用于治疗神经母细胞瘤的Aurora A激酶抑制剂

摘要

本发明提供了如下式（I）所示的Aurora A激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，用于治疗神经母细胞瘤。

说明书

本发明涉及Aurora A激酶抑制剂及其盐用于治疗神经母细胞瘤的用途。

神经母细胞瘤是儿童中最常见的实体瘤之一，且在北美每年诊断出超过650例神经母细胞瘤病例。神经母细胞瘤可再分为两个明确的患者亚群，一般称为低风险和高风险。低风险神经母细胞瘤通常发现于18个月龄以下的儿童，疾病负担有限，结果是预后良好。然而，高风险神经母细胞瘤一般发生于18个月龄以上的儿童，常发生骨组织转移，结果是预后较差。尽管多模式治疗策略的进步已经导致神经母细胞瘤患者的改善的结果，但高风险类型患者的存活率仍然很低，确诊后五年不到50%存活。

高风险神经母细胞瘤与编码N-myc原癌基因蛋白（N-MYC）的MYCN基因有关。尽管还不完全了解，N-MYC和Aurora A激酶似乎相互作用，且Aurora A激酶的表达和扩增被认为稳定N-MYC和/或减缓其降解，这反过来会导致N-MYC水平的增加。Michaelis, M等，“AuroraKinases as Targets in Drug–Resistant Neuroblastoma Cells”，PLOS One, 2014, 9(9) e108758。

Aurora A激酶抑制剂是本领域已知的（参见，例如PCT专利申请公开WO2016/077191，其公开了式I化合物（参见下文）。某些Aurora激酶抑制剂（包括Aurora A选择性抑制剂阿利色替（alisertib）和泛Aurora抑制剂陶扎色替（tozasertib））的用途与不可接受高水平的中性粒细胞减少及其他毒性作用有关。

需要新的方法和药物来治疗神经母细胞瘤，特别是高风险神经母细胞瘤。此外，需要提供抑制Aurora激酶（特别是Aurora A激酶）和降低N-MYC的表达和/或活性的方法。本发明解决了这些需要并提供了治疗神经母细胞瘤的方法。

一方面，本发明提供用于在需要治疗的患者中治疗神经母细胞瘤的方法。优选地，本发明提供在需要治疗的患者中治疗高风险神经母细胞瘤的方法。所述方法包括向患者施用有效量的如下文式I所示的化合物或所述式I化合物的药学上可接受的盐，所述化合物为(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[(3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-哌啶-4-甲酸。在一个实施方案中，式I化合物以游离酸形式提供。在另一实施方案中，式I化合物以碱加成盐形式提供。在一个优选实施方案中，式I化合物以2-甲基丙烷-2-铵盐（也称为特丁胺盐或叔丁胺盐）形式提供，即((2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-哌啶-4-甲酸：2-甲基-2-丙烷胺(1:1))。在另一实施方案中，式I化合物以(2R,4R)-1-[(3-氯-2-氟-苯基)甲基]-4-[[3-氟-6-[(5-甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-2-吡啶基]甲基]-2-甲基-哌啶-4-甲酸：胺(1:1)盐)的铵盐形式提供。

另一方面，本发明提供了用于治疗神经母细胞瘤的药物组合物，其包含式I化合物或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，优选用于治疗高风险神经母细胞瘤。在一个实施方案中，所述组合物包含式I化合物，其为游离酸。在另一个实施方案中，所述组合物包含为碱加成盐形式的式I化合物，优选2-甲基丙烷-2-铵盐或铵盐，更优选甲基丙烷-2-铵盐。

本发明提供用于治疗神经母细胞瘤的式I化合物或其药学上可接受的盐。本发明还提供式I化合物或其药学上可接受的盐用于制备用于治疗神经母细胞瘤的药物中的用途。在一个实施方案中，所述化合物以游离酸形式提供。在另一实施方案中，式I化合物以碱加成盐形式提供。在一个优选实施方案中，式I化合物以2-甲基丙烷-2-铵盐形式提供。在又一实施方案中，式I化合物以铵盐形式提供。

式I化合物或其药学上可接受的盐可与用于需要治疗神经母细胞瘤的患者的标准治疗（standard-of-care treatment）组合使用。标准治疗可包括以下的一种或多种：手术或切除全部或部分肿瘤；放射治疗；干细胞移植；施用化疗剂、分化剂和免疫治疗。

可与式I化合物或其药学上可接受的盐组合或施用的其他化疗剂的实例包括：烷化剂（环磷酰胺、替莫唑胺和盐酸美法仑）、铂类药物（卡铂、顺铂和奥沙利铂）、蒽环类（盐酸阿霉素）、拓扑异构酶I抑制剂（伊立替康和拓扑替康）和长春花生物碱（硫酸长春新碱）。分化剂包括异维甲酸（13-顺式维甲酸），且免疫治疗剂包括单克隆抗体如GD2单克隆抗体（ 地努图希单抗（dinutuximab））。式I化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种其它化疗剂、分化剂和/或免疫治疗剂可以同时、单独或顺序施用以治疗神经母细胞瘤。

本文所用术语“药学上可接受的盐”是指式I化合物的盐。药学上可接受的盐及其制备方法的实例可在下列中找到：Stahl. P等，“ Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties, Selection and Use”，第二修订版，Wiley-VCH，(2011) 和Berge, S.,M.等，"Pharmaceutical Salts"，Journal of Pharmaceutical Sciences，1977， 66(1)，1-19；Gould, P.L.，“Salt selection for basic drugs”，

式I化合物或其药学上可接受的盐可以作为药物组合物的一部分配制施用。优选的药物组合物可以配制成用于口服施用的片剂或胶囊、用于口服施用的溶液或可注射溶液。片剂、胶囊或溶液可包含有效治疗需要治疗的患者的神经母细胞瘤的量的式I化合物或其药学上可接受的盐。更优选地，这样的组合物用于口服施用。因此，包含式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物可与一种或多种药学上可接受的添加剂组合。本文中用于药物组合物的术语“药学上可接受的添加剂”是指以下的一种或多种：与组合物或制剂的其它添加剂相容且对患者无害的载体、稀释剂和赋形剂。药物组合物及其制备方法的实例可见于：“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, Loyd, V.等编辑，第22版，Mack Publishing Co., (2012)。药学上可接受的载体、稀释剂及赋形剂的非限制性实例包括下列：盐水、水、淀粉、糖、甘露醇和二氧化硅衍生物；粘合剂，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；高岭土和膨润土；和聚乙二醇。

“有效量”意指式I化合物或其药学上可接受的盐的量；或含有式I化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物的量，其会引起研究人员、兽医、医生或其他临床医生寻求的组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物或医学响应或期望的治疗效果。在某些实施方案中，有效量是指式I化合物或药学上可接受的盐的量，当施用时其能有效减缓、停止或逆转神经母细胞瘤的进展；或减缓或停止患者中神经母细胞瘤细胞的生长或增殖。

对组织、系统或患者引发生物或医学响应或期望的治疗效果的实际施用的式I化合物或其药学上可接受的盐的有效量将由医生在相关情况下确定，包括待治疗的症状；所选择的施用途径；所施用的本发明的实际化合物；个体患者的年龄、体重和响应；以及患者症状的严重程度。每日剂量通常在约0.1至约100 mg的范围内。在某些情况下，低于该范围下限的剂量水平可能是绰绰有余的，而在其他情况下，可能采用更大的剂量。优选剂量在1至80 mg的范围内；更优选从1至50 mg；仍更优选从1至30 mg；仍更优选从1至25 mg。这些剂量可以每日施用一次、两次、三次或更多次。在一个实施方案中，本发明化合物可以以每剂量15 mg或25 mg的剂量施用，每日口服施用两次（BID）。

如本文所用，术语“患者”是指人类或非人类哺乳动物。更具体地，术语“患者”是指人类。

术语“治疗（treating）”（或治疗（treat）或治疗（treatment））是指涉及减缓、中断、阻止、控制、减少或逆转症状、紊乱、病症或疾病（如神经母细胞瘤）的进展或严重程度的过程。

如本文所用，以下术语具有所指出的含义：“ATCC”是指美国典型菌种保藏中心（American Type Culture collection）；“BID”是指每天两次给药；“DMEM”是指杜尔贝科改良的伊格尔培养基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）；“DNA”是指脱氧核糖核酸；“EMEM”是指伊格尔极限必需培养基（Eagles's Minimal Essential Medium）；“F12”是指哈姆F12培养基；“FBS”是指胎牛血清；“HBSS”是指汉克平衡盐溶液（Hank's Balanced SaltSolution）；“HSRRB”是指卫生科研资源库（Health Science Research Resources Bank）；“JCRB”是指日本研究生物资源收藏（Japanese Collection of Research Bioresources）；“MEM”是指最低必需培养基；“NBL”是指神经母细胞瘤；“NEAA”是指非必需氨基酸；“PBS”是指磷酸盐缓冲盐水；“RPMI”是指洛斯维帕克纪念研究所(Roswell Park MemorialInstitute)；以及“SCID”是指严重的联合免疫缺陷小鼠。

包括2-甲基丙烷-2-铵盐和氨盐的式I化合物及其药学上可接受的盐可根据US9637474中公开的合成方法制备。

生物测定

单层抗增殖测定

测量Aurora A抑制剂效力的一个方法是它由于细胞周期停滞和有丝分裂灾难而在培养基中抑制癌细胞增殖的能力。Aurora A抑制剂在NBL细胞系中的抗增殖活性可以指示对Aurora A抑制剂的临床响应性。从冻存品恢复NBL肿瘤细胞系，并在细胞培养瓶中培养1-2代。NBL肿瘤细胞系包括：CHP-212、GOTO、IMR-32、NB16、NH-6、SH-SY5Y、SK-N-AS、SK-N-DZ、SK-N-F1、SK-N-MC、SK-N-SH和TGW，详见表1。

表1

Aurora A抑制剂的抗增殖活性可通过CellTiter Glo®测定进行测量。在用式I化合物处理之前，将细胞以每种细胞系预定的最佳密度接种到在白壁透明底微量滴定板中的完全生长培养基中。接种十六小时后，添加式I化合物。添加化合物后两次细胞倍增时间，按照制造商的规程制备CellTiter-Glo®试剂并添加到每个孔中。将板在室温孵育10分钟，然后根据对CellTiter-Glo®发光细胞活力测定，Promega目录#G7571的制造商规程用发光板读取器读取。

Aurora A抑制剂的抗增殖活性也可以通过处理后的细胞计数来测量。对于该测定，将NBL细胞系SK-N-DZ、SK-N-F1和KELLY在完全生长培养基中以每孔5000个细胞接种到黑壁透明底微量滴定板中。接种十六小时后，添加式I化合物72小时。然后将细胞固定在3.7%甲醛（Sigma#F-1268）中，用0.1%Triton X-100（Roche#92522020）在PBS中渗透10分钟，然后用在PBS中以1:5000稀释的Hoechst 33342（Mol. Probes＃H-21492）将DNA染色。使用靶标激活生物应用程序，用CellInsight NXT®筛选平台（Thermo Fischer）扫描染色的板，以量化每个视野的细胞核，即每个孔的细胞测量。对于这两种测定，从式I的10点系列稀释曲线报告绝对EC

如表2所示，儿科NBL细胞系对用式I化合物的体外处理高度敏感。这表明式I化合物能有效抑制多种神经母细胞瘤细胞系的细胞生长。

表2

神经母细胞瘤异种移植瘤模型中的单药功效

可以在神经母细胞瘤的体内小鼠模型中评价式I化合物或其药学上可接受的盐的功效。可以使用28天的BID给药时间表，对带有细胞衍生的异种移植物（CDX）的裸鼠或C.B-17 SCID小鼠口服施用2-甲基-2-丙烷胺盐形式的式I化合物（34.5mg/kg）。每周可测量两次肿瘤体积和体重。

以下方案可用于测量响应于活性药物成分的肿瘤体积的减少。在培养物中扩增人NBL癌细胞，收获周期，并将在200 µL 1:1 HBSS和Matrigel®的1:1溶液中的5×10

将2-甲基-2-丙烷胺盐形式的式I化合物配制到在25 mM磷酸盐缓冲液中的20％2-羟丙基-β-环糊精中，pH为 2，并以34.5 mg/kg BID口服给药28天。每周两次测量体重和肿瘤体积。

发现2-甲基-2-丙烷胺盐形式的式I化合物具有如表3中提供的%回归值。

表3

在神经母细胞瘤异种移植模型中评价2-甲基-2-丙烷胺盐形式的式I化合物

CDX是指细胞衍生的异种移植类型。

N是指重复的次数（#）。

这些结果表明，在人NBL异种移植模型中，2-甲基-2-丙烷胺盐形式的式I化合物表现出显著的抗肿瘤活性。2-甲基-2-丙烷胺盐形式的式I化合物作为单一药剂在测试的100%（3/3）的儿科NBL体内小鼠模型中有效，其结果范围从稳定疾病到完全响应。