用于产生具有热稳定纤维素分解活性的植物细胞壁降解酶的转基因微藻

摘要

本发明涉及用于生产具有热稳定纤维素分解活性的细胞壁降解酶(HCWDE)的转基因微藻及其在工业领域中纤维素或木质纤维素源的生物降解中的相关用途。

说明书

本发明涉及用于产生具有热稳定纤维素分解活性的植物细胞壁降解酶(HCWDE)的转基因微藻及其在工业领域中纤维素或木质纤维素源的生物降解中的相关用途。

木质纤维素是地球上最丰富的有机碳源，并且是碳水化合物的储藏库，具有很大的潜力用于生产生物燃料。不幸的是，其极度难以转化成单糖的性质极大地限制了其在该领域的开发(Sanderson K.，2011；Saini J.K.等人，2015)。

包括物理、物理化学、化学和生物处理的方法通常用于减少对水解的抵抗并促进糖化作用(Harmsen PFH等人，2010；Badiei M.等人，2014；Kumar AK和Sharma S.，2017)。

然而，化学处理对环境有害，并且与使用木质纤维素产生某种形式的可持续能源的想法相背；此外，这种处理产生的反应衍生物会抑制微生物的代谢，使单糖向生物能产物(如乙醇，脂质和甲烷)的转化无效(

相反，物理方法尽管相对无污染，但其大规模应用却较昂贵(Kumar A.K.和SharmaS.，2017)。

生物处理涉及使用具有微生物性质的植物壁降解酶(CWDE)，这种酶通常通过培养具有木质纤维素分解活性的嗜中温霉菌和细菌而获得(SánchezC.，2009)。一般而言，这些微生物分泌广范围的CWDE，但量较少，这是其严格需求所需的。

迄今为止，真正的生物技术挑战在于选择能够表达大量CWDE的株系，其然后可用于木质纤维素的降解。

最有希望的株系应具有以下特征：

(i)表达所选酶的能力

(ii)高生产率(指单位时间内产生的酶量)和

(iii)低生产成本。

具有这些表型特征的生物肯定是大规模生产CWDE的有效候选者。

从这个角度来看，微藻可以成为有前途的生物工厂，因为它们具有高生长速率和非常低的生产成本的特点(Brasil B.等人，2017)。

但是，使用微藻作为重组蛋白生物工厂存在局限性；首先，关于微藻作为异源表达系统的知识有限。例如，已经在藻类模型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中尝试了编码细菌和真菌CWDE的转基因的核表达；表达产量低于预期(Rasala B.A.等人，2012)，即使内源性纤维素分解系统的存在导致相反的假定(Blifernez-Klassen等人,2012)。

在负面影响微藻中转基因表达的各种因素中，基因沉默起主要作用(Schroda M.，2006)。

为了避免该问题，本发明尝试首次在微藻的叶绿体中表达一组具有热稳定活性的CWDE(HCWDE)。这种方法的成功难以预测，因为大多数碳水化合物的代谢都位于叶绿体中，因此，纤维素酶的表达在理论上可能会干扰这种代谢。

由于HCWDE(缩写为HC)是细菌来源的，因此它们不需要翻译后修饰即可发挥其正确的功能，因此，叶绿体的原核性质是合乎目的的。

与使用热不稳定的HC酶相比，通过使用热稳定的HC酶降解植物生物质具有多种优势(Anitori R.P.，2012；Peng X.等人，2015)。HC发挥其活性的高温促进木质素从纤维素纤维中部分脱离，有利于HC的活性，同时防止嗜中温微生物的污染(Sarmiento F.等人，2015)。

此外，CWDE蛋白抑制剂和植物防御蛋白酶会因高温而失活，从而不会发生由这些防御蛋白引起的任何可能的抑制机制。

相反，即使在侵蚀性化学试剂、离子型去污剂和极端pH条件下，HC的稳健结构也赋予了显著的酶稳定性，这继而可以促进木质纤维素的弱化，从而进一步提高了酶促水解反应的效率。

作为迈向可持续性的进一步，在叶绿体中表达HC的微藻(下文称为HC-藻类)也经历了工程改造，以在细胞质中表达施氏假单胞菌(P.stutzeri)的亚磷酸脱氢酶D(PTXD)，其表达使微藻类具有了使用亚磷酸根离子作为唯一的磷源的能力，从而允许在含有亚磷酸根离子而不是磷酸根离子的生长培养基中培养藻类(Costas AMG等人，2001；Loera-QuezadaMM等人，2016)。双转基因微藻(下文称为HC-PTXD藻)可以在这种类型的土壤中进行培养，而无需使用无菌材料和程序，因为亚磷酸根离子具有抗真菌作用并且不能被大多数常见细菌代谢。

应该注意的是，灭菌材料和程序对微藻的培养成本有很大的影响，实际上，在某些情况下，它可能占最终生产成本多达50％。参照一些微藻生产公司的价格，在非无菌条件下进行培养可将其生产成本降低多达€5kg

因此，本发明的一个目的涉及转基因微藻的组合，其中每种转基因微藻表达细菌来源的亚磷酸脱氢酶D和选自下组的热稳定植物细胞壁降解酶：新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)的内切葡聚糖酶B(SEQ ID NR：1)、解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticus)的纤维体CelB的具有纤维二糖水解酶活性的部分(SEQ ID NR：3)和强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)的β-葡糖苷酶(SEQ ID NR：5)，其中所述新阿波罗栖热袍菌的内切葡聚糖酶B由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列(SEQ ID NR：2)编码，所述解糖热解纤维素菌的纤维体CelB的部分由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列(SEQ ID NR：4)编码，所述强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列(SEQ ID NR：6)编码。

任选地，可以将表达细菌来源的亚磷酸脱氢酶D和新阿波罗栖热袍菌的木聚糖酶XynA(SEQ ID NR：7)的转基因微藻添加到上述转基因微藻的组合中。

优选地，上述的新阿波罗栖热袍菌的木聚糖酶XynA由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列SEQ ID NR：8编码。

根据本发明的替代实施方案，可以将表达细菌来源的亚磷酸脱氢酶D和木质素酶(除木聚糖酶之外或代替木聚糖酶)的转基因微藻添加到组合中，所述木质素酶优选选自嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的漆酶(SEQ ID NR：14)和嗜热栖热菌的多酚氧化酶(SEQ ID NR：16)。

根据本发明的一个优选实施方案，所述热稳定植物细胞壁降解酶选自：

-新阿波罗栖热袍菌的内切葡聚糖酶B CelB(T-EG)，其具有氨基酸序列：

MAEVVLTDIGATDITFKGFPVTMELNFWNVKSYEGETWLKFDGEKVQFYADIYNIVLQNPDSWVHGYPEIYYGYKPWAAHNSGTEILPVKVKDLPDFYVTLDYSIWYENDLPINLAMETWITRKPDQTSVSSGDVEIMVWFYNNILMPGGQKVDEFTTTIEINGSPVETKWDVYFAPWGWDYLAFRLTTPMKDGRVKFNVKDFVEKAAEVIKKHSTRVENFDEMYFCVWEIGTEFGDPNTTAAKFGWTFKDFSVEIGE

-解糖热解纤维素菌的纤维体CelB的具有纤维二糖水解酶活性的部分(C-CBH)，其具有氨基酸序列：

MGVTTSSPTPTPTPTVTVTPTPTPTPTPTVTATPTPTPTPVSTPATGGQIKVLYANKETNSTTNTIRPWLKVVNSGSSSIDLSRVTIRYWYTVDGERAQSAVSDWAQIGASNVTFKFVKLSSSVSGADYYLEIGFKSGAGQLQPGKDTGEIQIRFNKSDWSNYNQGNDWSWLQSMTSYGENEKVTAYIDGVLVWGQEPSGATPAPTMTVAPTATPTPTLSPTVTPTPAPTQTAIPTPTLTPNPTPTSSIPDDTNDDWLYVSGNKIVDKDGRPVWLTGINWFGYNTGTNVFDGVWSCNLKDTLAEIANRGFNLLRVPISAELILNWSQGIYPKPNINYYVNPELEGKNSLEVFDIVVQTCKEVGLKIMLDIHSIKTDAMGHIYPVWYDEKFTPEDFYKACEWITNRYKNDDTIIAFDLKNEPHGKPWQDTTFAKWDNSTDINNWKYAAETCAKRILNINPNLLIVIEGIEAYPKDDVTWTSKSSSDYYSTWWGGNLRGVRKYPINLGKYQNKVVYSPHDYGPSVYQQPWFYPGFTKESLLQDCWRPNWAYIMEENIAPLLIGEWGGHLDGADNEKWMKYLRDYIIENHIHHTFWCFNANSGDTGGLVGYDFTTWDEKKYSFLKPALWQDSQGRFVGLDHKRPLGTNGKNINITTYYNNNEPEPVPASK

-强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶(P-BG)，其具有氨基酸序列：

MAKFPKNFMFGYSWSGFQFEMGLPGSEVESDWWVWVHDKENIASGLVSGDLPENGPAYWHLYKQDHDIAEKLGMDCIRGGIEWARIFPKPTFDVKVDVEKDEEGNIISVDVPESTIKELEKIANMEALEHYRKIYSDWKERGKTFILNLYHWPLPLWIHDPIAVRKLGPDRAPAGWLDEKTVVEFVKFAAFVAYHLDDLVDMWSTMNEPNVVYNQGYINLRSGFPPGYLSFEAAEKAKFNLIQAHIGAYDAIKEYSEKSVGVIYAFAWHDPLAEEYKDEVEEIRKKDYEFVTILHSKGKLDWIGVNYYSRLVYGAKDGHLVPLPGYGFMSERGGFAKSGRPASDFGWEMYPEGLENLLKYLNNAYELPMIITENGMADAADRYRPHYLVSHLKAVYNAMKEGADVRGYLHWSLTDNYEWAQGFRMRFGLVYVDFETKKRYLRPSALVFREIATQKEIPEELAHLADLKFVTRK

-任选地，新阿波罗栖热袍菌的木聚糖酶XynA(T-XY)，其具有氨基酸序列：

MATGALGFGGKGVSPFETVLVLSFEGNTDGASPFGKDVVVTASQDVAADGEYSLKVENRTSVWDGVEIDLTGKVNTGTDYLLSFHVYQTSDSPQLFSVLARTEDEKGERYKILADKVVVPNYWKEILVPFSPTFEGTPAKFSLIITSPKKTDFVFYVDNVQVLTPKEAGPKVVYETSFEKGIGDWQPRGSDVKISISPKVAHSGKKSLFVSNRQKGWHGAQISLKGILKTGKTYAFEAWVYQESGQDQTIIMTMQRKYSSDSSTKYEWIKAATVPSGQWVQLSGTYTIPAGVTVEDLTLYFESQNPTLEFYVDDVKVVDTTSAEIKLEMNPEEEIPALKDVLKDYFRVGVALPSKVFINQKDIALISKHFNSITAENEMKPDSLLAGIENGKLKFRFETADKYIEFAQQNGMVVRGHTLVWHNQTPEWFFKDENGNLLSKEEMTERLREYIHTVVGHFKGKVYAWDVVNEAVDPNQPDGLRRSTWYQIMGPDYIELAFKFAREADPNAKLFYNDYNTFEPKKRDIIYNLVKSLKEKGLIDGIGMQCHISLATDIRQIEEAIKKFSTIPGIEIHITELDISVYRDSTSNYSEAPRTALIEQAHKMAQLFKIFKKYSNVITNVTFWGLKDDYSWRATRRNDWPLIFDKDYQAKLAYWAIVAPEVLPPLPKESKISEGEAVVVGMMDDSYMMSKPIEIYDEEGNVKATIRAIWKDSTIYVYGEVQDATKKPAEDGVAIFINPNNERTPYLQPDDTYVVLWTNWKSEVNREDVEVKKFVGPGFRRYSFEMSITIPGVEFKKDSYIGFDVAVIDDGKWYSWSDTTNSQKTNTMNYGTLKLEGVMVATAKYGTPVIDGEIDDIWNTTEEIETKSVAMGSLEKNATAKVRVLWDEENLYVLAIVKDPVLNKDNSNPWEQDSVEIFIDENNHKTGYYEDDDAQFRVNYMNEQSFGTGASAARFKTAVKLIEGGYIVEAAIKWKTIKPSPNTVIGFNVQVNDANEKGQRVGIISWSDPTNNSWRDPSKFGNLRLI

-任选地，嗜热栖热菌的漆酶具有氨基酸序列：

MLARRSFLQAAAGSLVLGLARAQGPSFPEPKVVRSQGGLLSLKLSATPTPLALAGQRATLLTYGGSFPGPTLRVRPRDTVRLTLENRLPEPTNLHWHGLPISPKVDDPFLEIPPGESWTYEFTVPKELAGTFWYHPHLHGRVAPQLFAGLLGALVVESSLDAIPELREAEEHLLVLKDLALQGGRPAPHTPMDWMNGKEGDLVLVNGALRPTLVAQKATLRLRLLNASNARYYRLALQDHPLYLIAADGGFLEEPLEVSELLLAPGERAEVLVRLRKEGRFLLQALPYDRGAMGMMDMGGMAHAMPQGPSRPETLLYLIAPKNPKPLPLPKALSPFPTLPAPVVTRRLVLTEDMMAARFFINGQVFDHRRVDLKGQAQTVEVWEVENQGDMDHPFHLHVHPFQVLSVGGRPFPYRAWKDVVNLKAGEVARLLVPLREKGRTVFHCHIVEHEDRGMMGVLEVG(SEQ ID NR:14)

-任选地，嗜热栖热菌的多酚氧化酶具有氨基酸序列：

MTLLRTPLPVPHGFTTREGGVSEGPFRSLNLSAATGDDPERVAENQRRVL

AAFGHPPVAGLRQVHGTEVHPVEGPGLWEGDGLLTRTPGLLLRVGVADCYPLLLYHPKGAVGALHAGWRGVVGGILPKALERLEAVYRLDPTEVHLAIGPGIGGACYQVGEEVVARFAEAGLFTFREDPAAPGKYLLDLEKALLLQARRAGLREERIYRVGLCTHCAPNLFSHRRDRGRTGRMWGLVMLPPR

(SEQ ID NR:16)。

上述新阿波罗栖热袍菌的内切葡聚糖酶B由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列SEQ ID NR：2编码；上述解糖热解纤维素菌的纤维体CelB的部分CBM3GH5由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列SEQ ID NR：4编码；上述强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列SEQ ID NR：6编码；上述新阿波罗栖热袍菌的木聚糖酶XynA由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列SEQ IDNR：8编码；上述嗜热栖热菌的漆酶由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列SEQID NR：15编码，以及上述嗜热栖热菌的多酚氧化酶由具有密码子优化以用于叶绿体表达的核苷酸序列SEQ ID NR：17编码。

根据本发明的一个优选实施方案，转基因微藻属于莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)种。

在本发明的一个优选实施方案中，所述亚磷酸脱氢酶D来自施氏假单胞菌(PTXD)，并具有以下氨基酸序列：

MLPKLVITHRVHDEILQLLAPHCELMTNQTDSTLTREEILRRCRDAQAMMAFMPDRVDADFLQACPELRVVGCALKGFDNFDVDACTARGVWLTFVPDLLTVPTAELAIGLAVGLGRHLRAADAFVRSGEFQGWQPQFYGTGLDNATVGILGMGAIGLAMADRLQGWGATLQYHEAKALDTQTEQRLGLRQVACSELFASSDFILLALPLNADTQHLVNAELLALVRPGALLVNPCRGSVVDEAAVLAALERGQLGGYAADVFEMEDWARADRPRLIDPALLAHPNTLFTPHIGSAVRAVRLEIERCAAQNIIQVLAGARPINAANRLPKAEPAACEF(SEQ ID NR:11)

上述施氏假单胞菌的亚磷酸脱氢酶D(PTXD)的氨基酸序列由以下优化的核苷酸序列编码：

ATGCTGCCGAAGCTGGTCATCACCCACCGCGTCCACGACGAGATCCTGCAGCTGCTGGCCCCGCACTGCGAGCTGATGACGAACCAGACCGACTCGACCCTGACGCGCGAGGAGATCCTGCGCCGCTGCCGCGACGCGCAGGCTATGATGGCCTTCATGCCGGACCGCGTGGACGCTGACTTCCTGCAGGCTTGCCCGGAGCTGCGCGTGGTCGGCTGCGCTCTGAAGGGCTTCGACAACTTCGACGTGGACGCTTGCACCGCTCGCGGCGTGTGGCTGACGTTCGTCCCGGACCTGCTGACCGTGCCGACGGCTGAGCTGGCCATCGGCCTGGCTGTCGGCCTGGGCCGCCACCTGCGCGCCGCGGACGCTTTCGTGCGCTCCGGCGAGTTCCAGGGCTGGCAGCCGCAGTTCTACGGCACCGGCCTGGACAACGCTACGGTCGGCATCCTGGGCATGGGCGCTATCGGCCTGGCTATGGCTGACCGCCTGCAGGGCTGGGGCGCTACCCTGCAGTACCACGAGGCTAAGGCCCTGGACACCCAGACGGAGCAGCGCCTGGGCCTGCGCCAGGTGGCTTGCAGCGAGCTGTTCGCCTCGTCCGACTTCATCCTGCTGGCTCTGCCGCTGAACGCTGACACCCAGCACCTGGTCAACGCTGAGCTGCTGGCTCTGGTGCGCCCCGGCGCTCTGCTGGTCAACCCGTGCCGCGGCTCTGTGGTGGACGAGGCTGCCGTGCTGGCTGCTCTGGAGCGCGGCCAGCTGGGCGGCTACGCCGCGGACGTCTTCGAGATGGAGGACTGGGCGCGCGCTGACCGCCCGCGCCTGATCGACCCGGCTCTGCTGGCTCACCCGAACACCCTGTTCACGCCGCACATCGGCAGCGCCGTGCGCGCGGTCCGCCTGGAGATCGAGCGCTGCGCTGCCCAGAACATCATCCAGGTGCTGGCCGGCGCCCGCCCGATCAACGCTGCCAACCGCCTGCCGAAGGCTGAGCCGGCTGCTTGCGAATTCTAA(SEQ ID NR:12)。

本发明还涉及如上定义的转基因微藻的组合用于在含有亚磷酸根离子作为磷源的培养基中生产热稳定植物细胞壁降解酶的混合物的用途。

本发明还涉及生产热稳定植物细胞壁降解酶的混合物的方法，包括以下步骤：

a)在光生物反应器中在含有亚磷酸根离子作为唯一磷源的培养基中培养如上定义的转基因微藻的组合；

b)将微藻干燥，优选通过在-80℃冷冻干燥的手段；

c)备选地通过超声处理、在80℃短时间热处理、非变性条件或变性条件来提取酶。

由于使用亚磷酸根离子而大量培养微藻的可能性使得可以避免使用灭菌过程，灭菌过程在大规模时在经济上不可持续。例如，通过根据本发明的转基因微藻的组合产生的热稳定植物细胞壁降解酶的混合物可以有利地用于沼气生产植物中，以将纤维素底物降解为相应的组成单糖。这是在30-40℃下在生物反应器中进行的，此时存在的细菌产生甲烷。包含热稳定纤维素分解酶的冻干粉可在进入生物反应器前，在合适的处理槽中，温度范围为70至100℃的情况下以范围为1Kg：1吨底物至5Kg：1吨底物的量直接用在底物上。

本发明还涉及可根据上述方法获得的热稳定植物细胞壁降解酶的混合物，其特征在于其包含新阿波罗栖热袍菌的内切葡聚糖酶B(SEQ ID NR：1)、解糖热解纤维素菌的纤维体CelB的具有纤维二糖水解酶活性的部分(SEQ ID NR：3)、强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶(SEQ ID NR：5)，比率为20:50:30[g株内切葡聚糖酶B：g株纤维体CelB的纤维二糖水解酶部分：g株β-葡糖苷酶],其对应于5:65:30的摩尔酶比[mol.内切葡聚糖酶B：mol.纤维体CelB的纤维二糖水解酶部分：mol.β-葡糖苷酶]。该混合物的特征在于比活性(每克藻混合物干重的酶单位)对于CMC底物的范围为10到30U，而对于pNPG底物的范围为8到24U。

在另一个特别优选的实施方案中，可根据上述方法获得的热稳定植物细胞壁降解酶的混合物的特征在于，其包含新阿波罗栖热袍菌的内切葡聚糖酶B(SEQ ID NR：1)、解糖热解纤维素菌的纤维体CelB的具有纤维二糖水解酶活性的部分(SEQ ID NR：3)、强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶(SEQ ID NR：5)和新阿波罗栖热袍菌的木聚糖酶XynA(SEQ ID NR：7)，比率为20:40:20:20[g株内切葡聚糖酶B：g株纤维体CelB的纤维二糖水解酶部分：g株β-葡糖苷酶：g株木聚糖酶]。将木聚糖酶XynA添加到上述三元混合物中导致摩尔酶比[mol.内切葡聚糖酶B：mol.纤维体CelB的纤维二糖水解酶部分：mol.β-葡糖苷酶：mol.木聚糖酶]等于5：60：25：10。在这种情况下，对CMC底物的比活性范围为8至24U，对pNPG底物的比活性范围为6至18U，对木聚糖底物的比活性范围为1至3U。

上文所定义的根据本发明的热稳定植物细胞壁降解酶的混合物的特征还在于，其另外地(除木聚糖酶以外)或备选地(代替木聚糖酶)包含选自嗜热栖热菌的漆酶(SEQ IDNR：14)和嗜热栖热菌的多酚氧化酶(SEQ ID NR：16)的木质素酶。

根据一个特别优选的实施方案，本发明的热稳定植物细胞壁降解酶的混合物为冻干粉的形式。

最后，本发明涉及新阿波罗栖热袍菌的木聚糖酶XynA(SEQ ID NR：7)与包含新阿波罗栖热袍菌的内切葡聚糖酶B(SEQ ID NR：1)、解糖热解纤维素菌的纤维体CelB的具有纤维二糖水解酶活性的部分(SEQ ID NR：3)和强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶(SEQ ID NR：5)的半纤维素酶类型的热稳定植物细胞壁降解酶混合的用途，用于基于木质纤维素的底物的生物降解的预防性处理。

本发明的另一个目的涉及以上定义的热稳定植物细胞壁降解酶的混合物在基于纤维素的底物(即纸浆)或木质纤维素的生物降解中(例如，在生物燃料的生产中)的用途。在后一种情况下，显然有必要在混合物中包括微藻，即被转化以表达木质素酶类型的酶的微藻。

现在将根据优选实施方案并特别参考附图，出于说明性而非限制性的目的描述本发明，其中：

-图1显示了作为HC酶的生物工厂的莱茵衣藻细胞的图形表示。a)组成纤维素分解机器的酶列表[T-EG＝内切葡聚糖酶，C-CBH＝纤维二糖水解酶，P-BG＝β-葡糖苷酶，T-XY＝木聚糖酶]。b)每个株共表达亚磷酸脱氢酶(PTXD)和a)中所示的HC酶之一。

-图2显示了HC-藻中同质情况的评估结果。404和350bp的扩增子分别表示野生型(WT)和重组叶绿体质粒的反向重复区域(IR)的存在。株1a+的DNA和质粒pLM20分别用作同质情况的阴性和阳性对照。显示了对表达T-EG的藻的四个转化体(#1-4)的分析，作为代表性结果。

-图3显示了HC的叶绿体表达。a)通过机械破裂(超声处理+珠粒)，用阴离子去污剂(2％SDS)，非离子去污剂和热处理(0.3％Tween20+加热)和单独用热处理(加热)获得的莱茵衣藻细胞提取物中各种HC的活性的评估。b)对使用非离子去污剂和热处理获得的莱茵衣藻的细胞提取物进行免疫修饰分析。酶活性表示为每克藻(DW＝干重)的酶单位(μmolesmin-1)，并在pH 5.5和75℃进行了评估。[T-EG:新阿波罗栖热袍菌的内切葡聚糖酶，C-CBH:解糖热解纤维素菌的纤维二糖水解酶，P-BG：强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶，T-XY：新阿波罗栖热袍菌的内切木聚糖酶]。

-图4显示了比活性的测定结果。a)阴离子交换色谱洗脱级分(fx)中的HC活性表示为相对活性(％)。旁边还显示了洗脱梯度。b)对显示最大活性的级分进行SDS-PAGE分析(左)和免疫修饰分析(右)。[T-EG:新阿波罗栖热袍菌的内切葡聚糖酶，C-CBH:解糖热解纤维素菌的纤维二糖水解酶，P-BG：强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶，T-XY：新阿波罗栖热袍菌的内切木聚糖酶]。

-图5显示了使用其中磷酸根离子被亚磷酸根离子替代的生长培养基在混合营养条件下的HC-藻(HC株)和HC-PTXD-藻(HC-PTXD株)的生长。

-图6显示了直方图，其说明了C-CBH-PTXD藻中优化表达条件的结果。a)使用三种不同的光强度，在光合自养条件下生长7天的藻培养物的细胞提取物的酶活性。b)使用不同的生长培养基在50μmol m

-图7显示了使用不同HC-PTXD混合物的蛋白提取物对PASC纤维素的转化数据。a)与不同HC-PTXD混合物(#1-11)的蛋白提取物一起孵育24小时后，PASC纤维素(0.6％w/v)在还原末端(白色条)和糖(灰色条)中的转化。数字表示每种混合物中使用的相应HC-PTXD株的百分比(w/w)。b)与HC-PTXD混合物#8的蛋白提取物一起孵育24小时后，PASC纤维素(0.6％w/v)在还原末端和糖中的转化。每24小时将新鲜的PASC纤维素(0.6％，w/v)加入同一反应混合物中。每个转化百分比是指最后添加的PASC纤维素。c)评估冷冻干燥之前(HC-PTXD混合物)和冷冻干燥并于室温保存1个月之后(HC-PTXD冷冻干燥的混合物)的HC-PTXD混合物(还添加了20％w/w的藻T-XY)对CMC(灰色条)，pNPG(白色条)和木聚糖(黑色条)的活性。

-图8显示了通过纤维素酶(CC混合物＝Celluclast+纤维二糖酶)和使用还包含木聚糖酶的本发明混合物(HH混合物＝αAF+βG+ManB/5A+XynA+GghA)对于木质纤维素底物转化的水解的比较结果。图板A和B显示了在不同酶处理后，碱处理后从大麦秆中释放的糖(A)和碱处理后从玉米糠中释放的糖(B)。酸处理过的滤液中的葡萄糖(黑色条)和总糖(灰色条)的含量分别通过GO-POD和酚硫酸法测定。图板C显示了用HH混合物处理后，大麦秆(黑色条)和小麦秆(灰色条)的酸处理过的滤液中单糖的组成分析，其通过HPAEC-PAD测定。+/-表示使用活性/高压灭菌处理的酶混合物进行处理。数据表示为均值±SD，n＝3。用相同字母(a-e)表示的值无显著差异(ANOVA测试，P<0.05)。

-图9显示了酶促反应后，经碱处理后来自大麦秆和玉米糠的酸处理过的滤液中单糖的组成分析，其通过HPAEC-PAD测定。图板(C)显示了用HH混合物(HH混合物＝αAF+βG+ManB/5A+XynA+GghA)和CC(CC混合物＝Celluclast+纤维二糖酶)处理后来自大麦秆(A)和玉米糠(B)的滤液的标准单糖的色谱分析(HPAEC-PAD)。

现在提供以下实施例以更好地说明本发明，这些实施例应被认为是说明性的而非限制性的。

实施例1：编码HC的基因的体外合成和克隆

材料和方法

新阿波罗栖热袍菌的内切葡聚糖酶B(T-EG)(Bok JD等人，1998)、被称为CBM3GH5的解糖热解纤维素菌的纤维体CelB的具有纤维二糖水解酶活性的部分(C-CBH；Park JI等人，2011；美国9,624,482B2)和强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶(P-BG，Kengen SWM等人，1993；Kado Y.等人，2011)被选为要在微藻的叶绿体中表达的纤维素分解机器的主要组分。

此外，将新阿波罗栖热袍菌的木聚糖酶XynA(T-XY)(Zverlo等人，1996)包括进来作为用于降解更复杂底物的支持酶(Hu J.等人2011)，因为XynA的底物木聚糖是最丰富的半纤维素之一，且它的存在可以抑制纤维素酶的活性。四种HC在莱茵衣藻叶绿体中单独表达以区室化并同时使其表达最大化(Rochaix J.D.等人，2014)。避免了HC在同一细胞中的共表达，因为有效的水解反应需要精确量的每种酶，而在共表达的情况下，这无法被操作者管控。

特别地，将以下的新阿波罗栖热袍菌的CelB(UniprotKB：P96492，aa 18-274)(SEQID NR：1；SEQ ID NR：2)、解糖热解纤维素菌的纤维体CelB的部分CBM3GH5(UniprotKB：P10474，aa 380-1039)(SEQ ID NR：3，SEQ ID NR：4)、强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶(UniprotKB：Q51723，aa 1-472)(SEQ.ID NR：5，SEQ ID NR：6)和新阿波罗栖热袍菌的木聚糖酶XynA(UniprotKB：Q60042，aa 30-1055)(SEQ.ID NR：7，SEQ ID NR：8)的蛋白质序列转化为核苷酸序列，并使用OPTIMIZER程序对其密码子使用进行了优化，以用于在莱茵衣藻中叶绿体表达。

对组成纤维素分解机器的酶(图1)的编码序列进行了优化，以用于莱茵衣藻的叶绿体表达，并在3'处与编码HA表位的序列融合(蛋白质序列的C末端)，从而使它们能够通过免疫修饰分析(immuno-decoration analysis)被检测。随后将这些基因克隆到针对叶绿体表达进行了优化的表达载体中(Day A.和Goldschmidt-Clermont M.2011；Michelet L.等人，2011)，并通过生物弹枪轰击(biolistic gun bombardment)(Purton S.，2007)分别地引入莱茵衣藻中。对获得的转化子进行重复的选择循环以促进同质(homoplasmy)情况，然后通过对转化体的DNA进行PCR分析来确认其同质性(图2)。

通过使用Signal IP 4.1Server程序，排除了用于在细胞外环境中分泌的信号肽的可能存在。将编码HA表位的序列(YPYDVPDYA)添加至每个序列的3'端。包含限制性位点NcoI和SphI的序列分别在每个序列的5'端和3'端处融合。小心地突变含有限制性位点NcoI，SphI，ClaI和SmaI的基因内序列，以消除限制性位点的存在而不改变所得的蛋白质序列。然后通过GeneArt(Life Technologies)在体外合成基因。使用限制性位点NcoI和SphI，将合成基因分别克隆到启动子的下游，所述启动子调节在载体pCLE(SEQ ID NR：9)内的基因psaA的表达。随后使用限制性位点ClaI和SmaI从载体pCLE中切出包括转基因和赋予壮观霉素抗性的基因aadA的表达盒，并转移至表达载体pLM20(Michelet L.等人2011)(SEQ IDNR：10)。用这些构建体转化大肠杆菌菌株XL10gold(Agilent Technologies)，并用于重组DNA的扩增。

随后对这四个HC-藻株系进行了工程改造，以表达施氏假单胞菌PTXD基因，该基因编码氧化还原酶(Costas AMG，2001)，其表达赋予微藻以亚磷酸根离子作为唯一磷源代谢的能力(López-ArredondoD.和Herrera-Estrella L.，2012；Loera-Quezada MM等人，2015；US 2012/0295303 A1)。所用莱茵衣藻的株为1a+。对于表达HC酶的基因的叶绿体转化，使用Faè等人，2017所述的相同程序和仪器转化1a+。按照Goldschmidt-Clermont，1991所述进行同质转化体的选择。

对于PTXD核表达(SEQ ID NR.11；SEQ ID NR：12)，使用(Loera-Quezada MM等人，2016)中的相同构建体(SEQ ID NR：13)进行电穿孔，分析所得的转化体(称为HC-PTXID藻)在含有亚磷酸根离子而不是磷酸根离子的培养基中生长的能力。特别地，通过在25℃的温度和50μmol m

在25℃的温度，50μmol m

为了确定允许HC酶的更多积累的生长条件，通过在不同光照条件和生长培养基下培养微藻来评估C-CBH的活性(本文中表示为参考HC酶的表达)(图6，图板a-c)。值得注意的是，在非无菌条件下(例如使用非无菌自来水)株C-CBH-PTXD的生长不会影响C-CBH酶的表达水平(图6，图板b)。在测试的各种光照条件下，在等于50μmol m

使用不同的方法和条件从莱茵衣藻的冷冻干燥细胞中进行蛋白质提取。冷冻干燥后，将所得粉末在室温下保存1个月，或在-80℃保存更长的时间。将冷冻干燥的藻以[1mL提取缓冲液：6mg DW微藻]的比例重悬。使用由10mM柠檬酸盐pH 5.5和0.3％Tween20组成的裂解缓冲液，在非变性条件下进行提取。将重悬的样品在70℃温和搅拌下孵育1小时。对于机械破裂提取，在直径为425-600μm的玻璃珠(Sigma-Aldritch)的存在下，将细胞在超声浴(Sigma-Aldritch)中温育30分钟。使用由20mM Tris-HCl pH 7.0、2％SDS和10mM EDTA组成的裂解缓冲液在变性条件下进行提取。样品的重悬在[1mL提取缓冲液：6mg DW微藻]的比例下进行。提取后，将样品离心(14,000r x 10分钟)，并将上清液用于分析。通过SDS-PAGE或酶促测定分析60μg DW藻生物量的总蛋白；单克隆抗体AbHA(HA7克隆，Sigma-Aldritch)用于免疫修饰分析。

对于酶促测定，将蛋白提取物(总反应体积的1/10)在由50mM乙酸钠pH 5.5和以下浓度的底物组成的缓冲液中温育：1％CMC(以评估T-EG的内切葡聚糖酶活性和C-CBH的纤维二糖水解酶)，5mM pNPG(以评估P-BG的β-葡糖苷酶活性)和1％的木聚糖(以评估T-XY的木聚糖酶活性)。所有底物均购自Sigma-Aldritch。基于先前Kengen S.W.M.等人，1993；Zverlov V.等人，1996；Bok J.D.等人，1998；Park J.I.等人，2011中所述的酶表征建立用于酶促反应的pH和优化温度条件，选择单一pH和温度值来进行所有反应(即75℃和pH5.5)。

活性表示为每克(g)干重(DW)微藻的酶单位(μmoles还原末端min

为了纯化HC，在非变性条件下使用改良缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5，0.3％Tween20)以[1mL提取缓冲液：6mg DW微藻]的比例从100mg莱茵衣藻冻干物中进行提取。在70℃孵育1小时后，将样品离心(14,000r x 10分钟)，然后将上清液装入预先用20mM Tris-HCl pH 7.5平衡的Q-琼脂糖层析柱(Amersham)上。使用NaCl阶梯梯度进行洗脱。通过活性测定分析从Q-琼脂糖柱洗脱的级分。通过SDS-PAGE分析显示最高活性的级分，以确定酶浓度(使用不同量的BSA作为校准曲线)。浓度的确定是通过Quantity-One程序(Biorad)进行的。通过免疫修饰分析确认条带的身份。比活性用于确定每种HCG-藻株的每种酶的表达水平。在75℃和pH 5.5下评估了各种HC的比活性。

然后在莱茵衣藻的细胞提取物中评估了HC的酶活性；使用不同的提取方法(例如在玻璃珠存在下进行超声处理或用阴离子和非离子去污剂处理)来确定哪种方法最适合酶的提取。通过在0.3％(v/v)Tween20存在下于70℃孵育细胞有效地提取了HC，其活性水平与通过机械性细胞破裂获得的活性水平相当(图3，图板a)。

值得注意的是，酶T-EG和C-CBH对SDS处理具有抗性，这表明它们在含阴离子去污剂的反应缓冲液中的可能应用(Li Y.等人，2016)。免疫修饰分析证实了细胞裂解液中四种酶的存在，如不同的信号强度所示，其以不同的水平表达(图3，图板b)。在这种情况下，不将蛋白酶抑制剂添加到提取缓冲液中以模拟实际的实地(field)提取和反应条件。

由热富集(Patchett M.L.等人，1989)和随后的阴离子交换色谱法(AEC)组成的纯化程序可纯化这四种酶；因为它们是具有酸性等电点的蛋白质，所以它们在中性pH条件下被色谱柱保留，并被0.3至0.6M浓度的NaCl洗脱。

各种酶的活性用于验证其在从AEC色谱洗脱的不同级分中的存在(图4，图板a)。通过SDS-PAGE分析和免疫修饰分析评估显示最高活性的级分；后者证实了对于分离出的每种酶具有预期的分子量的条带(图4，图板b)。

在确定各个级分中每种酶的浓度后，计算比活性(表示为每毫克酶的酶单位)(图4，图板c)，从而可以估算初始细胞提取物中的水平。

下表1显示了各种HC对1％的羧甲基纤维素(CMC)，5mM的对硝基苯基葡糖苷(pNPG)和1％的木聚糖(Xylan)底物的比活性的结果。

表1

纤维二糖水解酶C-CBH具有最高产出(0.8-1mg g

但是，应该指出的是，粗细胞提取物中的任何污染物都可能干扰酶的活性，从而导致低估了酶的实际表达水平。

按Cannella D.等人，2016中所述，制备用磷酸预处理的纤维素(PASC)。按照此程序获得的PASC纤维素的特征在于糖含量(葡萄糖)大于90％(w/w)。将0.6g冷冻干燥的HC-PTXD混合物重悬在100mL非变性提取缓冲液中，并在70℃孵育1小时。孵育结束时，将样品离心(14,000r x 10分钟)，并将上清液用于酶促测定。为此，将PASC纤维素添加到上清液中(0.3ppure 0.6％，w/v)，并将该反应在75℃孵育24小时。为了测试HC的耐热性，每24小时向反应混合物中加入新鲜的PASC纤维素。没有添加新的PASC的反应用作添加了PASC的反应的阴性对照。重复该程序，共4个循环，每个循环24小时。在分析可溶性糖之前，将样品离心(4,000r x 5分钟)，并将上清液用于后续分析。转化率(％)是指PASC纤维素释放的(还原末端和总糖)的重量百分比。

根据(Lever M.，1972)，使用不同量的葡萄糖作为校准曲线，进行酶水解后释放的还原末端的微摩尔数的测定。通过苯酚-硫酸的比色测定法确定总糖(Dubois M.等人，1956年)。按照国家可再生能源实验室的实验室分析程序所述的方法，对底物进行酸水解后，测定PASC纤维素中所含的总糖：首先将样品溶于72％的硫酸(v/v)中，在30℃的温度1小时，然后稀释至硫酸的最终浓度为4％(v/v)，并在120℃的温度孵育1小时。然后测试上清液以确定溶解的糖的量。然后通过苯酚-硫酸的比色测试确定糖。报告的值是三次独立重复的平均值(Dubois M.等人，1956)。

为了优化用于降解木质纤维素材料的基于藻的产品，测试了表达HC酶的各种株(即HC-PTXD-藻)的不同混合物，并测试了它们在长期保存后的稳定性。应当指出的是，所选择的酶均具有5至6的最佳pH值，使得它们可同时使用而不会有明显的活性损失(KengenSWM等人，1993；Zverlov V.等人，1996；Bok JD等人，1998；Park JI等人，2011)。使用磷酸预处理的纤维素(缩写为PASC)作为底物，测试了从四种HC-PTXD-藻的11种不同混合物中获得的提取物的降解能力。在75℃孵育1天后，PASC底物向可溶性糖(以总糖和还原剂表示)的最高转化率从混合物#8得到(图7，图板a)，其组成[T-EG：C-CBH：P-BG]为20:50:30(w/w/w)。配方HC-PTXD#8(以下简称HC-PTXD混合物)的特征是纤维素分解酶含量为0.1％(w/w：5％T-EG，66％C-CBH，29％P-BG，对应于对于每克DW藻而言，0.01mg的T-EG，0.5mg的C-CBH和0.15mg的P-BG)。

为了确定HC酶的耐热性，每24小时将新鲜的PASC添加到细胞提取物中，总共进行4天。酶活性一直保持不变，直到第三次添加PASC，这表明酶在反应的第三天之前一直保持稳定(图7，图板b)。

在这些实验中，使用了HC-PTXD混合藻粉末，其通过冷冻干燥获得，然后在使用前在室温保存一个月。冷冻干燥程序和储存条件均未改变酶的功能，这表明莱茵衣藻叶绿体是用于保存具有热稳定活性的纤维素分解酶的有效区室(图7，图板c)。

对HC-PTXD混合物的底物特异性的进一步分析表明，该混合物对微晶纤维素也具有活性，即使是以较低水平(即Avicell PH101)。

下表2表明HC-PTXD混合物对不同的纤维素底物CMC1％(w/v)、PASC纤维素0.6％(w/v)和Avicell 2.5％(w/v)的比活性。酶活性以每克(dw)HC-PTXD混合物的酶单位(μmoles min-1)表示，并在pH 5.5和75℃计算。

表2

大麦秆由Felice Cervone教授(罗马萨皮恩扎大学生物与生物技术系)提供。玉米糠(玉蜀黍(Zea mays))由David Bolzonella教授(维罗纳大学生物技术系)提供。在这两种情况下，木质纤维素材料均用温和的碱性溶液预处理。将该材料在液氮中均化，并在适当体积的水中与每克底物0.1克NaOH混合，以得到4％NaOH溶液。将样品在75℃孵育2小时，然后将不溶性固体部分用超纯水洗涤几次，然后冷冻干燥并在室温保存。为了进行酶促测定，将这种不溶性固体部分(1.5％w/v)与0.5％(v/v)的Celluclast/纤维二糖酶混合物(CC混合物)或与0.1mg mL

αAF：α-阿拉伯呋喃糖苷酶，从诸如半乳聚糖和木聚糖等多糖降解阿拉伯糖

βG：β-内切半乳聚糖酶(beta-endogalactanase)，降解半乳聚糖(由半乳糖组成)

ManB/5A：β-内切甘露聚糖酶，降解甘露聚糖(由甘露糖组成)

XynA：β-内切木聚糖酶，降解木聚糖(由木糖组成)

GghA：β-葡聚糖葡糖水解酶，降解一些二糖

还进行了两步酶降解，其中样品首先在75℃与HH混合物孵育24小时，然后在37℃与CC混合物再孵育24小时。

同时加入灭活的酶混合物作为阴性对照。在反应结束时，使用苯酚-硫酸测定法评估可溶性糖的产率(Dubois M.等人，1956)。底物的水解表示为与经碱处理的不溶性木质纤维素材料的重量(g)成比例的释放的糖量(g)，并以百分比表示。使用Megazyme的葡萄糖氧化酶/过氧化物酶(GOPOD)分析试剂盒对酸中和的滤液中的葡萄糖进行定量。

通过高效阴离子交换色谱联合脉冲安培计检测(HPAEC-PAD)，在用酸中和的样品中确定了用碱处理过的木质纤维素材料和反应滤液的单糖的组成。

图8显示了通过纤维素酶混合物(CC混合物＝Celluclast+纤维二糖酶)和还包含木聚糖酶XynA的半纤维素酶混合物(HH混合物＝αAF+βG+ManB/5A+XynA+GghA)的木质纤维素底物水解的比较数据。

该分析表明半纤维素酶的预处理能够增强纤维素酶的作用；这可以在图8中得出，图板A-B对比了用半纤维素酶预处理材料时(+，+)纤维素酶释放的葡萄糖(黑色条)与仅用纤维素酶处理材料时(-，+)纤维素酶释放的葡萄糖。

在图8，图板C中，分析了用半纤维素酶预处理释放的糖，并且在两种木质纤维素底物(大麦秆和玉米糠)中木糖(XynA的底物木聚糖降解的最终产物)的产生都很突出。

另一方面，图9显示了用半纤维素酶和纤维素酶处理后，通过HPAEC-PAD色谱对木质纤维素材料(大麦秆和玉米糠)的水解产物进行定性和定量分析的结果。分析表明，在用酶混合物处理的两种木质纤维素底物中，葡萄糖(纤维素酶的降解产物)释放的增加总是与木糖(XynA的底物木聚糖的组分)的显著释放有关。

总体上，这些结果表明增加的葡萄糖的释放(通过纤维素酶)可归因于添加的木聚糖酶的协同作用。

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序列表

<110> BASSI, ROBERTO

DALL'OSTO, LUCA

BENEDETTI, MANUEL

<120> 用于产生具有热稳定纤维素分解活性的植物细胞壁降解酶的转基因微藻

<130> P1610PC

<150> 102018000009867

<151> 2018-10-29

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> 新阿波罗栖热袍菌（Thermotoga neapolitana）

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (258)..(267)

<223> HA标签

<400> 1

Met Ala Glu Val Val Leu Thr Asp Ile Gly Ala Thr Asp Ile Thr Phe

1 5 10 15

Lys Gly Phe Pro Val Thr Met Glu Leu Asn Phe Trp Asn Val Lys Ser

20 25 30

Tyr Glu Gly Glu Thr Trp Leu Lys Phe Asp Gly Glu Lys Val Gln Phe

35 40 45

Tyr Ala Asp Ile Tyr Asn Ile Val Leu Gln Asn Pro Asp Ser Trp Val

50 55 60

His Gly Tyr Pro Glu Ile Tyr Tyr Gly Tyr Lys Pro Trp Ala Ala His

65 70 75 80

Asn Ser Gly Thr Glu Ile Leu Pro Val Lys Val Lys Asp Leu Pro Asp

85 90 95

Phe Tyr Val Thr Leu Asp Tyr Ser Ile Trp Tyr Glu Asn Asp Leu Pro

100 105 110

Ile Asn Leu Ala Met Glu Thr Trp Ile Thr Arg Lys Pro Asp Gln Thr

115 120 125

Ser Val Ser Ser Gly Asp Val Glu Ile Met Val Trp Phe Tyr Asn Asn

130 135 140

Ile Leu Met Pro Gly Gly Gln Lys Val Asp Glu Phe Thr Thr Thr Ile

145 150 155 160

Glu Ile Asn Gly Ser Pro Val Glu Thr Lys Trp Asp Val Tyr Phe Ala

165 170 175

Pro Trp Gly Trp Asp Tyr Leu Ala Phe Arg Leu Thr Thr Pro Met Lys

180 185 190

Asp Gly Arg Val Lys Phe Asn Val Lys Asp Phe Val Glu Lys Ala Ala

195 200 205

Glu Val Ile Lys Lys His Ser Thr Arg Val Glu Asn Phe Asp Glu Met

210 215 220

Tyr Phe Cys Val Trp Glu Ile Gly Thr Glu Phe Gly Asp Pro Asn Thr

225 230 235 240

Thr Ala Ala Lys Phe Gly Trp Thr Phe Lys Asp Phe Ser Val Glu Ile

245 250 255

Gly Glu Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

260 265

<210> 2

<211> 812

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子使用优化序列，编码带HA标签的新阿波罗栖热袍菌CelB di

<220>

<221> misc_feature

<222> (777)..(803)

<223> HA标签

<400> 2

ccatggctga agttgtttta acagatattg gtgctacaga tattacattt aaaggttttc 60

cagttacaat ggaattaaat ttttggaatg ttaaatcata tgaaggtgaa acatggttaa 120

aatttgatgg tgaaaaagtt caattttatg ctgatattta taatattgtt ttacaaaatc 180

cagattcatg ggttcatggt tatccagaaa tttattatgg ttataaacct tgggctgctc 240

ataattcagg tacagaaatt ttaccagtta aagttaaaga tttaccagat ttttatgtta 300

cattagatta ttcaatttgg tatgaaaatg atttaccaat taatttagct atggaaacat 360

ggattacacg taaaccagat caaacatcag tttcatcagg tgatgttgaa attatggttt 420

ggttttataa taatatttta atgccaggtg gtcaaaaagt tgatgaattt acaacaacaa 480

ttgaaattaa tggttcacca gttgaaacaa aatgggatgt ttattttgct ccttggggtt 540

gggattattt agcttttcgt ttaacaacac caatgaaaga tggtcgtgtt aaatttaatg 600

ttaaagattt tgttgaaaaa gctgctgaag ttattaaaaa acattcaaca cgtgttgaaa 660

attttgatga aatgtatttt tgtgtttggg aaattggtac agaatttggt gatccaaata 720

caacagctgc taaatttggt tggacattta aagatttttc agttgaaatt ggtgaatatc 780

catatgatgt tccagattat gcttgagcat gc 812

<210> 3

<211> 676

<212> PRT

<213> 解糖热解纤维素菌（Caldicellulosiruptor saccharolyticus）

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (668)..(776)

<223> HA标签

<400> 3

Met Gly Val Thr Thr Ser Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Val

1 5 10 15

Thr Val Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Val Thr Ala

20 25 30

Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Pro Val Ser Thr Pro Ala Thr Gly Gly

35 40 45

Gln Ile Lys Val Leu Tyr Ala Asn Lys Glu Thr Asn Ser Thr Thr Asn

50 55 60

Thr Ile Arg Pro Trp Leu Lys Val Val Asn Ser Gly Ser Ser Ser Ile

65 70 75 80

Asp Leu Ser Arg Val Thr Ile Arg Tyr Trp Tyr Thr Val Asp Gly Glu

85 90 95

Arg Ala Gln Ser Ala Val Ser Asp Trp Ala Gln Ile Gly Ala Ser Asn

100 105 110

Val Thr Phe Lys Phe Val Lys Leu Ser Ser Ser Val Ser Gly Ala Asp

115 120 125

Tyr Tyr Leu Glu Ile Gly Phe Lys Ser Gly Ala Gly Gln Leu Gln Pro

130 135 140

Gly Lys Asp Thr Gly Glu Ile Gln Ile Arg Phe Asn Lys Ser Asp Trp

145 150 155 160

Ser Asn Tyr Asn Gln Gly Asn Asp Trp Ser Trp Leu Gln Ser Met Thr

165 170 175

Ser Tyr Gly Glu Asn Glu Lys Val Thr Ala Tyr Ile Asp Gly Val Leu

180 185 190

Val Trp Gly Gln Glu Pro Ser Gly Ala Thr Pro Ala Pro Thr Met Thr

195 200 205

Val Ala Pro Thr Ala Thr Pro Thr Pro Thr Leu Ser Pro Thr Val Thr

210 215 220

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Gln Thr Ala Ile Pro Thr Pro Thr Leu Thr

225 230 235 240

Pro Asn Pro Thr Pro Thr Ser Ser Ile Pro Asp Asp Thr Asn Asp Asp

245 250 255

Trp Leu Tyr Val Ser Gly Asn Lys Ile Val Asp Lys Asp Gly Arg Pro

260 265 270

Val Trp Leu Thr Gly Ile Asn Trp Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Thr Asn

275 280 285

Val Phe Asp Gly Val Trp Ser Cys Asn Leu Lys Asp Thr Leu Ala Glu

290 295 300

Ile Ala Asn Arg Gly Phe Asn Leu Leu Arg Val Pro Ile Ser Ala Glu

305 310 315 320

Leu Ile Leu Asn Trp Ser Gln Gly Ile Tyr Pro Lys Pro Asn Ile Asn

325 330 335

Tyr Tyr Val Asn Pro Glu Leu Glu Gly Lys Asn Ser Leu Glu Val Phe

340 345 350

Asp Ile Val Val Gln Thr Cys Lys Glu Val Gly Leu Lys Ile Met Leu

355 360 365

Asp Ile His Ser Ile Lys Thr Asp Ala Met Gly His Ile Tyr Pro Val

370 375 380

Trp Tyr Asp Glu Lys Phe Thr Pro Glu Asp Phe Tyr Lys Ala Cys Glu

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Trp Ile Thr Asn Arg Tyr Lys Asn Asp Asp Thr Ile Ile Ala Phe Asp

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Leu Lys Asn Glu Pro His Gly Lys Pro Trp Gln Asp Thr Thr Phe Ala

420 425 430

Lys Trp Asp Asn Ser Thr Asp Ile Asn Asn Trp Lys Tyr Ala Ala Glu

435 440 445

Thr Cys Ala Lys Arg Ile Leu Asn Ile Asn Pro Asn Leu Leu Ile Val

450 455 460

Ile Glu Gly Ile Glu Ala Tyr Pro Lys Asp Asp Val Thr Trp Thr Ser

465 470 475 480

Lys Ser Ser Ser Asp Tyr Tyr Ser Thr Trp Trp Gly Gly Asn Leu Arg

485 490 495

Gly Val Arg Lys Tyr Pro Ile Asn Leu Gly Lys Tyr Gln Asn Lys Val

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Val Tyr Ser Pro His Asp Tyr Gly Pro Ser Val Tyr Gln Gln Pro Trp

515 520 525

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Pro Asn Trp Ala Tyr Ile Met Glu Glu Asn Ile Ala Pro Leu Leu Ile

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Gly Glu Trp Gly Gly His Leu Asp Gly Ala Asp Asn Glu Lys Trp Met

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Lys Tyr Leu Arg Asp Tyr Ile Ile Glu Asn His Ile His His Thr Phe

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Trp Cys Phe Asn Ala Asn Ser Gly Asp Thr Gly Gly Leu Val Gly Tyr

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Asp Phe Thr Thr Trp Asp Glu Lys Lys Tyr Ser Phe Leu Lys Pro Ala

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Leu Trp Gln Asp Ser Gln Gly Arg Phe Val Gly Leu Asp His Lys Arg

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Pro Leu Gly Thr Asn Gly Lys Asn Ile Asn Ile Thr Thr Tyr Tyr Asn

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Asn Asn Glu Pro Glu Pro Val Pro Ala Ser Lys Tyr Pro Tyr Asp Val

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Pro Asp Tyr Ala

675

<210> 4

<211> 2039

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 带HA标签的解糖热解纤维素菌CBM3GH5的密码子优化序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (2004)..(2030)

<223> HA标签

<400> 4

ccatgggtgt tacaacatca tcaccaacac caacaccaac accaacagtt acagttacac 60

caacaccaac accaacacca acaccaacag ttacagctac accaacacca acaccaacac 120

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ttgatttatc acgtgttaca attcgttatt ggtatacagt tgatggtgaa cgtgctcaat 300

cagctgtttc agattgggct caaattggtg cttcaaatgt tacatttaaa tttgttaaat 360

tatcatcatc agtttcaggt gctgattatt atttagaaat tggttttaaa tcaggtgctg 420

gtcaattaca accaggtaaa gatacaggtg aaattcaaat tcgttttaat aaatcagatt 480

ggtcaaatta taatcaaggt aatgattggt catggttaca atcaatgaca tcatatggtg 540

aaaatgaaaa agttacagct tatattgatg gtgttttagt ttggggtcaa gaaccatcag 600

gtgctacacc agctccaaca atgacagttg ctccaacagc tacaccaaca ccaacattat 660

caccaacagt tacaccaaca ccagctccaa cacaaacagc tattccaaca ccaacattaa 720

caccaaatcc aacaccaaca tcatcaattc cagatgatac aaatgatgat tggttatatg 780

tttcaggtaa taaaattgtt gataaagatg gtcgtccagt ttggttaaca ggtattaatt 840

ggtttggtta taatacaggt acaaatgttt ttgatggtgt ttggtcatgt aatttaaaag 900

atacattagc tgaaattgct aatcgtggtt ttaatttatt acgtgttcca atttcagctg 960

aattaatttt aaattggtca caaggtattt atccaaaacc aaatattaat tattatgtta 1020

atccagaatt agaaggtaaa aattcattag aagtttttga tattgttgtt caaacatgta 1080

aagaagttgg tttaaaaatt atgttagata ttcattcaat taaaacagat gctatgggtc 1140

atatttatcc agtttggtat gatgaaaaat ttacaccaga agatttttat aaagcttgtg 1200

aatggattac aaatcgttat aaaaatgatg atacaattat tgcttttgat ttaaaaaatg 1260

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ttaataattg gaaatatgct gctgaaacat gtgctaaacg tattttaaat attaatccaa 1380

atttattaat tgttattgaa ggtattgaag cttatccaaa agatgatgtt acatggacat 1440

caaaatcatc atcagattat tattcaacat ggtggggtgg taatttacgt ggtgttcgta 1500

aatatccaat taatttaggt aaatatcaaa ataaagttgt ttattcacca catgattatg 1560

gtccatcagt ttatcaacaa ccttggtttt atccaggttt tacaaaagaa tcattattac 1620

aagattgttg gcgtccaaat tgggcttata ttatggaaga aaatattgct ccattattaa 1680

ttggtgaatg gggtggtcat ttagatggtg ctgataatga aaaatggatg aaatatttac 1740

gtgattatat tattgaaaat catattcatc atacattttg gtgttttaat gctaattcag 1800

gtgatacagg tggtttagtt ggttatgatt ttacaacatg ggatgaaaaa aaatattcat 1860

ttttaaaacc agctttatgg caagattcac aaggtcgttt tgttggttta gatcataaac 1920

gtccattagg tacaaatggt aaaaatatta atattacaac atattataat aataatgaac 1980

cagaaccagt tccagcttca aaatatccat atgatgttcc agattatgct tgagcatgc 2039

<210> 5

<211> 482

<212> PRT

<213> 强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (474)..(482)

<223> HA标签

<400> 5

Met Ala Lys Phe Pro Lys Asn Phe Met Phe Gly Tyr Ser Trp Ser Gly

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Trp Val Trp Val His Asp Lys Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Val Ser

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Asp His Asp Ile Ala Glu Lys Leu Gly Met Asp Cys Ile Arg Gly Gly

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Asp Val Glu Lys Asp Glu Glu Gly Asn Ile Ile Ser Val Asp Val Pro

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145 150 155 160

Pro Ile Ala Val Arg Lys Leu Gly Pro Asp Arg Ala Pro Ala Gly Trp

165 170 175

Leu Asp Glu Lys Thr Val Val Glu Phe Val Lys Phe Ala Ala Phe Val

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Ala Tyr His Leu Asp Asp Leu Val Asp Met Trp Ser Thr Met Asn Glu

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Pro Asn Val Val Tyr Asn Gln Gly Tyr Ile Asn Leu Arg Ser Gly Phe

210 215 220

Pro Pro Gly Tyr Leu Ser Phe Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Phe Asn

225 230 235 240

Leu Ile Gln Ala His Ile Gly Ala Tyr Asp Ala Ile Lys Glu Tyr Ser

245 250 255

Glu Lys Ser Val Gly Val Ile Tyr Ala Phe Ala Trp His Asp Pro Leu

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

Val Asn Tyr Tyr Ser Arg Leu Val Tyr Gly Ala Lys Asp Gly His Leu

305 310 315 320

Val Pro Leu Pro Gly Tyr Gly Phe Met Ser Glu Arg Gly Gly Phe Ala

325 330 335

Lys Ser Gly Arg Pro Ala Ser Asp Phe Gly Trp Glu Met Tyr Pro Glu

340 345 350

Gly Leu Glu Asn Leu Leu Lys Tyr Leu Asn Asn Ala Tyr Glu Leu Pro

355 360 365

Met Ile Ile Thr Glu Asn Gly Met Ala Asp Ala Ala Asp Arg Tyr Arg

370 375 380

Pro His Tyr Leu Val Ser His Leu Lys Ala Val Tyr Asn Ala Met Lys

385 390 395 400

Glu Gly Ala Asp Val Arg Gly Tyr Leu His Trp Ser Leu Thr Asp Asn

405 410 415

Tyr Glu Trp Ala Gln Gly Phe Arg Met Arg Phe Gly Leu Val Tyr Val

420 425 430

Asp Phe Glu Thr Lys Lys Arg Tyr Leu Arg Pro Ser Ala Leu Val Phe

435 440 445

Arg Glu Ile Ala Thr Gln Lys Glu Ile Pro Glu Glu Leu Ala His Leu

450 455 460

Ala Asp Leu Lys Phe Val Thr Arg Lys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp

465 470 475 480

Tyr Ala

<210> 6

<211> 1457

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码带HA标签的强烈炽热球菌的β-葡糖苷酶的密码子优化序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1443)..(1457)

<223> HA标签

<400> 6

ccatggctaa atttccaaaa aattttatgt ttggttattc atggtcaggt tttcaatttg 60

aaatgggttt accaggttca gaagttgaat cagattggtg ggtttgggtt catgataaag 120

aaaatattgc ttcaggttta gtttcaggtg atttaccaga aaatggtcca gcttattggc 180

atttatataa acaagatcat gatattgctg aaaaattagg tatggattgt attcgtggtg 240

gtattgaatg ggctcgtatt tttccaaaac caacatttga tgttaaagtt gatgttgaaa 300

aagatgaaga aggtaatatt atttcagttg atgttccaga atcaacaatt aaagaattag 360

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aacgtggtaa aacatttatt ttaaatttat atcattggcc attaccatta tggattcatg 480

atccaattgc tgttcgtaaa ttaggtccag atcgtgctcc agctggttgg ttagatgaaa 540

aaacagttgt tgaatttgtt aaatttgctg cttttgttgc ttatcattta gatgatttag 600

ttgatatgtg gtcaacaatg aatgaaccaa atgttgttta taatcaaggt tatattaatt 660

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atttaattca agctcatatt ggtgcttatg atgctattaa agaatattca gaaaaatcag 780

ttggtgttat ttatgctttt gcttggcatg atccattagc tgaagaatat aaagatgaag 840

ttgaagaaat tcgtaaaaaa gattatgaat ttgttacaat tttacattca aaaggtaaat 900

tagattggat tggtgttaat tattattcac gtttagttta tggtgctaaa gatggtcatt 960

tagttccatt accaggttat ggttttatgt cagaacgtgg tggttttgct aaatcaggtc 1020

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aattagctca tttagctgat ttaaaatttg ttacacgtaa atatccatat gatgttccag 1440

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<210> 7

<211> 1036

<212> PRT

<213> 新阿波罗栖热袍菌

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1028)..(1036)

<223> HA标签

<400> 7

Met Ala Thr Gly Ala Leu Gly Phe Gly Gly Lys Gly Val Ser Pro Phe

1 5 10 15

Glu Thr Val Leu Val Leu Ser Phe Glu Gly Asn Thr Asp Gly Ala Ser

20 25 30

Pro Phe Gly Lys Asp Val Val Val Thr Ala Ser Gln Asp Val Ala Ala

35 40 45

Asp Gly Glu Tyr Ser Leu Lys Val Glu Asn Arg Thr Ser Val Trp Asp

50 55 60

Gly Val Glu Ile Asp Leu Thr Gly Lys Val Asn Thr Gly Thr Asp Tyr

65 70 75 80

Leu Leu Ser Phe His Val Tyr Gln Thr Ser Asp Ser Pro Gln Leu Phe

85 90 95

Ser Val Leu Ala Arg Thr Glu Asp Glu Lys Gly Glu Arg Tyr Lys Ile

100 105 110

Leu Ala Asp Lys Val Val Val Pro Asn Tyr Trp Lys Glu Ile Leu Val

115 120 125

Pro Phe Ser Pro Thr Phe Glu Gly Thr Pro Ala Lys Phe Ser Leu Ile

130 135 140

Ile Thr Ser Pro Lys Lys Thr Asp Phe Val Phe Tyr Val Asp Asn Val

145 150 155 160

Gln Val Leu Thr Pro Lys Glu Ala Gly Pro Lys Val Val Tyr Glu Thr

165 170 175

Ser Phe Glu Lys Gly Ile Gly Asp Trp Gln Pro Arg Gly Ser Asp Val

180 185 190

Lys Ile Ser Ile Ser Pro Lys Val Ala His Ser Gly Lys Lys Ser Leu

195 200 205

Phe Val Ser Asn Arg Gln Lys Gly Trp His Gly Ala Gln Ile Ser Leu

210 215 220

Lys Gly Ile Leu Lys Thr Gly Lys Thr Tyr Ala Phe Glu Ala Trp Val

225 230 235 240

Tyr Gln Glu Ser Gly Gln Asp Gln Thr Ile Ile Met Thr Met Gln Arg

245 250 255

Lys Tyr Ser Ser Asp Ser Ser Thr Lys Tyr Glu Trp Ile Lys Ala Ala

260 265 270

Thr Val Pro Ser Gly Gln Trp Val Gln Leu Ser Gly Thr Tyr Thr Ile

275 280 285

Pro Ala Gly Val Thr Val Glu Asp Leu Thr Leu Tyr Phe Glu Ser Gln

290 295 300

Asn Pro Thr Leu Glu Phe Tyr Val Asp Asp Val Lys Val Val Asp Thr

305 310 315 320

Thr Ser Ala Glu Ile Lys Leu Glu Met Asn Pro Glu Glu Glu Ile Pro

325 330 335

Ala Leu Lys Asp Val Leu Lys Asp Tyr Phe Arg Val Gly Val Ala Leu

340 345 350

Pro Ser Lys Val Phe Ile Asn Gln Lys Asp Ile Ala Leu Ile Ser Lys

355 360 365

His Phe Asn Ser Ile Thr Ala Glu Asn Glu Met Lys Pro Asp Ser Leu

370 375 380

Leu Ala Gly Ile Glu Asn Gly Lys Leu Lys Phe Arg Phe Glu Thr Ala

385 390 395 400

Asp Lys Tyr Ile Glu Phe Ala Gln Gln Asn Gly Met Val Val Arg Gly

405 410 415

His Thr Leu Val Trp His Asn Gln Thr Pro Glu Trp Phe Phe Lys Asp

420 425 430

Glu Asn Gly Asn Leu Leu Ser Lys Glu Glu Met Thr Glu Arg Leu Arg

435 440 445

Glu Tyr Ile His Thr Val Val Gly His Phe Lys Gly Lys Val Tyr Ala

450 455 460

Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Val Asp Pro Asn Gln Pro Asp Gly Leu

465 470 475 480

Arg Arg Ser Thr Trp Tyr Gln Ile Met Gly Pro Asp Tyr Ile Glu Leu

485 490 495

Ala Phe Lys Phe Ala Arg Glu Ala Asp Pro Asn Ala Lys Leu Phe Tyr

500 505 510

Asn Asp Tyr Asn Thr Phe Glu Pro Lys Lys Arg Asp Ile Ile Tyr Asn

515 520 525

Leu Val Lys Ser Leu Lys Glu Lys Gly Leu Ile Asp Gly Ile Gly Met

530 535 540

Gln Cys His Ile Ser Leu Ala Thr Asp Ile Arg Gln Ile Glu Glu Ala

545 550 555 560

Ile Lys Lys Phe Ser Thr Ile Pro Gly Ile Glu Ile His Ile Thr Glu

565 570 575

Leu Asp Ile Ser Val Tyr Arg Asp Ser Thr Ser Asn Tyr Ser Glu Ala

580 585 590

Pro Arg Thr Ala Leu Ile Glu Gln Ala His Lys Met Ala Gln Leu Phe

595 600 605

Lys Ile Phe Lys Lys Tyr Ser Asn Val Ile Thr Asn Val Thr Phe Trp

610 615 620

Gly Leu Lys Asp Asp Tyr Ser Trp Arg Ala Thr Arg Arg Asn Asp Trp

625 630 635 640

Pro Leu Ile Phe Asp Lys Asp Tyr Gln Ala Lys Leu Ala Tyr Trp Ala

645 650 655

Ile Val Ala Pro Glu Val Leu Pro Pro Leu Pro Lys Glu Ser Lys Ile

660 665 670

Ser Glu Gly Glu Ala Val Val Val Gly Met Met Asp Asp Ser Tyr Met

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Met Ser Lys Pro Ile Glu Ile Tyr Asp Glu Glu Gly Asn Val Lys Ala

690 695 700

Thr Ile Arg Ala Ile Trp Lys Asp Ser Thr Ile Tyr Val Tyr Gly Glu

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Val Gln Asp Ala Thr Lys Lys Pro Ala Glu Asp Gly Val Ala Ile Phe

725 730 735

Ile Asn Pro Asn Asn Glu Arg Thr Pro Tyr Leu Gln Pro Asp Asp Thr

740 745 750

Tyr Val Val Leu Trp Thr Asn Trp Lys Ser Glu Val Asn Arg Glu Asp

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Val Glu Val Lys Lys Phe Val Gly Pro Gly Phe Arg Arg Tyr Ser Phe

770 775 780

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885 890 895

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Asp Ser Val Glu Ile Phe Ile Asp Glu Asn Asn His Lys Thr Gly Tyr

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Tyr Glu Asp Asp Asp Ala Gln Phe Arg Val Asn Tyr Met Asn Glu Gln

930 935 940

Ser Phe Gly Thr Gly Ala Ser Ala Ala Arg Phe Lys Thr Ala Val Lys

945 950 955 960

Leu Ile Glu Gly Gly Tyr Ile Val Glu Ala Ala Ile Lys Trp Lys Thr

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Ile Lys Pro Ser Pro Asn Thr Val Ile Gly Phe Asn Val Gln Val Asn

980 985 990

Asp Ala Asn Glu Lys Gly Gln Arg Val Gly Ile Ile Ser Trp Ser Asp

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Pro Thr Asn Asn Ser Trp Arg Asp Pro Ser Lys Phe Gly Asn Leu

1010 1015 1020

Arg Leu Ile Lys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1025 1030 1035

<210> 8

<211> 3119

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码带HA标签的新阿波罗栖热袍菌的木聚糖酶XynA的密码子优化序列

<400> 8

ccatggctac aggtgcttta ggttttggtg gtaaaggtgt ttcaccattt gaaacagttt 60

tagttttatc atttgaaggt aatacagatg gtgcttcacc atttggtaaa gatgttgttg 120

ttacagcttc acaagatgtt gctgctgatg gtgaatattc attaaaagtt gaaaatcgta 180

catcagtttg ggatggtgtt gaaattgatt taacaggtaa agttaataca ggtacagatt 240

atttattatc atttcatgtt tatcaaacat cagattcacc acaattattt tcagttttag 300

ctcgtacaga agatgaaaaa ggtgaacgtt ataaaatttt agctgataaa gttgttgttc 360

caaattattg gaaagaaatt ttagttccat tttcaccaac atttgaaggt acaccagcta 420

aattttcatt aattattaca tcaccaaaaa aaacagattt tgttttttat gttgataatg 480

ttcaagtttt aacaccaaaa gaagctggtc caaaagttgt ttatgaaaca tcatttgaaa 540

aaggtattgg tgattggcaa ccacgtggtt cagatgttaa aatttcaatt tcaccaaaag 600

ttgctcattc aggtaaaaaa tcattatttg tttcaaatcg tcaaaaaggt tggcatggtg 660

ctcaaatttc attaaaaggt attttaaaaa caggtaaaac atatgctttt gaagcttggg 720

tttatcaaga atcaggtcaa gatcaaacaa ttattatgac aatgcaacgt aaatattcat 780

cagattcatc aacaaaatat gaatggatta aagctgctac agttccatca ggtcaatggg 840

ttcaattatc aggtacatat acaattccag ctggtgttac agttgaagat ttaacattat 900

attttgaatc acaaaatcca acattagaat tttatgttga tgatgttaaa gttgttgata 960

caacatcagc tgaaattaaa ttagaaatga atccagaaga agaaattcca gctttaaaag 1020

atgttttaaa agattatttt cgtgttggtg ttgctttacc atcaaaagtt tttattaatc 1080

aaaaagatat tgctttaatt tcaaaacatt ttaattcaat tacagctgaa aatgaaatga 1140

aaccagattc attattagct ggtattgaaa atggtaaatt aaaatttcgt tttgaaacag 1200

ctgataaata tattgaattt gctcaacaaa atggtatggt tgttcgtggt catacattag 1260

tttggcataa tcaaacacca gaatggtttt ttaaagatga aaatggtaat ttattatcaa 1320

aagaagaaat gacagaacgt ttacgtgaat atattcatac agttgttggt cattttaaag 1380

gtaaagttta tgcttgggat gttgttaatg aagctgttga tccaaatcaa ccagatggtt 1440

tacgtcgttc aacatggtat caaattatgg gtccagatta tattgaatta gcttttaaat 1500

ttgctcgtga agctgatcca aatgctaaat tattttataa tgattataat acatttgaac 1560

caaaaaaacg tgatattatt tataatttag ttaaatcatt aaaagaaaaa ggtttaattg 1620

atggtattgg tatgcaatgt catatttcat tagctacaga tattcgtcaa attgaagaag 1680

ctattaaaaa attttcaaca attccaggta ttgaaattca tattacagaa ttagatattt 1740

cagtttatcg tgattcaaca tcaaattatt cagaagctcc acgtacagct ttaattgaac 1800

aagctcataa aatggctcaa ttatttaaaa tttttaaaaa atattcaaat gttattacaa 1860

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cagttttaaa taaagataat tcaaatcctt gggaacaaga ttcagttgaa atttttattg 2760

atgaaaataa tcataaaaca ggttattatg aagatgatga tgctcaattt cgtgttaatt 2820

atatgaatga acaatcattt ggtacaggtg cttcagctgc tcgttttaaa acagctgtta 2880

aattaattga aggtggttat attgttgaag ctgctattaa atggaaaaca attaaaccat 2940

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<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达载体pCLE

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ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 240

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 300

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 360

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 420

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgctgcagcc 660

aacaagtttt aaaacctctt caacgctata ttccacaaaa cggtggattt acatggccag 720

gtgattattt acgtttagaa attgttgaaa tgccaaaatt aaaatcaatc aatattaaaa 780

aaacaagttt aaaacaaaaa attaatgttc aaccagttgg tattatgcca cgtaaatatt 840

taattgaaaa acataatatt aaagtattga aaaagaaact ttctcaagct tattcaacac 900

aacaattaac taaagtggta caagaatata aaaatttaat tcaaaattct ccaccagcta 960

tttaaaaata tgccatattt ttactaattt tatattccaa gacattgtat gcttataaat 1020

aaagaagatg ctttgcatct ctaaagatga gtacaatgtt ttggaatatt tatataatat 1080

attaatatat atagttaaat gaaaaaacta aaaaataagc gttagtgaat aatacttttt 1140

atatataaat tctactatat gtttgagctt ccttttatat aaattttaaa tttataacaa 1200

gttacactct cagtatttcc tgcctttttg aaagtaaagc cacaatgttt acatactagg 1260

cagtggcgat accactgcca ctggcgtcct ccttcggagt atgtaaacat gctaagttta 1320

cttgcccgaa ggggaaggag gaggttctta tttcaaatta cctaagataa agtttccttc 1380

ggggtttata cgtaagaatt taagtaaaat aagttaaaat atgaatgcct tggggcatat 1440

taattccact tactatgagt gattctattg aaacaaaaaa catgggacgt attgtacaaa 1500

ttattggtcc tgttttagat atcgtatttg ctaaaggcca agtaccaaat atttacaacg 1560

ctctaactat tcgtgctaaa aactcagcag gtacagaaat ggctgttact tgtgaagttc 1620

aacaactttt aggtgataac tgtgtacgtg cagtttctat gaacccaaca gaaggtttaa 1680

tgcgtggtat ggaagttgta gatactggta aaccgttaag tgttcctgta ggtaaagtaa 1740

ctttaggacg tattttcaac gttctaggtg aacctgtaga taacatgggt aatgttaaag 1800

ttgaagaaac tttaccaatt caccgtacag ctcctgcttt cgttgattta gatactcgtt 1860

tatcaatttt tgaaacaggt attaaagttg tagacctttt agctccatac cgtcgtggtg 1920

gtaaaattgg tcttttcggt ggtgctggtg taggcaaaac agttttaatt atggaactga 1980

tcaacaacat tgctaaagca cacggtggtg tttctgtatt tgctggtgtt ggtgaacgta 2040

cacgtgaagg taacgacctt tacacagaaa tgaaagaatc tggtgttatt gttgaaaaga 2100

acttatctga ttcaaaagta gctcttgtat acggtcaaat gaacgaacca ccaggtgctc 2160

gtatgcgtgt tgctttaaca gctttaacaa tggctgaata tttccgtgat gttaacaaac 2220

aagacgtatt attcttcatt gataacattt tccgtttcgt acaagctggt gctgaagtat 2280

ctgctttatt aggtcgtatg ccatcagctg taggttacca acctacttta gctacagaaa 2340

tgggtggtct tcaagaacgt attacttcaa ctaaagatgg ttctatcaca tcgattcagg 2400

ctgtatatgt acctgcagat gaccttactg accctgctcc tgctacaaca ttcgctcact 2460

tagatgctac tacagtactt tctcgtaact tagctgctaa aggtatttac cctgcggttg 2520

acccattaga atcaacttca actatgttac aaccgtggat tcttggtgaa aaacactatg 2580

attctgcaca aagcgtaaaa aaaactttac aacgttacaa agaattacaa gatattattg 2640

ctattctagg tttagatgaa ttatctgaag aagacagact tattgtagct cgtgctcgta 2700

aaattgaacg tttcttatca caaccattct tcgtagctga agtatttaca ggttcacctg 2760

gtaaatatgt ttctttagct gaaactattg aaggttttgg taaaattttc gctggtgaat 2820

tagatgattt accagaacaa gcattctact tagtaggtaa cattacagaa gctattagta 2880

aagctgcttc attaaaattt ttatttttca tgatgtttat gtgaataatt tggaaccttc 2940

acgcagatgc tcatgacttt gacagtcata caagtgatct agaagaaatt tctagaaaag 3000

tattcagtgc acactttggt caattaggta tcattttcat ttggttaagt gggtgcgaca 3060

cgaagacgta tatattttta tagtttaaaa agatactttt acactgtagt tgaaaagtat 3120

aagcactttt aaaaatcaaa gcagtataag gcaattattt gcattttgct ttagttcttt 3180

ttattttttc agaaaaactt actttttagt ttcaattatg tctaaaagga tcccgggtac 3240

cgagctccac cgcggtggcg gccgctctag ctagaactag tggatcgcac tctaccgatt 3300

gagttacatc cgctttagta tgttactatt tcttttatta taacttataa aatataatac 3360

ataaagataa attctataat aaaaagctaa gattttattt ttctggcaca tcgtaattta 3420

taaagacagg caaatttaaa caaaagataa ctttagaact taattttaaa aatgtaaaat 3480

gatgtttagg tatttaacct aaacaccata aaaaataaaa acgatgttta tgctattcac 3540

ataaacatca tgaaaaataa aaattaaagt ttgtcaatag tatcaaattc gaatttaatt 3600

tctttccaaa cttcacatgc agcagcaagt tctggagacc atttacaagc tgaacgaatt 3660

acgtcgccac cttcacgagc aaggtcacga ccttcgttac gagcttgagt acaagcttgc 3720

atgcctgcag ttatttgcca actaccttag tgatctcgcc tttcacgtag tgaacaaatt 3780

cttccaactg atctgcgcgc gaggccaagc gatcttcttg tccaagataa gcctgcctag 3840

cttcaagtat gacgggctga tactgggccg gcaggcgctc cattgcccag tcggcagcga 3900

catccttcgg cgcgattttg ccggttactg cgctgtacca aatgcgggac aacgtaagca 3960

ctacatttcg ctcatcgcca gcccagtcgg gcggcgagtt ccatagcgtt aaggtttcat 4020

ttagcgcctc aaatagatcc tgttcaggaa ccggatcaaa gagttcctcc gccgctggac 4080

ctaccaaggc aacgctatgt tctcttgctt ttgtcagcaa gatagccaga tcaatgtcga 4140

tcgtggctgg ctcgaagata cctgcaagaa tgtcattgcg ctgccattct ccaaattgca 4200

gttcgcgctt agctggataa cgccacggaa tgatgtcgtc gtgcacaaca atggtgactt 4260

ctacagcgcg gagaatctcg ctctctccag gggaagccga agtttccaaa aggtcgttga 4320

tcaaagctcg ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacggtcac cgtaaccagc aaatcaatat 4380

cactgtgtgg cttcaggccg ccatccactg cggagccgta caaatgtacg gccagcaacg 4440

tcggttcgag atggcgctcg atgacgccaa ctacctctga tagttgagtc gatacttcgg 4500

cgataaccgc ttcacgagcc atggatttct ccttataata acaattattt aatttaataa 4560

atacattatt tacaccatta gcaacgcttt taattattat gtgttcataa aaaatgcatg 4620

gttattaaat tagacaaata gtttttttta catcatatgt tatattatac cataaatata 4680

ttttttattg gtttacaaat tatttttact tattttaaag atattgtttt attttttacc 4740

atatgtgtat tcgtaaaagt ataacattaa acagtattta cttaaaaatg ttgaattaag 4800

aaagcttatc gataagcttg atctagagtc gataatacga atagtaatac ggttttataa 4860

taataataat aataataata ataataataa taataataat aaaattctta aaaatataca 4920

aaaaattaac atacaaattt aatcccctcc gggattttaa atactccgta aggaggacgt 4980

cctaactacg gattgaaatc cctaagttta ctctttctcg gggaagggga aggggacgtc 5040

ctaaaataca tttcttcaac tgccctttct ttcctcaccc cttcggggac ggctcataaa 5100

gacaagcttt cctctggtcc cctttgggga aagagacatt tcatttaaaa gacaagcttt 5160

ggttgtcccc tttggggaag caactatttt caggcgaccg acgtatcctc tagctcaaat 5220

ttcttcccct ttggggacga cgctcaatca tacccttcca tcccctacgg ggatatatac 5280

cctttcaggg tattagggta tgggggaagc cgatggacta tttacattcc ttgtcccctt 5340

tgggaatcgg ctttgccgat agatttgttg ggaagtaggg tagggatgta aagcttgtca 5400

aagtttacta aaaaaaagta atatataata tatttaaaaa aagtaatata taatatattt 5460

aaaaaaagta atatataata tatttaaaaa aagtaatata taatatattt aaaaaaagta 5520

atatataata tatttaaaaa aagtaatata taatatattt aaatgtattt aaaaattttt 5580

aagattttta aattatattt ccggacagat tattttagga tcgacaacaa aagttacatt 5640

tatttatatt tatgacaaat aatgatattt atagcgtaca agacagttta gtagaacatt 5700

ttaatggttt gaatataaaa acagaaaacc agtttaaact tttagtaaat aagtactgct 5760

tgtatctaaa aaattcgaca gaaggtctta tttttttgtt taagctatat gtaaacagtt 5820

ctactcgtga gcaatctatt attcacctta gtatcttgaa ttggttaaat actaaatctt 5880

taccccaaag aaaagttact ctaattacct ttttacaaga tttagattta gaatttggta 5940

ctgtaaatta tctacagcaa actgaagtat tggttgtttt aaaatttatc tatagtttac 6000

taattaagaa aaaccaagat cgagcatcgc gagatactcc atcagaggat cctctagagg 6060

cccggtaccc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gcgcgcttgg cgtaatcatg 6120

gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 6180

cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca cattaattgc 6240

gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat 6300

cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac 6360

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 6420

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 6480

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 6540

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 6600

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 6660

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 6720

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 6780

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 6840

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 6900

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 6960

aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 7020

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 7080

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 7140

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 7200

gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 7260

tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 7320

ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 7380

ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 7440

tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 7500

aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 7560

gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 7620

gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 7680

ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 7740

gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 7800

gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 7860

gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 7920

tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 7980

gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 8040

agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 8100

aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 8160

ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 8220

gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 8270

<210> 10

<211> 13840

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达载体pLM20

<400> 10

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt caaacgaaga aaaacgaagt 420

tttaacagtt aaaactgcgt taaatatgtt tttaagaaat tatacgagct aaccttcact 480

aagcttcagg aacatttggg gagttttgct gctttgcagc cccgaagggg acgacatttg 540

atgagtttca atgacgttcg atgacgttcg atgacacttt acaatatgtc acgaaggttg 600

accaaaaggt atgaccgaag gtaatagcaa cattgttgtg ttttaaggtc tataaataaa 660

ggggacttgt ttttttttta caactttgtt ataataaaat aaatattatt ttaaagtttg 720

aataatcaag tttgcttaat aaaaatataa aatttttccc cttacgggtg taaataacat 780

taaatccctt tatgactaca aaaaaaacaa tacaatttta tgctaatata gctcaggttc 840

gtaatcacga actaatttct cttagtaaca tccaaacacc ttctcaaggt tcaattacaa 900

ttttttgtaa aacttgtaaa accagcttta caacaacagc acgttcttat cagaacgctc 960

gtaaaacagg ttgtcctcaa tgtaaagcaa aaacaacaag tgaaaactgg aaaggtaaaa 1020

ttcgtacaaa atctcctgaa gaggcctcta aacaggccgt tttaaatgaa tataaacaac 1080

aaaaacactt acaaaaaggt ttagcatatg cacatatttc taataaagaa gatttaaaaa 1140

tttttctgaa agaaagtcca aacgtttata acaattttat actccaacgg attgaccatc 1200

cagttatagg aaaatatact gaaaaccatc atattattcc taaacacacc ggtggtccac 1260

ataaacgctg gaatttaata aaattaacac cagaagacca tatggaagct caccgattac 1320

gtgctttagt atataacgaa gctggtgatc accaagcaat tcgtttcaga actaatcctt 1380

ctgagctagt tgaacgacgt cttcgaggaa accaaatagc caacgaaacg cgtttaagag 1440

aacgtactgg tatctatgcc gaaggcgctt cttctaaagg tggacgtatt ggtggtctag 1500

taaaaagtca cgaaaaagat ttaaaacaaa gtacaaaaat gagccaaccc gtattaaaag 1560

ctctttacga aggttcacgt tggaaacatt tacaatccgg aactgaacta aaccttcaac 1620

caaacagatt gtttacgctt ccgcagctag ttcaaaaact tttagaagct ttaccaccat 1680

gtaaagataa agaagtttta gaaagagcaa aaacaagtac agttacttca aatctggctc 1740

gtgtaattaa aaaacaacga ccttctgcat atggctggat aacgttttaa acctttttac 1800

gttttttgta ataatatggc aacctgcagc gaagctaggg atgggcattg cttccctaga 1860

acgttcagag actagagctt gagtcccaac aataatagct cactagcgcc cggcatctaa 1920

aatggtttaa attttagatg gtgatatagt ccaacccacc ttgaaaaagg tggacgacga 1980

ccagtagatt aaaaaggttt ttagtctata ttaaatggtt actttggtcg tctaatcttc 2040

caatacgctt ctttcaacaa ctctcgttca ttacacttct tcttagctgc ttggccggta 2100

atcggtattt ggttcactgc tttaggttta tcaactatgg cattcaactt aaacggtttc 2160

aacttcaacc aatcagtagt agactcacaa ggtcgtgtac taaacacttg ggcagacatc 2220

atcaaccgtg ctaacttagg tatggaagta atgcacgagc gtaacgctca caacttccct 2280

ctagacttag cttcaactaa ctctagctca aacaactaat ttttttttaa actaaaataa 2340

atctggttaa ccatacctgg tttattttag tttatacaca cttttcatat atatatactt 2400

aatagctacc ataggcagtt ggcaggacgt ccccttacgg gacaaatgta tttattgttg 2460

cctgccaact gcctaatata aatattagtg gacgtcccct tccccttacg ggcaagtaaa 2520

cttagggatt ttaatgctcc gttaggaggc aaataaattt tagtggcagt tgcctcgcct 2580

atcggctaac aagttccttc ggagtatata aatatcctgc caactgccga tatttatata 2640

ctaggcagtg gcggtaccac tcgactaata tttatattcc gtaagacgtc ctccttcgga 2700

gtatgtaaac atgctaagtt tacttgccca atatttatat taggacgtca gtggcagtgg 2760

accaccactc gtattttata ctcgaaaggc agttggcagg caactcgact aaaatttatt 2820

tacccgaaga cgtcccgaag aaggggaagg aggcagtggt accaccactg gctccgcagt 2880

attaacatcc tatatttata tactccgaag aacttcttag ccgatggcaa ctgccacaaa 2940

aaaccatcgg cttcgtttca cacagatggt gagaaccaca cgtttcgtcc tataaaaata 3000

gctaagttta cttgcccaat atttatatta ggacgtcccc ttcggtaaat aaattttagt 3060

ggctgtgtga cgttcactgg cgtcttggta ggttctgtga ctgactaaat aaaaaagtat 3120

ttgtcgtcta cgatatgtaa atctgtcgta tacgatatgt aaatttgagc tcttatggcc 3180

tctacatcga ggtttattat cttaccgaag gtaaatgcct tcgtggatct tatgggacgt 3240

cctgtgtcct tcctagtggt caataatcac ttcgtgacag cctgggctta catttatata 3300

agcgctgtta tatttatacg ctgttagaca aggtttaaat acataaattt ttattagtct 3360

atcgaccgtt aattgcttaa cttaccgaag gttaatcgct ttacttaccg aaggttaatc 3420

gctttactta ccgaaggtta attgcttaac ttactgaagg ttaatcgctt tacttaccga 3480

aggttaattg cttaacttac tgaaggttaa tcgctttact taccgaaggt taatccaatt 3540

tttttttcgc catatgtaga cgtttaattg ctacaacgtt attagccttt cgtcgctatc 3600

aaatcggttc agatatatat cactttattc actttcgttt atattatggc tggattaggt 3660

cttttagtta attaaaattt acatatttaa tgctatttat tattattgca attgcattaa 3720

atattttttt aaaaaaaatt aatcttcagc tatattagta aataacccat aaatagtttc 3780

aattggaata attggaattg gatatggact agttttattt tcttctaata actttaatat 3840

cgctggatct taatacgact cactataggg cgaattggag ctccaccgcg gtggcggccc 3900

gaacgccagc aagacgtagc ccagcgcgtc ggccgccatg ccggcgataa tggcctgctt 3960

ctcgccgaaa cgtttggtgg cgggaccagt gacgaaggct tgagcgaggg cgtgcaagat 4020

tccgaatacc gcaagcgaca ggccgatcat cgtcgcgctc cagcgaaagc ggtcctcgcc 4080

gaaaatgacc cagagcgctg ccggcacctg tcctacgagt tgcatgataa agaagacagt 4140

cataagtgcg gcgacgatag tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctga ctgggttgaa 4200

ggctctcaag ggcatcggtc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc 4260

cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat 4320

ggcgcccaac agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct 4380

catgggccgc tctagctaga actagtggat cgcactctac cgattgagtt acatccgctt 4440

tagtatgtta ctatttcttt tattacttat aaaatataat acataaagat aaattctata 4500

ataaaaagct aagattttat ttttctggca catcgtaatt tataaagcac aggcaaattt 4560

aaacaaaaga taactttaga acttaatttt aaaaatgtaa aatgatgttt aggtatttaa 4620

cctaaacacc ataaaaaata aaaacgatgt ttatgctatt cacataaaca tcatgaaaaa 4680

taaaaattaa agtttgtcaa tagtatcaaa ttcgaattta atttctttcc aaacttcaca 4740

tgcagcagca agttctggag accatttaca agctgaacga attacgtcgc caccttcacg 4800

agcaaggtca cgaccttcgt tacgagcttg agtacaagct tgcatgcctg cagttatttg 4860

ccaactacct tagtgatctc gcctttcacg tagtgaacaa attcttccaa ctgatctgcg 4920

cgcgaggcca agcgatcttc ttgtccaaga taagcctgcc tagcttcaag tatgacgggc 4980

tgatactggg ccggcaggcg ctccattgcc cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt 5040

ttgccggtta ctgcgctgta ccaaatgcgg gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg 5100

ccagcccagt cgggcggcga gttccatagc gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga 5160

tcctgttcag gaaccggatc aaagagttcc tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta 5220

tgttctcttg cttttgtcag caagatagcc agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag 5280

atacctgcaa gaatgtcatt gcgctgccat tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga 5340

taacgccacg gaatgatgtc gtcgtgcaca acaatggtga cttctacagc gcggagaatc 5400

tcgctctctc caggggaagc cgaagtttcc aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt 5460

gtttcatcaa gccttacggt caccgtaacc agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg 5520

ccgccatcca ctgcggagcc gtacaaatgt acggccagca acgtcggttc gagatggcgc 5580

tcgatgacgc caactacctc tgatagttga gtcgatactt cggcgataac cgcttcacga 5640

gccatggaca ttttcacttc tggagtgtat tgttcaatta aatctttaat aagattacta 5700

agttcttctg gagtacgcat tgccataaaa aagaaaaaat aaataaaaga ttaaaaaagt 5760

ttatttttaa aatctttctc gagaatttta aataagttta aaattcaaca aaaatagtga 5820

gtggtaagat cacttgttaa caaaagtaat ggttcaccct tgtcatattt aaatactaaa 5880

attcatttgc ccgaagagga caaatttatt tattgcatta aaatccctaa gtttacttgc 5940

ccgtaagggg aaggggggga cgtccacagg cgtcgtaagc aactaaagtt tatgacgccg 6000

attgctttgt taggaaaata taaatatccc ataagaaaag gtcctttaaa ggttttatgg 6060

actaaataaa aaagatagca taagcattaa aatcatgcaa attaaaaaaa aggtaaatgt 6120

atttataaaa aggtaaatgt atttatatag tatttatatt atagcataat aataaatata 6180

tttataaatt gattgttctt agagctaaaa gagaagaaca atgggtttat aggtattttg 6240

agaccagtta taaaaatgac ttttgacgtt taggtatata aacactgcct ctaataaagt 6300

catcgaacgc cagcaagacg tagcccagcg cgtcggccgc catgccggcg ataatggcct 6360

gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa ggcttgagcg agggcgtgca 6420

agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc gctccagcga aagcggtcct 6480

cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac gagttgcatg ataaagaaga 6540

cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt 6600

tgaaggctct caagggcatc ggtcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc 6660

agcccagtag taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg 6720

agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag 6780

cgctcatgcg ataccgtcga cctcgagggg gggcccggta cccagctttt gttcccttta 6840

gtgagggtta atcccgggta ccgagctcca ccgcggtggc ggccgctcta gctagaacta 6900

gtggatcgca ctctaccgat tgagttacat ccgctttagt atgttactat ttcttttatt 6960

acttataaaa tataatacat aaagataaat tctataataa aaagctaaga ttttattttt 7020

ctggcacatc gtaatttata aagcacaggc aaatttaaac aaaagataac tttagaactt 7080

aattttaaaa atgtaaaatg atgtttaggt atttaaccta aacaccataa aaaataaaaa 7140

cgatgtttat gctattcaca taaacatcat gaaaaataaa aattaaagtt tgtcaatagt 7200

atcaaattcg aatttaattt ctttccaaac ttcacatgca gcagcaagtt ctggagacca 7260

tttacaagct gaacgaatta cgtcgccacc ttcacgagca aggtcacgac cttcgttacg 7320

agcttgagta caagcttgca tgcttataat gtgaaatcaa ctaatggagc tgtaccacgt 7380

gtaccatttt gaatatcaac accttcagca tttgattttt taacagcaac ttcaccttga 7440

tttgtttcaa cttcgaataa aaaacgagct tgacgaccag ctgtaataga agcaccaaca 7500

tcagcagcta catcagctgg ttttaatgta acagcaccac ctgatggtaa tgtaactgat 7560

aatgctttac gtgtaactaa aactgtacct tcaccacgac cattagcagc atgatcagca 7620

tattctgtaa ttgtaacgaa aattttacca ccttctgttg gtaaaatgtt tgaaacatca 7680

cgaatgtgaa ttaaatttgc tgatgttgta cctgttgtaa ttgtatcgaa tttcatacca 7740

tcacgtgtta aaatgaataa atcagctaat tcatctttga aataattata tgttgcttgt 7800

gaatcacctt gaatttcagc tttaacattg aagtttacag ctggaactgg aactgtattg 7860

tcagcagcaa catataatgt accgaaagca gctaaagcat tttgaacacc acctgccata 7920

ttaccagcac ctaaaacagc tgtagctgat tgaccatcag cagcagcttt ccaaccaatt 7980

gaagcaccag ctttattaac taaattacca ttagcatctt ttttaaaagc tgaaacatca 8040

cctgttaaag ttaaatttac tttatcacgt tgaattgttt gatttgttgt aacatttgta 8100

atagcgaaat ctgtagctga aatattagca tcaccaatat ttaattttaa aaaaccttct 8160

gaaactaaag ctgtagcttt accagcattt gttaatgata attggaataa tttacctaat 8220

ttgaataatg gttttgtagc aactggatca gctgtatatg atgcattcca taaagcacca 8280

gctgttaaag caactgtacc ttgtgaacct gatgttaatt taaatgcttg attagctaag 8340

tttaatttta attcaacttc agcatcagcg aaattaattg tttcttcaac atctgaagct 8400

aaagctaaac gtaaacgttt accatttgaa tcaattgtgt gaacaattgt taattgtgta 8460

ccatctgaaa taattttgaa gaatttacga acatcattaa cttcacctga attagcaaaa 8520

ttaccgtgat catttggatt aactaataaa cctgtaaatg gacgacgcca aaaaccattt 8580

gataaccatt gacgaatttc agcatcattg aattgacctt caccttgaat ttctaaaaca 8640

atgaaaccat tattttttaa atcaccaact tcagagaaat ttaatgttaa attttgttga 8700

gctgttgaaa aatctaaaac tggttgtttt gtaactgaag ctaatgatgt tgtaacgaat 8760

gtattatcat ttggtgaaat aacaacatca gcaaaagctg gagcagctga accaacaaca 8820

atagcagcag caattaatgt ttttttgaac atagccatgg acattttcac ttctggagtg 8880

tattgttcaa ttaaatcttt aataagatta ctaagttctt ctggagtacg cattgccata 8940

aaaaagaaaa aataaataaa agattaaaaa agtttatttt taaaatcttt ctcgagaatt 9000

ttaaataagt ttaaaattca acaaaaatag tgagtggtaa gatcacttgt taacaaaagt 9060

aatggttcac ccttgtcata tttaaatact aaaattcatt tgcccgaaga ggacaaattt 9120

atttattgca ttaaaatccc taagtttact tgcccgtaag gggaaggggg ggacgtccac 9180

aggcgtcgta agcaactaaa gtttatgacg ccgattgctt tgttaggaaa atataaatat 9240

cccataagaa aaggtccttt aaaggtttta tggactaaat aaaaaagata gcataagcat 9300

taaaatcatg caaattaaaa aaaaggtaaa tgtatttata aaaaggtaaa tgtatttata 9360

tagtatttat attatagcat aataataaat atatttataa attgattgtt cttagagcta 9420

aaagagaaga acaatgggtt tataggtatt ttgagaccag ttataaaaat gacttttgac 9480

gtttaggtat ataaacactg cctctaataa agtcatcgat atcggatccg tatccatgct 9540

agcaatatct gatggtactt gcatttcata agtttggcct ggaataacca ccgtttcgga 9600

agtacctgtc gctttaagtt ttatagctaa atctaaagtt tctttaagtc ttttagctgt 9660

attaaatact ccacgacttt cccttacggg acaataaata aatttgtccc cttcccctta 9720

cgtgacgtca gtggcagttg cctgccaact gcctccttcg gagtattaaa atcctatatt 9780

tatatactcc taagtttact tgcccaatat ttatattagg cagttggcag gcaactgcca 9840

ctgacgtccc gaaggggaag gggaaggacg tccccttcgg gtaaataaat tttagtggca 9900

gtggtaccac cactgcctgc ttcctccttc cccttcgggc aagtaaactt agaataaaat 9960

ttatttgctg cgctagcagg tttacatact cctaagttta cttgcccgaa ggggaaggag 10020

gacgtcccct tacgggaata taaatattag tggcagtggt acaataaata aattgtatgt 10080

aaaccccttc gggcaactaa agtttatcgc agtatataaa tatagaatgt ttacatactc 10140

cgaaggagga cgccagtggc agtggtaccg ccactgcctg tccgcagtat taacatccta 10200

ttttaatact ccgaaggagg cagttggcag gcaactgcca ctaatattta tattcccgta 10260

aggggacgtc ctaatttaat actccgaagg aggcagttgg caggcaactg ccactaaaat 10320

ttatttgcct cctaacggag cattaaaatc ccgaagggga cgtcccgaag gggaagggga 10380

aggaggcaac tgcctgcttc ctccttcccc ttcgggcaag taaacttaga ataaaattta 10440

tttgctgcgc tagcaggttt acatactcct aagtttactt gcccgaaggg gaaggaggac 10500

gtccccttac gggaatataa atattagtgg cagtggtaca ataaataaat tgtatgtaaa 10560

ccccttcggg caactaaagt ttatcgcagt atataaatat cggcagttgg caggcaactg 10620

ccactaaaat tcatttgccc gaaggggacg tccactaata tttatattcc cgtaagggga 10680

cgtcccgaag gggaagggga cgtcctaaac ggagcattaa aatccctaag tttacttgcc 10740

taggcagttg gcaggatatt tatatacgat attaatactt ttgctactgg cacactaaaa 10800

tttatttgcc cgtaagggga cgtccttcgg tggttatata aataatcccg tagggggagg 10860

gggatgtccc gtagggggag gggagtggag gctccaacgg aggttggagc ttctttggtt 10920

tcctaggcat tatttaaata ttttttaacc ctagcactag aactgagatt ccagacggcg 10980

acccgtaaag ttcttcagtc ccctcagctt tttcacaacc aagttcggga tggattggtg 11040

tgggtccaac tgagcaaaga gcaccaaggt taactgcatc tctgtgagat gctagttaaa 11100

ctaagcttag cttagctcat aaacgatagt tacccgcaag gggttatgta attatattat 11160

aaggtcaaaa tcaaacggcc tttagtatat ctcggctaaa gccattgctg actgtacacc 11220

tgatacctat ataacggctt gtctagccgc ggccttagag agcactcatc ttgagtttag 11280

cttcctactt agatgctttc agcagttatc tatccatgcg tagctaccca gcgtttccca 11340

ttggaatgag aactggtaca caattggcat gtcctttcag gtcctctcgt actatgaaag 11400

gctactctca atgctctaac gcctacaccg gatatggacc aaactgtctc acgcatgaaa 11460

ttttaaagcc gaataaaact tgcggtcttt aaaactaacc cctttacttt cgtaaaggca 11520

tggactatgt cttcatcctg ctactgttaa tggcaggagt cggcgtatta tactttccca 11580

ctctcgacct gcaggcatgc aagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga 11640

aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc 11700

tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc 11760

cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc 11820

ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt 11880

cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca 11940

ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa 12000

aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat 12060

cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc 12120

cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc 12180

gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt 12240

tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac 12300

cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg 12360

ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca 12420

gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc 12480

gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa 12540

accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa 12600

ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac 12660

tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta 12720

aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt 12780

taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata 12840

gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc 12900

agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac 12960

cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag 13020

tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac 13080

gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc 13140

agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg 13200

gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc 13260

atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct 13320

gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc 13380

tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc 13440

atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc 13500

agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc 13560

gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca 13620

cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt 13680

tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt 13740

ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca 13800

ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg ccctttcgtc 13840

<210> 11

<211> 338

<212> PRT

<213> 施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）

<400> 11

Met Leu Pro Lys Leu Val Ile Thr His Arg Val His Asp Glu Ile Leu

1 5 10 15

Gln Leu Leu Ala Pro His Cys Glu Leu Met Thr Asn Gln Thr Asp Ser

20 25 30

Thr Leu Thr Arg Glu Glu Ile Leu Arg Arg Cys Arg Asp Ala Gln Ala

35 40 45

Met Met Ala Phe Met Pro Asp Arg Val Asp Ala Asp Phe Leu Gln Ala

50 55 60

Cys Pro Glu Leu Arg Val Val Gly Cys Ala Leu Lys Gly Phe Asp Asn

65 70 75 80

Phe Asp Val Asp Ala Cys Thr Ala Arg Gly Val Trp Leu Thr Phe Val

85 90 95

Pro Asp Leu Leu Thr Val Pro Thr Ala Glu Leu Ala Ile Gly Leu Ala

100 105 110

Val Gly Leu Gly Arg His Leu Arg Ala Ala Asp Ala Phe Val Arg Ser

115 120 125

Gly Glu Phe Gln Gly Trp Gln Pro Gln Phe Tyr Gly Thr Gly Leu Asp

130 135 140

Asn Ala Thr Val Gly Ile Leu Gly Met Gly Ala Ile Gly Leu Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Arg Leu Gln Gly Trp Gly Ala Thr Leu Gln Tyr His Glu Ala

165 170 175

Lys Ala Leu Asp Thr Gln Thr Glu Gln Arg Leu Gly Leu Arg Gln Val

180 185 190

Ala Cys Ser Glu Leu Phe Ala Ser Ser Asp Phe Ile Leu Leu Ala Leu

195 200 205

Pro Leu Asn Ala Asp Thr Gln His Leu Val Asn Ala Glu Leu Leu Ala

210 215 220

Leu Val Arg Pro Gly Ala Leu Leu Val Asn Pro Cys Arg Gly Ser Val

225 230 235 240

Val Asp Glu Ala Ala Val Leu Ala Ala Leu Glu Arg Gly Gln Leu Gly

245 250 255

Gly Tyr Ala Ala Asp Val Phe Glu Met Glu Asp Trp Ala Arg Ala Asp

260 265 270

Arg Pro Arg Leu Ile Asp Pro Ala Leu Leu Ala His Pro Asn Thr Leu

275 280 285

Phe Thr Pro His Ile Gly Ser Ala Val Arg Ala Val Arg Leu Glu Ile

290 295 300

Glu Arg Cys Ala Ala Gln Asn Ile Ile Gln Val Leu Ala Gly Ala Arg

305 310 315 320

Pro Ile Asn Ala Ala Asn Arg Leu Pro Lys Ala Glu Pro Ala Ala Cys

325 330 335

Glu Phe

<210> 12

<211> 1017

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 施氏假单胞菌PTXD的密码子优化序列

<400> 12

atgctgccga agctggtcat cacccaccgc gtccacgacg agatcctgca gctgctggcc 60

ccgcactgcg agctgatgac gaaccagacc gactcgaccc tgacgcgcga ggagatcctg 120

cgccgctgcc gcgacgcgca ggctatgatg gccttcatgc cggaccgcgt ggacgctgac 180

ttcctgcagg cttgcccgga gctgcgcgtg gtcggctgcg ctctgaaggg cttcgacaac 240

ttcgacgtgg acgcttgcac cgctcgcggc gtgtggctga cgttcgtccc ggacctgctg 300

accgtgccga cggctgagct ggccatcggc ctggctgtcg gcctgggccg ccacctgcgc 360

gccgcggacg ctttcgtgcg ctccggcgag ttccagggct ggcagccgca gttctacggc 420

accggcctgg acaacgctac ggtcggcatc ctgggcatgg gcgctatcgg cctggctatg 480

gctgaccgcc tgcagggctg gggcgctacc ctgcagtacc acgaggctaa ggccctggac 540

acccagacgg agcagcgcct gggcctgcgc caggtggctt gcagcgagct gttcgcctcg 600

tccgacttca tcctgctggc tctgccgctg aacgctgaca cccagcacct ggtcaacgct 660

gagctgctgg ctctggtgcg ccccggcgct ctgctggtca acccgtgccg cggctctgtg 720

gtggacgagg ctgccgtgct ggctgctctg gagcgcggcc agctgggcgg ctacgccgcg 780

gacgtcttcg agatggagga ctgggcgcgc gctgaccgcc cgcgcctgat cgacccggct 840

ctgctggctc acccgaacac cctgttcacg ccgcacatcg gcagcgccgt gcgcgcggtc 900

cgcctggaga tcgagcgctg cgctgcccag aacatcatcc aggtgctggc cggcgcccgc 960

ccgatcaacg ctgccaaccg cctgccgaag gctgagccgg ctgcttgcga attctaa 1017

<210> 13

<211> 4657

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于表达PTXD的构建体

<400> 13

tcgctgaggc ttgacatgat tggtgcgtat gtttgtatga agctacagga ctgatttggc 60

gggctatgag ggcgggggaa gctctggaag ggccgcgatg gggcgcgcgg cgtccagaag 120

gcgccatacg gcccgctggc ggcacccatc cggtataaaa gcccgcgacc ccgaacggtg 180

acctccactt tcagcgacaa acgagcactt atacatacgc gactattctg ccgctataca 240

taaccactca gctagcttaa gatcccatca agcttgcatg ccgggcgcgc cagaaggagc 300

gcagccaaac caggatgatg tttgatgggg tatttgagca cttgcaaccc ttatccggaa 360

gccccctggc ccacaaaggc taggcgccaa tgcaagcagt tcgcatgcag cccctggagc 420

ggtgccctcc tgataaaccg gccagggggc ctatgttctt tactttttta caagagaagt 480

cactcaacat cttaaaatgg ccaggtgagt cgacgagcaa gcccggcgga tcaggcagcg 540

tgcttgcaga tttgacttgc aacgcccgca ttgtgtcgac gaaggctttt ggctcctctg 600

tcgctgtctc aagcagcatc taaccctgcg tcgccgtttc catttgcagg atggccatgc 660

atatggccaa gctgaccagc gccgttccgg tgctcaccgc gcgcgacgtc gccggagcgg 720

tcgagttctg gaccgaccgg ctcgggttct cccgggactt cgtggaggac gacttcgccg 780

gtgtggtccg ggacgacgtg accctgttca tcagcgcggt ccaggaccag gtgagtcgac 840

gagcaagccc ggcggatcag gcagcgtgct tgcagatttg acttgcaacg cccgcattgt 900

gtcgacgaag gcttttggct cctctgtcgc tgtctcaagc agcatctaac cctgcgtcgc 960

cgtttccatt tgcaggacca ggtggtgccg gacaacaccc tggcctgggt gtgggtgcgc 1020

ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg gaggtcgtgt ccacgaactt ccgggacgcc 1080

tccgggccgg ccatgaccga gatcggcgag cagccgtggg ggcgggagtt cgccctgcgc 1140

gacccggccg gcaactgcgt gcacttcgtg gccgaggagc aggacgcccc ggtgaagcag 1200

accctgaact tcgacctgct gaagctggcg ggcgacgtgg agagcaaccc gggccccgaa 1260

ttcatgctgc cgaagctggt catcacccac cgcgtccacg acgagatcct gcagctgctg 1320

gccccgcact gcgagctgat gacgaaccag accgactcga ccctgacgcg cgaggagatc 1380

ctgcgccgct gccgcgacgc gcaggctatg atggccttca tgccggaccg cgtggacgct 1440

gacttcctgc aggcttgccc ggagctgcgc gtggtcggct gcgctctgaa gggcttcgac 1500

aacttcgacg tggacgcttg caccgctcgc ggcgtgtggc tgacgttcgt cccggacctg 1560

ctgaccgtgc cgacggctga gctggccatc ggcctggctg tcggcctggg ccgccacctg 1620

cgcgccgcgg acgctttcgt gcgctccggc gagttccagg gctggcagcc gcagttctac 1680

ggcaccggcc tggacaacgc tacggtcggc atcctgggca tgggcgctat cggcctggct 1740

atggctgacc gcctgcaggg ctggggcgct accctgcagt accacgaggc taaggccctg 1800

gacacccaga cggagcagcg cctgggcctg cgccaggtgg cttgcagcga gctgttcgcc 1860

tcgtccgact tcatcctgct ggctctgccg ctgaacgctg acacccagca cctggtcaac 1920

gctgagctgc tggctctggt gcgccccggc gctctgctgg tcaacccgtg ccgcggctct 1980

gtggtggacg aggctgccgt gctggctgct ctggagcgcg gccagctggg cggctacgcc 2040

gcggacgtct tcgagatgga ggactgggcg cgcgctgacc gcccgcgcct gatcgacccg 2100

gctctgctgg ctcacccgaa caccctgttc acgccgcaca tcggcagcgc cgtgcgcgcg 2160

gtccgcctgg agatcgagcg ctgcgctgcc cagaacatca tccaggtgct ggccggcgcc 2220

cgcccgatca acgctgccaa ccgcctgccg aaggctgagc cggctgcttg cgaattctaa 2280

ctcgagcacc accaccacca ccacggcaag cccatcccca accccctgct gggcctggac 2340

agcaccgaga acctgtactt ccagggggta ccaggatccg gaagatctgg tctagagggc 2400

aagcccatcc ccaaccccct gctgggcctg gacagcaccc gtaccggtca ccaccaccac 2460

caccactaac tgcagccgct ccgtgtaaat ggaggcgctc gttgatctga gccttgcccc 2520

ctgacgaacg gcggtggatg gaagatactg ctctcaagtg ctgaagcggt agcttagctc 2580

cccgtttcgt gctgatcagt ctttttcaac acgtaaaaag cggaggagtt ttgcaatttt 2640

gttggttgta acgatcctcc gttgattttg gcctctttct ccatgggcgg gctgggcgta 2700

tttgaagcgg cggtatttca caccgcatca ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga 2760

acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagattatca 2820

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 2880

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 2940

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 3000

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 3060

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 3120

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 3180

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 3240

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 3300

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 3360

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 3420

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 3480

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 3540

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 3600

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 3660

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 3720

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 3780

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag 3840

ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct 3900

ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt 3960

tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt cagcagagcg 4020

cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct 4080

gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgt tgccagtggc 4140

gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg 4200

tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa 4260

ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg 4320

gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg 4380

ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga 4440

tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt 4500

ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct 4560

gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga 4620

acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcgg 4657

<210> 14

<211> 462

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）

<400> 14

Met Leu Ala Arg Arg Ser Phe Leu Gln Ala Ala Ala Gly Ser Leu Val

1 5 10 15

Leu Gly Leu Ala Arg Ala Gln Gly Pro Ser Phe Pro Glu Pro Lys Val

20 25 30

Val Arg Ser Gln Gly Gly Leu Leu Ser Leu Lys Leu Ser Ala Thr Pro

35 40 45

Thr Pro Leu Ala Leu Ala Gly Gln Arg Ala Thr Leu Leu Thr Tyr Gly

50 55 60

Gly Ser Phe Pro Gly Pro Thr Leu Arg Val Arg Pro Arg Asp Thr Val

65 70 75 80

Arg Leu Thr Leu Glu Asn Arg Leu Pro Glu Pro Thr Asn Leu His Trp

85 90 95

His Gly Leu Pro Ile Ser Pro Lys Val Asp Asp Pro Phe Leu Glu Ile

100 105 110

Pro Pro Gly Glu Ser Trp Thr Tyr Glu Phe Thr Val Pro Lys Glu Leu

115 120 125

Ala Gly Thr Phe Trp Tyr His Pro His Leu His Gly Arg Val Ala Pro

130 135 140

Gln Leu Phe Ala Gly Leu Leu Gly Ala Leu Val Val Glu Ser Ser Leu

145 150 155 160

Asp Ala Ile Pro Glu Leu Arg Glu Ala Glu Glu His Leu Leu Val Leu

165 170 175

Lys Asp Leu Ala Leu Gln Gly Gly Arg Pro Ala Pro His Thr Pro Met

180 185 190

Asp Trp Met Asn Gly Lys Glu Gly Asp Leu Val Leu Val Asn Gly Ala

195 200 205

Leu Arg Pro Thr Leu Val Ala Gln Lys Ala Thr Leu Arg Leu Arg Leu

210 215 220

Leu Asn Ala Ser Asn Ala Arg Tyr Tyr Arg Leu Ala Leu Gln Asp His

225 230 235 240

Pro Leu Tyr Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Phe Leu Glu Glu Pro Leu

245 250 255

Glu Val Ser Glu Leu Leu Leu Ala Pro Gly Glu Arg Ala Glu Val Leu

260 265 270

Val Arg Leu Arg Lys Glu Gly Arg Phe Leu Leu Gln Ala Leu Pro Tyr

275 280 285

Asp Arg Gly Ala Met Gly Met Met Asp Met Gly Gly Met Ala His Ala

290 295 300

Met Pro Gln Gly Pro Ser Arg Pro Glu Thr Leu Leu Tyr Leu Ile Ala

305 310 315 320

Pro Lys Asn Pro Lys Pro Leu Pro Leu Pro Lys Ala Leu Ser Pro Phe

325 330 335

Pro Thr Leu Pro Ala Pro Val Val Thr Arg Arg Leu Val Leu Thr Glu

340 345 350

Asp Met Met Ala Ala Arg Phe Phe Ile Asn Gly Gln Val Phe Asp His

355 360 365

Arg Arg Val Asp Leu Lys Gly Gln Ala Gln Thr Val Glu Val Trp Glu

370 375 380

Val Glu Asn Gln Gly Asp Met Asp His Pro Phe His Leu His Val His

385 390 395 400

Pro Phe Gln Val Leu Ser Val Gly Gly Arg Pro Phe Pro Tyr Arg Ala

405 410 415

Trp Lys Asp Val Val Asn Leu Lys Ala Gly Glu Val Ala Arg Leu Leu

420 425 430

Val Pro Leu Arg Glu Lys Gly Arg Thr Val Phe His Cys His Ile Val

435 440 445

Glu His Glu Asp Arg Gly Met Met Gly Val Leu Glu Val Gly

450 455 460

<210> 15

<211> 1400

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码嗜热栖热菌漆酶的密码子使用优化的核苷酸序列

<400> 15

ccatggcttt agctcgtcgt tcatttttac aagctgctgc tggttcatta gttttaggtt 60

tagctcgtgc tcaaggtcca tcatttccag aaccaaaagt tgttcgttca caaggtggtt 120

tattatcatt aaaattatca gctacaccaa caccattagc tttagctggt caacgtgcta 180

cattattaac atatggtggt tcatttccag gtccaacatt acgtgttcgt ccacgtgata 240

cagttcgttt aacattagaa aatcgtttac cagaaccaac aaatttacat tggcatggtt 300

taccaatttc accaaaagtt gatgatccat ttttagaaat tccaccaggt gaatcatgga 360

catatgaatt tacagttcca aaagaattag ctggtacatt ttggtatcat ccacatttac 420

atggtcgtgt tgctccacaa ttatttgctg gtttattagg tgctttagtt gttgaatcat 480

cattagatgc tattccagaa ttacgtgaag ctgaagaaca tttattagtt ttaaaagatt 540

tagctttaca aggtggtcgt ccagctccac atacaccaat ggattggatg aatggtaaag 600

aaggtgattt agttttagtt aatggtgctt tacgtccaac attagttgct caaaaagcta 660

cattacgttt acgtttatta aatgcttcaa atgctcgtta ttatcgttta gctttacaag 720

atcatccatt atatttaatt gctgctgatg gtggtttttt agaagaacca ttagaagttt 780

cagaattatt attagctcca ggtgaacgtg ctgaagtttt agttcgttta cgtaaagaag 840

gtcgtttttt attacaagca ttaccatatg atcgtggtgc tatgggtatg atggatatgg 900

gtggtatggc tcatgctatg ccacaaggtc catcacgtcc agaaacatta ttatatttaa 960

ttgctccaaa aaatccaaaa ccattaccat taccaaaagc attatcacca tttccaacat 1020

taccagctcc agttgttaca cgtcgtttag ttttaacaga agatatgatg gctgctcgtt 1080

tttttattaa tggtcaagtt tttgatcatc gtcgtgttga tttaaaaggt caagctcaaa 1140

cagttgaagt ttgggaagtt gaaaatcaag gtgatatgga tcatccattt catttacatg 1200

ttcatccatt tcaagtttta tcagttggtg gtcgtccatt tccatatcgt gcttggaaag 1260

atgttgttaa tttaaaagct ggtgaagttg ctcgtttatt agttccatta cgtgaaaaag 1320

gtcgtacagt ttttcattgt catattgttg aacatgaaga tcgtggtatg atgggtgttt 1380

tagaagttgg ttaagcatgc 1400

<210> 16

<211> 242

<212> PRT

<213> 嗜热栖热菌

<400> 16

Met Thr Leu Leu Arg Thr Pro Leu Pro Val Pro His Gly Phe Thr Thr

1 5 10 15

Arg Glu Gly Gly Val Ser Glu Gly Pro Phe Arg Ser Leu Asn Leu Ser

20 25 30

Ala Ala Thr Gly Asp Asp Pro Glu Arg Val Ala Glu Asn Gln Arg Arg

35 40 45

Val Leu Ala Ala Phe Gly His Pro Pro Val Ala Gly Leu Arg Gln Val

50 55 60

His Gly Thr Glu Val His Pro Val Glu Gly Pro Gly Leu Trp Glu Gly

65 70 75 80

Asp Gly Leu Leu Thr Arg Thr Pro Gly Leu Leu Leu Arg Val Gly Val

85 90 95

Ala Asp Cys Tyr Pro Leu Leu Leu Tyr His Pro Lys Gly Ala Val Gly

100 105 110

Ala Leu His Ala Gly Trp Arg Gly Val Val Gly Gly Ile Leu Pro Lys

115 120 125

Ala Leu Glu Arg Leu Glu Ala Val Tyr Arg Leu Asp Pro Thr Glu Val

130 135 140

His Leu Ala Ile Gly Pro Gly Ile Gly Gly Ala Cys Tyr Gln Val Gly

145 150 155 160

Glu Glu Val Val Ala Arg Phe Ala Glu Ala Gly Leu Phe Thr Phe Arg

165 170 175

Glu Asp Pro Ala Ala Pro Gly Lys Tyr Leu Leu Asp Leu Glu Lys Ala

180 185 190

Leu Leu Leu Gln Ala Arg Arg Ala Gly Leu Arg Glu Glu Arg Ile Tyr

195 200 205

Arg Val Gly Leu Cys Thr His Cys Ala Pro Asn Leu Phe Ser His Arg

210 215 220

Arg Asp Arg Gly Arg Thr Gly Arg Met Trp Gly Leu Val Met Leu Pro

225 230 235 240

Pro Arg

<210> 17

<211> 740

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 嗜热栖热菌的多酚氧化酶的密码子使用优化的核苷酸序列

<400> 17

ccatggctac attattacgt acaccattac cagttccaca tggttttaca acacgtgaag 60

gtggtgtttc agaaggtcca tttcgttcat taaatttatc agctgctaca ggtgatgatc 120

cagaacgtgt tgctgaaaat caacgtcgtg ttttagctgc ttttggtcat ccaccagttg 180

ctggtttacg tcaagttcat ggtacagaag ttcatccagt tgaaggtcca ggtttatggg 240

aaggtgatgg tttattaaca cgtacaccag gtttattatt acgtgttggt gttgctgatt 300

gttatccatt attattatat catccaaaag gtgctgttgg tgctttacat gctggttggc 360

gtggtgttgt tggtggtatt ttaccaaaag cattagaacg tttagaagct gtttatcgtt 420

tagatccaac agaagttcat ttagctattg gtccaggtat tggtggtgct tgttatcaag 480

ttggtgaaga agttgttgct cgttttgctg aagctggttt atttacattt cgtgaagatc 540

cagctgctcc aggtaaatat ttattagatt tagaaaaagc attattatta caagctcgtc 600

gtgctggttt acgtgaagaa cgtatttatc gtgttggttt atgtacacat tgtgctccaa 660

atttattttc acatcgtcgt gatcgtggtc gtacaggtcg tatgtggggt ttagttatgt 720

taccaccacg ttaagcatgc 740