大容量培养箱用细胞培养片组件及包括其的大容量培养箱

摘要

本发明提供大容量培养箱用细胞培养片。本发明一实施例的细胞培养片设置于大容量培养箱，在上述大容量培养箱的内部，多张片以片之间的规定间隔隔开配置，上述细胞培养片的面积为100cm2以上且弯曲深度为0.5cm以下。由此，在有限的体积空间紧密配置培养片的情况下，朝向特定方向的下垂或形状变形少，由此，防止与相邻配置的其他培养片相接触，从而，可防止无效区引起的细胞培养量的减少。进而，可使上述接触引起的细胞培养液的流动妨碍最小化或防止，其可稳定且顺畅地以大容量培养细胞，因此，适合于大容量培养箱且可广泛应用于细胞培养产业。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养片组件，更详细地，涉及大容量培养箱用细胞培养片组件及包括其的大容量培养箱。

背景技术

近年来，随着培养细胞在疾病治疗中的用途扩大，对于细胞培养的关注及研究正在增加。细胞培养为从生物体收集细胞并在体外培养的技术，培养的细胞可通过分化为皮肤、器官、神经等身体的各种组织来移植到人体或以分化之前的状态移植到人体，由此同时进行植入及分化，从而可用于治疗各种疾病。

需要以超出实验室水平的量培养靶细胞的数，来向人体移植为了治疗疾病而培养的细胞。但是，细胞难以在不是二维的三维上增殖，为了获取大量的细胞，不可避免使用大面积的支架来培养细胞。

但是，当考虑细胞培养箱具有有限的体积时，增加支架的面积时受限，需具有在有限的体积的细胞培养箱内具有尽可能大的比表面积的支架。

作为解决上述问题的方法，可考虑将多个板形支架以支架之间的规定间隔隔开来配置在有限的培养空间的方案。在此情况下，当支架在培养空间允许的范围内具有最大面积且在有限的高度内层叠大量的支架时，具有薄厚度的支架更有利。

但是，在支架面积变大且厚度变薄的情况下，随着自重的影响增加，支撑侧部的支架的中心部凹陷而朝向下方下垂。并且，在支架被细胞培养液浸湿的情况下，具有支架的下垂更严重的忧虑。在此情况下，由于下垂，一支架的下部面与配置在其下部的支架上部面之间可能相接触，相接触的位置成为细胞无法增殖的无效区，从而具有细胞培养量减少的问题。

并且，细胞培养液位于隔着规定间隔层叠的支架之间，支架的下垂使支架之间的间隔变窄，由此，妨碍或阻隔细胞培养液的流动，从而具有细胞培养效率显著减少的忧虑。

进而，在机械强度无法支撑下垂的发生的情况下，由于流动的细胞培养液，可诱发支架持续晃动，这种晃动具有难以稳定地培养细胞的问题。

因此，急需研究如下的细胞培养支架：设置大面积的细胞培养支架，在隔着规定间隔层叠的情况下，解决如上所述的无效区问题，持续维持支架之间的隔开距离，不妨碍细胞培养液的流动，同时，即使细胞培养液流动，支架也不易晃动，从而，可稳定地培养细胞。

发明内容

技术问题

本发明考虑如上所述的问题而提出，其目的在于，提供如下的大容量培养箱用细胞培养片组件和构成其的大容量培养箱用细胞培养片以及设置有其的大容量培养箱：即使在有限的体积空间内紧密地隔开配置多张大面积细胞培养片，也会使朝向特定方向的下垂或形状变形减少，由此，防止与相邻配置的其他培养片相接触，可使细胞培养液的流动的妨碍最小化或防止其，即使细胞培养液晃动，也不易晃动，从而，可稳定地培养细胞。

技术方案

为了实现如上所述的目的，本发明提供大容量培养箱用细胞培养片组件，多张细胞培养片沿着相对于主表面的垂直方向以规定间隔隔开配置，上述细胞培养片的面积为100cm

根据本发明的一实施例，相邻的细胞培养片之间的垂直距离可以为0.1mm至20mm。

并且，上述细胞培养片可设置有纤维网及薄膜中的一个以上。

并且，上述细胞培养片的厚度可以为200μm至800μm。

并且，上述细胞培养片可包含选自由聚苯乙烯(PS)、聚酯、聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰胺、聚酰亚胺、聚乙烯及聚丙烯组成的组中的一种以上的成分。

并且，上述细胞培养片可包括纤维网，上述纤维网由平均直径为10nm至1.5μm的纤维形成且克重为1g/m

并且，在121℃的温度、1.15的气压条件下，将上述细胞培养片放置1小时后所测量的弯曲深度可以为2.6cm以下。

并且，上述细胞培养片沿着宽度方向或长度方向中的一方向具有规定曲率，曲率半径可以为0.1mm至0.5mm。

并且，在上述细胞培养片的表面可具有生理活性成分，上述生理活性成分具有促进细胞的附着、迁移、增殖及分化中的一种以上的功能。

并且，在上述细胞培养片中，纤维网的厚度为1μm至10μm，上述纤维网的一面可与薄膜层叠为一体。

并且，本发明提供大容量培养箱用细胞培养片，设置于大容量培养箱，在上述大容量培养箱的内部空间，多张细胞培养片沿着相对于主表面的垂直方向以规定间隔隔开配置，细胞培养片的面积为100cm

并且，本发明提供大容量培养箱，其包括：外壳，具有内部空间；以及本发明的细胞培养片组件，收容在上述内部空间。

根据本发明的一实施例，大容量培养箱的特征在于，上述细胞培养片组件形成有沿着单张细胞培养片的边缘隔着规定间隔冲孔的第一孔，还包括：间隔件，形成有第二孔；以及支柱，具有与上述第一孔及第二孔相对应的直径，上述间隔件配置在相邻的细胞培养片之间，来使第二空与细胞培养片的第一孔相对应，上述支柱以贯通相对应来配置的第一孔及第二孔的方式插入。

并且，在上述外壳的相向的两个内侧面可形成有以规定间隔隔开的槽，使得细胞培养片组件中的各个细胞培养片插入固定在外壳内侧面。

并且，本发明提供设置有在本发明的细胞培养片组件及细胞培养片组件中各自的细胞培养片上培养的细胞的组织工程用植入物。

以下，说明在本发明中使用的术语。

本发明的“细胞外基质(extracellular matrix，ECM)”为包围细胞的外部的基质，占据细胞与细胞之间，具有主要由蛋白质和多糖组成的网状结构。

本发明的“基序”为如下的包含氨基酸序列的肽，即，包含于在细胞的附着、迁移、分化等中起到重要作用的细胞外基质中的蛋白质、糖蛋白等，由此，以与贯通细胞薄膜的表面或膜的方式形成的受体在结构上/功能上相互作用，包括从细胞中分离或者通过基因克隆(Gene cloning)技术人工生成的肽。

发明的效果

根据本发明，具有如下的优点，即，即使在有限的体积空间内紧密地隔开配置多张大面积细胞培养片，随着细胞培养片满足本发明的物性，朝向特定方向的下垂或形状变形少，来使与相邻配置的其他培养片相接触而引起的无效区最小化或防止其，由此，可将最初设计的细胞培养面积尽可能利用于细胞培养。并且，可持续且顺畅地维持位于相邻配置的细胞培养片之间的细胞培养液的流动，由此，与大面积细胞培养片的位置无关地，可向细胞提供新鲜的细胞培养液，与大容量培养箱中的位置无关地，有利于恒定维持细胞培养液的二氧化碳浓度等。进而，即使细胞培养液流动，所发生的晃动少，可稳定地培养细胞，由此，可广泛应用于培养大容量的细胞。

附图说明

图1为本发明一实施例的细胞培养片组件的立体图。

图2为本发明比较例的细胞培养片组件的立体图和根据X-X'边界线的部分剖视图。

图3为示出本发明的对于细胞培养片测量弯曲深度的方法的模式图。

图4为图1的分解立体图。

图5为本发明一实施例的细胞培养片组件的分解立体图。

图6为本发明一实施例的大容量培养箱的分解立体图。

图7为本发明一实施例的大容量培养箱的照片。

图8为相邻的细胞培养片相接触的本发明比较例的设置有细胞培养片组件的大容量培养箱的照片。

图9为本发明一实施例的大容量培养箱的照片，两个大容量培养箱中的左侧大容量培养箱处于设置有细胞培养片的状态，右侧大容量培养箱处于未设置细胞培养片的状态的照片。

具体实施方式

以下，参照附图详细说明本发明的实施例，使得本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施。本发明能够以各种不同形态体现，并不限定于在此说明的实施例。在附图中，为了明确说明本发明，省略了与说明无关的部分，在说明书全文中，对相同或相似的结构要素赋予相同的附图标记。

参照图1，在本发明一实施例的细胞培养片组件100中，多张细胞培养片11、12、13沿着相对于主表面垂直的方向隔着规定间隔隔开构成。为了维持上述间隔，在相邻的细胞培养片11、12、13之间，还可包括间隔件20以及用于固定上述间隔件20和上述多张细胞培养片11、12、13的支柱30。

上述细胞培养片11、12、13将单张片的上部面及下部面作为主表面，可将纤维网、薄膜或它们结合的常规细胞培养支架无限制地用作在上述主表面上放置细胞后用于使细胞增殖的支架。

但是，为了适合于单张面积为100cm

先参照图2说明大容量培养箱用细胞培养片具有规定弯曲深度的原因。

如图2所示，在隔着规定间隔隔开配置多张细胞培养片1、2的细胞培养片组件100’中，由于自重，细胞培养片1、2的中心部可发生下垂，在细胞培养片1、2的面积增加或相同面积的情况下，当宽度和长度中的一个大时，这种下垂可更加严重。并且，为了使在有限的体积内层叠的细胞培养片1、2的数量增加，需使细胞培养片的厚度薄，但是，在此情况下，下垂可能更加严重。进而，细胞培养片组件100’能够以浸渍于细胞培养液的状态培养细胞，在细胞培养片1、2被细胞培养液浸湿的情况下，由于重量增加，自重引起的下垂现象可更加严重。

如图2，若发生细胞培养片1、2的下垂，则上部细胞培养片1与下部细胞培养片2之间可相接触，相接触的细胞培养片1、2的区域A成为无效区，在该部分难以培养细胞，诱发细胞可培养量的减少，使得细胞培养液难以顺畅地通过，可显著降低细胞培养效率。进而，在细胞培养液以规定流速向上部细胞培养片1与下部细胞培养片2之间的空间流入并流动的情况下，当通过发生下垂的相邻的细胞培养片1、2之间的空间时，产生流速的差异，由此，在细胞培养液以慢的流速通过的部分中，由于顺畅地供给细胞培养液而无法更换现有的胞培养液来，可降低细胞培养效率。并且，相反地，在细胞培养液以快的速度通过的部分中，由于快的流速，可发生细胞培养片的晃动，在此情况下，细胞难以稳定地附着在细胞培养片并培养，从而可诱发细胞培养效率的降低。

因此，在以单张面积为100cm

另一方面，为了防止细胞培养片的下垂，可考虑设置用于支撑发生下垂的部分的额外的支撑部件(例如，后述的间隔件等)，被支撑部件支撑的细胞培养片区域成为无法培养细胞的无效区，由此，不适合用作在有限的体积内培养尽可能多的细胞的方法。

由此，在本发明的细胞培养片组件中，由如下的细胞培养片构成，即，即使单张面积为100cm

在此情况下，参照图3说明上述弯曲深度，弯曲深度d表示如下情况下的弯曲程度，即，利用重量为500g的夹具按压垂直于分别以18cm、3cm的长度和宽度切割的细胞培养片10的长度方向的一边角至沿着长度方向隔开12.5cm的第一线为止的区域，即，第一部分l，并使其固定在工作台T上部面，在此状态下，长度方向的剩余5.5cm部分被自重弯曲，通过从第一部分l的上部面至弯曲的剩余部分的末端上部边角之间的垂直距离测定。

设置于本发明的细胞培养片组件100的细胞培养片11、12、13的弯曲深度d为0.5cm以下，优选为0.35cm以下。若弯曲深度d大于0.5cm，则当以100cm

另一方面，为了防止细胞培养片过于下垂而使相邻的片之间相接触，可在承受细胞培养片的下垂的情况下增加片之间的距离，如上所述的方法减少可在有限的体积(即，高度)内隔开配置的细胞培养片的数量，因此，不符合所要体现适合于大容量培养箱的细胞培养片的本发明，并不是本发明的考虑对象。

上述细胞培养片11、12、13只要是用于常规细胞培养支架的材质就没有限制。如一例，上述细胞培养片11、12、13可利用选自由聚苯乙烯(PS)、聚酯、聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯腈(PAN)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰胺、聚亚烷基、聚亚烷基环氧(poly(alkylene oxide))、聚氨基酸(poly(amino acids))、聚烯丙胺(poly(allylamines))、聚磷腈(polyphosphazene)、聚氨酯及聚乙烯环氧-聚丙烯环氧嵌段共聚物组成的组中的一种以上的非生物降解成分、由聚己内酯(polycaprolactone)、聚对二氧环己酮(polydioxanone)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、左旋聚乳酸(PLLA，poly(L-lactide))、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA，poly(DL-lactide-co-glycolide))、聚乳酸(Polylacticacid)及聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)组成的组中的一种以上的生物降解成分、它们的混合物或它们的共聚物形成。优选地，上述细胞培养片11、12、13可包含选自由聚苯乙烯(PS)、聚酯、聚醚砜(PES)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚酰胺、聚酰亚胺、聚乙烯及聚丙烯组成的组中的一种以上的成分。

并且，上述细胞培养片11、12、13可设置纤维网及薄膜中的一个以上来实现。具体地，上述细胞培养片11、12、13可以为包括一张纤维网或单独的薄膜或者多张纤维网或薄膜的层叠体。或者，可以为一张或多张纤维网与一张或多张薄膜结合为一体的层叠体。在此情况下，在纤维网与薄膜结合的情况下，可通过硅材质等的粘结剂结合或者在没有粘结剂的情况下通过薄膜或纤维网的部分熔融结合。根据一实施例，细胞培养片可以为纤维网与支撑上述纤维网的薄膜形成为一体的层叠体。在此情况下，有利于利用纤维网表面的形态有效地放置细胞并使细胞增殖，还可在通过纤维网内部气孔形成的空间使细胞增殖，因此，可有利于细胞的三维生长。并且，与一面一体化的薄膜放置于纤维网后，防止细胞因自重通过纤维网内部并朝向下方脱离，同时，具有可更有利于实现本发明的弯曲深度的优点。进而，随着呈纤维网与薄膜层叠的形态，处理性得到提高，可更容易在培养箱安装细胞培养片。同时，在将后述的生理活性成分，如作为肽的基序涂敷在纤维网的情况下，涂敷表面可根据纤维网的形态体现更有助于细胞的附着、再生及增殖的拓扑结构，从而可更有利于细胞增殖。另一方面，在纤维网的情况下，当纤维直径大时，纤维网的密度小，根据如上所述的拓扑结构的效果甚微。并且，相比于单独设置薄膜情况，设置纤维网的细胞培养片可更有利于回收细胞，尤其，随着细胞培养片的大面积化，细胞回收率可显著优秀。

上述纤维网可通过纺粘法、熔喷法等的公知方法以网状体现，或者可通过电纺丝体现。并且，上述纤维网由平均直径为10nm至1.5μm的纤维形成，克重可以为1g/m

并且，上述薄膜可以为通过公知方法体现的薄膜，如一例，形成薄膜的成分被熔融而通过模具挤压，或者形成薄膜的成分被溶解后通过常规涂敷方法以规定厚度形成于基材上。并且，为了提高亲水性，可通过等离子处理等对薄膜的表面进行改性，用于提高亲水性的表面改性方法可使用公知的方法，因此，本发明并不特别限定。并且，为了提高放入细胞后的薄膜表面与细胞之间的附着力，可在作为薄膜的细胞培养片的表面形成微细弯曲、槽等，来具有规定的表面粗糙度。

上述细胞培养片11、12、13的厚度优选为200μm至800μm，更优选为250μm至700μm，更加优选为300μm至520μm。若厚度小于200μm，则厚度薄而难以满足本发明的弯曲深度。尤其，在通过单独的纤维网体现细胞培养片的情况下，调整纤维直径/克重等也难以满足上述弯曲深度。并且，当进行用于灭菌工序而执行的高温、高压处理时，可诱发细胞培养片的扭曲、弯曲等形状变形，由于形状变形，具有没有自重也可使细胞培养片之间相接触的忧虑。进而，当细胞培养片以100cm

另一方面，可在高温、高压条件下，对细胞培养片进行灭菌，即使在这种条件下进行灭菌，为了防止如上所述的各种问题的发生，细胞培养片的厚度优选为300μm至520μm。

并且，在细胞培养片11、12、13为纤维网与薄膜形成为一体的层叠体的情况下，纤维网的厚度优选为1μm至10μm，由此，可表达进一步得到提高的细胞增殖效果，尤其，可更有利于干细胞的增殖。更优选地，在上述纤维网中，所设置的纤维的平均直径为200nm至300nm，克重为2.5g/m

如另一例，在上述纤维网中，所设置的纤维的平均直径为500nm至600nm，上述纤维网的克重为3g/m

并且，上述细胞培养片11、12、13的面积为100cm

另一方面，以具有如上所述的弯曲深度的方式体现作为纤维网、薄膜或结合它们的层叠体的单张细胞培养片的方法并不受限。作为调节所目的的规定弯曲深度的一例，可通过在优选范围内调节厚度、调节层叠数量、变更材质、形成纤维网的网的纤维的直径和/或克重调节、机械强度优秀的异质纤维网或薄膜的层叠等实现，因此，本发明将省略与之有关的具体说明。

但是，对于大面积细胞培养片的自重引起的下垂的发生，难以将细胞培养片的厚度视作影响其的唯一因素，反而，受到细胞培养片的弯曲特性、蠕变、热变形温度、热膨胀系数、朝向TD及MD方向收缩/膨胀率的差异、冲载的细胞培养片的方向性(如一例，MD方向是否为冲载的片的长度方向、宽度方向或者并不是长度方向和宽度方向的其他方向等)的影响更大。由此，可通过复合调整这些因素来体现本发明的弯曲深度。

并且，在121℃的温度、1.15的气压条件下，将上述细胞培养片11、12、13放置1小时后所测量的弯曲深度可以为0.5cm以下。在放入细胞前，细胞培养片可在高温、高压条件下进行灭菌过程，在培养细胞的过程中，维持浸渍于细胞培养液的状态，因此，需要在高温、多湿的条件下也防止下垂的形状维持力。由此，在121℃的温度、1.15的气压条件下放置1小时后所测量的弯曲深度满足0.5cm以下的细胞培养片经过高温杀菌过程后，在以浸渍于细胞培养液的状态长时间持续培养细胞的情况下，也防止无效区的产生，并可有利于更稳定地培养更多的细胞。在此情况下，作为满足中这种条件的细胞培养片的一例，可以为单独使用如高耐热性聚酯、聚酰亚胺、聚碳酸酯的材质的薄膜或层叠上述材质的薄膜和纤维网的形态，在聚苯乙烯薄膜的情况下，当以高温高压的灭菌条件进行处理时，具有导致形状变形的忧虑。

并且，上述细胞培养片11、12、13可具有朝向宽度方向或长度方向中的一方向的规定曲率。原因在于，在形成有曲率的细胞培养片的凸出的部分以与自重方向相反的方向层叠的情况下，可抵消自重引起的中心部的下垂，在此情况下，曲率半径可以为0.1mm至0.5mm，若曲率半径小于0.1mm，则通过曲率抵消自重影响的效果甚微，若曲率大于0.5mm，则由于过多的曲率，相邻的细胞培养片之间可相接触。

另一方面，在上述细胞培养片11、12、13的表面可具有生理活性成分，上述生理活性成分具有诱导或促进细胞的附着、迁移、增殖及分化中的一种以上的功能。

上述生理活性成分可包含选自由单胺、氨基酸、肽、糖(saccharide)、脂质(lipid)、蛋白质、糖蛋白(glucoprotein)、唐脂(glucolipid)、蛋白聚糖、黏多糖(mucopolysaccharide)及核酸(nucleic acid)组成的组中的一种以上的化合物及细胞中的一种以上。具体地，上述生理活性物质可以为存在于细胞外基质的物质或以与其相似相同或相似的方式人工制备的物质。

并且，上述生理活性成分可包含基序。上述基序可以为包含位于选自生长因子(growth factor)或细胞外基质(extracellular matrix)中所包含的蛋白质、糖蛋白及蛋白聚糖中的一种以上的规定氨基酸序列的天然肽或重组肽。具体地，上述基序可包含选自由肾上腺髓质素(Adrenomedullin)、血管生成素(Angiopoietin)、骨成型蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、红细胞生成素(Erythropoietin)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor)、神经胶质细胞源性的神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、生长分化因子-9(Growth differentiation factor-9，GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(Hepatoma-derived growth factor，HDGF)、胰岛素样生长因子(Insulin-like growthfactor，IGF)、角质细胞生长因子(Keratinocyte growth factor，KGF)、迁移刺激因子(Migration-stimulating factor，MSF)、肌生成抑制蛋白(Myostatin，GDF-8)、神经生长因子(Nerve growth factor，NGF)、血小板源性生长因子(Platelet-derived growthfactor，PDGF)、促血小板生成素(Thrombopoietin，TPO)、T-细胞生长因子(T-cell growthfactor，TCGF)、神经毡蛋白、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)及白细胞介素-7(IL-7)组成的组中的一种以上的生长因子(GF)中所包含的规定的氨基酸序列。或者，可包含选自由透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、海藻酸盐、纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋包、弹性蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、钙黏蛋白及层粘连蛋白组成的组中的一种以上的细胞外基质(extracellular matrix)中所包含的规定的氨基酸序列。

并且，上述基序可都包含生长因子中所包含的规定的氨基酸序列及上述细胞外基质中所包含的规定的氨基酸序列两者。更优选地，上述基序可包含选自由包含SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:28的氨基酸序列来形成的蛋白质及这些蛋白质中的至少两个融合的蛋白质组成的组中的一种以上，但并不局限于此。

另一方面，上述细胞培养片11、12、13还可具有粘结成分。上述粘结成分可执行在初期将培养细胞固定在细胞培养片来防止添加至培养溶液上的细胞悬浮的功能和/或将并不是粘结成分的生理活性成分固定在细胞培养片来防止在细胞培养过程中生理活性成分从细胞培养片脱离的功能。

为了增强细胞的附着性，上述粘结成分可包含公知的贻贝蛋白或贻贝蛋白中的特定结构域或基序。上述粘结成分在具有常规生物相容性而不生成细胞毒性的公知的粘结成分的情况下，可无限制地使用，优选地，可包含选自由SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:7的氨基酸序列反复1次至20次来形成的蛋白质及这些蛋白质中的至少两个融合的蛋白质组成的组中的一种以上，由此，具有如下的优点，即，细胞毒性显著降低，生理活性成分的粘结力优秀，同时，在细胞培养的过程中，防止随着粘结成分溶解在培养溶液而发生的生理活性成分的脱离或细胞的分离。

并且，在生理活性成分为基序的情况下，上述基序可与粘结成分共价结合来以一体型体现。如一例，在上述粘结成分为蛋白质的情况下，使上述基序与多肽的N-末端和/或C-末端直接共价结合或者通过介入异源肽或多肽来共价结合，在此情况下，可更坚固地在细胞培养片附着生理活性成分，可使生理活性成分的细胞培养中的脱离最小化。

并且，如上所述的生理活性成分可通过公知的方法提供至细胞培养片11、12、13的表面。如一例，上述生理活性成分可通过涂敷工序提供至纤维网或薄膜的表面。在涂敷在纤维网的表面的情况下，在维持纤维网的气孔结构的同时涂敷在构成纤维网的纤维外表面和/或在堵塞纤维网表面侧的一部分气孔结构的同时集中在纤维网表面侧来涂敷。或者，上述生理活性物质与形成纤维网或薄膜的高分子化合物一同混合来从用于制备纤维网或薄膜的粗液制备步骤开始使用。在此情况下，具有如下的优点，即，没有额外的涂敷工序或用于固定生理活性物质的额外的粘结成分也可容易将生理活性物质提供至所制备的纤维网或薄膜的外部面。

接着，说明配置在相邻的细胞培养片11、12、13之间的间隔件20。在多张细胞培养片11、12、13层层地层叠的情况下，上述间隔件20起到维持相邻的细胞培养片之间的规定间隔的作用。上述间隔件20为不溶解于细胞培养液的材质，可无限制地使用不妨碍细胞培养液的流动的形状。

在此情况下，上述间隔件20的厚度可以为相邻配置的细胞培养片之间的距离。

并且，参照图4及图5，如图4，上述间隔件20的形状可以为O形环的形状，或者如图5，间隔件20'可以为具有规定宽度且沿着一方向长长的形成的形状，但形状并不局限于此。

并且，上述支柱30起到固定如上所述的细胞培养片11、12、13和间隔件20的作用。上述支柱30为不溶解于细胞培养液的材质，直径可与形成在细胞培养片11、12、13和间隔件20的孔的直径相同或小于其。

参照图4及图5，在细胞培养片组件100、100"中，上述细胞培养片11、12、13可沿着单张细胞培养片的边缘形成隔着规定间隔冲孔的第一孔H1，上述间隔件20、20'可形成第二孔H2、H'2，上述间隔件20、20'配置在细胞培养片11、12、13之间，使得相邻配置的细胞培养片11、12、13的第一孔H1与第二孔H2、H'2相对应，上述支柱30以与细胞培养片11、12、13的层叠方向平行地贯通上述第一孔H1及第二孔H2、H'2的方式插入，由此，可固定细胞培养片11、12、13及间隔件20、20'。

形成于上述间隔件20的第二孔H2的直径可与第一孔H1的直径相同，但并不局限于此。并且，上述相邻的第一孔H1之间的距离可以为5cm，更优选为2.5cm，更加优选为1cm以下，由此，具有还可在结构上防止细胞培养片的下垂的优点。

图1所示的细胞培养片组件100可收容在外壳内部来体现大容量培养箱。在此情况下，在上述外壳的内部形成有收容支柱30的端部的槽，使得所收容的细胞培养片组件100可固定在外壳内部。或者，在上述外壳可形成使上述支柱30端部贯通的孔，在支柱30插入至孔后，支柱30的端部可从外壳外部通过如螺栓的额外的紧固部件紧固的方式固定在外壳内部。

另一方面，与图1及图4不同地，如图6所示，本发明一实施例的细胞培养片组件200以多张细胞培养片14、15、16插入至形成于大容量培养箱1000的外壳40内部面的槽41的方式嵌入，由此，能够以形成规定间隔的方式体现。在此情况下，上述外壳40可以为除使细胞培养片14、15、16插入的一侧壁之外的剩余面均封闭的结构。在此情况下，即使没有间隔件等隔开细胞培养片的额外的部件，细胞培养片14、15、16可形成多张细胞培养片以规定的垂直距离隔开的细胞培养片组件200。

除多张细胞培养片之外，本发明另一实施例的细胞培养片组件还可包括图6的具有外壳40的变形结构的引导部件来体现。上述引导部件能够以在图6的外壳40中除形成有槽41的两侧壁之外的剩余侧壁部分与上部及下部敞开的结构体现。在此情况下，多张细胞培养片安装在引导部件的槽的细胞培养片组件成为如盒的一个单位单元，多个单位单元可收容在外壳内部来构成大容量培养箱。

在如上所述的细胞培养片组件100、100"、200中，可设置10张至100张的细胞培养片，但可根据大容量培养箱的容量适当变更，因此，并不局限于此。

在如上所述的本发明的细胞培养片中，多张片能够以片之间的规定间隔隔开层叠来体现大容量培养箱。

在此情况下，细胞培养片的片之间的间隔可以为0.1mm至50mm，更优选为0.1mm至20mm，更加优选为0.5mm至20mm，进一步优选为0.5mm至12mm。若细胞培养片间隔大于100mm，则在有限的空间内设置的细胞培养片的数量可减少。并且，若细胞培养片间隔小于0.1mm，则细胞培养液难以通过以规定间隔形成的细胞培养片之间的隔开空间，由此，具有细胞培养效率降低的忧虑。并且，即使本发明的具有弯曲深度的细胞培养片，当被细胞培养液浸湿后因自重下垂时，也具有产生无效区的忧虑。

另一方面，作为大容量培养箱的一结构的如上所述的外壳可在内部形成空间来收容细胞培养片组件。并且，上述外壳还可包括细胞培养液流入口和流出口，使得细胞培养液向外壳内部流入且为了更换细胞培养液而向外部流出。在此情况下，如一例，上述流入口及流出口的直径可以为0.5π至5π或1π至3π。并且，通过上述流入口流入的细胞培养液的流速为80ml/min以下，更优选为20ml/min至50ml/min，由此，有利于使形成于外壳内部的细胞培养液的流动引起的细胞培养片的晃动最小化。

并且，本发明可利用上述大容量培养箱体现大容量细胞培养系统。上述大容量细胞培养系统可通过设置大容量培养箱、向上述大容量培养箱的一侧供给细胞培养所需的培养基的培养基供给装置以及用于使上述培养基循环的泵来体现。

上述培养基供给装置、泵可适当采用、变更在本技术领域中通常以大容量培养细胞时使用的结构，因此，将省略对其的具体说明。或者，设置上述大容量培养箱的具体结构、培养基供给装置及泵的大容量细胞培养系统参照本发明的申请人发明的韩国专利申请号第10-2018-0140008号，在该专利文献公开的大容量细胞培养系统采用本发明的细胞培养片的情况下，可有利于更显著地培养大量细胞。

并且，本发明一实施例的如上所述的细胞培养片组件，具体地，在构成细胞培养片组件的细胞培养片上培养的细胞可与细胞培养片组件或从细胞培养片组件分离的单张细胞培养片一同以组织工程用植入物体现。在此情况下，上述细胞培养片可使用由生物降解成分体现的细胞培养片，在此情况下，可直接以细胞培养片移植到人体等。并且，上述细胞可包含选自由全能干细胞、万能干细胞、多能干细胞、寡能(oligopotent)干细胞及单一干细胞组成的组中的一种以上的干细胞以及由造血干细胞、肝细胞、纤维细胞、上皮细胞、间皮细胞、内皮细胞、肌细胞、神经细胞、免疫细胞、脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、血液细胞及皮肤细胞组成的组中的分化细胞中的一种以上。

下述表1示出如上所述的生理活性成分的氨基酸序列。

表1

发明实施方式

实施例1

准备了由平均直径为260nm的聚偏二氟乙烯纤维形成且克重为4.5g/m

实施例2至7

通过与实施例1相同的方式实施并制造，将细胞培养片的材质、结构规格变更为如下述表2，从而制备了如下述表2的细胞培养片。

比较例1至2

通过与实施例1相同的方式实施并制造，将细胞培养片的材质、结构规格变更为如下述表2，从而制备了如下述表2的细胞培养片。

实验例1

分别以18cm、3cm的宽度、长度冲载所制造的细胞培养片后，如图3所示，利用重量为500g的夹具按压垂直于冲载的试片的长度方向的一边角至沿着长度方向隔开12.5cm的第一线为止的区域，即，第一部分ll，并使其固定在工作台T的上部面，在此状态下，测量长度方向的剩余5.5cm部分因自重弯曲到何种程度，并以弯曲深度示出在下述表2。具体地，通过从第一部分l的上部面弯曲的剩余部分的末端上部边角之间的垂直距离来测量弯曲深度d。并且，为了评价高温、高压条件下的弯曲深度，以相同大小冲载细胞培养片后，在121℃的温度、1.15的气压条件下，放置1小时后通过如上所述的方法测量弯曲深度。

实验例2

分别以11cm、11cm的宽度、长度冲载实施例及比较例的细胞培养片后，以与图9的右侧大容量培养箱外壳内部的支柱相对应的方式对细胞培养片进行冲孔。之后，以5kGy的强度向所准备的细胞培养片照射γ-射线(γ-ray)，由此，对细胞培养片进行灭菌。之后，使厚度为1mm且以与上述支柱的直径相对应的方式冲孔的间隔件通过大容量培养箱外壳内部的支柱。接着，在大容量培养箱的内部安装一张细胞培养片，使得冲孔的孔通过上述支柱。之后，再次使厚度为1mm的间隔件通过支柱，并通过安装一张细胞培养片的方式体现共30张的细胞培养片以1mm的垂直距离隔开形成的细胞培养片组件。接着，密封大容量培养箱外壳来使其不受到外部空气影响后，通过设置于一侧面的细胞培养液流入管投入混合有所要接种的细胞的细胞培养液，并在37℃的温度条件下培养5天。在此情况下，上述混合有所要接种的细胞的细胞培养液使用如下的细胞培养液，即，在500ml的KBS-3Basal medium(B1001)混合2ml的KSB-3supplyments(S2901)的培养基，投入胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)来使其占培养基总重量的10％，包含青霉素(Penicillin)/链霉素(Streptomycin)来使其成为培养基总体积的1/100，并且，在通过上述方式制备的细胞培养液包含间充质干细胞来使每细胞培养片单位面积的数量成为4000个/cm

之后，回收通过培养增殖的细胞并对细胞数量进行计数。具体地，在大容量培养箱去除培养基后，向外壳内部注入将温度调节为37℃的0.15％的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)溶液，从细胞培养片分离悬浮通过放置规定时间来培养的细胞后，为了中和胰蛋白酶成分，再次注入相同的细胞培养溶液并回收其。接着，通过使用离心分离机将所回收的溶液中的细胞沉淀并去除上清液，之后，以1∶1的比例混合所提取的细胞溶液与台盼蓝(Trypan blue)溶液，对于所混合的溶液，利用细胞计数器(cell counter)计数细胞数，在下述表2示出以比例计算相对于所接种的细胞数的增殖后回收的细胞数的细胞增殖回收率。

并且，分别以25cm、25cm的宽度、长度冲裁实施例及比较例的细胞培养片后，通过与上述方法相同的方法增殖细胞后计算细胞增殖回收率，并在下述表2示出。

另一方面，在下述表3示出对于包含所回收的细胞的溶液使用细胞计数器来导出的在实施例1和实施例6中回收的细胞的大小范围。

并且，相对于培养前接种的细胞，利用CD标记(CD29、CD44、CD73、CD10、CD11b、CD34、CD45)且通过流式细胞仪(FACS)分析通过实施例1/实施例6增殖、回收的细胞是否具有转化，并在下述表3一同示出其结果。

表2

如可通过表1确认，对于细胞增殖回收率，与弯曲深度为0.5cm以下的细胞培养片相对应的实施例与比较例相比更优秀。具体观察实施例的结果，当比较实施例4和实施例2时，实施例4的弯曲深度更小，因此，可更有利于细胞培养，经预测，细胞增殖回收率的差异较少的原因在于，纤维网的规格差异，在所培养的间充质干细胞中，相比于在实施例4中使用的纤维网的形态，在实施例2中使用的纤维网的形态更有利于培养细胞。在实施例5中所使用的薄膜的材质为聚苯乙烯，当利用γ射线进行灭菌时，相比于实施例1，细胞增殖回收率为相似的水平，但是，当在高温高压条件下进行灭菌时，由于细胞培养片的薄膜部分熔融，无法测量弯曲深度。由此可知，在缓解灭菌方式的局限的方面，在实施例1中使用的聚碳酸酯材质的薄膜与实施例5相比更有利。

另一方面，实施例6为单独使用薄膜的情况，具有优秀的细胞培养效率，但是，相比于实施例8，可知细胞培养效率显著降低。另一方面，在实施例7中，相比于11cm×11cm的大小，25cm×25cm大小的片的细胞增殖回收率的降低幅度较大，这是因为，随着细胞在薄膜上形成膜并增殖，回收结果，细胞不被分离且存在细胞聚集而回收的细胞。

并且，在比较实施例1和实施例7的情况下，当以25cm×25cm的大小大面积化时，可确认，实施例1的细胞增殖回收率更高，这是因为，在实施例7的细胞培养片的情况下，在浸渍于细胞培养液的状态下，相比于实施例1，细胞培养液的浸湿影响更大。

表3

可通过表3确认，通过实施例1及实施例6的细胞培养片增殖、回收的细胞没有细胞转化的变化。但是，在实施例1的细胞培养片中增殖、回收的细胞的大小略小于在实施例6的细胞培养片中增殖、回收的细胞的大小，由此可知，所培养的细胞非常新鲜且细胞状态优秀。通过实施例1的细胞培养片增殖、回收的细胞地大小较小的原因在于，通过纤维网形态的拓扑结构效果和相对于薄膜的纤维网特性，可通过在本申请中记载的优选的纤维网更加优秀的实现这种效果。

以上，说明了本发明的一实施例，本发明的思想并不局限于在本说明书中提出的实施例，理解本发明的思想的普通技术人员可在相同思想的范围内容易通过结构要素的附加、变更、删除、追加等提出其他实施例，这也属于本发明的思想范围内。