胺素(维生素B12)及其组合组成的组的至少一种外源性补充剂，其中培养肉的特征在于肉样颜色。根据某些示例性实施方案，细胞培养物形成培养肉。

根据某些实施方案，外源性补充剂存在于选自由所述细胞内空间、膜内空间、细胞膜上及其任何组合组成的组的部位处。

细胞颜色和补充剂浓度如上文描述。

根据又另一个方面，本发明提供了用于培养非人类动物来源的细胞的富集的细胞培养液体培养基，该培养基包含选自由至少一种天然着色剂、氰钴胺(维生素B12)及其组合组成的组的至少一种补充剂，其中补充剂的量足以赋予非人类动物来源的细胞肉样颜色。

根据某些实施方案，细胞培养基包含含有至少一种着色剂和维生素B12的补充剂的组合。

根据某些实施方案，细胞培养基包含由至少一种着色剂和维生素B12组成的补充剂的组合。

根据某些实施方案，富集的细胞培养液体培养基的特征在于在约300nm和约700nm之间的多于一个波长处具有吸光度。

根据又另外的方面，本发明提供了用于培养非人类动物来源的细胞的富集的细胞培养液体培养基，该富集的细胞培养液体培养基包含至少一种天然着色剂和至少一种钴胺素(维生素B12)的组合。

根据某些实施方案，本发明的富集的培养基还包含选自由铁和/或其盐、酵母提取物、细菌提取物或其组合组成的组的补充剂。

至少一种天然着色剂如上文描述的。

根据一些实施方案，富集的细胞培养液体培养基还包含至少一种另外的补充剂，所述至少一种另外的补充剂选自由以下组成的组：叶酸、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种不饱和脂肪酸、至少一种饱和脂肪酸及其任何组合。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，维生素D选自由维生素D

根据某些示例性实施方案，不饱和脂肪酸选自由ω3脂肪酸、ω6脂肪酸、ω9脂肪酸及其任何组合组成的组。根据某些实施方案，富集的细胞培养液体培养基包含至少两种不饱和脂肪酸。根据某些另外的或可选择的实施方案，饱和脂肪酸是硬脂酸。

应当明确理解，如上文描述的培养基的补充剂是酵母提取物或细菌提取物中存在的补充剂之外的补充剂。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约0.1μg/ml至约50mg/ml的浓度的至少一种类胡萝卜素。

根据某些实施方案，培养基中的类胡萝卜素浓度为从约1μg/ml至约10mg/ml。根据某些示例性实施方案，富集的培养基包含以从约1μg/ml至约5mg/ml的浓度的至少一种类胡萝卜素。根据某些另外的示例性实施方案，富集的培养基包含以从约1μg/ml至约1.5mg/ml的浓度的至少一种类胡萝卜素。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约0.5mg/ml至100mg/ml的浓度的维生素B12。根据某些示例性实施方案，富集的培养基包含以从约1mg/ml至约50mg/ml的浓度的维生素B12。根据其他示例性实施方案，富集的培养基包含以从约1mg/ml至约15mg/ml的浓度的维生素B12。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约10μg/ml至约5g/ml的浓度的酵母提取物。根据某些示例性实施方案，富集的培养基包含以从约50μg/ml至约1g/ml的浓度的酵母提取物。根据某些示例性实施方案，富集的培养基包含以从约500μg/ml至约50mg/ml的浓度的酵母提取物。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约100μg/ml至约1,250μg/ml的浓度的铁和/或其盐。根据某些示例性实施方案，富集的培养基包含以从约100μg/ml至约1000μg/ml的浓度的铁盐。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约0.1μg/ml至约50μg/ml的浓度的锌或其盐。根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约0.1μg/ml至约15μg/ml的浓度的锌或其盐。

根据又另外的方面，本发明提供了一种用于生产以肉样颜色为特征的培养肉的方法，该方法包括在本发明的富集的培养基中培养非人类动物来源的细胞。

根据某些实施方案，富集的培养基包含至少一种天然着色剂、维生素B12、铁和/或其盐、酵母提取物、细菌提取物或其组合。根据这些实施方案，培养肉的特征还在于类似于非人类动物来源的肉的感官特性。

应当理解，本文公开的每个方面和实施方案的任何组合明确地涵盖在本发明的公开内容中。

本发明的其他目的、特征和优势从下文的描述和附图将变得清楚。

附图简述

图1展示了从培养基中到牛细胞中的β-胡萝卜素摄取。图1A：100μgβ-胡萝卜素/ml生长培养基的初始浓度。图1B：10μgβ-胡萝卜素/ml生长培养基的初始浓度。

图2示出了在含有750μg甘氨酸亚铁/ml生长培养基的培养基中孵育持续24小时的牛细胞内甘氨酸亚铁的积累。

图3示出了在含有1000μg氰钴胺素(Cbl)/ml生长培养基的培养基中孵育持续24小时的牛细胞内氰钴胺素(Cbl)的积累。

图4示出了暴露于反油酸和DHA的组合持续6天的BEF细胞的照片。脂滴(含有油红O)在细胞中呈现为深灰色斑点。

发明详述

近十年来，已经认识到对培养肉及其产品的需求，但是未获得高品质的、可负担得起的产品。本发明提供了将获得这样的产品的努力向前推进一步的组合物和方法，改善了形成培养肉的非人类动物来源的细胞培养物的生长率、味道、香味、颜色和营养价值。

为了方便和清楚起见，在本文中描述了本说明书、实施例和权利要求书中所用的某些术语。

定义

术语“清洁肉”或“培养肉”或“体外肉(in-vitro meat)”在本文中可互换地使用，以描述从体外非人类动物细胞培养物生长的肉，而不是来自屠宰的动物的肉。可以在本领域中用于描述从体外动物细胞培养物生长的肉的另外的术语包括实验室生长的肉(lab-grown meat)、试管肉(test tube meat)、试管牛排(tube steak)、合成肉(syntheticmeat)、细胞培养肉(cell-cultured meat)、组织工程化肉(tissue engineered meat)、工程化肉(engineered meat)、人工肉(artificial meat)、肉类似物(meat analog)和人造肉(manmade meat)。

如本文使用的，关于补充剂的术语“外源性”是指细胞从培养基中吸收的物质/化合物。外源性补充剂可以是天然存在于细胞内的化合物(内源化合物)，或非天然存在于非人类动物来源的细胞中的化合物(异源化合物)。

如本文使用的，术语“天然着色剂”是指可以在包括植物、藻类、真菌等的天然来源中发现的色素。应当明确理解，本发明的天然着色剂可以来源于天然来源，或者可以化学合成。

单独使用时的术语“肉”；“肉样”；和“非人类动物来源的肉”在本文中可互换地使用，并且是指来源于包括牛、羊、猪、家禽、贝类和鱼的非人类动物的肉。

如本文使用的，关于肉和/或培养肉的术语“感官特性”是指纯肉/培养肉的外观、味道、香味和质地。

如本文使用的，术语“多能干细胞(PSC)”是指可以无限繁殖，以及产生身体中的所有其他细胞类型的细胞。

如本文使用的，术语“诱导多能干细胞(iPSC)”是指可以通过重编程过程从分化的细胞直接产生的多能干细胞类型。

如本文使用的，术语“胚胎干细胞(ESC)”是指来源于胚泡的多能干细胞类型。

术语“重编程”是指一种特定细胞类型向另一种特定细胞类型的转化。根据本发明的某些实施方案，重编程是将体细胞类型转化为被称为诱导多能干细胞或iPSC的多能干细胞类型。

根据一个方面，本发明提供了包含多于一个非人类动物来源的细胞的细胞培养物，其中细胞的至少60％包含选自由至少一种天然着色剂、钴胺素(维生素B12)及其组合组成的组的至少一种外源性补充剂，其中细胞培养物的特征在于肉样颜色。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，细胞的至少60％还包含外源性铁或其盐。

根据某些实施方案，细胞培养物的非人类动物来源的细胞包含至少一种天然着色剂和维生素B12的组合。根据某些示例性实施方案，细胞培养物的非人类动物来源的细胞包含至少一种天然着色剂、维生素B12以及铁或其盐的组合。

根据某些实施方案，多于一个非人类动物来源的细胞的至少60％包含至少一种外源性补充剂。根据某些实施方案，多于一个非人类动物来源的细胞的至少65％、70％、75％、80％包含至少一种外源性补充剂。根据其他实施方案，多于一个非人类动物来源的细胞的至少85％包含至少一种外源性补充剂。根据又另外的实施方案，多于一个非人类动物来源的细胞的60％-100％包含至少一种外源性补充剂。根据其他实施方案，多于一个非人类动物来源的细胞的60％-90％、或60％-80％或60％-70％包含至少一种外源性补充剂。

根据某些实施方案，本发明提供了非人类动物来源的细胞，其包含选自由至少一种天然着色剂、钴胺素(维生素B12)及其组合组成的组的外源性补充剂，其中非人类动物来源的细胞的特征在于肉样颜色。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含铁或其盐。

根据某些实施方案，本发明提供了非人类动物来源的细胞，其包含选自由至少一种天然着色剂、钴胺素(维生素B12)、铁或其盐、酵母提取物及其任何组合组成的组的外源性补充剂，其中非人类动物来源的细胞的特征在于肉样颜色。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，本发明提供了包含多于一个非人类动物来源的细胞的培养肉，其中细胞包含至少一种外源性补充剂，所述至少一种外源性补充剂选自由至少一种天然着色剂、钴胺素(维生素B12)及其组合组成的组，其中培养肉的特征在于肉样颜色。根据一些实施方案，培养肉包含多于一个非人类动物来源的细胞，其中细胞还包含铁或其盐。根据又另外的实施方案，培养肉包含多于一个非人类动物来源的细胞，其中细胞包含至少一种外源性补充剂，所述至少一种外源性补充剂选自由至少一种天然着色剂、钴胺素(维生素B12)、铁或其盐、酵母提取物及其任何组合组成的组，其中培养肉的特征在于肉样颜色。根据某些示例性实施方案，多于一个非人类动物来源的细胞形成培养肉。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，细胞培养物和/或培养肉的颜色类似于肌红蛋白的颜色。根据某些实施方案，细胞培养物和/或培养肉的颜色类似于瘦肉切片。根据某些实施方案，细胞培养物和/或培养肉的颜色类似于屠宰肉。根据某些实施方案，细胞培养物和/或培养肉的颜色是棕色。根据某些实施方案，细胞培养物和/或培养肉的颜色是红色至亮红色。根据某些实施方案，细胞培养物和/或培养肉的颜色是粉紫色。

根据某些示例性实施方案，细胞培养物和/或培养肉的颜色在棕色至红色的范围内变化。

根据某些实施方案，细胞培养物和/或培养肉的非人类动物来源的细胞还包含选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合组成的组的外源性补充剂。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，维生素D选自由维生素D

到达反刍动物的肠的脂肪酸的分布将与动物所食用的脂肪酸的分布非常不同。这是因为由于细菌活动在瘤胃中发生了广泛的生物氢化作用(Drackley,J.K.Overview ofFat Digestion and Metabolism in Dairy Cows；University of Illinois:Urbana,IL,USA,2007；第1-9页)。有利地，本发明的教导能够控制由非人类动物来源的细胞摄取的脂肪酸分布，并且因此提供具有预设的所需脂肪酸分布的培养肉及其产品。

根据某些实施方案，脂肪酸是选自由以下组成的组的不饱和脂肪酸：ω3脂肪酸，包括但不限于DHA、EPA和ALA；ω6脂肪酸，包括但不限于LA、GLA、十八碳三烯酸和花生四烯酸；ω9脂肪酸，包括但不限于芥酸/顺式-13-二十二碳烯酸、油酸和反油酸；及其任何组合。根据某些实施方案，脂肪酸是饱和酸。根据一些实施方案，饱和酸是硬脂酸。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

硬脂酸是一种独特的饱和脂肪酸，与食物中发现的增加血液中胆固醇的浓度的其他饱和脂肪酸相比，硬脂酸具有不同的作用并且不会导致血脂的增加。

根据某些实施方案，细胞培养物和/或培养肉的非人类动物来源的细胞还包含至少两种脂肪酸。

将培养肉产品引入市场的一个障碍是其外观，因为消费者在寻找熟悉的肉类外观。本发明的培养的非人类动物来源的细胞包含天然着色剂和维生素B12中的至少一种，它们为细胞提供模拟全动物来源的肉的颜色。此外，选择这些特定的着色化合物是由于除了它们的颜色之外，它们对消费者还有有益的价值。

肉的颜色可以通过几种方法来测量。新鲜动物来源的肉的颜色主要由三种肉类色素的相对比例决定：紫色还原肌红蛋白(Mb)、红色氧合肌红蛋白(MbO

可选择的方法不是基于在特定波长处的吸光度，而是基于三刺激值的测量，也被称为CIE系统。这是一种比色方法，其被设计成通过模拟人眼-大脑感知来执行一种类型的心理物理样品分析。该方法是基于人眼的三原色感受器，被定量为L*a*b*的坐标值。较大的a*/b*比率(或b*/a*降低)指示更红，并且变色越少(Setser,C S.1984.J.Food Qual.6:183–197)。L*：亮相对于暗，其中低数字(0-50)指示暗，并且高数字(51-100)指示亮。

a*：红色相对于绿色，其中正数指示红色，并且负数指示绿色。

b*：黄色相对于蓝色，其中正数指示黄色，并且负数指示蓝色。

L*C*h颜色空间类似于L*a*b*，但是它使用圆柱坐标而不是直角坐标以不同的方式描述颜色。

在该颜色空间中，L*指示亮度，C*表示色度(颜色饱和度)，并且h是色相角(0°-360°)。

C*：颜色饱和度-标度0-100。较高的值表示样品中较高的色素量。

h标度：色相角(0°-360°)。约0°(＝360°)的h值指示红色；约180°的h值指示蓝色。

色度和色相是从L*a*b*中的a*和b*坐标计算的。亮度(ΔL*)、色度(ΔC*)和色相(ΔH*)的差值可以是正(+)或负(-)。它们被表示为：

ΔL*(L*样品减去L*标准)＝亮度和暗度的差：

(+)＝较亮，(-)＝较暗；

ΔC*(C*样品减去C*标准)＝色度的差：

(+)＝较明亮，(-)＝较暗淡；

ΔH*(H*样品减去H*标准)＝色相的差。

根据本发明的教导，可以使用如本领域已知的用于测量本发明的非人类动物来源的细胞培养物和/或培养肉的颜色的任何方法。

根据某些实施方案，细胞培养物包含至少一种在从约300nm至约700nm的一个波长或多于一个波长处具有吸光度的化合物。钴胺素(维生素B12)吸收峰在361nm；β胡萝卜素吸收峰在450nm、480nm和520nm；番茄红素吸收峰在360nm、443nm、471nm、502nm；角黄素峰在480nm。

根据本发明的教导，可以使用如本领域已知的用于测量天然着色剂色素或提供颜色的化合物的光谱吸收的任何方法。

根据一些实施方案，如本领域已知的，通过化学反应和/或HPLC和/或UPLC测量着色化合物的含量。

根据一些实施方案，首先从细胞中提取色素，并且通过分光光度计测量色素提取物的吸光度。根据其他实施方案，色素提取物的吸光度通过色度计测量。

根据某些示例性实施方案，天然着色剂是类胡萝卜素。

根据某些示例性实施方案，为根据本发明的教导的非人类动物来源的细胞培养物和/或培养肉提供颜色的类胡萝卜素选自由以下组成的组：α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、番茄红素、茜草黄质(cryptomonaxanthin)、别黄素(alloxanthin)、玉米黄质、紫黄质、α-zetcarotene、十氢番茄红素(lycopersene)、六氢番茄红素(hexahydrolycopene)、圆酵母素(torulene)、梳黄质(cynthiaxanthin)、蛤黄质(pectenoxanthin)、甲壳黄素、尬赞黄素(gazaniaxanthin)、羟基绿硫菌烯(OH-chlorobactene)、绿藻黄素、叶黄素、番茄黄素、玫红品(Rhodopin)、玫红品醇(rhodopinol)(warmingol)、腐菌黄素、颤藻黄素、草分枝杆菌叶黄素(phleixanthophyll)、紫菌红醇、球形烯、硅甲藻黄素、黄体黄质、玉米黄质、柠黄质、玉米黄质呋喃氧化物(zeaxanthin furanoxide)、neochrome、foliachrome、金莲花色素(trollichrome)、无隔藻黄素(vaucheriaxanthin,)、玫红品醛(rhodopinal)、warmingone、圆酵母红素醛(torularhodinaldehyde)、红酵母红素(torularhodin)、红酵母红素甲酯、虾红素、虾青素、角黄素(束生藻色素乙(aphanicin))、斑蝥黄素(chlorellaxanthin)、辣椒红(capsanthin)、辣椒红素(capsorubin)、隐辣椒质(cryptocapsin)、2,2’-二酮螺菌黄素(2,2’-diketospirilloxanthin)、海胆烯酮、3'-羟基海胆烯酮、屈曲黄素(flexixanthin)、3-OH-角黄素(金盏花红素、phoenicoxanthin)、羟基球形烯酮(hydroxyspheriodenone)、奥克酮(okenone)、扇贝醇酮(pectenolone)、phoeniconone(脱氢金盏花红素)、芬妮黄酮(phoenicopterone)、玉红黄素酮(rubixanthone)、sphonaxanthin、虾红素(astacein)、岩藻黄素(fucoxanthin)、酸浆果红素(physalien)、管藻素(siphonein)、β-阿朴-2'-胡萝卜素醛(β-apo-2'-carotenal)、阿朴-2-番茄红素醛(apo-2-lycopenal)、阿朴-6’-番茄红素醛、玄参红酸醛(azafrinaldehyde)、胭脂素(bixin)、枳橙黄素(citranaxanthin)、藏红花酸(crocetin)、藏红花酸半醛(crocetinsemialdehyde)、藏红花素(crocin)、霍普斯金叶黄素(hopkinsiaxanthin)、甲基阿朴-6’-番茄红酯(methyl apo-6'-lycopenoate)、paracentrone、sintaxanthin、珊瑚红素(actinioerythrin)、多甲藻黄素(peridinin)、pyrrhoxanthininol、半-α-胡萝卜素酮、半-3-胡萝卜素酮、臭橘黄素(triphasiaxanthin)、退类胡萝卜素(retro-carotenoids)和退-阿朴-类胡萝卜素、花菱草类黄素(eschscholtzxanthin)、花菱草类黄素酮(eschscholtzxanthone)、紫衫紫素(rhodoxanthin)、福橘黄素(tangeraxanthin)、壬异戊二烯黄素(nonaprenoxanthin)、癸异戊二烯黄素(decaprenoxanthin)、C.p.450 2-[4-羟基-3-(羟甲基)-2-丁烯基]-2'-(3-甲基-2-丁烯基)-b,b-胡萝卜素、C.p.473 2'-(4-羟基-3-甲基-2-丁烯基)-2-(3-甲基-2-丁烯基)-3',4’-二脱氢-l',2’-二氢-b,y-胡萝卜素-1'-醇和菌红素(bacterioruberin)。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，类胡萝卜素选自由β-胡萝卜素、番茄红素、角黄素、胭脂素、甜菜色素及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，类胡萝卜素是胡萝卜素番茄红素。

番茄红素是一种天然红色色素分子，具有公认的抗氧化特性。美国FDA已经报告，合成番茄红素以及从天然来源获得的番茄红素当以0.5％至7％的范围内的水平用作各种食品中的食品补充剂时是安全的(通常被认为是安全的，GRAS)。在安全性研究中，在高达3g/(kg*d)的膳食或配制的番茄红素的摄入水平未观察到不良影响(Trumbo,P.R.J.Nutr.2005,135,2060S–2061S)。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.1mg/100g细胞至约50mg/100g细胞的番茄红素的量的多于一个细胞。根据一些实施方案，番茄红素是以从1mg/100g细胞至约20mg/100g细胞的量。

根据某些实施方案，类胡萝卜素是叶黄素角黄素。

角黄素是一种属于叶黄素类的红橙色的类胡萝卜素。这种天然存在的色素存在于细菌、藻类和一些真菌中。角黄素也是火烈鸟羽毛、锦鲤鱼皮和甲壳动物外壳的颜色的原因。角黄素作为饲料添加剂广泛用于家禽(肉鸡、蛋鸡)。它被添加到动物饲料中，以改善鸡皮、蛋黄、鲑鱼和鳟鱼的颜色。合成角黄素是一种性质相同的化合物。该合成化合物赋予动物来源的食物特有的红橙色色相。类胡萝卜素的大小、形状或结构(conformation)在它们的着色特性中也发挥关键作用。此外，类胡萝卜素-蛋白质的相互作用是角黄素的各种红色的原因。(Esatbeyoglu,T.,&Rimbach,G.2016.Molecular Nutrition&Food Research,61(6),1600469.doi:10.1002/mnfr.201600469)。根据美国食品和药品管理局，角黄素的推荐上限剂量是每磅固体或半固体食物或每品脱液体食物30毫克。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约1mg/100g细胞至约100mg/100g细胞的角黄素的量的多于一个细胞。根据一些实施方案，角黄素是以从10mg/100g细胞至约50mg/100g细胞的量。

根据某些实施方案，类胡萝卜素是胡萝卜素β-胡萝卜素。

β-胡萝卜素(Beta-Carotene或β-carotene)是一种类异戊二烯化合物，它在动物体内无法合成，而是由植物和微生物生物合成。β-胡萝卜素作为维生素A的重要来源，这是人类已知的类胡萝卜素的主要功能。根据2012年4月20日公布的FDA信息，β-胡萝卜素被确认为GRAS。它可以用作营养补充剂或颜色添加剂。也允许使用β-胡萝卜素作为抗氧化剂营养素。

维生素A具有一个等式：1μg的视黄醇＝6μgβ-胡萝卜素。维生素A的推荐上限是3mg/天，这意味着18mg/天的β-胡萝卜素。

此外，每天摄入>30mg的β-胡萝卜素可能导致高胡萝卜素血症，其特征是皮肤(包括脚底和手掌)呈黄色。这是无害且可逆的(Mason,P.2001.DietarySupplements.Pharmaceutical press,London)。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约1mg/100g细胞至约100mg/100g细胞的β-胡萝卜素的量的多于一个细胞。根据一些实施方案，β-胡萝卜素是以从10mg/100g细胞至约50mg/100g细胞的量。

如下文的实施例部分中例示的，细胞负载有富含外源性补充剂的培养基，所述外源性补充剂选自由β-胡萝卜素、番茄红素、角黄素和/或维生素B12组成的组，影响细胞的颜色和营养价值两者。富集的细胞提供有益量的所述营养素。

根据一些实施方案，类胡萝卜素是胭脂素。

胭脂树(annatto)中发现的类胡萝卜素家族的另一个成员胭脂素是一种从热带植物胭脂树(achiote tree)(胭脂树(Bixa orellana))的种子中获得的天然食用色素。胭脂树种子和从种子中获得的提取物在欧洲和北美作为食物着色剂(colorant)已经使用了200多年，赋予食品红-橙-黄色(Smith,J和Wallin,H.2006.Annatto Extracts:Chemical andTechnical Assessment)。如今，胭脂素在全球使用的主要天然颜色中占据第二位(Giridhar P.和Parimalan RA.Asia Pac J Mol Biol Biotechnol.2010.18:77–79；Chuyen H V和Hoi N T.Eun JB.Int J Food Sci Tech.2012.47:1333–1338)。这两种颜色补充剂被FDA和欧洲食品安全局(EFSA)两者批准使用。

根据另外的某些示例性实施方案，天然着色剂是至少一种甜菜色素。根据一些实施方案，甜菜色素选自由β花青苷和甜菜黄素组成的组。根据一些实施方案，β花青苷选自由甜菜苷、异甜菜苷、前甜菜苷和新甜菜苷组成的组。根据一些实施方案，甜菜黄素选自由仙人掌黄质、紫茉莉黄质、马齿苋黄质和梨果仙人掌黄质组成的组。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.1mg/100gr细胞至约600mg/100gr细胞的至少一种甜菜色素的甜菜色素的量的多于一个细胞。

甜菜色素是一类发现于石竹目(Caryophyllales)植物中的红色和黄色吲哚来源的色素，在石竹目植物中其取代花青苷色素。存在两类甜菜色素：具有红色至紫色的β花青苷，包括甜菜苷、异甜菜苷、前甜菜苷和新甜菜苷；以及具有黄色至橙色的甜菜黄素，包括仙人掌黄质、紫茉莉黄质、马齿苋黄质和梨果仙人掌黄质。甜菜色素通常用作食品着色剂，特别是甜菜来源的甜菜苷。最近，已经提出甜菜苷作为抗氧化剂也具有健康益处。

如上文描述的，维生素B12是一种必需维生素，其作为类胡萝卜素，无法由人体合成，而是通过食用动物来源的产品获得。根据本发明的教导，形成维生素B12结构的一部分的钴给出了其独特的红色，并且因此维生素B12具有作为着色剂和作为必需维生素的双重功能。

在1998年，美国医学研究所(IOM，现为卫生与医学部门(HMD))更新了维生素B12的平均需求量(Estimated Average Requirements，EAR)和推荐膳食摄入量(RecommendedDietary Allowances，RDA)。目前14岁及以上的女性和男性的维生素B12的EAR为2.0μg/天；RDA为2.4μg/天。

EFSA把这一组集合信息称为饮食参考值。对于超过18岁的女性和男性，维生素B12的适宜摄入量(AI)设定为4.0μg/天。妊娠女性的AI为4.5μg/天，并且哺乳期女性的AI为5.0μg/天。对于1-17岁的儿童，AI随着年龄从1.5μg/天增加到3.5μg/天。

然而，EFSA和IOM解释，没有足够的证据要求设定维生素B12的可耐受最高摄入水平(UL)。

本发明现在示出，在每ml含有1mg氰钴胺素的生长培养基中孵育牛胚胎成纤维细胞和成肌细胞产生一定量的维生素，其赋予细胞明显的红粉色。

此外，本发明示出了牛来源的细胞能够从培养基中以所检测的浓度线性摄取维生素B12，达到从约10mg/100g细胞至约100mg/100g细胞的量。

铁是一种必需的微量营养素，其确保正常红细胞的发育和健康的免疫功能。缺铁可能导致贫血，并且已被示出负面地影响儿童发育。膳食铁的吸收是一个可变且动态的过程。与摄入的铁量相比，吸收的铁量通常是低的，但取决于环境和铁的类型可以在从5％至多达35％的范围内。铁的最佳吸收形式来自动物产品。从动物产品和一些植物产品中吸收铁是以血红素铁的形式，并且更有效地允许吸收摄入量的15％至35％。动物中的血红素铁来自血液和肌肉，以及肉类和线粒体中含有血红素的蛋白质。本发明的培养肉包含铁强化的细胞，这种铁强化的细胞提高了培养肉的营养价值。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.01mg/100gr细胞至约50mg/100gr细胞的铁或其盐的量的多于一个细胞。根据某些实施方案，铁是以从约0.1mg/100gr细胞至约40mg/100gr细胞的量。根据某些实施方案，铁的量是从约0.5mg/100gr细胞至约5mg/100gr细胞。

根据某些实施方案，培养肉的非人类动物来源的细胞还包含选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种不饱和脂肪酸、至少一种饱和脂肪酸及其任何组合组成的组的外源性补充剂。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

辅酶Q10，也被称为泛醌、泛癸利酮、辅酶Q，并且有时缩写为CoQ10、CoQ或Q10，是一种辅酶。这种脂溶性物质类似于维生素，存在于所有呼吸的真核细胞中，主要是线粒体中。它是电子传递链的组成部分，并且参与需氧细胞呼吸，以ATP的形式产生能量。CoQ10作为膳食补充剂出售。CoQ10没有确立的理想剂量；典型的每日剂量是100毫克-200毫克。CoQ10是一种不溶于水的结晶粉末。CoQ10可以用几种方法来改性，以便通过增加其在水中的溶解度来增加其吸收。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含辅酶Q10。根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.5mg/100gr细胞至约20mg/100gr细胞的量的辅酶Q10的多于一个细胞。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含叶酸。根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约50μg/100gr细胞至约500μg/100gr细胞的叶酸的量的多于一个细胞。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含维生素E。根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.5mg/100gr细胞至约50mg/100gr细胞的维生素E的量的多于一个细胞。根据某些实施方案，多于一个细胞提供从约1mg/100g细胞至约10mg/100g细胞的维生素E的量。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含硒和/或其盐。根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约5.0μg/100gr细胞至约60μg/100gr细胞的硒的量的多于一个细胞。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含维生素D。根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约0.01μg/100gr细胞至约150μg/100gr细胞的量的维生素D的多于一个细胞。根据某些实施方案，维生素D的量为从约0.1μg/100gr细胞至约100μg/100gr细胞。根据某些实施方案，维生素D的量为从约0.1μg/100gr细胞至约15μg/100gr细胞。

根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞还包含至少一种不饱和脂肪酸。根据某些实施方案，非人类动物来源的细胞培养物包含提供从约5mg/100gr细胞至约2500mg/100gr细胞的量的不饱和脂肪酸的多于一个细胞。根据某些实施方案，至少一种不饱和脂肪酸的量为从约5mg/100gr细胞至约1500mg/100gr细胞。根据某些实施方案，至少一种不饱和脂肪酸的量为从约5mg/100gr细胞至约500mg/100gr细胞。根据某些实施方案，至少一种不饱和脂肪酸的量为从约5mg/100gr细胞至约50mg/100gr细胞。

根据某些实施方案，培养肉的非人类动物来源的细胞包含：至少一种天然着色剂，所述至少一种天然着色剂选自由番茄红素、角黄素及其组合组成的组；维生素B12；铁或其盐；至少两种脂肪酸；硒和/或其盐；锌和/或其盐；维生素E、辅酶Q10以及维生素D。

根据又另一个方面，本发明提供了用于培养非人类动物来源的细胞的富集的细胞培养液体培养基，该培养基包含选自由至少一种天然着色剂、氰钴胺(维生素B12)及其组合组成的组的至少一种补充剂，其中补充剂的量足以赋予非人类动物来源的细胞肉样颜色。

根据某些实施方案，富集的细胞培养液体培养基的特征在于在约300nm和约700nm之间的多于一个波长处具有吸光度。氰钴胺素(维生素B12)峰吸光度在361nm；胡萝卜素峰吸光度：β胡萝卜素：450nm、480nm、520nm；番茄红素峰在360nm、443nm、471nm、502nm。胭脂素在360nm、470nm-476nm、501nm-507nm；甜菜苷峰吸光度在535nm；角黄素峰在480nm。

根据又另一方面，本发明提供了用于生产具有肉样颜色的培养肉的富集的细胞培养液体培养基，该培养基包含外源性补充剂的组合，该外源性补充剂包括至少一种天然着色剂和氰钴胺素(维生素B12)。

根据某些实施方案，本发明提供了用于生产具有肉样颜色的培养肉的富集的细胞培养液体培养基，该培养基包含外源性补充剂的组合，该外源性补充剂包括至少一种天然着色剂、氰钴胺素(维生素B12)以及铁或其盐。根据某些实施方案，培养基包含由至少一种着色剂、B12以及铁或其盐组成的外源性补充剂的组合。

除了需要吸引人的培养肉产品的外观之外，味道也非常重要。通过添加天然或合成香料可以改善培养肉的味道。酵母提取物在食品工业中作为风味前体是已知的，并且通常被添加以赋予非肉类菜肴肉汤味道。本发明现在公开了，出乎意料地，在含有酵母提取物的培养基中培养非人类动物来源的细胞产生形成具有改善的肉样味道的食品的培养的细胞。

根据某些实施方案，培养基包含含有至少一种着色剂、B12和酵母提取物的补充剂组合物。根据某些实施方案，培养基包含由至少一种着色剂、B12和酵母提取物组成的补充剂组合物。

根据某些实施方案，培养基包含含有至少一种着色剂、B12、铁或其盐和酵母提取物的补充剂组合物。根据某些实施方案，培养基包含由至少一种着色剂、B12、铁或其盐和酵母提取物组成的补充剂组合物。

根据又另一个方面，本发明提供了一种用于生产具有肉样颜色的培养肉的富集的液体细胞培养基，该培养基包含选自由至少一种天然着色剂、氰钴胺素(维生素B12)、铁或其盐及其任何组合组成的组的补充剂，其中补充剂的量足以赋予培养肉肉样颜色。

根据又另一方面，本发明提供了一种用于生产具有肉样颜色的培养肉的富集的细胞培养液体培养基，该培养基包含选自由至少一种天然着色剂、氰钴胺素(维生素B12)、铁或其盐、酵母提取物及其任何组合组成的组的补充剂，其中补充剂的量足以赋予培养肉肉样颜色。

根据一些实施方案，富集的培养基还包含至少一种补充剂，所述至少一种补充剂选自由以下组成的组：叶酸、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种不饱和脂肪酸、至少一种饱和脂肪酸及其任何组合。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，培养基包含补充剂组合物，该补充剂组合物包含至少一种着色剂、B12和至少一种外源性补充剂，所述外源性补充剂选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。根据某些实施方案，培养基包含补充剂组合物，该补充剂组合物由至少一种着色剂、B12和至少一种外源性补充剂组成，所述外源性补充剂选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，培养基包含补充剂组合物，该补充剂组合物包含至少一种着色剂、B12、铁或其盐和至少一种外源性补充剂，所述外源性补充剂选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。根据某些实施方案，培养基包含补充剂组合物，该补充剂组合物由至少一种着色剂、B12、铁或其盐和至少一种外源性补充剂组成，所述外源性补充剂选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，培养基包含补充剂组合物，该补充剂组合物包含至少一种着色剂、B12、酵母提取物和至少一种外源性补充剂，所述外源性补充剂选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。根据某些实施方案，培养基包含补充剂组合物，该补充剂组合物由至少一种着色剂、B12、酵母提取物和至少一种外源性补充剂组成，所述外源性补充剂选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据某些实施方案，培养基包含补充剂组合物，该补充剂组合物包含至少一种着色剂、B12、铁或其盐、酵母提取物和至少一种外源性补充剂，所述外源性补充剂选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。根据某些实施方案，培养基包含补充剂组合物，该补充剂组合物由至少一种着色剂、B12、铁或其盐、酵母提取物和至少一种外源性补充剂组成，所述外源性补充剂选自由叶酸(维生素B9)、锌和/或其盐、硒和/或其盐、维生素D、维生素E、辅酶Q10、至少一种脂肪酸及其任何组合组成的组。每一种可能性代表本发明的单独实施方案。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约100μg/ml至约5mg/ml的浓度的叶酸。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约5ng/ml至约500ng/ml的浓度的硒和/或其盐。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约0.1pM至约100μM的浓度的维生素D。根据某些示例性实施方案，富集的培养基包含以从约0.1nM至约1μM的浓度的维生素D。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约10nM至约250μM的浓度的维生素E。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约10μM至约350μM的浓度的至少一种不饱和脂肪酸。

根据一些实施方案，富集的培养基包含以从约5μg/ml至约2mg/ml的浓度的辅酶Q10。

抗菌肽(AMP)是存在于动物、植物、昆虫和细菌中的多组天然蛋白质。这些肽是宿主抵御病原生物体的防御机制的一部分，并且已被发现是化学防腐剂的替代物。

根据某些实施方案，本发明的培养基还包含防止污染培养的细胞的AMP。如上文描述的，这些肽是天然防腐剂。AMP是由自古以来存在于许多类型的食物中的细菌产生的，食物诸如奶酪、酸奶和葡萄牙发酵肉，并且AMP已被证明对于人类食用是安全的，并且因此被批准用于食品工业。

常用的AMP是nicin，一种具有3.5KDa分子量、34个氨基酸、正电荷和针对革兰氏阳性菌(包括芽孢杆菌(Bacilluses)、微球菌(Micrococcuses)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcrus aureuses)、单核细胞性李斯特菌(Listeria monocytogenes)和梭菌(Clostridiums))的抗菌活性，以及针对革兰氏阴性菌的低抗菌活性的肽。Nicin用于保护和延长巴氏杀菌的奶酪、乳制品甜点、罐头食品、咸肉和海鲜的保存时间。(Thomas L.V.和Delves-Broughton,J.2005.在Davidson M P等人,Antimicrobial in foods,第三版,由CRC Press出版,第237-274页)。虽然nicin在食品工业中已经使用了几十年，但是还没有检测到抗性食品腐败生物体(resistant food-spoilage organisms)的发展。

花青苷是属于酚类的有色水溶性色素。低于pH 3时，花青苷溶液显示出其最强烈的红色。当这样的溶液的pH升高时，它们的红色通常会褪色到在4至5的pH范围内呈现出无色的程度。pH的进一步增加产生紫色和蓝色的花青苷溶液，在储存或热处理时，已经观察到色素从蓝色变为黄色。酰化和共色素化的花色素具有较高的热稳定性，因此即使在不同的pH条件也能保持结构。花青苷是具有附加值的着色剂，其可以用于预防若干种疾病，包括心血管疾病、癌症、糖尿病、一些代谢疾病和微生物感染。这些化合物还提高视觉能力，并且具有神经保护作用。(Khoo,H E等人.2017.Food Nutr.Res.61:1361779)。

根据又另外的方面，本发明提供了一种用于生产以肉样颜色为特征的培养肉的方法，该方法包括在本发明的富集的细胞培养基中培养非人类动物来源的细胞。

在本发明的培养基中培养非人类动物来源的细胞可以在培养肉生产的任何阶段进行。根据某些实施方案，在低细胞分裂速率的时候添加本发明的富集的培养基，以获得更强烈的类似屠宰肉的颜色可能是优选的。根据某些实施方案，将本发明的富集的培养基添加到非人类动物来源的细胞，在接近培养物生长结束时形成肉培养物。根据某些示例性实施方案，将培养基添加到具有基本上恒定的葡萄糖摄取速率(GUR)的细胞中。根据一些实施方案，在培养完成之前约1天至约3天，将富集的培养基添加到细胞中。

提供以下实施例以便更充分地例证本发明的一些实施方案。然而，这些实施方案绝不应当被解释为限制本发明的宽范围。在不背离本发明的范围的情况下，本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变型和修改。

实施例

由分析研究实验室用UPLA-UV/Vis仪器在下列条件下分析β-胡萝卜素、番茄红素和角黄素：

仪器：Waters ACQUITY UPLC系统

柱：Phenomenex Kinetex 2.6pm Cis 100x 2.1mm；零件号：OOD-4462-AN

柱温：50℃

自动取样器温度：5℃

检测器：光电二极管阵列波长范围250nm-499nm

分辨率：3.6nm

取样速率：10点/秒

流动相A：乙腈:甲醇:乙酸铵缓冲液25:25:50

流动相B：乙腈:甲醇:二氯甲烷:己烷70:25:2.5:2.5

流量：0.5mL/分钟

注入体积：17pL部分环路，针溢出

弱洗涤体积：600μL

强溶剂体积：200μL

密封洗涤：1分钟

运行时间：8分钟

下次注入延迟：5分钟

梯度条件呈现在下表1中。

β-胡萝卜素、番茄红素或角黄素以一份如下制备：

将100mg样品/对照样品转移到适合于均质化的聚丙烯小瓶中。添加100mg/1mm玻璃珠，然后添加2mL重构溶液。将样品均质化持续30秒以破坏细胞。在离心小瓶之后，将上清液转移到UPLC小瓶中以用于使用UPLC-UV/Vis分析。

样品以一份如下制备：

将100mg对照样品转移到适合于均质化的聚丙烯小瓶中。添加100mg/1mm玻璃珠，然后添加2mL标准溶液。将样品均质化持续30秒以破坏细胞。在离心小瓶之后，将上清液转移到UPLC小瓶中以用于分析。

β-胡萝卜素、番茄红素和角黄素的样品中的类胡萝卜素含量通过相对于由每种类胡萝卜素分别制备的“标准”溶液的单点校准来确定。每种类胡萝卜素的峰面积是在最大峰值的波长处确定的。

将BEF细胞暴露于不同浓度的维生素B12持续24小时。通过HPLC分析细胞沉淀物。

使用以下条件通过HPLC进行分析：

仪器：Agilent 1100系统

柱：Waters Symmetry 5μm C18 150x 4.6mm

柱温：30℃

自动取样器温度：5℃

检测器：在361nm的UV

流动相A：水中0.025％TFA

流动相B：乙腈

流量：1.0mL/分钟

注入体积：100μl

运行时间：30分钟

梯度条件呈现在下表2中。

标准储备溶液以一式两份如下制备：

将10mg的维生素B12 V2876参照物质(reference material)转移到20mL琥珀色容量瓶中，用HPLC水完成定容并混合。

工作标准以一式两份如下制备：

将1mL的标准储备溶液转移到50mL琥珀色容量瓶中，用HPLC水完成定容并混合。

样品以一份如下制备：

将50mg样品/对照转移到适合于均质器的聚丙烯小瓶中。

添加50mg 1mm玻璃珠，然后添加2mL稀释液(水)。

将样品均质化持续30秒以破坏细胞。在离心小瓶之后，将上清液转移到HPLC小瓶中以用于分析。

样品以一份如下制备：

将50mg对照样品转移到适合于均质器的聚丙烯小瓶中。

添加50mg 1mm玻璃珠，然后添加2mL工作标准溶液。

将样品均质化持续30秒以破坏细胞。在离心小瓶之后，将上清液转移到HPLC小瓶中以用于分析。

样品中维生素B12的含量通过相对于工作标准溶液的单点校准来确定。

BEF-来源于胚胎骨骼肌组织的牛胚胎成纤维细胞的培养物。培养物中的细胞的90％-100％是BEF。

BEM-来源于胚胎骨骼肌组织的牛胚胎成肌细胞的培养物。

BCL-来源于牛脐带膜的成纤维细胞的培养物。

测试牛胚胎成纤维细胞(BEF)对有色化合物的摄取。牛细胞的自然颜色是白色到黄色。β-胡萝卜素是一种维生素A原，其可以被人体转化为维生素A。β胡萝卜素具有黄-橙-红的颜色。

在一个实验中，将水溶性β-胡萝卜素添加到标准培养基(DMEM，10％FCS和1％青霉素/链霉素)中的1.2*10

在另外的实验中，将BEF细胞与β-胡萝卜素10％乳液红(DSM，目录#5012538004)在标准培养基(DMEM高葡萄糖，10％FCS，1％青霉素-链霉素)中以最终β-胡萝卜素浓度110μg/ml在38℃，5％CO

然后通过胰蛋白酶化收获细胞，并且用PBS将沉淀物洗涤三次。细胞沉淀物颜色为橙色。将63*10

如下表4中可以看到的，向细胞施加0.11mg/mlβ-胡萝卜素导致200μgβ-胡萝卜素/gr细胞的摄取。应注意到，乳液形式的β-胡萝卜素为细胞提供了红橙色，相比之下，水溶性β-胡萝卜素的摄取产生细胞的橙色。因此，根据本发明的教导，使用乳液形式的β-胡萝卜素是有利的。

甘氨酸亚铁是一种具有深棕色的水溶性化合物。如上文关于β-胡萝卜素描述的，检查了来源于BCL细胞的牛成纤维细胞对三种浓度的甘氨酸亚铁的摄取：1500μg/ml、750μg/ml和375μg/ml。

发现以1500μg/ml的浓度的甘氨酸亚铁对牛细胞有毒。在750μg/ml浓度，细胞被着色成浅棕色(图2)。375μg/ml没有使细胞着色。

将充分汇合的BEF细胞与溶解在标准培养基(DMEM高葡萄糖，10％FCS，1％青霉素-链霉素)中至最终浓度为0.5mM的七水合硫酸亚铁(II)(Sigma,目录#F8633)在38℃，5％CO

然后通过胰蛋白酶化收获细胞，并且用PBS将沉淀物洗涤三次。使用ICP-MS方法分析重量为1107mg的细胞。

电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)是用于分析环境样品中痕量金属的有力工具。其适用于确定水样品中大量元素的亚-μg/L浓度。该方法测量由射频电感耦合等离子体产生的离子。液体中的分析物物质被雾化，并且产生的气溶胶被氩气输送到等离子炬中。高温产生的离子夹带在等离子体气体中，并且通过接口引入质谱仪中。等离子体中产生的离子根据其质荷比(m/z)来分类，并且用通道电子倍增器(由US EPA公开的方法6020b电感耦合等离子体质谱)来定量。

用标准培养基孵育的BEF细胞仅含有8.36μg铁/g细胞，而在如上文描述的补充有七水合硫酸亚铁的培养基中孵育细胞，产生了含有25.11μg铁/g细胞的细胞，增加了约3倍。

氰钴胺素(Cbl)是一种水溶性维生素B12，其具有红色。如上文关于β-胡萝卜素描述的，检查了BEF细胞对三种浓度的氰钴胺素的摄取：1000μg/ml、100μg/ml和10μg/ml，并且孵育时间为24h。

当暴露于1000μg/ml的高浓度时，细胞被着色成红-粉红色(图3)。在100μg/ml和10μg/ml，牛细胞颜色没有视觉变化。

将充分汇合的BEF细胞与在标准培养基(DMEM高葡萄糖，10％FCS，1％青霉素-链霉素)中最终浓度为13.3mg/ml、6.67mg/ml、3.33mg/ml和1.67mg/ml的维生素B12(氰钴胺素，Sigma,目录#V2876)在38℃，5％CO

然后通过胰蛋白酶化收获细胞，并且用PBS将沉淀物洗涤三次。取决于维生素B12的浓度，细胞沉淀物的颜色为不同强度的红-粉红色。将12.8*10

如表3中可以看到的，向细胞施加1.67mg/ml、3.33mg/ml、6.67mg/ml和13.3mg/ml的维生素B12导致线性摄取。

将包含充分汇合的BEF和BEM细胞(大多数是BEF细胞)的混合物与溶解在标准培养基(DMEM高葡萄糖，10％FCS，1％青霉素-链霉素)中至最终浓度为100μM(13μg/ml)的氯化锌(Sigma,目录#Z0152)在38℃，5％CO

在未补充有氯化锌的标准培养基中孵育的细胞仅含有8.5μg锌/gr细胞。向细胞施加100μM氯化锌导致30.44μg锌/gr细胞的摄取，即增加约3.6倍。

将顺式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA，或Sigma D2534)和反油酸(Caymen chemicals,目录#90250)溶解在标准培养基(DMEM高葡萄糖，10％FCS，1％青霉素-链霉素)中至最终浓度为50μM。

将BEF细胞接种在6孔板中，50,000个细胞/孔，并且在38℃，5％CO

如图4中可以看到的，用含有反油酸和DHA(比例为1:1)的培养基处理的细胞开始在细胞中积累脂滴。

半定量地测量油红O染色。油红O染色用100％异丙醇提取持续5min。在492nm的波长处测量吸光度。用反油酸和DHA的组合观察到显著的染色(OD 492吸光度为0.1207，相比于对照为0.0352)。

实施例6：番茄红素摄取

在一个实验中，将充分汇合的BEF细胞与在标准培养基(DMEM高葡萄糖，10％FCS，1％青霉素-链霉素)中的最终浓度为0.11mg/ml的Redivivo(番茄红素)10％CWS/S-TG(DSM，目录#5003792004)在38℃，5％CO

然后通过胰蛋白酶化收获细胞，并且用PBS将沉淀物洗涤三次。细胞沉淀物颜色为黄色。用UPLC方法分析13*10

向细胞施加0.11mg/ml番茄红素导致10μg番茄红素/gr细胞的摄取，如在下表4中可以看到的。

在另外的实验中，将充分汇合的BEM细胞与在标准培养基(DMEM高葡萄糖，20％FCS，1％青霉素-链霉素)中最终浓度为0.002mg/ml的Resolute Ruby ALycored(目录#400280，可溶性番茄红素在水中的另一种配制物)在38℃，5％CO

然后通过胰蛋白酶化收获细胞，并且用PBS将沉淀物洗涤三次。细胞沉淀物颜色为暗红色。用UPLC方法分析13*10

如表4中可以看到的，向细胞施加0.002mg/ml番茄红素导致30μg番茄红素/gr细胞的摄取。

番茄红素的膳食摄入量取决于研究人群而极大地变化。意大利人平均每天消耗14.3mg的总类胡萝卜素(Lucarini等人.2006)。在美国，番茄红素的典型膳食摄入量为约每天2毫克-5毫克(mg)(Krinsky和Johnson,2005)。

将充分汇合的BEF和BEM细胞的混合物与在标准培养基(DMEM高葡萄糖，10％FCS，1％青霉素-链霉素)中最终浓度为1.1mg/ml的角黄素10％CWS/S(目录#5005256004)在38℃，5％CO

然后通过胰蛋白酶化收获细胞，并且用PBS将沉淀物洗涤三次。细胞沉淀物颜色为红橙色。用UPLC方法分析20*10

向细胞施加1.1mg/ml角黄素导致420μg角黄素/gr细胞的摄取，如在表4中可以看到的。

根据FDA公布的批准用于人类食品的颜色添加剂，第73部分，子部分A：不受批次认证限制的颜色添加剂，每千克固体或半固体食品或每品脱液体食品不超过66mg角黄素。

实施例8：使用酵母提取物用于富集牛来源的细胞味道

将充分汇合的BEF细胞与溶解在标准培养基(DMEM高葡萄糖，10％FCS，1％青霉素-链霉素)中至最终浓度分别为0.5％或2％的酵母提取物在38℃，5％CO

然后通过胰蛋白酶化收获细胞，并且用PBS将沉淀物洗涤三次。通过电子鼻和电子舌分析细胞沉淀物，并且与对照(不含酵母提取物)进行比较。

人造舌通常依赖于测量由目标分子与受体反应引起的电势或电流的变化。因此，这些设备通常被称为电子舌(electronic tongue)或电子舌(e-tongue)，并且以与天然舌类似的方式工作。人造舌可以感知：苦味、酸味、咸味、鲜味(umami)(鲜味(savory))和甜味。示例性的味觉传感器是商业化的味觉传感系统SA402B和TS-5000Z(KiyoshiToko.2012.Nature486:S18–S19 doi:10.1038/486S18a)。

电子鼻被设计成在仪器内模拟哺乳动物的嗅觉系统，该仪器被设计成获得可重复的测量结果，允许识别和分类芳香混合物。电子鼻系统通常由多传感器阵列、信息处理单元—人工神经网络(ANN)、带有数字模式识别算法的软件和参考图书馆数据库组成。已经开发了数百种不同的人工鼻设备原型(参见，例如Wilson AD和Baietto M.2009.Sensors 9:5099-5148；doi:10.3390/s90705099)。

实施例9：维生素B12、角黄素和番茄红素组合的摄取

在一个实验中，制备了维生素B12(Sigma,目录#V2876)；角黄素10％CWS/S(目录#5005256004)；和番茄红素Resolute Ruby A(Lycored,目录#400280)在纯水中的混合物，最终浓度如下表5中呈现的。根据由美国肉类科学协会(American Meat ScienceAssociation)出版的指南，通过色度计测量补充剂混合物的颜色的L*a*b*参数。将参数与肉类切片的L*a*b*值进行比较，并且发现是相当的(表6)。

将充分汇合的BEF细胞与上文描述的补充剂混合物在38℃，5％CO

然后通过胰蛋白酶化收获细胞，并且用PBS将沉淀物洗涤三次。通过色度计设置L*a*b*或L*C*h参数来分析细胞沉淀物颜色。

在另一个实验中，制备含有维生素B12(Sigma,目录#V2876)；角黄素10％CWS/S(目录#5005256004)；Redivivo番茄红素10％CWS/S-TG(目录#5003792004)在纯水中的补充剂混合物至最终浓度分别为0.5mg/ml、3.5mg/ml、0.9mg/ml。通过色度计测量营养素的混合物(维生素B12、角黄素和番茄红素)的颜色的L*a*b*参数。将参数与来自瘦肉切片的L*a*b*值进行比较。

将充分汇合的BEF细胞与上文描述的补充剂混合物在38℃，5％CO

具体实施方案的前述描述将如此完全地揭示本发明的一般本质，以致其他人可以通过应用当前的知识容易地修改和/或调整这样的具体实施方案用于多种应用，而没有过度的实验并且不脱离一般概念，并且因此，这样的调整和修改应当且意图被包含在公开的实施方案的等效物的含义和范围内。应当理解，本文中采用的措辞或术语是为了描述而非限制性的目的。用于实施多种公开的功能的手段、材料和步骤可以采取多种可选择的形式而不脱离本发明。