一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体为一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，包括如下步骤：步骤1：将肝癌组织标本的表面清洗并去除脂肪组织；步骤2：将组织剪成小块接种到孔板中并采用初级培养基培养；步骤3：待肿瘤浸润淋巴细胞爬出孔板达一定数量后，将肿瘤浸润淋巴细胞和饲养细胞混合接种并加入加入全培养基中培养；步骤4：培养至饲养细胞至少部分死亡后，收集细胞冻存，得到肿瘤浸润淋巴细胞。该方法快速可靠且性价比高，经过本发明的方法能够在较短时间内获得足够数目的淋巴细胞，同时这些淋巴细胞亦具有相当的活力，可用于ACT等细胞治疗，为CAR‑T、TCR‑T等治疗方法提供良好基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法。

背景技术

肝癌是世界第四最常见肿瘤相关死亡原因，其五年生存率只有18％，是第二最常见致死肿瘤，仅次于胰腺癌。肝癌中有接近90％的病理类型为肝细胞癌，常见的发病危险因素为：肝硬化、年龄、种族、性别以及肝脏损害程度，乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染已成为肝癌发病的两个重要原因之一。肝癌患者通常合并分子病理学的改变，接近30％早起肝癌患者存在免疫活化，但于此同时，亦有25％患者没有免疫浸润。早期肝癌可选择肿瘤消融术、手术切除、肝移植等治疗方式，但晚期肝癌患者可供选择的方案不多，常见的一线用药未索拉非尼和仑伐替尼，虽然同时亦有许多临床试验在进行中，但效果差强人意。因此，开发新的肝癌治疗方法尤为重要。

肿瘤免疫治疗现正成为研究热点，ACT(Adaptive cell transfer)疗法为肿瘤晚期病人带来一线希望。但体外淋巴细胞的培养、扩增以及如何能在短时间内获得足够数目的可以用于治疗的细胞一直是个难题。

本申请比较了手动研磨肿瘤组织和机器研磨肿瘤组织后使用淋巴细胞分离液和CD45磁珠纯化后培养肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)，以及单纯组织块爬出细胞培养TIL等各种不同方法，旨在发现一种快速可靠且性价比高的体外培养TIL的方法，在较短时间内获得足够数目的淋巴细胞，同时这些淋巴细胞亦具有相当的活力，可用于ACT等细胞治疗，为CAR-T、TCR-T等治疗方法提供良好基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，该方法快速可靠且性价比高，经过本发明的方法能够在较短时间内获得足够数目的淋巴细胞，同时这些淋巴细胞亦具有相当的活力，可用于ACT等细胞治疗，为CAR-T、TCR-T等治疗方法提供良好基础。

在详细描述本发明的方法之前，对本文涉及的相关技术名词予以解释：

肿瘤浸润淋巴细胞：tumor-infiltrating lymphocyte,TIL；

rhIL-2：重组人白介-素2；

HEPES：Good’s缓冲试剂,中文全称为N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸；

RMPI-1640：Roswell Park Memorial Institute洛斯维·帕克纪念研究所1640培养基；

OKT3：抗人成熟T细胞共同分化抗原CD3的单克隆抗体；

PBS：磷酸缓冲盐溶液。

本发明提供的技术方案为：一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，包括如下步骤：

步骤1：将肝癌组织标本的表面清洗并去除脂肪组织；

步骤2：将组织剪成小块接种到孔板中并采用初级培养基培养；

步骤3：待肿瘤浸润淋巴细胞爬出孔板达一定数量后，将肿瘤浸润淋巴细胞和饲养细胞混合接种并加入加入全培养基中培养；

步骤4：培养至饲养细胞至少部分死亡后，收集细胞冻存，得到肿瘤浸润淋巴细胞；

其中初级培养基中含10％人AB血清、6000U/ml rhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、RMPI-1640；

所述全培养基中含10％人AB血清、500U/ml rhIL-2、2mM左旋谷氨酰胺、25mMHEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素、50ng/ml OKT3、RMPI-1640。

在上述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法中，所述步骤2和步骤3的培养条件均为：在孵箱中以37℃，5％CO

在上述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法中，所述步骤2中的组织剪成1～2mm

在上述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法中，所述步骤3中，待肿瘤浸润淋巴细胞爬出孔板不少于10

在上述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法中，所述步骤2和步骤3之间，需要每隔1日更换初级培养基。

在上述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法中，所述步骤3中，肿瘤浸润淋巴细胞和饲养细胞的比例为1:100。

在上述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法中，所述步骤3中接种于24孔板，所述步骤3和步骤4之间还包括：

隔日观察细胞并进行换液，待镜下可见一定量的肿瘤浸润淋巴细胞增殖团时，进行传代处理；

经传代处理，待肿瘤浸润淋巴细胞长满2个24孔板的孔时，转到6孔板中，并隔日使用全培养基换液。

在上述的新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法中，所述步骤4在步骤1之后10天进行。

有益效果：

(1)操作便捷：无需gentleMACS等仪器对组织块进行匀浆消化处理，只需要简单的一把捏子和眼科剪将组织剪成小块培养；

(2)经济：无需肿瘤解离试剂盒等昂贵试剂，只需RMPI-1640、双抗、rhIL-2、OKT-3等简单试剂便可对肿瘤浸润淋巴细胞进行培养；

(3)培养耗时相对短：从获得组织到收取细胞冻存，平均培养时间为20天左右；

(4)获得的细胞总数多，淋巴细胞纯度高，并可保持与day0数据一致的CD4、CD8细胞表型。

附图说明

图1为不同的组织培养方法的效果曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

原料说明：

实施例

一种新型的原发性肝癌肿瘤浸润淋巴细胞的培养及体外扩增方法，包括如下步骤

1)使用PBS将肝癌组织标本表面的血冲洗干净后用镊子、眼科剪等去除多余的脂肪组织，将组织剪成数个1～2mm

2)每隔1天观察细胞爬出情况，并使用初级培养基进行换液处理；

3)待镜下观察细胞爬出较多，计数大约到10

4)隔日观察细胞并进行换液，待镜下可见较多细胞增殖团时，进行传代处理；

5)待长满2个24孔板的孔时，转到6孔板中，并隔日使用全培换液；

6)待饲养细胞死亡(一般得培养至10天后)时，收取细胞冻存。

本发明的优势在于：

(1)操作便捷：无需gentleMACS等仪器对组织块进行匀浆消化处理，只需要简单的一把捏子和眼科剪将组织剪成小块培养；

(2)经济：无需肿瘤解离试剂盒等昂贵试剂，只需RMPI-1640、双抗、rhIL-2、OKT-3等简单试剂便可对肿瘤浸润淋巴细胞进行培养；

(3)培养耗时相对短：从获得组织到收取细胞冻存，平均培养时间为20天左右；

(4)获得的细胞总数多，淋巴细胞纯度高，并可保持与day0数据一致的CD4、CD8细胞表型。

(5)所需组织质量小，方便临床实际应用；

(6)培养方案简便，全程只分为初始培养阶段(平均所需时间大约为5天)和后续扩增阶段(平均所需时间为10～15天)，总共约需20天便可获得足量的肿瘤浸润淋巴细胞；

(7)我们比较了混合酶消化和组织块直接培养等不同方式培养TIL的优劣，如图1。

其中，LF:混合酶消化后淋分法；LF+CZ:混合酶消化淋分后CD45磁珠分选后培养；F1:组织块1直接培养；F2:组织块2直接培养；其中组织块1和组织块2为2个平行的实验。

从图1可以看出，组织块直接培养的方法去其他两种在培养20天后得到的细胞数并未存在明显差异，而且组织块培养的方法更操作简便，经济易行。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。